डेल्फिनिडिन के एंटी-एंजियोजेनिक प्रभावों की वृद्धि जब छोटे एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं भाग 1 के भीतर encapsulated

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सारांश:(1) पृष्ठभूमि: एंथोसायनिन डेल्फिनिडिन इन विट्रो और विवो एंजियोजेनेसिस मॉडल दोनों में एंटी-एंजियोजेनिक गुणों को प्रदर्शित करता है। हालांकि, विवो डेल्फिनिडिन में खराब रूप से अवशोषित होता है, इस प्रकार इसकी मामूली जैव उपलब्धता और स्थिरता इसके एंटी-एंजियोजेनिक प्रभावों को कम करती है। वर्तमान कार्य डेल्फिनिडिन की स्थिरता और प्रभावकारिता दोनों को बढ़ाने के लिए छोटे एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका (ईवी) गुणों का लाभ उठाता है। जब एसईवी में encapsulated, delphinidin मानव महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (HAoECs) पर एंजियोजेनेसिस के विभिन्न चरणों को रोकता है। (2) विधियाँ: अपरिपक्व डेंड्राइटिक कोशिकाओं से एसईवी का उत्पादन किया गया था और डेल्फिनिडिन के साथ लोड किया गया था। यूएचपीएलसी-एचआरएमएस पर आधारित एक विधि को एसईवी के भीतर डेल्फिनिडिन मेटाबोलाइट्स का आकलन करने के लिए लागू किया गया था। प्रसार परख, नाइट्रिक ऑक्साइड (नहीं) उत्पादन, और Matrigel परख HAoECs में मूल्यांकन किया गया. (3) परिणाम: डेल्फिनिडाइन, 3-ओ-β-रुटिनोसाइड, और पियोनिडिन -3-गैलेक्टोसाइड दोनों डेल्फिनिडिन और डेल्फिनिडिन-लोडेड एसईवी में पाए गए थे। इस प्रकार, SEV-लोड डेल्फिनिडिन एंजियोजेनेसिस के विभिन्न चरणों पर प्रभाव डालता है। (4) निष्कर्ष: एसईवी को एंजियोजेनेसिस से संबंधित बीमारियों को लक्षित करने के लिए डेल्फिनिडिन को वितरित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में माना जा सकता है, जिसमें कैंसर और अतिरिक्त संवहन से जुड़े विकृति शामिल हैं।

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खोजशब्दों: डेल्फिनिडिन; एंडोथेलियल कोशिकाएं; एंजियोजेनेसिस; छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं; कैंसर; हृदय रोग

1. परिचय

पॉलीफेनोल्स मुख्य रूप से पौधे-व्युत्पन्न खाद्य पदार्थों और पेय पदार्थों में पाए जाते हैं और पौधे के खाद्य पदार्थों का स्वाद और रंग प्रदान करते हैं। इसके अलावा, महामारी विज्ञान के अध्ययनों ने पॉलीफेनोल्स में समृद्ध आहार से जुड़े हृदय जोखिम और कैंसर में अधिक कमी की सूचना दी है [1-3]।

डेल्फिनिडिन (2-(3,4,5-ट्राइ-हाइड्रॉक्सीफेनिल)क्रोमनिलियम-3,5,7-ट्राइओल) एक एंथोसायनिन है जिसे पिगमेंटेड सब्जियों और फलों, विशेष रूप से जामुन और लाल अंगूर में बहुतायत से पहचाना जाता है। हमने पहले बताया था कि डेल्फिनिडिन के पास इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता और टायरोसिन किनेसेस के सक्रियण की वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए रेड वाइन पॉलीफेनोलिक यौगिकों के कुल अर्क के रूप में एक ही औषधीय प्रोफ़ाइल है, जिससे एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ईआरओ) उत्तेजना के बाद एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) उत्पादन होता है [4]। इसके अलावा, हमने बताया कि ईआरओ के माध्यम से डेल्फिनिडिन एक इम्युनोमोड्यूलेटरी और विरोधी भड़काऊ अणु के रूप में कार्य करता है जो कार्डियोवैस्कुलर जोखिम कारकों वाले रोगियों में टी लिम्फोसाइट प्रसार और भेदभाव को बदल सकता है [5]।

अंत में, हमने प्रदर्शित किया कि डेल्फिनिडिन एंटी-एंजियोजेनिक गुणों को प्रदर्शित करता है, दोनों इन विट्रो और विवो एंजियोजेनेसिस मॉडल में, और मेलेनोमा [6-10] के विवो ट्यूमर विकास में कम हो जाता है। दरअसल, डेल्फिनिडिन साइक्लिन डी 1- और ए-निर्भर मार्गों [6,7] की भागीदारी के माध्यम से एंडोथेलियल सेल प्रसार को रोकता है। हमने डेल्फिनिडिन द्वारा एकेटी मार्ग के माध्यम से वीईजीएफ-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस के निषेध और इसके एंटी-एंजियोजेनिक प्रभाव [8] के बीच एक संभावित संबंध की भी सूचना दी। इसके अलावा, डेल्फिनिडिन विशेष रूप से एंडोथेलियल सेल प्रसार पर कार्य करके विवो में मेलेनोमा ट्यूमर कोशिकाओं के ट्यूमर के विकास को कम करता है। इस तंत्र का तात्पर्य वीईजीएफआर 2 सिग्नलिंग, एमएपीके, पीआई 3 के माध्यम से वीईजीएफ-प्रेरित प्रसार के निषेध और सीआरईबी / एटीएफ 1 कारकों पर प्रतिलेखन स्तर पर, और फोस्पोडीटेरेस 2 के निषेध के बीच एक संबंध है। सबसे दिलचस्प बात यह है कि डेल्फिनिडिन की उच्च खुराक ने एंजियोजेनेसिस के एक इन विवो मॉडल में नियोवैस्कुलराइजेशन को कम कर दिया, जो ऊरु धमनी स्नायुबंधन के चूहे के मॉडल का उपयोग करके इस्केमिया द्वारा ट्रिगर किया गया था [10]। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि डेल्फिनिडिन एक आशाजनक यौगिक है जो हृदय संबंधी विकारों और विकृति से जुड़े रोगों को रोकने के लिए है।

हालांकि, डेल्फिनिडिन कुल रेड वाइन पॉलीफेनोल अर्क की तुलना में इन लाभकारी प्रभावों को प्रेरित करने के लिए कम शक्तिशाली है, विशेष रूप से एंडोथेलियम-निर्भर नो-मध्यस्थता वासोडिलेशन [11] को प्रेरित करने में। दरअसल, डेल्फिनिडिन प्रकाश-संवेदनशील और केवल पीएच पर स्थिर है<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

ऐसी समस्याओं को दूर करने के लिए एक रणनीति एक दवा वितरण प्रणाली के रूप में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (ईवीएस) का उपयोग है। हमने हाल ही में पाया कि ईवी, जिसमें बड़े और छोटे ईवी (एसईवी) शामिल हैं, विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बे गुणों से उत्पन्न नैनोस्ट्रक्चर हैं, जो शास्त्रीय नैनो-फॉर्मूलेशन की सीमाओं पर काबू पाते हैं। एसईवी अस्थिरता और इम्युनोजेनेसिटी को कम करते हैं, जैव उपलब्धता में सुधार करते हैं और चयनात्मकता को लक्षित करते हैं [13]। कुछ रिपोर्टों को पॉलीफेनोल्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं द्वारा जारी ईवी के सुरक्षात्मक प्रभावों को कम स्कोर किया जाता है। दरअसल, करक्यूमिन के साथ इलाज की गई कोशिकाओं से एमआईआर -21 से समृद्ध एसईवी ने ट्यूमर सेल विकास और एंजियोजेनेसिस को कम कर दिया, एंडोथेलियल पारगम्यता को सही किया, और विभिन्न कैंसर सेल लाइनों की सेल व्यवहार्यता को कम कर दिया [14]। इसके अलावा, एपिगैलोकैटेचिन गैलेट के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं से एमआईआर -16-समृद्ध एसईवी ने ट्यूमर के विकास को दबा दिया [15]।

Cistanche प्रतिरक्षा में सुधार कर सकते हैं

वर्तमान अध्ययन में, हमने मानव महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएओईसी) का उपयोग करके डेल्फिनिडिन.सेव-लोड डेल्फिनिडिन प्रेरित एंजियोजेनेसिस निषेध की स्थिरता और प्रभावकारिता दोनों को बढ़ाने के लिए एसईवी गुणों का लाभ उठाया। इन ईवी के भीतर चयापचयों के संदर्भ में डेल्फिनिडिन सामग्री भी निर्धारित की गई थी।

2. सामग्री और तरीके

2.1.सेल संस्कृति

HAoECs (प्रोमोसेल, हीडलबर्ग, जर्मनी) को एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम एमवी 2 (प्रोमोसेल) में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सुसंस्कृत किया गया था, जो 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट क्वेंटिन फैलवियर, फ्रांस) के साथ पूरक था। कोशिकाओं को 70/80% संगम पर ट्रिप्सिनाइज़ किया गया था और सभी प्रयोगों के लिए मार्ग 3 और 6 के बीच उपयोग किया गया था।

JAWS II डेंड्राइटिक सेल लाइन को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (CRL-1194) से खरीदा गया था; ATCC; मानसस, वीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)। JAWS II कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर उगाया गया था, अल्फा न्यूनतम आवश्यक माध्यम (लोन्ज़ा) से बना एक पूर्ण संस्कृति माध्यम में; बेसल, स्विट्जरलैंड) जिसमें राइबोन्यूक्लियोसाइड्स और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड्स होते हैं और 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (गिबको, लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ पूरक होते हैं; ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए), 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन (लोन्ज़ा), 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट (लोन्ज़ा), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलिन / -स्ट्रेप्टोमाइसिन, सिग्मा-एल्ड्रिच) और 5ng / mL मुरीन जीएम-सीएसएफ (मिल्टेनेयी बायोटेक); सैन डिएगो, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)। कोशिकाओं को 70/80% संगम पर ट्रिप्सिनाइज़ किया गया था और सभी प्रयोगों के लिए मार्ग 8 और 16 के बीच उपयोग किया गया था।

2.2.sEVIsolation

JAWS II कोशिकाओं को एक पूर्ण विकास माध्यम में एक T175 सेल संस्कृति फ्लास्क में 5×10 ° कोशिकाओं के घनत्व पर बीज दिया गया था, और वे किसी भी अलगाव से पहले FBS में भूखे हैं। सेल माध्यम को क्रमशः कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 300×g और 2000×g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। परिणामी supernatant बड़े EVs को बाहर करने के लिए 30 मिनट के लिए 20,000× g पर centrifuged किया गया था। supernatant 200,000×g (Optima MAX-XP ultracentrifuge और MLA-50 रोटर, Beckman Coulter, Villepinte, फ्रांस) पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था 2h के लिए sEVs पैलेटाइज़ करने के लिए। फिर, एसईवी को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41.8 mM, pH = 7.4) में धोया गया था और 2 घंटे के लिए 200,000×g पर recentrifuged। अंत में, sEVpellets PBS के 1 मिलीलीटर में resuspended थे और बाद के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। एसईवी की मात्रा लोरी की विधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी, जिसमें गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ मानक.एसईवी का उपयोग 10 यूजी / एमएल पर किया गया था।

2.3. डेल्फिनिडिन लोड हो रहा है

डेल्फिनिडिन को 10 यूजी / एमएल की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 0.1% डीएमएसओ के साथ पीएच = 2 पर पानी में तैयार किया गया था। एसईवी को जोड़ा गया था (2 मिलीग्राम), और समाधान को हिलाया गया था और फिर 10 मिनट के लिए भंवर किया गया था। 200,000×g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के 2 ज के बाद, प्राप्त गोली को 0.1% डीएमएसओ या पीबीएस के 1 एमएल में पुनर्गठित किया गया था। डेल्फिनिडिन अवशोषण को 530 एनएम पर मापा गया था, और मुक्त डेल्फिनिडिन के विभिन्न सांद्रता (0.1 से 10 यूजी / एमएल) के साथ एक मानक वक्र किया गया था। एसईवी के लोडिंग की प्रभावकारिता का प्रतिशत 9% था, स्वतंत्र रूप से डेल्फिनिडिन की एकाग्रता का उपयोग किया गया (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इस प्रकार, डेल्फिनिडिन की मात्रा को 10 μg / mL sEVs के भीतर वांछित एकाग्रता (0.1 से 5 ug / mL) प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था। मुक्त डेल्फिनिडिन को हटाने के लिए, इन पुटिकाओं को दो बार धोया गया था।

2.4. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)

sEV नमूनों बाँझ NaCl0.9% में पतला कर रहे थे, और आकार वितरण NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, ब्रिटेन) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। वीडियो रिकॉर्ड किए गए थे। NTA सॉफ़्टवेयर ने स्टोक्स-एनस्टीन समीकरण का उपयोग करके आकार वितरण निर्धारित किया।

2.5. संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी

एसईवी को पहली बार 0.1 एम पीबीएस में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड (एलएफजी डिस्ट्रीब्यूशन, ल्यों, फ्रांस) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर तय किया गया था। फिर, एसईवी को पीबीएस में 100,000×जी सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा दो बार धोया गया था 70 मिनट के लिए एसईवी को कॉपर ग्रिड पर 2 मिनट के लिए जमा किया गया था और 30 सेकंड के लिए 20 μL यूरेनिल एसीटेट 5% (इथेनॉल 50% में पतला) के साथ नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था। ग्रिड को तब एक Jeol JEM 1400 माइक्रोस्कोप (Jeol, Croissy sur Seine, France) के साथ देखा गया था, जो 120 keV पर संचालित था।

2.6. एसईवी के भीतर डेल्फिनिडिन मेटाबोलाइट्स का निर्धारण

नमूना तैयारी इस प्रकार थी: 250 μL मेथनॉल (MeOH) को पीबीएस में पुनर्गठित 10μg एसईवी में जोड़ा गया था, और नमूनों को 20 मिनट के ultrasonication के अधीन किया गया था। MeOH के दो सौ uL को आगे जोड़ा गया था, और नमूनों को सेंट्रीफ्यूज (10,000× जी, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और एक miVac जोड़ी कंसंट्रेटर (जिनेवाक लिमिटेड, इप्सविच, यूके) में वाष्पित किया गया था। सूखे निकालने को 200 μL LC-MS ग्रेड पानी के साथ पुनर्गठित किया गया था जिसमें 1% फॉर्मिक एसिड था। मिश्रण को अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस तरल क्रोमैटोग्राफी से पहले दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन (10,000× जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के अधीन किया गया था, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-एचआरएमएस) विश्लेषण के लिए युग्मित था ताकि सटीक द्रव्यमान माप के साथ डेल्फिनिडिन मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण किया जा सके।

क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण को एक Kinetex@ 1.7 μm XB C18,150×2.1 मिमी कॉलम के साथ इसी SecurityGard C18 कॉलम (Phenomenex) के साथ प्राप्त किया गया था। मोबाइल चरणों में चैनल ए में एचओ और चैनल बी में एसिटोनिट्राइल शामिल थे, दोनों में 0.1% फॉर्मिक एसिड था। क्षालन ढाल (A: B, o / ø) निम्नानुसार था: 2 मिनट के लिए प्रारंभिक स्थितियों को 95: 5 पकड़ो, इसके बाद 6 मिनट की अवधि में 95: 5 से 0: 100 तक एक रैखिक ढाल, 3 मिनट के लिए 0: 100 पर पकड़ो, प्रारंभिक स्थितियों में 95: 5 पर लौटें और इन स्थितियों को 3.5 मिनट के लिए रखें। 0.300 mL/min की एक स्थिर प्रवाह दर का उपयोग किया गया था; इंजेक्शन की मात्रा 10 μL थी।

पूर्ण स्कैन और लक्षित सिम द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को सकारात्मक आयनीकरण मोड में अधिग्रहित किया गया था, जिसमें रिज़ॉल्यूशन 70,000 पूर्ण चौड़ाई का उपयोग करके आधा अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर 3 × 10 डिग्री आयनों के स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य और 200 एमएस के अधिकतम आयन इंजेक्शन समय (आईटी) के साथ। डेटा-निर्भर एमएस / एमएस प्रयोगों को 'Top5 के डेटा-निर्भर मोड में प्राप्त किया गया था।

साहित्य में रिपोर्ट किए गए मेटाबोलाइट्स [16-18] की निगरानी की गई थी: डेल्फिनिडिन, एल्डे-हाइड, फ्लोरोग्लूसिनोल एल्डिहाइड, गैलिक एसिड, चाल्कोन, पेटुनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, पेटुनिडिन-3-अरबिनोसाइड, पेटुनिडिन 3-ओ-रुटिनोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फ β िनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-β गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड, डेल्फिनिडिन-3-गैलेक्टोसाइड,

दैनिक उपकरण अंशांकन पियर्स LTO Velos ESI सकारात्मक / नकारात्मक अंशांकन किट के जलसेक द्वारा किया गया था के रूप में निर्माता द्वारा सिफारिश की. Xcalibur 2.2 सॉफ्ट-वेयर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग डेटा अधिग्रहण के लिए किया गया था, और ट्रेसफाइंडर 3.0 सॉफ्टवेयर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) को डेटा प्रोसेसिंग के लिए नियोजित किया गया था।

2.7. सेल व्यवहार्यता परख

1 ×104 एचएओईसी को 96-अच्छी तरह से प्लेट पर सीड किया गया था और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था और डेल्फिनिडिन (1 से 10 यूजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था। फिर, 5 μg / mL 3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- टेट्राज़ोलियम (MTS अभिकर्मक, Promega, WI, USA) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था और 120 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। अवशोषण को 490 एनएम पर एक CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, जर्मनी) स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापा गया था।

2.8. प्रसार परख

प्रसार assays CyQUANT सेल प्रसार परख किट (Invitrogen, Carlsbad, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) निर्माता की सिफारिशों के अनुसार का उपयोग कर आयोजित किए गए थे. संक्षेप में, 1.5 × 10 * कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेट में बीज दिया गया था। कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए सीरम-भूखे रखा गया था और फिर डेल्फिनिडिन, देशी एसईवी या एसईवी के साथ अलग-अलग सांद्रता में डेल्फिनिडिन के साथ लोड किया गया था। इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ धोया गया था, और एक डाई-बाइंडिंग समाधान जोड़ा गया था। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लेट रीडर (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, जर्मनी) 485 एनएम उत्तेजना और 530 एनएम उत्सर्जन के लिए फिल्टर के साथ प्रतिदीप्ति माप के लिए इस्तेमाल किया गया था।

2.9.NO उत्पादन Assaty

HAoECs को 8-अच्छी तरह से स्लाइड (Ibidi, Gräfelfing, जर्मनी) पर 3×104 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (यानी, 3×104 कोशिकाओं / सेमी²) की दर से माध्यम के 300 μL में बीज दिया गया था। 70-80% संगम पर, कोशिकाओं को डेल्फिनिडिन, देशी एसईवी या सेव-लोड डेल्फिनिडिन के साथ 24 घंटे के लिए उत्तेजित किया गया था। एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उपयोग एक सकारात्मक नियंत्रण (10 μM, सिग्मा-एल्ड्रिच) के रूप में किया गया था ताकि NO के उत्पादन को प्रोत्साहित किया जा सके। 24 घंटे के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम को हटा दिया गया था, और डायमिनोफ्लोरोसीन डायसीटेट (डीएएफ -2 डीए) जांच को जोड़ा गया था (30 मिनट के लिए 5 μM, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए)। फिर, कुओं को पीबीएस के साथ धोया गया था। कोशिकाओं को पैराफॉर्मेल्डिहाइड (4%, 20 मिनट) के साथ तय किया गया था। प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी (Zeiss, जेना, जर्मनी, LSM700) द्वारा पढ़ा गया था। चार चित्रों का अधिग्रहण किया गया था, और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया गया था।

2.10.Matrigel परख

HAoECs Matrigel के साथ लेपित कुओं में बीज थे (Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich के मुरीन सारकोमा के एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स का जेल)। संक्षेप में, तरल Matrigel के 10 μL एक 15-अच्छी तरह से Ibidi μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस प्लेट (lbidi) के प्रत्येक कुएं में रखा गया था और फिर एक जेल बनाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए incubated। HAoECs को तब 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर बीज और इनक्यूबेट किया गया था, 45 मिनट के लिए या तो डेल्फिनिडिन, देशी एसईवी या एसईवी-लोड डेल्फिनिडिन के साथ उपचार से पहले, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर 12 से 14 एच की इनक्यूबेशन थी। "केशिका जैसी संरचनाओं" का गठन एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (ओलंपस सीके 40) के साथ देखा गया था। छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करके केशिका जैसी संरचनाओं की संख्या को मापकर परिमाणीकरण किया गया था।

2.11. सांख्यिकीय विश्लेषण

परिणामों को SEM के ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। समूहों के बीच अंतर का महत्व विचरण (एनोवा) के विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, इसके बाद टुकी के कई तुलनात्मक-आइसोन्स परीक्षण किया गया था। का p-मान<0.05 were="" considered="">

3. परिणाम

3.1.sEV लक्षण वर्णन और डेल्फिनिडिन की लोडिंग

साहित्य के साथ समझौते में, एसईवी के भीतर लोड डेल्फिनिडिन ने पुटिकाओं के आकार में परिवर्तन को प्रेरित नहीं किया, 118.7± 2.9 और 111.7± 1.8एनएम के लिए खाली एसईवी और डेल्फिनिडिन-लोडेड एसईवी के लिए क्रमशः, जैसा कि नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (चित्रा 1 ए) द्वारा निर्धारित किया गया है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण (चित्रा 1 बी) द्वारा पुष्टि की गई है। इसके अलावा, दोनों प्रकार के एसईवी, देशी और डेल्फिनिडिन के साथ लोड किए गए, समान स्तरों (चित्रा 1 सी) पर एलिक्स, सीडी 63 और टीएसजी 101 जैसे एक्सोसोमल मार्करों को व्यक्त किया, जबकि उन्होंने बड़े ईवी एस का एक मार्कर, एक्टिन व्यक्त नहीं किया।

चित्र 1. एसईवी का लक्षण वर्णन। (ए) एनटीए मापों के आधार पर डेल्फिनिडिन के साथ लोड किए गए देशी एसईवी और एसईवी का आकार वितरण। (B) प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी देशी एसईवी और डेल्फिनिडिन के साथ लोड किए गए एसईवी की छवि। स्केल बार = 100 एनएम. (सी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण एलिक्स, सीडी 63, टीएसजी 101, और डेल्फिनिडिन के साथ लोड किए गए एसईवी और एसईवी में π-एक्टिन की अभिव्यक्ति को दर्शाता है।

यह लेख पोषक तत्व 2021, 13, 4378 से निकाला गया है। https://doi.org/10.3390/nu13124378