मानव हाइपरट्रॉफिक स्कार फाइब्रोब्लास्ट में ट्रांसफ़ॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर - P1 / Smads सिग्नलिंग पाथवे पर फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड का प्रभाव

मानव हाइपरट्रॉफिक निशान फ़ाइब्रोब्लास्ट में ट्रांसफ़ॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर - p1 / Smads सिग्नलिंग पाथवे पर फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड का प्रभाव

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[सार]उद्देश्य परिवर्तनकारी वृद्धि कारक के आधार पर - pl (TGF - pl) / Smads सिग्नलिंग पाथवे के प्रभावों की जांच करने के लिएफेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्ससेसिस्टैंच ट्यूबुलोसा(CPhGs) मानव हाइपरट्रॉफिक निशान फाइब्रोब्लास्ट (HSFbs) और संभावित तंत्र पर। तरीके मार्च से जून 2019 तक नितंब के बाद हाइपरट्रॉफिक निशान वाले 9 मरीजों को भर्ती किया गया। फाइब्रोब्लास्ट्स को हाइपरट्रॉफिक निशान से अलग किया गया और सुसंस्कृत किया गया। मानव हाइपरट्रॉफिक निशान हटा दिए गए थे और फाइब्रोब्लास्ट इन विट्रो में सुसंस्कृत थे। रिक्त समूह, मॉडल समूह, सकारात्मक नियंत्रण समूह (TGF - pl plus 5 - fluorouracil) और प्रयोगात्मक समूह (TGF - pl plus CPhGs) स्थापित किए गए थे। इसके प्रभावफेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्ससेसिस्टैंच ट्यूबुलोसासेल काउंटिंग किट {{0}} (CCK - 8) परख द्वारा HSFbs के प्रसार पर विभिन्न सांद्रता का पता लगाया गया। Smad2, Smad3, Smad7, कोलेजन I (COL -1) और कोलेजन HI (COL -3) mRNA की अभिव्यक्ति का पता वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस - पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT - qPCR) द्वारा लगाया गया था। प्रत्येक समूह। पश्चिमी सोख्ता द्वारा Smad2, Smad3, फॉस्फोराइलेटेड Smad2 (p - Smad2), फॉस्फोराइलेटेड Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 और COL {{2 0}} प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया। मापन डेटा को माध्य ± मानक विचलन (माध्य ± एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था। एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके कई समूहों की तुलना की गई। परिणाम 60, 90, और 48 घंटे के लिए 120 मिलीग्राम/ली पर सीपीएचजी के साथ उपचार के बाद फाइब्रोब्लास्ट की अवरोध दर (36.87 ±0.06) प्रतिशत बनाम (43.52 ±0.04) प्रतिशत बनाम (78.11 ±0.03) थी प्रतिशत , F मान =45.070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="" <="" 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

{{0}}.04 ± 0.04, F मान=14.780, P < {{21="" }}.05)="" ;="" पश्चिमी="" सोख्ता="" परिणामों="" से="" पता="" चला="" है="" कि="" प्रायोगिक="" समूह="" और="" सकारात्मक="" नियंत्रण="" समूह="" में="" p-smad2="" और="" p="" -smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3="" की="" प्रोटीन="" अभिव्यक्ति="" मॉडल="" समूह="" की="" तुलना="" में="" काफी="" कम="" थी,="" और="" smad7="" प्रोटीन="" की="" अभिव्यक्ति="" मॉडल="" समूह="" (0.="" 16="" ±="" 0.03="" बनाम="" 0.="" 11="" ±="" 0.02="" बनाम="" 0.06="" ±="" 0.{{}="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" थी।="" 26}}),="" (0.="" 12="" ±="" 0.02="">

{{0}}.07 ± 0.{{10}}1 बनाम 0.04 ±{ {18}}। {{2 0}} 1, एफ मान =7 .670, पी <0.05), (0.12 ± 0.03 बनाम 0.15 ± 0.06 बनाम 0.23 土 0.05, एफ मान { {24}}.936, पी<0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="" <="" 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[कुंजी शब्द] फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्ससेसिस्टैंच ट्यूबुलोसा; हाइपरट्रॉफिक निशान फाइब्रोब्लास्ट; ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर - pl/Smads सिग्नलिंग पाथवे

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हाइपरट्रॉफिक स्कारिंग (एचएस) त्वचा की एक फाइब्रोटिक बीमारी है, जो फाइब्रोब्लास्ट्स (एफबीएस) के अत्यधिक प्रसार के साथ-साथ बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जमाव की विशेषता है, जो निशान गठन के लिए मुख्य सक्षम कोशिकाएं हैं, बड़ी मात्रा में कोलेजन का स्राव कर सकती हैं, और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (TGF) - P / Smads सिग्नलिंग पाथवे HS के गठन से निकटता से संबंधित है।सिस्टांचेएक पारंपरिक टॉनिक पारंपरिक चीनी दवा है, जिसका अर्क फेनिलएथेनॉइड एसिटिक एसिड टोटल (cphgs) औषधीय प्रभाव डालने वाले मुख्य तत्वों में से एक है और विभिन्न जैविक कार्यों जैसे कि सूजन-रोधी, एंटी-ट्यूमर, एंटी-रेडिएशन, फ्री रेडिकल स्कैवेंजिंग है। , आदि अध्ययनों से पता चला है कि cphgs हेपेटिक स्टेलेट सेल प्रसार को रोक सकता है, और यह Smad2, Smad3 की अभिव्यक्ति को कम करके ऐसा कर सकता है, Smad7 की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर tgf-p / Smads सिग्नलिंग पाथवे ट्रांसडक्शन को अवरुद्ध करता है और फिर प्रगति में देरी करता है यकृत फाइब्रोसिस से। इस अध्ययन का उद्देश्य TGF PL / Smad सिग्नलिंग मार्ग पर आधारित मानव हाइपरट्रॉफिक स्कार फाइब्रोब्लास्ट (hsfbs) से संबंधित जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर प्रभाव का निरीक्षण करना था।

सामग्री और तरीके

1. सामग्री:सिस्टांचेcphgs को हेचेन फार्मास्युटिकल बायोटेक कं, लिमिटेड, हेटियन, चीन से खरीदा गया था; भ्रूण गोजातीय सीरम क्लार्क बायोसाइंस, यूएसए से खरीदा गया था; सेल काउंटिंग किट टीजीएफ पीएल को पेप्रो टेक, यूएसए से खरीदा गया था; प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर किट तकारा कॉर्पोरेशन, जापान से खरीदी गई थी; रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट सभी थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए से खरीदे गए थे; Smad2 / 3, p-Smad2 / 3 एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग तकनीक, यूएसए से खरीदे गए थे; Smad7, COL -1, COL -3, ग्लिसराल्डिहाइड -3- फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (गैप-डीएच) के एंटीबॉडी अबीम (यूके) से खरीदे गए थे; पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली मिलिपोर, यूएसए से खरीदी गई थी।

2. सभी मामलों को ऑर्थोपेडिक्स विभाग, झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल से चुना गया था, और तीन नमूने (जिनमें से सभी को निश्चित रूप से पैथोलॉजी द्वारा हाइपरट्रॉफिक निशान के रूप में निदान किया गया था) को एफबीएस की प्राथमिक संस्कृति के लिए यादृच्छिक रूप से चुना गया था; इस प्रयोग को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल (अनुमोदन संख्या 20170214-71) की चिकित्सा नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और रोगियों और उनके परिवारों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

3. Cell grouping: randomly divided into blank group; Model group: 5 |ug / L TGF - & 1; Positive control: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Experimental group: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 मिलीग्राम / एल) cphgso।

4. सेल प्रसार सेल काउंटिंग किट (CCK-8) द्वारा निर्धारित किया गया था: लॉगरिदमिक विकास चरण में hsfbs लिया गया था, प्रत्येक समूह से कोशिकाओं को डिजाइन के रूप में माना गया था, और प्रत्येक समूह के प्रत्येक कुएं के अवशोषण मूल्य की क्रमिक रूप से निगरानी की गई थी 24, 48 और 72 घंटों में एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम तरंग दैर्ध्य।

5. RT qPCR द्वारा mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाना: 48 घंटे के हस्तक्षेप के बाद प्रत्येक समूह से hsfbs एकत्र किए गए, RNA निकाला गया और mRNA अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की गई।

6. प्रोटीन की अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रत्येक समूह से उपचार के 48 घंटे बाद कुल सेलुलर प्रोटीन निकाला गया।

7. सांख्यिकीय विधियाँ: सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर SPSS 22.0 का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया था, और माप डेटा को माध्य ± मानक विचलन (माध्य ± SD) के रूप में व्यक्त किया गया था, और विचरण के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग तुलना के लिए किया गया था। कई समूहों, और P <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया।

परिणाम

सेल प्रसार परिणामों से पता चला है कि फ़ाइब्रोब्लास्ट पर 6 0, 9 {{1 0}}, और 120 मिलीग्राम/एल cphgs 48 घंटे के लिए, निषेध दर [(36.87 ± 0.06) प्रतिशत: (43.52) ±0.04) प्रतिशत :(78.11 ±0.03) प्रतिशत, एफ=45.073,पी< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

प्रत्येक समूह में CoL-I, COL-3, Smad2 और Smad3 mRNA अभिव्यक्ति की तुलना: मॉडल समूह की तुलना में, सकारात्मक नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह दोनों ही परिवर्तनकारी वृद्धि कारक को कम कर सकते हैं - प्रेरित CoL-I, COL{{ 6}}, Smad2, और Smad3 mRNA अभिव्यक्ति, और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतरों के साथ Smad7 mRNA अभिव्यक्ति को बढ़ावा देते हैं। (1.56 ±0.01:0. 30 ± 0.25: 0.21 ±0.04,F=39. 755, पी<0.01; 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01;="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ;2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ;0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

प्रत्येक समूह में p-Smad2, p-smad3, col-l, COL -3 की तुलना: रिक्त समूह की तुलना में, मॉडल समूह में p-Smad2, col-l की प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि Smad7 कम हो गया; मॉडल समूह की तुलना में, सकारात्मक नियंत्रण समूह p-smad3, COL -1, COL -3 की प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम कर सकता है, और प्रयोगात्मक समूह ने p- की उन्नत प्रोटीन अभिव्यक्ति पर एक निरोधात्मक प्रभाव दिखाया। Smad2, p-smad3, col - 3। COL -3 अभिव्यक्ति को विभिन्न डिग्री तक बाधित किया गया था, जबकि Smad7 की अभिव्यक्ति दो समूहों में अपेक्षाकृत बढ़ गई थी, और p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL {{27 के प्रोटीन अभिव्यक्ति मान }} रिक्त समूह में, सकारात्मक नियंत्रण समूह और प्रयोगात्मक समूह थे (0.{{30}}9 ±0.04,{ {38}}.16 ±{{40}}.03,0.11 ± 0.{{50}}2 ,0.06 ± 0.00),(0.07 ±0.03,0.12 ± 0.02,0.07 ± 0.01,0. 04 ±0. 01,F { {60}}। 670, पी<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05,="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01),(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02,="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

बहस

एच एस ऊतक की मरम्मत का एक अनिवार्य परिणाम है, और इसकी घटना तंत्र मुख्य रूप से एफबीएस हाइपरप्रोलिफरेशन, अपर्याप्त गिरावट और इतने पर एच एस के गठन और विकास के लिए नेतृत्व करता है। Tgf-p1 व्यापक रूप से सेलुलर, ऊतक असामान्य प्रसार और विभेदन रोगों में शामिल है और घाव भरने के दौरान जारी रहता है; यह मुख्य रूप से tgf-p / Smads सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से अपना प्रभाव डालता है, जिसमें Smad2 / 3 प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन से इंट्रासेल्युलर और बाह्य कोशिकीय फाइब्रोजेनिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, कोलेजन उत्पादन को बढ़ावा देता है, और फाइब्रोसिस की प्रगति को तेज करता है; Smad7, एक नकारात्मक नियामक के रूप में, सक्रिय tgf-p1 रिसेप्टर्स के साथ बातचीत के माध्यम से इस मार्ग को रोक सकता है, जिससे कोलेजन फाइबर संश्लेषण को कम किया जा सकता है; इस प्रकार या तो Smad7 अभिव्यक्ति बढ़ाना या Smad2 / 3 अभिव्यक्ति को रोकना हाइपरट्रॉफिक निशान विकास को रोक सकता है।

इस अध्ययन ने Cistanche cphgs को HS, एक त्वचा फाइब्रोटिक रोग पर लागू किया, और पाया कि cphgs की विभिन्न खुराकों ने tgf-p1 द्वारा प्रेरित hsfbs के प्रसार को रोक दिया; इसके अलावा, 90m और / L cphgs ने Smad7 अभिव्यक्ति को बढ़ावा देकर और जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों स्तरों पर Smad2 / 3 अभिव्यक्ति को कम करके मार्ग संकेतन को बाधित किया, और CoL-I, COL -3 उत्पादन को कम किया, जो बदले में HS प्रगति को बाधित करता है। हमारे परिणामों ने पुष्टि की कि cphgs ने tgf-p1 उत्तेजना के तहत tgf-p / Smads सिग्नलिंग मार्ग से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति में हस्तक्षेप करके कोलेजन उत्पादन को रोक दिया। वर्तमान अध्ययन के परिणामों ने प्रदर्शित किया कि सिस्टैन्च cphgs ने tgf-p / Smads सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से हाइपरट्रॉफिक निशान फ़ाइब्रोब्लास्ट के प्रसार और प्रभावी रूप से कोलेजन स्राव को कम कर दिया।