इन विट्रो और विवो पार्ट 2 में प्रोसायनिडिन के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव और तंत्र

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3. चर्चा

कई अध्ययनों से पता चला है कि पीसी मजबूत रेडिकल-स्कैवेंजिंग और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों का प्रदर्शन करते हैं ]25-27I, और आरओएस के अत्यधिक उत्पादन और/या एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणाली की हानि के कारण होने वाला ऑक्सीडेटिव तनाव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [ -6,28,29]। हालांकि, ऑक्सीडेटिव क्षति के संबंध में पीसी के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव और तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। इसलिए, इस अध्ययन ने न्यूरोप्रोटेक्शन में पीसी के प्रभाव और तंत्र पर शोध किया।

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वर्तमान अध्ययन में, पीसी की उपयुक्त सांद्रता ने जीएसएच-पीएक्स, कैट और एसओडी सहित एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों के स्तर में सुधार किया, लेकिन अकेले एच, ओ का उपयोग करके माप की तुलना में ऑक्सीडेटिव क्षति के मॉडल में आरओएस और एमडीए के स्तर में कमी आई। ये वर्तमान निष्कर्ष पिछले अध्ययनों के अनुरूप थे, जिसमें सुझाव दिया गया था कि आहार के माध्यम से एक कम पीसी पूरक जीएसएच-पीएक्स, कैट और एसओडी की गतिविधियों में सुधार कर सकता है [30]। एक अन्य अध्ययन ने यह भी सुझाव दिया कि पीसी ने कैट और एसओडी गतिविधियों में काफी वृद्धि की और एमडीए सामग्री में कमी की, इस प्रकार बकरी के शुक्राणु की गुणवत्ता में सुधार हुआ [31]।

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

Nrf2/ARE पाथवे एक महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट मार्ग है [32-34]। आम तौर पर, Nrf2 साइटोप्लाज्म में रहता है, जहां यह निरोधात्मक प्रोटीन, Keap135,36] से बंधा होता है। H2O2 उत्तेजना पर, Nrf2 Keap1 से अलग हो जाता है, अंतर्जात एंटीऑक्सीडेंट रक्षा प्रणाली शुरू करता है, और बाद में नाभिक [34,37,38] में स्थानांतरित हो जाता है। इसके बाद यह जीसीएलसी, जीसीएलएम, एनओओ1 और एचओ-139,40] सहित सेल-सुरक्षात्मक और एंटीऑक्सीडेंट जीन की एक श्रृंखला को सक्रिय करने के लिए ARE के साथ इंटरैक्ट करता है। ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में, H-O2 उत्तेजना के दौरान देखे गए परिवर्तनों के समान, Nrf2 साइटोसोल में Keap1 से अलग हो जाता है और फिर नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है, क्रायोप्रोटेक्टिव जीन [41,42] के प्रतिलेखन को सक्रिय करने के लिए ARE अनुक्रम के लिए बाध्य होता है। हमने देखा कि पीसी की उपयुक्त सांद्रता ने पीसी12 कोशिकाओं में एच, ओ 2-घाव की स्थिति के तहत एनआरएफ 2 के परमाणु स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, पीसी की उपयुक्त सांद्रता ने NOO1, HO -1, GCLM, और GCLC के अभिव्यक्ति स्तरों को स्पष्ट रूप से विनियमित किया, जो सभी सीधे मुक्त कणों और ऑक्सीडेटिव अणुओं को खत्म करने के लिए कार्य कर सकते हैं [43]। इसलिए, इन परिणामों से पता चला है कि पीसी की उपयुक्त सांद्रता ने Nrf2 / ARE पाथवे के स्तर को बढ़ा दिया है। इसके बाद, Nrf2 siRNA के माध्यम से Nfr2 जीन साइलेंसिंग का उपयोग Nrf2 की भूमिका का आकलन करने के लिए किया गया था / H, O 2- प्रेरित ऑक्सीडेटिव क्षति के खिलाफ पीसी की मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्शन में सक्रियण हैं। Nrf2-siRNA- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ने Nrf2 अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी का संकेत दिया। इसके साथ ही, हमने पाया कि Nrf2 नॉकआउट ने H2O के खिलाफ पीसी-मध्यस्थता संरक्षण को समाप्त कर दिया, सेल व्यवहार्यता में इलाज की हानि, और Nrf2 नॉकआउट ने पीसी के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव को भी समाप्त कर दिया। ये निष्कर्ष पिछले अध्ययन के अनुरूप थे जिसमें सुझाव दिया गया था कि Nrf2 / ARE पाथवे की सक्रियता में सुधार से न्यूरोप्रोटेक्शन में योगदान होता है [44]। इसलिए, वर्तमान परिणामों से संकेत मिलता है कि Nrf2 / ARE पाथवे न्यूरोडीजेनेरेशन की रोकथाम के लिए पीसी के औषधीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

4. सामग्री और तरीके 4.1। रसायन और अभिकर्मक

H2O2 को HUSHI (HUSHI, शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। CCK-8, NAC को Beyotime (Beyotime, शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। PC, 2', 7/-dichlorofluorescein diacetate, MDA, GSH-Px, SOD डायग्नोस्टिक किट, और CAT डायग्नोस्टिक किट Solarbio (Solarbio, बीजिंग, चीन) से खरीदे गए थे। RNAi Plus, प्राइमस्क्रिप्ट RT अभिकर्मक किट gDNA इरेज़र के साथ, और SYBR प्रीमिक्स एक्स टैग II तकरा (तकरा, शिगा, जापान) से खरीदे गए थे। Nrf 2-siRNA, control-siRNA, और lipofectamine 2000 GenePharma (GenePharma, शंघाई, चीन) से प्राप्त किए गए थे। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी और संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी प्रोटीनटेक (प्रोटीनटेक, वुहान, चीन) से प्राप्त किए गए थे: एनआरएफ 2, एचओ -1, जीसीएलसी, जीसीएलएम, एनएडी (पी) एच: एनक्यूओ 1, लैमिन बी, और जीएपीडीएच।

4.2. कोश पालन

PC12 कोशिकाओं को प्रमाणित सेल संस्कृतियों के राष्ट्रीय संग्रह से प्राप्त किया गया था। कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 यू/एमएल; 100 यूजी/एमएल） के साथ 37 डिग्री पर 5% सीओ2 के साथ पूरक डीएमईएम माध्यम में बनाए रखा गया था।

4.3. सेल व्यवहार्यता परख

PC12 कोशिकाओं को 1 × 104 कोशिकाओं / कुओं के घनत्व पर 96-वेल प्लेट्स में डाला गया। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पीसी या एनएसी μ20 μM） के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में लाया गया था, जिसके बाद उन्हें 24 घंटे के लिए H2O2 के 200 μM के साथ ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में 10 μLof CCK -8 घोल डाला गया और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, जिसके बाद अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया।

4.4. मछली रखरखाव

पशु उपयोग के लिए नैतिक अनुमोदन झेजियांग विश्वविद्यालय (ZJU20200125) में प्रायोगिक पशु केंद्र की पशु संरक्षण और उपयोग समिति द्वारा प्रदान किया गया था। वयस्क जेब्राफिश (डैनियो रेरियो, एबी स्ट्रेन) को झेजियांग विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु केंद्र से प्राप्त किया गया था और 14/10-एच प्रकाश/अंधेरे चक्र [21जे] के तहत 28 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। मछलियों को दिन में दो बार आर्टेमिया नौपली खिलाया जाता था। भ्रूण पैदा करने के लिए, वयस्क जेब्राफिश को रात भर प्रजनन टैंकों में 1:1, नर: मादा अनुपात में रखा गया था। अगली सुबह बत्तियां बुझने के बाद 2 घंटे के भीतर स्पॉनिंग शुरू हो गई। भ्रूण के पानी में भ्रूण को 28 डिग्री [45] पर उठाया गया था।

4.5. आरओएस मापन

विवो में आरओएस उत्पादन को मापने के लिए, जेब्राफिश लार्वा (एबी स्ट्रेन), 3 दिनों के बाद निषेचन pdf） को एनएसी（30 μM） या पीसी के विभिन्न सांद्रता में एच, ओ के 300 माइक्रोन की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 4 के लिए उजागर किया गया था। दिन। इसके बाद, 7 पीडीएफ़ पर, विभिन्न उपचार समूहों को एक 24-वेल प्लेट (प्रति समूह 10 जेब्राफिश लार्वा) में स्थानांतरित कर दिया गया, जिसे 2',7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट समाधान के 20 यूएम के साथ इलाज किया गया, और 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। 28.5 डिग्री सेल्सियस [46] पर अंधेरा। इसके बाद, अतिरिक्त 2'7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट को हटाने के लिए लार्वा को भ्रूण माध्यम से तीन बार धोया गया। सना हुआ लार्वा तब एक ओलिंप लेजर-स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा और imaged किया गया था। प्रत्येक व्यक्तिगत लार्वा की फ्लोरोसेंट तीव्रता छवि] सॉफ्टवेयर के माध्यम से निर्धारित की गई थी।

ROS उत्पादन को मापने के लिए इन विट्रो में, PC12 कोशिकाओं को 2×10* कोशिकाओं/कुओं के घनत्व पर 6-वेल प्लेट्स में रखा गया था। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पीसी या एनएसी (20 यूएम) के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया गया और फिर 24 घंटे के लिए एच ओ 200 यूएम के साथ ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए अंधेरे में 2', 7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट समाधान के 10 माइक्रोन के साथ ऊष्मायन किया गया था; उसके बाद, डाई के घोल को हटा दिया गया, और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा में तीन बार धोया गया। कोशिकाओं को तब एक ओलिंप लेजर-स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा और चित्रित किया गया था। कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता छवि] सॉफ्टवेयर के माध्यम से निर्धारित की गई थी।

4.6. एमडीए, जीएसएच-पीएक्स, एसओडी और सीएटी का आकलन

Zebrafish लार्वा AB स्ट्रेन） at3 pdf को एनएसी 30 μM） या पीसी के विभिन्न सांद्रता में 4 दिनों के लिए 300 uM H2O की अनुपस्थिति या उपस्थिति में उजागर किया गया था। 7 डीपीएफ जेब्राफिश को टेट्राकाइन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया और बर्फ पर इच्छामृत्यु के बाद समरूप बनाया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एमडीए, जीएसएच-पीएक्स, कैट और एसओडी का एक साथ विश्लेषण किया गया। प्रत्येक प्रयोग में 20 लार्वा थे, और प्रत्येक मापा सूचकांक को तीन प्रतियों में दोहराया गया था।

PC12 कोशिकाओं को 2 × 10 * कोशिकाओं / कुओं के घनत्व पर 6-वेल प्लेट्स में डाला गया। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पीसी या एनएसी (20 यूएम) के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में लाया गया था और फिर 24 घंटे के लिए एच 2 ओ के 200 यूएम के साथ ऊष्मायन किया गया था। PC12 कोशिकाओं को अगली बार एकत्र किया गया और lysis बफर के साथ जोड़ा गया। प्रत्येक निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, संबंधित परख किट का उपयोग करके एमडीए, जीएसएच-पीएक्स, एसओडी और कैट गतिविधियों को मापा गया। प्रत्येक मापा सूचकांक को तीन प्रतियों में दोहराया गया था।

4.7. टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और क्वांटिटेटिव रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

Zebrafish लार्वा AB स्ट्रेन） at3 dpf को 4 दिनों के लिए H, O के 300 uM की अनुपस्थिति या उपस्थिति में NAC-30 μM） या पीसी के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में लाया गया था। उपचार के बाद, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए RNAiso का उपयोग करके RNA निकाला गया। निर्माता के निर्देशों (तकरा, शिगा, जापान) का पालन करते हुए आरएनए को जीडीएनए इरेज़र के साथ प्राइमस्क्रिप्ट आरटी किट का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसकोड किया गया था। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर एक एप्लाइड बायोसिस्टम्स वी -7 के साथ किया गया था SYBR Premix Ex TaqII -actin का उपयोग करके रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम को एक संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2- AACt का उपयोग करके की गई थी। तरीका। उपयोग किए गए प्राइमर अनुक्रम तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।

4.8. Nrf2 siRNA अभिकर्मक

Nrf2-siRNA का उपयोग Nrf2 को पछाड़ने के लिए किया गया था। PC12 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में रखा गया था और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार, लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके Nrf 2-siRNA (80 nM) या नियंत्रण-siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था।

4.9. संपूर्ण-कोशिका, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु प्रोटीन की तैयारी

पूरे सेल प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और बर्फ पर 30 मिनट के लिए 1 प्रतिशत PMSF और 1 प्रतिशत प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल युक्त RIPA lysis बफर के साथ ऊष्मायन किया गया। सेल lysates centrifuged थे, और सतह पर तैरनेवाला एकत्र और संग्रहीत किया गया था। उपकोशिकीय विभाजन की तैयारी के लिए, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन निष्कर्षण किट का उपयोग करके सेल के नमूनों को संसाधित किया गया था। बीसीए परख का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री को परख लिया गया। 4.10.पश्चिमी सोख्ता

विभाज्य प्रोटीन के नमूनों को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया और पॉलीविनाइलिडीन-डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। तब धमाकों को निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया था: Nrf2, Keapl, HO -1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, या GAPDH। झिल्ली को तब 5 मिनट के लिए TBST से धोया गया था; यह 5 बार दोहराया गया था। इसके बाद, पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में धमाकों को ऊष्मायन किया गया। अंत में, ईसीएल-प्लस वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करके प्रोटीन बैंड की कल्पना की गई।

4.11.लोकोमोटर व्यवहार परख

Zebrafish लार्वा AB स्ट्रेन） 3 pdf पर NAC（30 μM） या पीसी के विभिन्न सांद्रता में 4 दिनों के लिए H O के 300 μM की अनुपस्थिति या उपस्थिति में उजागर किया गया था। इसके बाद, 7 पीडीएफ़ पर, इन उपचारित लार्वा को 24-वेल प्लेट्स (एक मछली प्रति कुएं और 12 लार्वा प्रति समूह) में चढ़ाया गया। हमने जेब्राफिश लार्वा के लोकोमोटर व्यवहार को मापने के लिए एनी-भूलभुलैया 4.73 का उपयोग किया, और 10 मिनट [47] में यात्रा की गई कुल दूरी की गणना की।

4.12.सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में दिखाया गया है। सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए विचरण (ANOVA) और डंकन के बहु-श्रेणी परीक्षणों का एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया गया था, और अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता था जब p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5। निष्कर्ष

निष्कर्ष में, वर्तमान निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि पीसी Nrf2 / ARE पाथवे और इसके डाउनस्ट्रीम डिटॉक्सिफिकेशन एंजाइम और एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम को सक्रिय करके न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव डालते हैं। एक साथ लिया गया, पीसी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों पर सुरक्षात्मक प्रभाव डाल सकता है।

लेखक योगदान:संकल्पना, जेसी और जेजेड। (जियाजिन झू); कार्यप्रणाली, जे.सी.; सॉफ्टवेयर, वाईसी; सत्यापन, YZ।, JZ (जियावेन झाओ) और HY; औपचारिक विश्लेषण, जे.सी.; जांच, वाईसी; संसाधन, जेजेड (इयाजिन झू); डेटा क्यूरेशन, जेसी; लेखन- मूल मसौदा तैयार करना, जे.सी.; लेखन-समीक्षा और संपादन, JZ.(iajin Zhu); विज़ुअलाइज़ेशन, जेसी; पर्यवेक्षण, डीएल; परियोजना प्रशासन, जेजेड (जियाजिन झू); फंडिंग अधिग्रहण, जेजेड (जियाजिन झू)। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और सहमत हैं।

वित्त पोषण:इस शोध को कोई बाहरी वित्त पोषण नहीं मिला।

संस्थागत समीक्षा बोर्ड का वक्तव्य:अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था, और झेजियांग विश्वविद्यालय (ZJU20200125) में प्रायोगिक पशु केंद्र की पशु संरक्षण और उपयोग समिति की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सूचित सहमति वक्तव्य: लागू नहीं।

डेटा उपलब्धता विवरण:डेटा लेख के भीतर निहित है। हितों के टकराव: लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

नमूना उपलब्धता: यौगिकों के नमूने लेखकों से उपलब्ध नहीं हैं।

यह लेख अणु 2021, 26, 2963 से निकाला गया है।