गॉसिपिट्रिन, एक प्राकृतिक रूप से पाया जाने वाला फ्लेवोनोइड, आयरन-प्रेरित न्यूरोनल और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को कम करता है: भाग 2

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2.5. गोस-फे (आई) कॉम्प्लेक्स डिटेक्शन

उपरोक्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए एक प्रशंसनीय परिकल्पना यह है कि गोस Fe (ll) के साथ एक क्षणिक परिसर बनाता है जो ऑक्सीजन द्वारा इसके ऑक्सीकरण की सुविधा प्रदान करता है। यह संक्रमणकालीन परिसर अपने इलेक्ट्रॉनों को Fe () - साइट्रेट की तुलना में अधिक आसानी से वितरित कर सकता है, जिससे Fe (Ill) के साथ अधिक स्थिर परिसर उत्पन्न होता है। चित्र 6क 276, 332 और 380 एनएम (काली रेखा) पर अधिकतम अवशोषण के साथ गोस का एक विशिष्ट स्पेक्ट्रम दिखाता है। Fe () के जोड़ ने अधिकतम अवशोषण चोटियों में एकाग्रता-निर्भर गिरावट और 500 एनएम (चित्रा 6ए) के पास एक नए की उपस्थिति को प्रेरित किया। गोस स्पेक्ट्रम से उत्पन्न होने वाले स्पेक्ट्रा की एक सरणी की घटना की पुष्टि iso =405 एनएम (ब्लैक डॉट्स देखें) पर एक आइसोस्बेस्टिक बिंदु की उपस्थिति से की गई थी, जो मुक्त और जटिल गोस के बीच एक रासायनिक संतुलन (जटिलता) का संकेत देता है। इनसेट (चित्रा 6ए)स्टोइकोमेट्री 2:1(गोस-आयरन) के साथ एक कॉम्प्लेक्स के गठन को दर्शाता है। ऐसे गोस-लौह परिसरों का स्टोइकोमेट्री अय्यूब की विधि द्वारा निर्धारित किया गया था जो 0.5 के दाढ़ अनुपात पर एक ब्रेकिंग पॉइंट दिखाता है।

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आयरन और गोस के बीच सहसंबंध पर और सबूत आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा 6बी) द्वारा प्राप्त किए गए थे। फ्री गो और इसके लौह परिसर के लिए, 3000-4000 सेमी-की सीमा में स्थित ब्रॉडबैंड को हाइड्रोजन का खिंचाव माना जाता था- जल के अणुओं की उपस्थिति के कारण बंधित हाइड्रॉक्सिल समूह। मुक्त गोस का v(C=O) स्ट्रेचिंग मोड 1654 cm-I पर होता है, जिसे 1636 cm-Iupon जटिल गठन की ओर स्थानांतरित कर दिया गया है। यह परिणाम बताता है कि Fe(Ⅱ) कार्बोनिल ऑक्सीजन [31] से सहसंबद्ध है। इसके अलावा, 630 सेमी-आई पर वी (फे-ओ) खिंचाव कंपन की उपस्थिति लौह-गोस परिसर के गठन की पुष्टि करती है, क्योंकि फ्री गोस इस तरह के बैंड को प्रदर्शित नहीं करता है।

चित्रा 6. (ए) गोस यूवी-विज़ स्पेक्ट्रम (200-600 एनएम) पर Fe (II) का प्रभाव। 125 मिमी सुक्रोज, 65 मिमी KCl, 1 0 मिमी HEPES बफर (पीएच 7.2), 2 मिमी साइट्रेट, और गोस 1.6 माइक्रोन युक्त ऊष्मायन मिश्रण। ऊपर से नीचे के निशान Fe（I） की सांद्रता थी {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96, और 1.12 μM.Inset∶ गोस-फे-द्वितीय-परिसर के लिए जॉब का प्लॉट एक स्थिर कुल एकाग्रता Fe（D）】 प्लस 【Gos】=1.6 μM पर। काला बिंदु समस्थानिक बिंदु को इंगित करता है। नीचे और ऊपर के तीर क्रमशः 380 और 500 एनएम पर अवशोषण मूल्यों में कमी और वृद्धि का संकेत देते हैं। प्रयोग 28 डिग्री पर आयोजित किए गए। स्कैन की गति 2nm/sA थी बेसलाइन को ऊष्मायन मिश्रण प्लस 1.6 μM Fe-I）.（B-इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रा ऑफ़ Gos और Gos-Fe-I） के साथ स्थापित किया गया था। विशिष्ट उदाहरण दिखाए गए हैं।

2.6. एस्कॉर्बेट द्वारा गोस प्रिवेंटेड Fe(III) रिडक्शन

गोस द्वारा प्रचारित लौह की फेरिक अवस्था एक प्रशंसनीय एंटीऑक्सीडेंट तंत्र का प्रतिनिधित्व करती है क्योंकि यह Fe (II) की उत्प्रेरक गतिविधि में बाधा डालती है। फिर भी, एस्कॉर्बेट जैसे प्राकृतिक कम करने वाले एजेंटों द्वारा Fe (III) को फिर से अपने लौह रूप में कम किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध Fe (II) के साथ जैविक प्रणालियों को पुनः लोड कर सकता है, जो फेंटन-हैबर-वीस प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है, जिससे अत्यंत प्रतिक्रियाशील · OH कट्टरपंथी उत्पन्न होता है। इन संभावनाओं की जांच करने के लिए, हमने 2 मिमी एस्कॉर्बेट और विभिन्न Fe-II） सांद्रता के साथ इलाज किए गए गोस समाधान （100 μM से Fe-II） गठन के स्तर को मापने के लिए 1,10-फेनेंथ्रोलाइन का उपयोग किया।{{6} } μM）। चित्र 7 से पता चलता है कि Gos की अनुपस्थिति ने Fe(II) से Fe(II) की अधिकतम कमी दर (5.85×10-3 की ढलान वाली काली रेखा) की अनुमति दी; हालाँकि, इस प्रक्रिया को गोस (1- मिनट ऊष्मायन, हरी रेखा) की उपस्थिति से धीमा कर दिया गया था, और गोस के साथ ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद, एस्कॉर्बेट द्वारा Fe (I) की कमी दर लगभग 3 गुना कम हो गई (लाल रेखा) 2.04× 10-3) के ढलान के साथ। यह परिणाम एस्कॉर्बेट-मध्यस्थता Fe () को Fe (I) में कमी को रोकने के लिए Gos की क्षमता को दर्शाता है।

चित्रा 7. गोस चूहे के जिगर माइटोकॉन्ड्रिया की अनुपस्थिति में एस्कॉर्बेट द्वारा Fe (ⅢI) - कमी को रोकता है। प्रायोगिक स्थितियां: 125 एमएम सुक्रोज, 65 एमएम केसीएल, 10 एमएम हेप्स बफर (पीएच 7.2), 1 एमएम साइट्रेट, गोस 100μM। प्रयोग 28 डिग्री पर आयोजित किए गए। एस्कॉर्बेट 4 एमएम） और 5 एमएम 1, 10- फेनेंथ्रोलाइन को गोस-फे (आई) ऊष्मायन के 1 मिनट या 5 मिनट के बाद जोड़ा गया था। रेखाएँ तीन परखों की प्रतिनिधि हैं।

2.7. गोस प्रोटेक्ट करता है 2-डीऑक्सीराइबोज ऑक्सीडेटिव डिग्रेडेशन

मुक्त कणों के बजाय लोहे पर अधिमान्य रूप से कार्य करने के लिए गोस की क्षमता का दस्तावेजीकरण करने के लिए, लोहे से 2.8 या 28 मिमी 2-डीऑक्सीराइबोज की रक्षा करने में गोस और दो ·ओएच मैला ढोने वालों (डीएमएसओ और सैलिसिलेट) की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिस्पर्धा अध्ययन किए गए थे। -मध्यस्थ ऑक्सीडेटिव क्षति (चित्र 8)। 20 मिमी पर ओएच मैला ढोने वालों ने 28 मिमी की रक्षा की 2-डीऑक्सीराइबोज 2.8 मिमी से काफी कम2-डीऑक्सीराइबोज (पी)<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

चित्रा 8. एफई (द्वितीय) -ईडीटीए प्लस एस्कॉर्बेट द्वारा प्रेरित 2.8 या 28 मिमी 2- ऑक्सीडेटिव क्षति पर गोस और · ओएच मैला ढोने वाले डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) और सैलिसिलेट का प्रभाव। समाधान 37 डिग्री पर 3 0 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था और इसमें 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7.2), 2- डीऑक्सीराइबोज (2.8or 28 मिमी）, 150 माइक्रोन ईडीटीए, और 50 माइक्रोन Fe（ⅢI） शामिल थे। . 2 मिमी की अंतिम सांद्रता के लिए एस्कॉर्बेट के अतिरिक्त द्वारा प्रतिक्रियाएं शुरू की गईं। बार शो का अर्थ है ± एसडी (एन =3)। नियंत्रण में केवल डीएमएसओ (0.001 प्रतिशत) होता है, जो गोस नमूनों में विलायक एकाग्रता है। *p . के लिए एक-पुच्छीय t-परीक्षण का प्रयोग किया गया<0.05, n.s.,="">

3. चर्चा

इस्केमिक और रक्तस्रावी स्ट्रोक सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के तहत जारी किया गया लोहा, मस्तिष्क के लोहे के होमियोस्टेसिस के विनियमन को उत्तेजित करता है, जिससे तंत्रिका संबंधी चोट [4,32-34] का पैथोफिज़ियोलॉजी होता है। उप-कोशिकीय स्तरों पर, माइटोकॉन्ड्रियल हानि लोहे की मध्यस्थता वाले न्यूरोनल मौत [10,15, 35-38] में शामिल होती है। प्रीक्लिनिकल साक्ष्य सभी प्रकार के स्ट्रोक [7,16] सहित न्यूरोडीजेनेरेशन के खिलाफ आयरन केलेटर्स, मुख्य रूप से डेफेरोक्सामाइन मेसाइलेट का उपयोग करने के लाभ का समर्थन करता है। हालांकि, उनकी उच्च लागत और अनुपलब्धता, और शास्त्रीय लौह chelators के प्रतिकूल प्रभावों की विस्तृत श्रृंखला ने डायहोमोस्टेसिस [39,40] में लौह प्रबंधन के लिए प्राकृतिक केलेटर्स का उपयोग किया है।

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

गोस की सुरक्षात्मक क्रिया एचटी-22 कोशिकाओं और चूहे-मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया पर लोहे/साइट्रेट मिश्रण से इनक्यूबेट की गई है, जहां हमें लौह-प्रेरित ऑक्सीडेटिव क्षति के खिलाफ मजबूत सुरक्षा मिली है। माउस हिप्पोकैम्पस एचटी -22 लोहे के अधिभार (24 एच) के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने व्यवहार्यता में कमी दिखाई, जो कि प्रारंभिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित अपव्यय और एटीपी कमी (चित्रा 2 ए-सी, क्रमशः) के साथ निकटता से जुड़ा था। इससे पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल हानि न्यूरोनल घातकता में योगदान करती है। दरअसल, हमारी शर्तों के तहत, न्यूरॉन्स पर अपलोड किए गए Fe (II) के कम से कम एक हिस्से के ऑर्गेनेल तक पहुंचने की उम्मीद है, क्योंकि लोहे से प्रेरित न्यूरोनल मौत माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के नुकसान से पहले हुई थी। इसलिए, यह दिखाया गया है कि लोहे का अधिभार माउस हिप्पोकैम्पस एचटी -22 कोशिका मृत्यु और माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन [41,42] को प्रेरित करता है। इसी तरह, निरंतर लोहे के संपर्क से डोपामिनर्जिक न्यूरोब्लास्टोमा SHSY5Y कोशिकाओं [43] में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस स्तर बढ़ जाता है। इसके अलावा, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में एक व्यापक लौह प्रवाह, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल क्षति, 100 uM लौह लौह [36] के संपर्क के बाद सत्यापित किया गया था। यहां हमने देखा कि लोहे से प्रभावित हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता का गो-प्रेरित संरक्षण उनकी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और एटीपी स्तरों के संरक्षण से निकटता से संबंधित है।

अक्षुण्ण कोशिकाओं के रूप में, लौह लोहे के प्रत्यक्ष माइटोकॉन्ड्रियल एक्सपोजर ने ऑर्गेनेल की व्यापक सूजन, झिल्ली क्षमता का अपव्यय, और एटीपी (क्रमशः चित्रा 3 ए-सी) की हानि को उकसाया। इस प्रयोगात्मक सेटिंग में, गोस की रक्षा करने में सक्षम था लौह-अतिभारित माइटोकॉन्ड्रिया, जो उपर्युक्त मापदंडों के संरक्षण द्वारा व्यक्त किया गया था। इस अर्थ में, यह देखा गया है कि माइटोकॉन्ड्रिया लोहे के माइक्रोमोलर सांद्रता से भरे हुए माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने और Y अपव्यय को इस तरह से लोड करता है जो लौह केलेशन के प्रति संवेदनशील है लेकिन उत्प्रेरक एंटीऑक्सीडेंट क्रिया पर निर्भर नहीं है|44]। दिलचस्प बात यह है कि मिटो-टेम्पो एंटीऑक्सिडेंट को माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड ऑयन रेडिकल को परिमार्जन करके और माइटोकॉन्ड्रियल रूपात्मक अखंडता और झिल्ली क्षमता [36] को संरक्षित करके हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में लोहे के अधिभार क्षति से बचाने के लिए सूचित किया गया था। हमने हाल ही में इस फ्लेवोनोइड के एंटीऑक्सीडेंट प्रभावों और रासायनिक हाइपोक्सिया-प्रेरित मौत [29] के खिलाफ पीसी 12 कोशिकाओं की रक्षा करने की क्षमता का वर्णन किया है, जहां यह निष्कर्ष निकाला गया था कि गोस की मुक्त कट्टरपंथी सफाई और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता लोहे की मध्यस्थता के खिलाफ सुरक्षा में आंशिक रूप से शामिल है। एचटी -22 और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति। हालांकि, लोहे की मध्यस्थता वाले लिपोपरोक्सीडेशन बनाम टर्टब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड-मध्यस्थता वाले लिपोपरोक्सीडेशन (क्रमशः चित्रा 4ए, बी,) के खिलाफ गोस की बेहतर प्रभावकारिता दृढ़ता से सुझाव देती है कि लोहे से प्रेरित क्षति के खिलाफ इसकी लौह-अंतःक्रियात्मक क्षमता मुख्य तंत्र है।

Gos-Fe इंटरैक्शन को आगे बढ़ाने के लिए, कई सेल-फ्री और माइटोकॉन्ड्रिया-मुक्त प्रयोग किए गए। हमने देखा कि जब पॉलीफेनोल को Fe (II) के साथ सह-ऊष्मायन किया गया था, तो धातु आयनों की सांद्रता में गिरावट आई थी, जबकि ऑक्सीजन की खपत दर (चित्रा 5ए-सी) में इसी तरह की वृद्धि हुई थी। इन प्रभावों से पता चलता है कि गोस साइट्रेट कॉम्प्लेक्स से Fe (II) को हटा देता है, और इसे एक फेरिक रूप में एक प्रक्रिया में ऑक्सीकरण करता है जिसके लिए इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में O2 की आवश्यकता होती है। नतीजतन, गोस Fe (II) एकाग्रता में गिरावट को बढ़ावा देता है जो फेंटन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स में बाधा उत्पन्न कर सकता है। चूंकि Gos-Fe (II) कॉम्प्लेक्स प्रासंगिक कम करने वाले एजेंटों जैसे एस्कॉर्बेट के ऑक्सीकरण को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप Fe (II) का निर्माण / उत्थान होता है, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि Gos Fe (II) की एस्कॉर्बेट-मध्यस्थता में कमी को रोकता है। फे (द्वितीय) के लिए।

गोस लोहे के साथ दृढ़ता से बातचीत करने वाली परिकल्पना की भी यहां स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों के माध्यम से पुष्टि की गई थी, और पिछले परिणामों की पुष्टि की जहां विभिन्न सरणियों के

गोस-आयरन कॉम्प्लेक्स स्टोइकोमेट्री को इलेक्ट्रॉन स्पिन आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोस्कोपी [45] की विशेषता थी।

इन परिणामों ने लोहे की मध्यस्थता वाले न्यूरोनल क्षति के खिलाफ गोस के सुरक्षात्मक प्रभावों का सबूत दिया, शायद फेरस आयनों के साथ बातचीत करके, उत्प्रेरक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के गठन में इसकी भागीदारी में बाधा। इसके अलावा, यह Fe (Ⅱ) और Gos के बीच एक क्षणिक चार्ज-ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स के गठन का सुझाव देता है, Fe (II) ऑक्सीकरण को तेज करता है और एक अधिक स्थिर Fe (III) -Gos कॉम्प्लेक्स का निर्माण करता है जो प्रसार चरण में भाग नहीं ले सकता है लिपिड का पेरोक्सीडेशन इसके अलावा, एक जैविक रूप से प्रासंगिक कम करने वाला एजेंट जैसे एस्कॉर्बेट, गोस की उपस्थिति में फेरिक आयरन को कम करने में असमर्थ था, फेरस आयन री-साइक्लिंग में शामिल कुछ फ्लेवोनोइड्स की प्रो-ऑक्सीडेंट विशेषता को सीमित करता है। [30]। माइक्रोमोलर सांद्रता पर गोस 2-डीऑक्सीराइबोज के प्री-वेंटिंग आयरन-मध्यस्थता ऑक्सीकरण में शास्त्रीय मैला ढोने वालों की तुलना में अधिक प्रभावी था। इस उच्च प्रभावकारिता को एक रेडॉक्स-सक्रिय गोस-फे (II) / () के गठन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जैसा कि हमने पहले अन्य पॉलीफेनोल्स के लिए देखा था, जो ऑक्सीडेटिव क्षति के इन विट्रो प्रतिमानों में लोहे के साथ उनकी बातचीत पर एंटीऑक्सिडेंट के रूप में उनके प्रदर्शन में सुधार करते थे। 22,46-48].

यह स्थापित किया गया है कि चेलेटिंग एजेंट जिनमें लिगैंड (ऑक्सो लिगैंड, ओ 2-) के रूप में ऑक्सीजन होता है, लोहे को चेलेट कर सकते हैं और Fe (I) के ऑक्सीकरण को बढ़ावा दे सकते हैं, Fe (II) का स्थिरीकरण कर सकते हैं, और परिणामस्वरूप कमी का उत्पादन कर सकते हैं इसकी कम करने की क्षमता49]। शारीरिक पीएच में, कैटेचोल आसानी से फेरिक आयरन के साथ थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर बीआईएस कॉम्प्लेक्स बनाते हैं, जो लिगैंड्स की कम सांद्रता के पक्ष में होते हैं। गोस संरचना में कैटेचोल की उपस्थिति लोहे के साथ एक समान बातचीत तंत्र का सुझाव देती है, जो न्यूरोनल कोशिकाओं और माइटोकॉन्ड्रिया के लोहे से प्रेरित क्षति के खिलाफ प्राप्त सुरक्षा की व्याख्या कर सकती है। इस संबंध में, हमने पहले यह भी प्रदर्शित किया था कि मैंगिफेरिन और गुटीफेरोन ए फेरस आयरन ऑक्सीकरण को उत्तेजित करते हैं और फेरिक आयरन की कमी [23,24, 26-28] में बाधा डालते हैं।

लोहे को चेलेट करने के लिए गोस की क्षमता भी सिग्नलिंग मार्ग को प्रेरित कर सकती है जो न्यूरोप्रोटेक्शन में योगदान करते हैं। उदाहरण के लिए, प्रोलिल हाइड्रॉक्सिलेज़ डोमेन एंजाइम (पीएचडी), शास्त्रीय हाइपोक्सिया इंड्यूसिबल फैक्टर-लाल्फा (एचआईएफ -1 ओ) नॉर्मोक्सिया के तहत हाइड्रॉक्सिलेशन-संशोधित एंजाइम, को आयरन केलेटर्स के महत्वपूर्ण लक्ष्यों के रूप में पहचाना गया है जो कई में चिकित्सकीय रूप से फायदेमंद हैं। तंत्रिका संबंधी विकार [50,51]। यह समझ में आता है क्योंकि पीएचडी एक युग्मन कारक के रूप में द्विसंयोजक लोहे पर निर्भर करता है [52]। कई जीन जो न्यूरोप्रोटेक्शन में शामिल हैं, उन्हें HIF-la द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जैसे कि eNOS, VEGF, और EPO[53]। इसके अलावा, PHD निषेध के परिणामस्वरूप HIF सक्रियण ऑक्सीडेटिव तनाव-मध्यस्थता वाले माइटोकॉन्ड्रियल हानि और एपोप्टोसिस को रोक सकता है, स्वतंत्र रूप से एक प्रतिलेखन कारक [54] के रूप में इसकी भूमिका।

फेरोप्टोसिस, हाल ही में लोहे पर निर्भर विनियमित कोशिका मृत्यु की विशेषता है, को उस तंत्र के रूप में प्रस्तावित किया गया है जिसके माध्यम से रक्तस्रावी क्षति के संपर्क में आने वाले न्यूरॉन्स मर जाते हैं [8]। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन हाल ही में फेरोप्टोसिस सेल डेथ [55] से संबंधित था। इसलिए, फेरोप्टोसिस का निषेध, जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को लोहे की क्षति से बचाता है, गोस द्वारा संरक्षित लोहे की मध्यस्थता वाले न्यूरोलॉजिकल विकारों के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन के लिए एक प्रशंसनीय तंत्र भी हो सकता है, जो आगे ध्यान देने योग्य होगा। लोहे से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेशन के विवो पशु मॉडल में गोस के अनुमानित लाभकारी प्रभावों पर अतिरिक्त शोध किया जाना चाहिए, ताकि इस फ्लेवोनोइड को लोहे के होमियोस्टेसिस डीरेग्यूलेशन से प्रेरित मस्तिष्क ऊतक क्षति के खिलाफ एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में प्रस्तावित किया जा सके।