माइस अल्कोहलिक लिवर रोग में सिस्टान्चे फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड आंत्र अवरोध और आंत माइक्रोबायोटा का प्रभाव

अमूर्त:

उद्देश्य:माउस मॉडलशराबी यकृत रोग(ALD) की स्थापना लिबर-डेकार्ली अल्कोहल तरल फ़ीड द्वारा की गई थी, और इसके प्रभावसिस्टांच फेनिलथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स(सीपीएचजी) के आंत्र अवरोध और एएलडी चूहों की आंत माइक्रोबायोटा संरचना पर अध्ययन पर चर्चा की गई थी।

विधि: 36 C57BL/6N मादा चूहों को यादृच्छिक रूप से सामान्य समूह, CPhGs सामान्य समूह, मॉडल समूह और CPhGs कम, मध्यम और उच्च खुराक समूहों (175 mg·kg-1, 350 mg·kg-1 और 700 mg·kg-1) ​​में विभाजित किया गया, जिसमें 6 चूहे शामिल थे। लाइबर-डेकार्ली अल्कोहल लिक्विड फीड का उपयोग करके ALD माउस मॉडल की स्थापना। CPhGs खुराक समूह और CPhGs सामान्य समूह को उचित खुराक पर प्रतिदिन गैवेज द्वारा CPhGs दिया गया। एक स्वचालित जैव रासायनिक विश्लेषक ने सीरम ALT, AST, TG और TC स्तरों का पता लगाया। सीरम TNF-, IL-1, LPS, LBP, D-LA, DAO और लीवर के LBP का पता ELISA द्वारा लगाया गया। लीवर होमोजीनट नमूनों में TG और TC के स्तरों का पता कलरिमेट्री द्वारा लगाया गया। लिवर के ऊतकों को ऑयल रेड ओ और एचई स्टेनिंग से रंगा गया। आंतों के ऊतकों को एचई और एबी-पीएएस स्टेनिंग और म्यूक2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से रंगा गया। सामान्य समूह, सीपीएचजी के सामान्य समूह, मॉडल समूह और सीपीएचजी के उच्च खुराक समूह की आंतों की सामग्री एकत्र की गई और आंत माइक्रोबायोटा को अनुक्रमित किया गया।

परिणाम: ALD मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया गया। सामान्य समूह की तुलना में, मॉडल समूह में सीरम ALT, AST और TG के स्तर और यकृत TG और TC के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

निष्कर्ष: सीपीएचजी एएलडी के कारण होने वाली आंत्र अवरोध क्षति को कम कर सकते हैं, जो हो सकता हैअक्करमेनसिया और एलोबैकुलम की प्रचुरता और संरचना को विनियमित करके एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाते हैं, और आंत के म्यूकोसल अवरोध के बलगम परत होमियोस्टेसिस को प्रभावित करता है।

कीवर्ड:सीपीएचजी; शराबी यकृत रोग; आंत्र अवरोध; आंत माइक्रोबायोटा

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शराब एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक बन गया है।विश्व भर में दीर्घकालिक बीमारियाँ।विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा जारी "शराब और स्वास्थ्य पर वैश्विक रिपोर्ट 2018" से पता चलता है कि 2016 में दुनिया भर में शराब के अत्यधिक उपयोग के कारण लगभग 3 मिलियन लोग मारे गए, जो कुल का 5.3% है [1]। हमारे देश में, शराब के कारण होने वाली यकृत की बीमारियाँ साल दर साल बढ़ रही हैं और यह लीवर सिरोसिस का दूसरा सबसे बड़ा कारण है [2], जो एक गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बन गई है। शराबी यकृत रोग (ALD) की शुरुआत और प्रगति के तंत्र जटिल और असंख्य हैं, मुख्य रूप से इथेनॉल मेटाबोलाइट एसीटैल्डिहाइड और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के यकृत क्षति तंत्र [3]। उनमें से, ALD की प्रगति में "आंत-यकृत अक्ष" की भूमिका रही है। इसने काफी ध्यान आकर्षित किया है [4-5]। शराब के ऑक्सीडेटिव मेटाबोल मानव आंत माइक्रोबायोटा (जीएम) की अनुमानित संख्या 10 ट्रिलियन [7] है। आंतों के वनस्पतियों, वायरस, कवक और मेटाबोलाइट्स से बना एक सूक्ष्म पारिस्थितिक संतुलन।

संतुलन, यानी आंतों की सूक्ष्म पारिस्थितिकी, "आंत-यकृत अक्ष" के माध्यम से ALD की प्रगति से निकटता से जुड़ी हुई है, लेकिन प्रासंगिक तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं [8-9]। आंतों की बाधा और वनस्पतियाँ "आंत-यकृत अक्ष" पर हावी होती हैं, और जीएम डिस्रेग्यूलेशन और भड़काऊ कारकों की अधिक अभिव्यक्ति ALD की घटना और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है [10-11]।

अध्ययनों में पाया गया है कि एएलडी की घटना और विकास के दौरान गंभीर जीएम डिस्रेग्यूलेशन और भड़काऊ कारकों की अधिक अभिव्यक्ति होती है [12]। शराब की बड़ी मात्रा का दीर्घकालिक सेवन या अल्पकालिक सेवन आंतों की पारगम्यता को बदल देगा, जिससे आंतों का एलपीएस पोर्टल परिसंचरण में प्रवेश कर जाएगा, जिससे भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न होगी और यकृत की क्षति बढ़ जाएगी [12-13]।

झिंजियांग में एक विशिष्ट चीनी औषधीय सामग्री के रूप में सिस्टांच को वेई और जिन राजवंशों के वू पु के मटेरिया मेडिका, सोंग राजवंश के "मटेरिया मेडिका का संग्रह" और मिंग राजवंश के "मटेरिया मेडिका का संग्रह" में दर्ज किया गया है [14]। आधुनिक औषधीय शोध में पाया गया है कि सिस्टांच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (CPhGs) सूजन-रोधी और एंटी-हेपेटिक फाइब्रोसिस [15-16] में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालाँकि, वर्तमान में इस बात पर शोध की कमी है कि क्या CPhGs ALD में आंतों के अवरोध कार्य या आंतों के वनस्पतियों को विनियमित कर सकते हैं और एक हेपेटोप्रोटेक्टिव प्रभाव डाल सकते हैं।

इस अध्ययन में लिबर-डेकार्ली अल्कोहल लिक्विड फीड का उपयोग करके नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज एंड एल्कोहॉलिज्म (NIAAA) [17] शॉर्ट-टर्म अल्कोहलिक लिवर इंजरी माउस मॉडल की स्थापना की गई, ताकि ALD के आंतों के माइक्रोइकोलॉजी पर CPhGs के प्रभाव का पता लगाया जा सके। प्रभाव। ALD मॉडल चूहों में आंतों के अवरोध समारोह और आंतों के माइक्रोबायोटा होमोस्टैसिस पर CPhGs के प्रभावों पर विशेष ध्यान दिया गया। यह आंतों के माइक्रोइकोलॉजी के दृष्टिकोण से CPhGs के हेपेटोप्रोटेक्टिव तंत्र को प्रकट करने में मदद करता है और दवा विकास के लिए एक प्रयोगात्मक संदर्भ प्रदान करता है।

1. सामग्री

1.1 पशु

एसपीएफ ग्रेड सी57बीएल/6एन मादा चूहे, 17~20 ग्राम, बीजिंग विटोंग लिहुआ प्रायोगिक पशु प्रौद्योगिकी कं, लिमिटेड, प्रमाण पत्र संख्या एससीएक्सके (बीजिंग) 2021-0006 से खरीदे गए थे। जानवरों को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी (एसवाईएक्सके (नया) 2022-0003) के पशु प्रयोग केंद्र के एसपीएफ वातावरण में पाला गया और प्रयोग किए गए। सख्त

झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी (IACUC-20220127-4) की प्रायोगिक पशु नैतिकता समिति की पशु कल्याण और नैतिक आवश्यकताओं का अनुपालन करें।

1.2 अभिकर्मक

पूर्ण इथेनॉल, आइसोप्रोपिल अल्कोहल (टियांजिन दामो केमिकल रिएजेंट फैक्ट्री, बैच संख्या क्रमशः 20230201 और 20190103); लिबर-डेकार्ली नियंत्रण तरल फ़ीड, लिबर-डेकार्ली अल्कोहल तरल फ़ीड (डाइट्ज़ बायोटेक्नोलॉजी (वूशी) कं, लिमिटेड, बैच संख्या क्रमशः 710027 और 710260);

पैराफॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेटिव, कार्नोय फिक्सेटिव और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिक्सेटिव (वुहान सेवियर बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड, बैच संख्या CR2208028, CR2305094 और CR2210001 क्रमशः); LBP एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (ELISA) किट, TNF- ELISA किट, IL-1

एलिसा किट, डी-एलए एलिसा किट, डीएओ एलिसा किट, टीजी कलरिमेट्रिक टेस्ट किट और टीसी कलरिमेट्रिक टेस्ट किट (वुहान यिलराइट बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड, बैच संख्या CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F3303, GY00L4423397) ,

GY010XN08244, GY03P04Z5104 और GY02DHB82603); LPS ELISA किट (वुहान फीन बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, बैच संख्या U3126I069T); ALT परख किट, AST परख किट, TG परख किट और TC परख किट (शेन्ज़ेन माइंड्रे बायोमेडिकल इलेक्ट्रॉनिक्स कं, लिमिटेड, बैच संख्या 140122014, 140223002, 141722001 और 141622017 हैं); HE अभिरंजन विलयन, संतृप्त तेल लाल O अभिरंजन विलयन, AB-PAS अभिरंजन विलयन; Muc2 प्राथमिक एंटीबॉडी, बकरी एंटी-माउस द्वितीयक एंटीबॉडी (वुहान सेवियर बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड, बैच नंबर क्रमशः G1005, G1015, G1049, GB11344 और GB23301 हैं)।

1.3 ड्रग्स

सिस्टान्चे अर्क कहाँ से खरीदा गया थाझिंजियांग होटन डिचेन फार्मास्युटिकल एंड बायोलॉजिकल कंपनी लिमिटेड(इचिनेसियासाइड 40% से अधिक या बराबर, वर्बास्कोसाइड 16% से अधिक या बराबर, फेनिलथेनॉइड ग्लाइकोसाइड 85% से अधिक या बराबर, बैच संख्या 20230103)।

1.4 उपकरण

बीएस-240वीईटी स्वचालित जैव रासायनिक विश्लेषक (शेन्ज़ेन माइंड्रे बायोमेडिकल इलेक्ट्रॉनिक्स कं, लिमिटेड); एचटी7800 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (हिताची मैन्युफैक्चरिंग कं, लिमिटेड, जापान)।

2. विधि

2.1 समूहीकरण और पशु मॉडल स्थापना

36 चूहों को यादृच्छिक रूप से सामान्य समूह, सामान्य प्रशासन समूह, मॉडल समूह और CPhGs निम्न, मध्यम और उच्च खुराक समूहों (175 mg·kg-1, 350mg·kg-1 और 700 mg·kg-1) में विभाजित किया गया, प्रत्येक समूह में 6 थे। सभी चूहों को पहले लाइबर-डेकार्ली नियंत्रण तरल फ़ीड दिया गया और 3 दिनों के लिए फ़ीड के लिए अनुकूलित किया गया। सामान्य

नियंत्रण समूह और सामान्य खुराक समूह को लीबर-डेकार्ली नियंत्रण तरल फ़ीड खिलाया गया; मॉडल समूह और CPhGs कम, मध्यम और उच्च खुराक समूहों को लीबरडेकार्ली अल्कोहल तरल फ़ीड खिलाया गया। प्रयोग के चौथे दिन से शुरू करते हुए, मॉडल समूह और CPhGs कम, मध्यम और उच्च खुराक समूहों ने अल्कोहल फ़ीड की अल्कोहल सांद्रता को धीरे-धीरे 0% से 5% तक बढ़ा दिया, और प्रयोग के अंत तक 5% अल्कोहल फ़ीड को बनाए रखा, और सामग्री एकत्र करने से 9 घंटे पहले दबाया। 0.2 mL · 10 g -1 को 30% इथेनॉल के साथ पेट में प्रशासित किया गया।

अब सभी फ़ीड तैयार और उपयोग की जाती हैं, और 17:00 से 19:00 तक हर दिन ताज़ा फ़ीड बदली जाती है। हर दिन चूहों के खाने, गतिविधि और मानसिक स्थिति का निरीक्षण करें। जब मॉडल समूह में चूहे नशे की हालत में दिखाई देते हैं जैसे कि सुस्ती, कम गतिविधि और कम भोजन का सेवन, तो यह दर्शाता है कि मॉडलिंग सफल है [17]। जब CPhGs कम, मध्यम और उच्च खुराक समूहों और सामान्य प्रशासन समूह ने मादक फ़ीड खिलाना शुरू किया, तो इसी सांद्रता के CPhGs घोल को कुल 14 दिनों के लिए हर दिन पिलाया गया, और बाकी के लिए सामान्य खारा घोल पिलाया गया।

2.2 सामान्य अवलोकन

चूहों के खाने, गतिविधि, मानसिक स्थिति और उत्सर्जन को हर दिन देखा गया; मॉडलिंग और दवा प्रशासन के दौरान, चूहों की मृत्यु की स्थिति और वजन दर्ज किया गया। अंग गुणांक=अंग द्रव्यमान / (शरीर द्रव्यमान / 100) × 100%।

2.3 प्रायोगिक पशुओं का चयन

12 घंटे तक भोजन और पानी से वंचित रखने के बाद, चूहों को बेहोश कर दिया गया, उनकी आंखें निकाल दी गईं और बलि देने से पहले उनका खून एकत्र किया गया। सबसे बड़े लोब से लीवर ऊतक को पैराफॉर्मलडिहाइड घोल में स्थिर किया गया। छोटे ऊतक को जल्दी से बर्फ पर अलग किया गया और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिक्सेटिव में स्थिर किया गया; छोटे और बृहदान्त्र ऊतक के 3 सेमी (सामग्री को फ्लश किए बिना) को अलग किया गया और कार्नोय के फिक्सेटिव में स्थिर किया गया। छोटे और बृहदान्त्र ऊतक के अन्य 3 सेमी (शारीरिक खारा से धोया गया) को पैराफॉर्मलडिहाइड घोल में स्थिर किया गया। सभी आंत्र खंडों की सामग्री को बाँझ एंजाइम-मुक्त क्रायोवियल में एकत्र किया गया, जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमाया गया, और फिर भंडारण के लिए -80 डिग्री रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित किया गया।

2.4 सीरम और यकृत ऊतक समरूप संकेतकों का एलिसा और रंगमिति पता लगाना

स्वचालित जैव रासायनिक उपकरण का उपयोग सीरम एएलटी, एएसटी, टीजी और टीसी स्तरों का पता लगाने के लिए किया गया था; एलिसा विधि का उपयोग सीरम टीएनएफ-, आईएल-1, एलपीएस, एलबीपी, डीएओ और डी-एलए स्तरों और यकृत एलबीपी स्तरों का पता लगाने के लिए किया गया था। निर्देशों के अनुसार काम करें। यकृत के ऊतकों को समरूप बनाने के लिए, 0.05~1.00 ग्राम ताजा यकृत ऊतक लें, वजन (जी): मात्रा (एमएल)=1:9 के अनुपात के अनुसार 2 ~ 8 डिग्री पर आइसोप्रोपिल अल्कोहल मिलाएं, होमोजेनेट करने के लिए पीसें और 20000g·min-1 15 मिनट पर सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरनेवाला लें और इसे परीक्षण के लिए बर्फ पर रखें, और निर्देशों के अनुसार काम करें। यकृत ऊतक समरूप नमूनों में टीजी और टीसी स्तरों का रंगमिति पता लगाना।

2.5 यकृत ऊतक विकृति का पता लगाने के लिए HE और ऑयल रेड O अभिरंजन

हेमेटोक्सिलिन-इओसिन स्टेनिंग (HE) के लिए, स्थिर लिवर ऊतक को निकाला गया, पैराफिन से काटा गया, HE से रंगा गया, और निर्जलित करके माउंट किया गया। स्थिर लिवर ऊतक को बाहर निकाला गया, जमे हुए हिस्से में काटा गया, आइसोप्रोपिल अल्कोहल से धोया गया, ऑयल रेड O से रंगा गया, सील किया गया, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया।

2.6 आंत्र ऊतक रोग संबंधी अवलोकन का पता लगाने के लिए HE और AB-PSA अभिरंजन

छोटे ऊतक को निकालकर HE धुंधलापन के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड घोल में स्थिर किया गया; कोलन ऊतक को निकालकर AB-PAS धुंधलापन के लिए कार्नोय के स्थिरीकरण में स्थिर किया गया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री चरण: पैराफिन सेक्शन को निर्जलित करना, एंटीजन रिट्रीवल, एंडोजेनस पेरोक्सीडेज को ब्लॉक करना, सीरम ब्लॉक करना, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ना, द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ना, रंग विकास के बाद सेल नाभिक को काउंटरस्टेन करना, निर्जलित करना और माउंट करना, और प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करना। छोटे ऊतक को हटा दिया गया, 1 मिमी × 1 मिमी × 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में काटा गया, प्रीमेनस्ट्रुअली, पोस्ट-फिक्स्ड, निर्जलित, एम्बेडेड, पॉलीमराइज़्ड और अल्ट्राथिनली सेक्शन किया गया। प्रत्येक समूह में छोटे उपकला कोशिकाओं के माइक्रोविली परिवर्तन एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए।

2.7 16एस विधि का उपयोग करके आंत्र वनस्पतियों का अनुक्रमण और विश्लेषण

सामान्य समूह, सामान्य खुराक समूह, मॉडल समूह और CPhGs उच्च खुराक समूह की आंतों की सामग्री, V3-V4 क्षेत्र 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') और 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT-3') के आधार पर, जीवाणु समुदाय अनुक्रमण के लिए 16S rDNA उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करते हुए। इस अध्ययन में अनुक्रमण प्रयोग शेन्ज़ेन माइक्रोटेक प्रौद्योगिकी समूह कं, लिमिटेड द्वारा पूरा किया गया था। इस अध्ययन में आंत माइक्रोबायोटा अनुक्रमण डेटा को प्रोजेक्ट नंबर PRJNA1006676 के तहत राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केंद्र में अपलोड किया गया है।

एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (ASV) के विश्लेषण परिणामों के आधार पर, अल्फा विविधता, बीटा विविधता विश्लेषण, प्रजाति वर्गीकरण एनोटेशन और अंतर विश्लेषण किया जाता है। उनमें से, अल्फा विविधता सूचकांक में मुख्य रूप से शैनन सूचकांक और चाओ 1 सूचकांक शामिल हैं, और सांख्यिकीय परीक्षण विलकॉक्सन परीक्षण का उपयोग करता है; पीसीओए

समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करने के लिए एनोसिम का उपयोग करके प्रिंसिपल कोऑर्डिनेट एनालिसिस (पीसीओए) किया गया; समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर वाली प्रजातियों को प्राप्त करने के लिए LEfSe का विश्लेषण करने के लिए LEfSe का उपयोग किया गया। माइक्रोटेक एलायंस के बायोइनक्लाउड प्लेटफ़ॉर्म (https://www.bioincloud.tech) टूल का उपयोग करके बायोइन्फ़ॉर्मेटिक्स विश्लेषण किया गया।

2.8 सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी माप डेटा को igh̅± 𝑠 के रूप में वर्णित किया गया है। डेटा के लिए जो सामान्य वितरण का पालन करता है और भिन्नता परीक्षण की समरूपता को संतुष्ट करता है, भिन्नता का एक-कारक विश्लेषण उपयोग किया जाता है। अन्यथा, गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग किया जाता है। डेटा का सांख्यिकीय रूप से SPSS 24.0 का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है।<0.05 means the difference is statistically significant.