एडेनो-संबद्ध वायरल वेक्टर तैयारियों में अतिरिक्त-वायरल डीएनए मानव प्लास्मेसीटॉइड डेंड्राइटिक कोशिकाओं में टीएलआर9-निर्भर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है

मानव-व्युत्पन्न एचईके कोशिकाओं या स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपरडा (एसएफ9) कीट कोशिकाओं में उत्पादित एडेनो-जुड़े वायरल (एएवी) वेक्टर निलंबन अवशिष्ट मेजबान सेल घटकों के साथ-साथ एएवी कैप्सिड प्रोटीन पर प्रदर्शित प्रजाति-विशिष्ट पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के संदर्भ में भिन्न होते हैं। . यहां हमने वेक्टर के इम्यूनोजेनिक गुणों पर इन अंतरों के प्रभाव का विश्लेषण किया। हमने विभिन्न निर्माताओं से प्राप्त HEK सेल-निर्मित और Sf9 सेल-निर्मित AAVCMV-eGFP वैक्टर के विभिन्न लॉट के साथ मानव प्लास्मेसीटॉइड डेंड्राइटिक कोशिकाओं को उत्तेजित किया। हमने पाया कि एएवी8-सीएमवी-ईजीएफपी के साथ-साथ एएवी2-सीएमवी-ईजीएफपी वैक्टर ने लॉट-विशिष्ट को प्रेरित किया, लेकिन उत्पादन प्लेटफॉर्म-विशिष्ट या निर्माता-विशिष्ट सूजन साइटोकिन प्रतिक्रियाओं को नहीं। इन्हें टोल-जैसे रिसेप्टर 9 सिग्नलिंग को अवरुद्ध करके या DNase का उपयोग करके वेक्टर लॉट में डीएनए को एंजाइमेटिक रूप से कम करके कम या समाप्त किया जा सकता है। DNase-उपचारित AAV लॉट और DNA विश्लेषण द्वारा सफल HEK सेल ट्रांसडक्शन से पता चला कि DNase ने वेक्टर की अखंडता को प्रभावित नहीं किया, लेकिन अतिरिक्त-वायरल डीएनए को ख़राब कर दिया। हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि HEK- और Sf 9- सेल व्युत्पन्न AAV तैयारियों में इम्युनोजेनिक एक्स्ट्रा-वायरल डीएनए घटक हो सकते हैं जो बहुत-विशिष्ट सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं। इससे पता चलता है कि अतिरिक्त-वायरल डीएनए अशुद्धियों को हटाने के लिए बेहतर रणनीतियाँ एएवी वेक्टर तैयारियों के इम्यूनोजेनिक गुणों को कम करने में सहायक हो सकती हैं।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

पिछले दशक में बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों1-3 दोनों के लिए नए पुनः संयोजक एडेनोएसोसिएटेड वायरस (एएवी)-आधारित रणनीतियों के विकास में भारी रुचि देखी गई है। मुख्य कारण इस तथ्य में निहित है कि एएवी वैक्टर जीन थेरेपी के क्षेत्र में बेहद बहुमुखी उपकरण रहे हैं, जो लक्षित ऊतकों तक चिकित्सीय जीन को कुशलतापूर्वक और सुरक्षित रूप से पहुंचाने की क्षमता रखते हैं। हालाँकि, जांचकर्ताओं की बढ़ती संख्या स्वतंत्र रूप से प्री-क्लिनिकल और क्लिनिकल अध्ययन 5-8 में एएवी की डिलीवरी के बाद स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का सुझाव देने वाले निष्कर्षों की रिपोर्ट करती है।

एएवी वैक्टर को टोल-लाइक रिसेप्टर (टीएलआर)2 और टीएलआर9 जैसे जन्मजात प्रतिरक्षा पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप सूजन संबंधी साइटोकिन्स और टाइप I इंटरफेरॉन (आईएफएन)9,10 जारी होते हैं। एएवी के इम्यूनोजेनिक घटक जो इन प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकते हैं उनमें कैप्सिड प्रोटीन और वेक्टर जीनोम9,10 शामिल हैं। एएवी अनुप्रयोग के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं वेक्टर सस्पेंशन5,11 में अशुद्धियों से भी शुरू हो सकती हैं। इन अशुद्धियों को वांछित उत्पाद12 के अलावा शुद्ध एएवी वेक्टर सस्पेंशन में मौजूद किसी भी घटक के रूप में परिभाषित किया गया है और वेक्टर की उत्पादन प्रक्रिया के परिणामस्वरूप। क्लिनिकल रीकॉम्बिनेंट एएवी वैक्टर के उत्पादन के दो प्रमुख तरीकों में एचईके कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए का ट्रांसफ़ेक्शन और बैकोलुवायरस 13 के साथ स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपरडा (एसएफ 9) कीट कोशिकाओं का संक्रमण शामिल है। तदनुसार, एएवी वेक्टर सस्पेंशन में निहित संभावित इम्युनोजेनिक अशुद्धियों में एंडोटॉक्सिन, सेल कल्चर माध्यम घटक, अभिकर्मक शामिल हो सकते हैं जो एएवी शुद्धि के लिए उपयोग किए जाते हैं, मेजबान कोशिकाओं से प्राप्त प्रोटीन और डीएनए, और अवशिष्ट बैकुलोवायरल डीएनए या प्लास्मिड डीएनए 5 शामिल हो सकते हैं। अतिरिक्त कारक जो एएवी वेक्टर सस्पेंशन की इम्युनोजेनेसिटी को प्रभावित कर सकते हैं, वे विभिन्न वेक्टर उत्पादन प्लेटफार्मों 5 द्वारा कैप्सिड पर अंकित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) हैं। महत्वपूर्ण रूप से, HEK सेल-व्युत्पन्न और Sf9 सेल-व्युत्पन्न AAV वैक्टर उनके PTMs, उनके अवशिष्ट मेजबान सेल प्रोटीन अशुद्धियों11 और संभावित रूप से उनके डीएनए अशुद्धियों (HEK सेल डीएनए बनाम Sf9 सेल डीएनए के साथ-साथ अवशिष्ट प्लास्मिड डीएनए) के संदर्भ में बहुत भिन्न होते हैं। बनाम बैकुलोवायरल डीएनए)14। प्लास्मेसीटॉइड डेंड्राइटिक कोशिकाएं (पीसीडी) एक विशेष जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार हैं जो वायरल संक्रमण9,15 पर बड़ी मात्रा में टाइप I आईएफएन और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का स्राव करती हैं और एएवी वैक्टर9 के संवेदन में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं। तदनुसार, यह विश्लेषण करने के लिए कि क्या एचईके सेल-निर्मित और एसएफ 9- सेल-निर्मित एएवी वैक्टर के बीच अंतर के परिणामस्वरूप उनके इम्युनोजेनिक गुणों में अंतर होता है, हमने दो उत्पादन प्रणालियों से प्राप्त समान एएवी वेक्टर के विभिन्न लॉट के साथ मानव पीडीसी को उत्तेजित किया। और विभिन्न निर्माता। हमने पाया कि आधे वेक्टर लॉट की जांच से लॉट-विशिष्ट प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्राप्त हुईं जो न तो वेक्टर उत्पादन प्रणाली और न ही निर्माता से संबंधित थीं। इन प्रतिक्रियाओं को टीएलआर9 सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थ किया गया था और DNase के साथ वेक्टर लॉट के उपचार के लिए अतिसंवेदनशील थे। अनुपचारित और DNase-उपचारित AAV वेक्टर लॉट और AAV तैयारियों के डीएनए विश्लेषण दोनों द्वारा सफल HEK सेल ट्रांसडक्शन ने सुझाव दिया कि DNase ने AAV कण अखंडता को प्रभावित नहीं किया, बल्कि गैर-एनकैप्सुलेटेड अतिरिक्त-वायरल डीएनए को लक्षित किया। सामूहिक रूप से, इससे पता चलता है कि एएवी वेक्टर तैयारियों में गैर-एनकैप्सुलेटेड अतिरिक्त-वायरल डीएनए हो सकता है जो मानव पीडीसी में एएवी वेक्टर तैयारियों के इम्यूनोजेनिक गुणों को प्रभावित कर सकता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

परिणाम

एएवी मानव पीडीसी में बहुत-विशिष्ट जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है।

अध्ययनों से पता चला है कि एचईके सेल-व्युत्पन्न, और एसएफ9 सेल-व्युत्पन्न, एएवी वैक्टर उनके पीटीएम और वायरल सस्पेंशन11 में निहित अशुद्धियों के संदर्भ में भिन्न हैं। हमने अनुमान लगाया कि इन कारकों के परिणामस्वरूप HEK सेल- और Sf9 सेल-व्युत्पन्न वेक्टर लॉट के बीच इम्युनोजेनिक गुणों में अंतर हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने कुल आठ एएवी सीरोटाइप 8 (एएवी8) वेक्टर लॉट का विश्लेषण किया जिसमें साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर (सीएमवी) के समान डीएनए अनुक्रम और संवर्धित हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (ईजीएफपी) (एएवी 8- के लिए समान ट्रांसजीन शामिल थे। सीएमवी-ईजीएफपी; तीन अलग-अलग निर्माताओं से पांच एचईके- और तीन एसएफ9 सेल-व्युत्पन्न लॉट) और चार एएवी 2- सीएमवी-ईजीएफपी लॉट (दो एचईके- और दो एसएफ9 सेल-व्युत्पन्न लॉट) [निर्माता ए; आयोवा विश्वविद्यालय (आयोवा, यूएसए) की वायरल वेक्टर कोर सुविधा, निर्माता बी; विरोवेक (सीए, यूएसए) और निर्माता सी; विजीन बायोसाइंसेज (एमडी, यूएसए)]। लॉट के बीच समानता को अधिकतम करने के लिए, निर्माता ए और निर्माता बी (तालिका 1) से सात एएवी 8 लॉट एक ही मूल प्लास्मिड का उपयोग करके उत्पादित किए गए थे। इसके अतिरिक्त, एएवी वेक्टर लॉट के वेक्टर जीनोम (वीजी) का एक ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) पंजीकरण दो अलग-अलग लक्ष्यों का उपयोग करके साइड-बाय-साइड माप में किया गया था: एक सीएमवी अनुक्रम के भीतर और दूसरा ईजीएफपी अनुक्रम के भीतर सदिश. सीएमवी लक्ष्य के परिमाणीकरण द्वारा प्राप्त परिणामों का उपयोग निम्नलिखित प्रयोगों (तालिका 1) में एएवी वेक्टर लॉट के अनुमापन के लिए किया गया था। पीडीसी विशेष वायरल सेंसर हैं जो वायरल संक्रमण15 पर एएवी वैक्टर9 सहित बड़े पैमाने पर टाइप I आईएफएन उत्पन्न करते हैं। यह जांचने के लिए कि क्या एचईके-सेल-निर्मित और एसएफ 9- सेल-निर्मित एएवी वैक्टर प्रतिरक्षा सक्षम कोशिकाओं में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने की क्षमता में भिन्न हैं, हमने उपरोक्त सूचीबद्ध एएवी वेक्टर लॉट के साथ मानव पीडीसी को उत्तेजित किया। इस प्रयोजन के लिए, पीडीसी को चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) का उपयोग करके नकारात्मक चयन द्वारा व्यक्तिगत स्वस्थ मानव दाताओं के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से शुद्ध किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने 90% से अधिक पृथक पीडीसी की शुद्धता की पुष्टि की (चित्र एस1)। एक व्यक्तिगत दाता के दस, पीडीसी को 18 घंटे के लिए 1:1× 106 वीजी/सेल के एमओआई पर एएवी8 और एएवी2 वेक्टर लॉट के साथ सीड और उत्तेजित किया गया। 50 यूएल/वेल में कुल 12,500 कोशिकाओं पर लागू 1:106 वीजी/सेल का एमओआई 2.5× 1011 वीजी/एमएल के अनुमापांक में तब्दील हो जाता है। हमने इस टिटर का उपयोग किया क्योंकि यह मनुष्यों (जैसे 1×1012 वीजी/एमएल16 या 4×1011–1.3×1012 वीजी/एमएल17) और गैर-मानव प्राइमेट (जैसे 5×) में रेटिनल जीन थेरेपी अध्ययन में लागू की जाने वाली सीमा के भीतर है। 1011-5 × 1012 वीजी/एमएल6)। वाहन के साथ उत्तेजना ने नियंत्रण का काम किया। AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट के साथ ऊष्मायन के परिणामस्वरूप pDCs में कोई पता लगाने योग्य ट्रांसजीन अभिव्यक्ति नहीं हुई। हालाँकि, आठ AAV8 लॉट में से चार (लॉट A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) और दो चार AAV2 लॉट (लॉट B-Sf9-1, B-Sf9-2) ने उत्तेजित pDCs में प्रतिक्रियाशील कोशिका प्रसार को प्रेरित किया (चित्र 1a)। इसके साथ प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (आईपी {{80 }}, एमआईपी {{81 }}, और टीएनएफ-) और टाइप I आईएफएन (आईएफएन-) का रिलीज हुआ। इसके विपरीत, शेष AAV8 (लॉट्स A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92}) से न तो कोशिका प्रसार हुआ और न ही साइटोकिन रिलीज़ प्रेरित हुआ। }) और AAV2 लॉट (लॉट C-HEK-1, C-HEK-2)। इन परिणामों की पुष्टि एक व्यक्तिगत दाता की कोशिकाओं के साथ किए गए तीन से चार स्वतंत्र प्रयोगों में की गई (चित्र 1ए-सी और तालिका एस1)। इन स्वतंत्र प्रयोगों में साइटोकिन सांद्रता में लॉट-विशिष्ट अंतरों का सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण एक रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल और पोस्ट हॉक डननेट परीक्षण (क्यू {101}}.6) का उपयोग करके विभिन्न एएवी वेक्टर लॉट के न्यूनतम-वर्ग माध्य की तुलना करके किया गया था। वाहन नियंत्रण (टेबल्स S2 और S3)। इसने "इम्यूनोजेनिक" AAV वेक्टर लॉट (AAV8 लॉट A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{) के बीच साइटोकिन प्रतिक्रियाओं में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित किया। {114}}, या एएवी2 लॉट बी-एसएफ9-1, बी-एसएफ9-2 क्रमशः) और नियंत्रण लेकिन "गैर-इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट (एएवी8 लॉट ए-एसएफ{{) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। 123}}, बी-एचईके-1, बी-एसएफ9-1, सी-एचईके-1 या एएवी2 लॉट सी-एचईके-1, सी-एचईके-2 क्रमशः) और नियंत्रण (तालिका S3)। मल्टीप्लेक्स परख में शामिल बाकी मापे गए साइटोकिन्स की सांद्रता या तो परख सीमा से नीचे थी (यानी, आईएल {{136 }} , आईएल {{137 }}, आईएल {{138 }}, आईएल {{139 }} , आईएल {{140 }}, आईएल {{141 }}, आईएल {{142 }}, आईएल {143 }}, आईएल 144 , जीएम-सीएसएफ, आईएफएन- ) या न तो "इम्यूनोजेनिक" और न ही "गैर-इम्युनोजेनिक" वेक्टर लॉट ने उनकी रिहाई में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि प्रेरित की (यानी, आईएल {{148 }}, आईएल {{149 }}, जी-सीएसएफ, एमसीपी {{151 }}) (चित्र एस2), सुझाव देते हुए एएवी-मध्यस्थता साइटोकिन प्रतिक्रिया में विशिष्टता की एक डिग्री। पहले के समय बिंदु पर साइटोकिन प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए, पीडीसी को "इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट ए-एचईके-1 से उत्तेजित किया गया था। हमने पीडीसी उत्तेजना के बाद 2 घंटे पहले ही सतह पर तैरनेवाला में टीएनएफ की एकाग्रता में उल्लेखनीय वृद्धि देखी। इस प्रतिक्रिया पैटर्न की पुष्टि तीन प्रयोगों में की जा सकती है, प्रत्येक प्रयोग एक व्यक्तिगत दाता की कोशिकाओं के साथ किया गया (चित्र S3)। यह जांचने के लिए कि क्या "गैर-इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट की उच्च खुराक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने में सक्षम थी, हमने तकनीकी रूप से अधिकतम लागू एमओआई (1:4.61× 106 वीजी) के साथ पीडीसी को उत्तेजित किया। दिलचस्प बात यह है कि इस बढ़े हुए टिटर (छवि एस 4) के साथ उत्तेजना पर न तो प्रतिक्रियाशील कोशिका प्रसार और न ही साइटोकिन प्रतिक्रियाओं का पता चला। हमारी परिकल्पना के विपरीत, ये परिणाम दर्शाते हैं कि पीडीसी में एएवी के प्रति जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं बहुत-विशिष्ट थीं और किसी विशिष्ट उत्पादन प्रणाली या निर्माता/शुद्धिकरण विधि से संबंधित नहीं थीं।

तालिका 1. इस अध्ययन में विभिन्न प्रकार के AAV8 और AAV2 वायरल वैक्टर का उपयोग किया गया।

चित्र 1. मानव पीडीसी में एएवी वेक्टर लॉट-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरण। मानव पीडीसी को 18 घंटे के लिए एएवी {{2} सीएमवी-ईजीएफपी और एएवी {{4} सीएमवी-ईजीएफपी (एमओआई: 1: 1 × 106 वीजी) के विभिन्न लॉट से उत्तेजित किया गया था (ए) पीडीसी की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को उत्तेजित किया गया था वाहन नियंत्रण (ऊपरी छवि) या एक इम्युनोजेनिक एएवी वेक्टर लॉट (निचली छवि)। स्केल बार 100μm है. (बी) एएवी द्वारा उत्तेजित पीडीसी द्वारा आईपी -10, एमआईपी -1, टीएनएफ-, और आईएफएन - 2 का साइटोकिन रिलीज। (सी) एएवी द्वारा उत्तेजित पीडीसी द्वारा साइटोकिन रिलीज। तीन से चार स्वतंत्र प्रयोगों में से एक के प्रतिनिधि प्लॉट। चूँकि IFN- 2 माप (b,c) और TNF- माप (c) में कुछ मान परख सीमा से नीचे आ गए थे, प्रस्तुति के लिए सभी मापे गए IFN- 2 और TNF- मानों में स्थिरांक 1 जोड़ा गया था अर्ध-लघुगणकीय कथानक में। माध्यिकाएँ और अंतःचतुर्थक श्रेणियाँ दिखाई गई हैं। व्यक्तिगत वेक्टर लॉट के लेबल में तीन निर्माताओं को ए, बी और सी अक्षरों द्वारा दर्शाया जाता है; HEK-सेल व्युत्पन्न और Sf{24}}सेल व्युत्पन्न वैक्टर को "HEK और "Sf9" द्वारा दर्शाया गया है और एक ही निर्माता और समान उत्पादन प्रणाली के संबंधित लॉट को "1, 2, 3" क्रमांकित किया गया है। सर्कल: HEK-व्युत्पन्न वेक्टर लॉट; त्रिकोण: Sf9-व्युत्पन्न वेक्टर लॉट; काला: निर्माता A से वेक्टर लॉट; नारंगी: निर्माता B से वेक्टर लॉट; हरा: निर्माता C से वेक्टर लॉट।

पीडीसी में एएवी उत्तेजना के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कैप्सिड/वीजी अनुपात में अंतर से प्रभावित नहीं होती है।

प्रीक्लिनिकल अध्ययनों से पता चला है कि एएवी वेक्टर सस्पेंशन में पूर्ण और खाली वेक्टर कणों की संख्या में अंतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रभावित कर सकता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या विश्लेषण किए गए वेक्टर लॉट के बीच इम्युनोजेनिक गुणों में अंतर पूर्ण और खाली वेक्टर कणों के अनुपात में अंतर के कारण था, हमने एएवी अनुमापन एलिसा द्वारा सभी एएवी लॉट में वेक्टर कैप्सिड का अनुमापांक निर्धारित किया और कैप्सिड/वीजी की गणना की। अनुपात। दिलचस्प बात यह है कि सभी एएवी लॉट के बीच कैप्सिड/वीजी अनुपात में बड़े अंतर पाए गए (चित्र 2)। वीजी (2:1) की तुलना में लगभग दो गुना अधिक कैप्सिड एएवी में पाए गए। } और एएवी2-सीएमवी-ईजीएफपी बी-एसएफ9-1; और AAV8 लॉट A-Sf9-1 में चार गुना अधिक (4:1)। बाकी लॉट में 1:1 का अनुपात देखा गया। हालाँकि, "इम्यूनोजेनिक" और "नॉन-इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट के कैप्सिड/वीजी अनुपात के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर एएवी8 (पी{{25%).27) में नहीं पाया गया और न ही एएवी2 (पी=0.37) में। वेक्टर लॉट (चित्र 2)। इससे पता चलता है कि विश्लेषण किए गए एएवी वेक्टर लॉट के इम्युनोजेनिक गुणों में अंतर भी पूर्ण और खाली वेक्टर कणों के अनुपात में अंतर से संबंधित नहीं थे।

सिस्टैंच अनुपूरक लाभ-प्रतिरक्षा प्रणाली को कैसे मजबूत करें

टीएलआर9 द्वारा "इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट की पहचान।

यह दिखाया गया है कि म्यूरिन और मानव पीडीसी द्वारा एएवी की जन्मजात प्रतिरक्षा पहचान डीएनए सेंसिंग टीएलआर99 द्वारा मध्यस्थ होती है। तदनुसार, हमने मूल्यांकन किया कि क्या टीएलआर9 भी हमारे "इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट की पहचान में शामिल था। इस प्रयोजन के लिए, पीडीसी को वर्णित के अनुसार बीजित किया गया और टीएलआर9 प्रतिपक्षी एच154 (50 µM) के साथ संवर्धित किया गया, इसके बाद "इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट ए-एचईके-1, ए-एचईके-2, ए के साथ उत्तेजना की गई। -HEK-3, और A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg)। 18 घंटे के बाद, कोशिका प्रसार का कोई सबूत नहीं देखा गया (छवि 3 ए) और आईपी {{20 }}, एमआईपी {{21 }}, टीएनएफ- और आईएफएन- की रिहाई में महत्वपूर्ण कमी मापी गई (छवि 3 ए)। 3बी). यह इंगित करता है कि मानव पीडीसी में "इम्यूनोजेनिक" एएवी8 वेक्टर लॉट के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं टीएलआर9 सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थ होती हैं।

चित्र 2. अलग-अलग एएवी {{1} सीएमवी-ईजीएफपी और एएवी 2- सीएमवी-ईजीएफपी वेक्टर लॉट के बीच कैप्सिड/वीजी अनुपात की तुलना। टी कैप्सिड/वीजी अनुपात (ए) आठ एएवी8 वेक्टर लॉट और (बी) चार एएवी2 वेक्टर लॉट के अवशोषण माप (एलिसा) और डीडीपीसीआर परिणामों से प्राप्त होते हैं। धराशायी रेखाएं "इम्यूनोजेनिक" को "गैर-इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट से अलग करती हैं। बार प्रतिकृतियों के माध्य और मानक विचलन दर्शाते हैं। अयुग्मित छात्र टी-परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था।

चित्र 3. पीडीसी द्वारा "इम्यूनोजेनिक" एएवी8-सीएमवी-ईजीएफपी वेक्टर लॉट की पहचान टीएलआर9 पर निर्भर है। मानव pDCs का इलाज TLR9 प्रतिपक्षी H154 (50 μM) के साथ किया गया, इसके बाद 18 घंटे के लिए "इम्यूनोजेनिक" AAV8 वेक्टर लॉट (MOI: 1:1× 106 vg) के साथ उत्तेजना की गई। (ए) "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट (ऊपरी छवि) या "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट और एच154 (निचली छवि) के साथ इलाज किए गए शुद्ध पीडीसी की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। स्केल बार 100 μm है। (बी) उत्तेजित पीडीसी द्वारा आईपी-10, एमआईपी-1, टीएनएफ-, और आईएफएन- 2 का साइटोकिन रिलीज। चूँकि IFN- 2 माप में, कुछ मान परख सीमा से नीचे आ गए थे, अर्ध-लघुगणकीय प्लॉट में प्रस्तुति के लिए सभी मापे गए IFN- 2 मानों में स्थिरांक 1 जोड़ा गया था। साधन और मानक विचलन दिखाए गए हैं। सांख्यिकीय महत्व एक-तरफ़ा एनोवा और होल्म-सिडक के पोस्ट हॉक विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। पी मान: 0.05 से कम या उसके बराबर: *; 0.01 से कम या इसके बराबर: **; 0.001 से कम या इसके बराबर: ***.

DNase उपचार "इम्यूनोजेनिक" AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कम कर देता है।

जबकि "इम्यूनोजेनिक" AAV8 वैक्टर ने पीडीसी में टीएलआर 9-निर्भर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न की, लेकिन "गैर-इम्यूनोजेनिक" लॉट द्वारा ऐसी कोई प्रतिक्रिया प्रेरित नहीं की गई। टीएलआर9 डीएनए की प्रतिक्रिया में सक्रिय होता है, विशेष रूप से डीएनए में अनमेथिलेटेड सीपीजी मोटिफ्स9 होता है। महत्वपूर्ण रूप से, हमारे डीडीपीसीआर माप ने पुष्टि की कि समान वायरल डीएनए घटक "इम्यूनोजेनिक" और "गैर-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट दोनों में मौजूद थे। सामूहिक रूप से, इसने सुझाव दिया कि इंट्रा-वायरल डीएनए के बजाय वायरल सस्पेंशन में अनपैक्ड/मुक्त डीएनए "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट के लिए देखी गई प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरक एजेंट हो सकता है। इसलिए, यदि अवशिष्ट मुक्त डीएनए "इम्यूनोजेनिक" AAV8 वेक्टर लॉट के वायरल सस्पेंशन में मौजूद था, तो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को DNase द्वारा क्षीण किया जाना चाहिए। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, "इम्यूनोजेनिक" AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट को AAV उत्तेजना से पहले 30 मिनट के लिए DNase I (100 µg/ml) के साथ पूर्व-उपचार किया गया था। PDCs या AAV कणों पर DNase उपचार के गैर-विशिष्ट प्रभावों को बाहर करने के लिए, AAV-केवल उत्तेजनाओं में, वैक्टर को PDC उत्तेजना से पहले DNasemock उपचार के अधीन किया गया था। DNase के बिना इन नकली उपचारों में, AAV कणों को DNase-उपचारित AAVs के समान समय के लिए एक समान DNase पाचन माध्यम में 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। दस, pDCs को DNase पूर्व-उपचारित या नकली-उपचारित "इम्यूनोजेनिक" AAV वेक्टर लॉट (MOI: 1:1× 106 vg) के साथ सीड और उत्तेजित किया गया था। पीडीसी जिन्हें केवल DNase के साथ इनक्यूबेट किया गया था या नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले वाहन के साथ दिखावा किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि, "इम्यूनोजेनिक" AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट के DNase उपचार से प्रतिक्रियाशील कोशिका प्रसार में कमी आई (चित्र 4a) और या तो पूरी तरह से समाप्त हो गया (AAV8 लॉट A-HEK-2 और A-Sf9-1; AAV2 लॉट) B-Sf9-1 और B-Sf9-2) या उल्लेखनीय रूप से कम (AAV8 लॉट A-HEK-1 और A-HEK-3) IP का रिलीज़{{40} }, एमआईपी-1 , टीएनएफ- और आईएफएन- एएवी उत्तेजना के बाद (चित्र 4बी,सी)। यह पुष्टि करने के लिए कि देखा गया DNase प्रभाव वास्तव में अतिरिक्त-वायरल डीएनए के पाचन के कारण हुआ था, न कि वेक्टर की अखंडता पर DNase के प्रभाव के कारण, हमने जांच की कि क्या AAV वेक्टर लॉट के DNase उपचार ने AAV की पारगमन क्षमता को प्रभावित किया है। चूंकि एएवी एप्लिकेशन के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य पीडीसी ट्रांसडक्शन नहीं हुआ, इसलिए इन जांचों के लिए एचईके कोशिकाओं का उपयोग किया गया क्योंकि एचईके कोशिकाएं एएवी ट्रांसडक्शन 19 पर ट्रांसडक्शन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए एक प्रसिद्ध सेल मॉडल हैं। हमने DNase-उपचारित और नकली-उपचारित AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट (MOI: 1:8× 104 vg) के साथ HEK293T कोशिकाओं को उत्तेजित किया और वेक्टर अनुप्रयोग के 3 दिन बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पारगमन दक्षता का मूल्यांकन किया। जैसा कि वर्णित है, AAV2 वैक्टर ने AAV8 वैक्टर की तुलना में उच्च पारगमन क्षमता दिखाई। इसके अलावा, महत्वपूर्ण बात यह है कि, DNase के साथ पूर्व-उपचार ने न तो HEK-व्युत्पन्न में और न ही Sf{61}}सेल व्युत्पन्न AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट (छवि S5a,b) में पारगमन दक्षता को कम किया। ये परिणाम इस बात का और सबूत देते हैं कि वेक्टर लॉट के इम्युनोजेनिक गुणों पर DNase प्रभाव अतिरिक्त-वायरल डीएनए के क्षरण के कारण होता है। हालाँकि TLR9 प्रतिपक्षी H154 ने अनिवार्य रूप से सभी चार इम्युनोजेनिक AAV8 लॉट (चित्र 3) के लिए प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की रिहाई को समाप्त कर दिया, DNase पूर्व-उपचार AAV8 लॉट A-HEK के लिए प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन प्रतिक्रिया को भी समाप्त कर सकता है। } और A-Sf9-1, जबकि इसने AAV8 लॉट A-HEK-1 और A-HEK-3 (चित्र 4) के लिए इसे पूरी तरह से नहीं हटाया। यह जांचने के लिए कि क्या बढ़ा हुआ DNase उपचार समय इस साइटोकिन प्रतिक्रिया को निरस्त कर सकता है, हमने संबंधित लॉट (A-HEK-1 और A-HEK{{87}) के DNase ऊष्मायन समय में दस गुना वृद्धि के बाद pDCs के सिमुलेशन प्रयोगों को दोहराया। }). हमने देखा कि 5 घंटे के लिए वैक्टर के DNase उपचार के बाद, AAV-उत्तेजित कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला में औसत साइटोकिन सांद्रता और कम हो गई, जो अब वाहन नियंत्रण से काफी अलग नहीं है। इस प्रतिक्रिया पैटर्न की पुष्टि तीन प्रयोगों में की जा सकती है, प्रत्येक प्रयोग एक व्यक्तिगत दाता की कोशिकाओं के साथ किया गया (चित्र S6)। इससे पता चलता है कि पीडीसी में टीएलआर पर निर्भर प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मुख्य कारण वास्तव में एक्स्ट्रा-वायरल डीएनए है। यह जांचने के लिए कि क्या इंट्रा-वायरल डीएनए के रिलीज होने से एएवी वैक्टर की इम्युनोस्टिम्युलेटरी गतिविधि बढ़ जाती है, हमने जानबूझकर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री पर गर्मी उपचार द्वारा "इम्यूनोजेनिक" एएवी 8 लॉट ए-एचईके -1 के वायरल कैप्सिड को खोला। . तब ताप-उपचारित वेक्टर लॉट का उपयोग पीडीसी को उत्तेजित करने के लिए किया गया था। यद्यपि गर्मी उपचार के साथ और उसके बिना एएवी8 लॉट ए-एचईके उत्तेजना पर प्रतिक्रियाशील कोशिका प्रसार में कोई अंतर नहीं था, आईपी {104}}, एमआईपी {105}} की रिहाई में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। , टीएनएफ- और आईएफएन- गर्म-उपचारित स्थिति में, यह दर्शाता है कि वेक्टर सस्पेंशन में इनकैप्सुलेटेड वायरल डीएनए की रिहाई प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में योगदान कर सकती है (चित्र 5)। साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एएवी वेक्टर तैयारियों में अतिरिक्त-वायरल डीएनए संदूषक हो सकते हैं जो पीडीसी में बहुत-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं। इन प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता TLR9 सिग्नलिंग द्वारा की जाती है और DNase के साथ वेक्टर लॉट के उपचार द्वारा इसे कम/समाप्त किया जा सकता है।

चित्र 4. DNase पूर्व-उपचार "इम्यूनोजेनिक" AAV8-CMV-eGFP और AAV2-CMV-eGFP वेक्टर लॉट से प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कम करता है। मानव pDCs को 18 घंटे के लिए DNase-उपचारित "इम्यूनोजेनिक" AAV8 वेक्टर लॉट से उत्तेजित किया गया (MOI: 1:1× 106 vg)। (ए) "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट (ऊपरी छवि) और "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट से प्रेरित शुद्ध पीडीसी की प्रतिनिधि उज्ज्वल फेल्ड छवियां, 1 {{3 {{32 }}}}0 यूजी/एमएल डीएनएएसई के साथ पूर्व-उपचारित मैं (निचली छवि)। स्केल बार 500 μm है। (बी) एएवी द्वारा उत्तेजित पीडीसी द्वारा आईपी -10, एमआईपी -1, टीएनएफ-, और आईएफएन - 2 का साइटोकिन रिलीज। (सी) एएवी द्वारा उत्तेजित पीडीसी द्वारा साइटोकिन रिलीज। चूंकि IFN- 2 माप (बी और सी) और टीएनएफ- माप (बी) में, कुछ मान परख सीमा से नीचे गिर गए, इसलिए सभी मापे गए आईएफएन - 2 और टीएनएफ- मानों में स्थिरांक 1 जोड़ा गया था। अर्ध-लघुगणकीय कथानक में प्रस्तुति। साधन और मानक विचलन दिखाए गए हैं। सांख्यिकीय महत्व एक-तरफ़ा एनोवा और होल्म-सिडक के पोस्ट हॉक विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। पी मान: 0.05 से कम या उसके बराबर: *; 0.01 से कम या इसके बराबर: **; 0.001 से कम या इसके बराबर: ***.

AAV8 वेक्टर तैयारियों में अतिरिक्त-वायरल डीएनए संदूषकों का खोजपूर्ण विश्लेषण।

एएवी वेक्टर लॉट में अतिरिक्त-वायरल डीएनए घटकों का पहला खोजपूर्ण लक्षण वर्णन करने के लिए, एक प्रतिनिधि "इम्यूनोजेनिक" (ए-एचईके-1) और "गैर-इम्यूनोजेनिक" (बी-एचईके-1) HEK सेल-व्युत्पन्न वेक्टर लॉट का विश्लेषण किया गया। जैसा कि ऊपर बताया गया है, इन लॉट को या तो 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए पीडीसी माध्यम में डीएनएस-ट्रीट किया गया था, या 100 केडीए कट-ऑफ फ़िल्टरिंग डिवाइस का उपयोग करके मॉक-ट्रीट किया गया था और अल्ट्रा-फ़िल्टर किया गया था, या केवल मॉक-ट्रीट किया गया था (चित्र। एस7ए-) जी)। लगातार बायोएनालाइजर लैबचिप पृथक्करण और शुद्ध डीएनए के मूल्यांकन से प्रत्येक लॉट के उपचारित और नकली-उपचारित नमूनों में वेक्टर डीएनए (चित्र। S7b-g) की तुलनीय मात्रा की उपस्थिति का पता चला, जिससे पुष्टि हुई कि न तो अल्ट्रा-फिल्ट्रेशन और न ही DNase-उपचार ने डीएनए सामग्री को प्रभावित किया। कैप्सिड के अंदर. इसके अतिरिक्त, इससे पता चला कि केवल "इम्यूनोजेनिक" (छवि S7a-d) लेकिन "गैर-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट (छवि S7a,e-g) में 100 से 450 बीपी (छवि) के आकार के अतिरिक्त डीएनए अणु शामिल थे . S7c,d और h). महत्वपूर्ण बात यह है कि इन अतिरिक्त डीएनए अणुओं को नकली-उपचारित नमूने और अल्ट्रा-फ़िल्टर किए गए नमूने में पाया जा सकता है, लेकिन DNase-उपचारित नमूने (छवि S7a-d) में वे वस्तुतः अनुपस्थित थे। यह इंगित करता है कि ये डीएनए अणु अतिरिक्त-वायरल डीएनए संदूषकों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्हें DNase द्वारा अपमानित किया जा सकता है लेकिन अल्ट्रा-निस्पंदन द्वारा वेक्टर निलंबन से हटाया नहीं जा सकता है। टी फंडिंग कि इन संदूषकों को केवल "इम्यूनोजेनिक" में ही पता लगाया जा सकता है, लेकिन "गैर-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट में नहीं, यह साबित करता है कि इन अतिरिक्त-वायरल डीएनए अणुओं की घटना बहुत-विशिष्ट है और इसके अतिरिक्त सुझाव दे सकती है कि ये अणु प्रेरित या योगदान करते हैं वेक्टर के इम्यूनोस्टिम्युलेटरी गुणों के लिए। "इम्यूनोजेनिक" (ए-एचईके-1) और "नॉन-इम्यूनोजेनिक" (बी-एचईके-1) में दूषित डीएनए के संभावित स्रोत का आकलन करने के लिए एचईके का बहुत सारा मात्रात्मक (क्यू) पीसीआर विश्लेषण सेल डीएनए, प्लास्मिड डीएनए और एएवी वेक्टर डीएनए का प्रदर्शन किया गया। DNase-उपचारित, मॉक-ट्रीटेड और अल्ट्रा-फिल्टरेटेड और प्रत्येक लॉट के केवल मॉक-ट्रीटेड नमूनों से टेम्पलेट डीएनए का उपयोग अलु रिपीट, परमाणु जीनोम मल्टीकॉपी एनपीआईपी जीन और HEK सेल मूल के माइटोकॉन्ड्रियल 16S rRNA जीन अनुक्रम (mt16S) के प्रवर्धन के लिए किया गया था। , एक एएवी8 इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट एम्प्लिकॉन (आईटीआर2; वेक्टर और ट्रांसजीन प्लास्मिड डीएनए मूल) के प्रवर्धन के लिए, और ब्लाह (एम्पीसिलीन प्रतिरोध) जीन (एएमपी; प्लास्मिड डीएनए मूल) (तालिका एस4) के लिए एक एम्प्लिकॉन के प्रवर्धन के लिए। HEK सेल डीएनए-विशिष्ट एम्प्लिकॉन बनाम ITR2 एम्प्लिकॉन (यानी Alu बनाम ITR2, NPIP बनाम ITR2, और mt16S बनाम ITR2) और प्लास्मिड डीएनए-विशिष्ट एम्प्लिकॉन बनाम ITR2 एम्प्लिकॉन (Amp) के ΔCt मानों के अनुपात की तुलना बनाम ITR2), क्रमशः इंगित करता है कि दोनों लॉट में HEK सेल परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की नगण्य मात्रा है। इसके विपरीत, विश्लेषण से "इम्यूनोजेनिक" और "गैर-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट (एएवी डीएनए के सापेक्ष प्रतिलिपि संख्या के संदर्भ में क्रमशः 1/32वां और 1/50वां) दोनों में प्लास्मिड डीएनए की एक अच्छी मात्रा का पता चला। एक अनुपात जो अन्य एएवी वैक्टर12 (चित्र एस7) के लिए रिपोर्ट किए गए मानों की सीमा के भीतर है। फिर भी, दोनों वेक्टर लॉट (छवि S8) के DNase-उपचारित और मॉक-ट्रीटेड या अल्ट्रा-फिल्टरेटेड और मॉक-ट्रीटेड नमूनों के बीच प्लास्मिड और HEK सेल डीएनए के वेक्टर डीएनए के सापेक्ष अनुपात में कोई स्पष्ट अंतर नहीं थे। इससे यह संकेत मिल सकता है कि गैर-पैकेजित संदूषक डीएनए लक्ष्य अनुक्रम संरचना में पैकेज्ड डीएनए के समान है। हालाँकि, क्यूपीसीआर विश्लेषण की एक सीमा दूषित डीएनए (100-450 बीपी) का आकार है जिसमें अधूरे लक्ष्य अनुक्रम के साथ टुकड़ों का एक अच्छा अंश होगा।

चित्र 5. वैक्टर के ताप उपचार द्वारा इंट्रा-वायरल डीएनए की रिहाई पीडीसी में प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन प्रतिक्रियाओं को बढ़ाती है। हीट-ट्रीटेड AAV8 लॉट A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 वी.जी.)। क्षैतिज रेखाएं माध्य और मानक विचलन दर्शाती हैं। गर्मी-उपचारित और अनुपचारित वैक्टर से प्रेरित साइटोकिन प्रतिक्रियाओं के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर छात्र टी-परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। पी मान: 0.01 से कम या उसके बराबर: **; 0.001 से कम या इसके बराबर: ***.

बहस

एएवी वैक्टर जीन थेरेपी में सबसे आशाजनक उपकरणों में से एक है। हालाँकि, साक्ष्य एकत्र करना इस दृष्टिकोण को चुनौती देता है कि एएवी की प्रतिरक्षाजनकता नगण्य है5। इसके प्रकाश में, उन तंत्रों को बेहतर ढंग से समझना महत्वपूर्ण हो गया है जिनके द्वारा एएवी के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं होती हैं। इस अध्ययन में हम प्रदर्शित करते हैं कि (1) एएवी8 और एएवी2 मानव पीडीसी में बहुत-विशिष्ट जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं जो न तो कैप्सिड/वीजी अनुपात, न ही उत्पादन मंच और न ही निर्माता/शुद्धिकरण विधि के लिए विशिष्ट हैं; (2) पीडीसी में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं टीएलआर9 सिग्नलिंग पर निर्भर होती हैं और DNase के साथ पूर्व-उपचार द्वारा इसे कम किया जा सकता है; (3) DNase उपचार वेक्टर कण की अखंडता को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि यह HEK293T कोशिकाओं में AAV8 और AAV2 वेक्टर लॉट की पारगमन दर को कम नहीं करता है; और (4) एएवी वेक्टर लॉट में अतिरिक्त-वायरल डीएनए अणु शामिल हो सकते हैं जिन्हें DNase के साथ वेक्टर लॉट के उपचार द्वारा हटाया जा सकता है। इससे पता चलता है कि HEK- और Sf9- सेल-व्युत्पन्न AAV तैयारियों में अतिरिक्त-वायरल डीएनए अशुद्धियाँ हो सकती हैं जो एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करती हैं। हाल के एक अध्ययन में, विभिन्न मेजबान कोशिका प्रजातियों (HEK कोशिकाओं और Sf9 कोशिकाओं)11 से एएवी वैक्टर का उपयोग करके एक तुलनात्मक विश्लेषण किया गया था। लेखकों ने पाया कि उनके द्वारा परीक्षण किए गए सभी एएवी सीरोटाइप और निर्माताओं में एचईके- और एसएफ 9- व्युत्पन्न वैक्टर उनके पीटीएम और उनके अवशिष्ट मेजबान सेल प्रोटीन अशुद्धियों के संदर्भ में भिन्न हैं। इसके अलावा, उन्होंने एएवी ट्रांसडक्शन के लिए प्राथमिक मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट की साइटोकिन प्रतिक्रिया का विश्लेषण किया और पाया कि एचईके- और एसएफ 9- व्युत्पन्न वैक्टर उनके इम्युनोजेनिक गुणों में भिन्न हो सकते हैं। हमारे अध्ययन में, हमने अलग-अलग निर्माताओं और दो अलग-अलग सीरोटाइप से समान एएवी निर्माण के विभिन्न लॉट का उपयोग करके इन दो मुख्य उत्पादन प्रणालियों की तुलना की। हालाँकि, हमारे मानव पीडीसी मॉडल में हमने जो वेक्टर-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं देखीं, वे विशेष रूप से किसी दिए गए उत्पादन प्रणाली, निर्माता या सीरोटाइप से संबंधित नहीं थीं, इसके बजाय, वे बहुत-विशिष्ट थीं। रेटिनल जीन थेरेपी के पिछले प्री-क्लिनिकल और क्लिनिकल अध्ययनों से पता चला है कि एएवी वैक्टर के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, जैसे नेत्र संबंधी सूजन या प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, कैप्सिड/वीजी अनुपात 18 या खुराक अंतर 5 में अंतर से प्रभावित हो सकती है। टिमर्स एट अल.18 ने दिखाया कि गैर-मानव प्राइमेट्स के साथ एक पूर्व-नैदानिक ​​​​अध्ययन में वायरल सस्पेंशन से खाली एएवी कैप्सिड हटाने से सूजन कम हो गई और वायरल ट्रांसडक्शन में सुधार हुआ। फिर भी, हमारे परिणामों से पता चला कि ऊंचा कैप्सिड/वीजी अनुपात "इम्यूनोजेनिक" और "गैर-इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट दोनों के बीच मौजूद था, जिसका अर्थ है कि वायरल सस्पेंशन में अधिक संख्या में कैप्सिड (खाली कैप्सिड) शामिल होने के लिए जिम्मेदार नहीं थे। हमारे मानव पीडीसी मॉडल में वेक्टर लॉट-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं। इसके अलावा, हमने पहले दिखाया है कि एएवी8 गैर-मानव प्राइमेट्स6,8 में खुराक पर निर्भर तरीके से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है। हालाँकि, इस अध्ययन में "गैर-इम्यूनोजेनिक" एएवी वैक्टर की खुराक बढ़ाना मानव पीडीसी में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त नहीं था। इसलिए, वैक्टर के इम्यूनोजेनिक गुणों में अंतर के कारण को समझने के लिए, हमने "इम्यूनोजेनिक" एएवी लॉट की पहचान में शामिल तंत्र की जांच की। इन विट्रो इम्युनोकोम्पेटेंट सेल मॉडल के उपयोग ने वैज्ञानिकों को एएवी वैक्टर9,10 द्वारा उत्पन्न जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में टीएलआर मार्गों की भूमिका का अधिक सटीक अध्ययन करने की अनुमति दी है। झू एट अल.9फ्रस्ट ने बताया कि पीडीसी, लेकिन पारंपरिक डीसी या गैर-पीडीसी नहीं, एएवी उत्तेजना के जवाब में बड़ी मात्रा में टाइप I आईएफएन और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जारी करते हैं और एएवी8 और एएवी2 की पहचान में टीएलआर9 मार्ग की भागीदारी का प्रदर्शन किया। माउस पीडीसी का उपयोग करना। लेखकों ने यह भी देखा कि AAV2 ने मानव pDCs में TLR9-निर्भर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया। हमारे अध्ययन में, सबसे विशिष्ट TLR9 प्रतिपक्षी, H1549,21–24 में से एक के उपयोग के साथ, हमने अप्रत्यक्ष रूप से दिखाया है कि न केवल AAV2, बल्कि AAV8 वैक्टर भी मानव pDCs में TLR{56}}निर्भर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। लेकिन बहुत विशिष्ट तरीके से। चूंकि टीएलआर9 एक डीएनए रिसेप्टर है, इससे पता चलता है कि "इम्यूनोजेनिक" एएवी वेक्टर लॉट के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं डीएनए घटकों द्वारा प्रेरित थीं। हालाँकि, हालांकि हमारे डीडीपीसीआर माप ने पुष्टि की थी कि समान पैकेज्ड डीएनए घटक "इम्यूनोजेनिक" और "नॉन-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट दोनों में मौजूद थे, "नॉन-इम्यूनोजेनिक" लॉट ने पीडीसी में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर नहीं किया। इसके अतिरिक्त, DNase उपचार ने "इम्यूनोजेनिक" AAV वेक्टर लॉट के इम्यूनोस्टिम्युलेटरी गुणों को या तो कम कर दिया या समाप्त कर दिया, लेकिन HEK कोशिकाओं में इन वैक्टरों की पारगमन क्षमता को कम नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि AAV के DNase उपचार ने गैर-एनकैप्सुलेटेड अतिरिक्त-वायरल डीएनए को लक्षित किया। वेक्टर निलंबन लेकिन बरकरार कैप्सिड के भीतर वेक्टर जीनोम की अखंडता को प्रभावित नहीं किया। प्रतिनिधि DNase-उपचारित और नकली-उपचारित "इम्यूनोजेनिक" और "गैर-इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट के तुलनात्मक डीएनए विश्लेषण से इसकी और पुष्टि हुई।

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सामूहिक रूप से, इन सभी प्रयोगों से संकेत मिलता है कि पीडीसी में "इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एएवी कणों में निहित डीएनए (यानी वेक्टर जीनोम या एएवी कैप्सिड में पैक किए गए संभावित डीएनए अशुद्धियों) द्वारा नहीं बल्कि सुलभ अतिरिक्त-वायरल डीएनए द्वारा व्यवस्थित की गई थी। वायरल सस्पेंशन में शामिल घटक (यानी डीएनए बाहर या वायरल कैप्सिड द्वारा असुरक्षित)। हमने यह भी देखा कि जब "इम्यूनोजेनिक" वेक्टर लॉट के वायरल कैप्सिड में मौजूद डीएनए को वेक्टर के ताप उपचार द्वारा कोशिकाओं के संपर्क में लाया गया तो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में वृद्धि हुई। यह स्पष्ट नहीं है कि कैप्सिड खोलने के बाद इम्यूनोस्टिम्युलेटरी गतिविधि में वृद्धि वेक्टर के एकल-फंसे डीएनए के कारण थी या एएवी कैप्सिड में पैक की गई संभावित अशुद्धियों जैसे अवशिष्ट मेजबान सेल न्यूक्लिक एसिड, अवशिष्ट सहायक डीएनए अनुक्रम, बैकबोन अनुक्रम के कारण थी। टुकड़ों को आईटीआर से कैसेट या रिवर्स प्राइमिंग के साथ पैक किया गया जिसके परिणामस्वरूप छोटे रीढ़ के टुकड़े एएवी12,25 में पैक किए गए। पीडीसी द्वारा अतिरिक्त-वायरल डीएनए ग्रहण का सटीक तंत्र अज्ञात बना हुआ है। सीपीजी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रति पीडीसी की प्रतिक्रिया दर्शाती है कि पीडीसी मुक्त डीएनए26 पर प्रतिक्रिया कर सकते हैं। इससे पता चलता है कि पीडीसी में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया वेक्टर निलंबन में निहित मुक्त दूषित डीएनए के अवशोषण से शुरू हो सकती है। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया है कि पीडीसी एएवी वैक्टर 27 को ले सकते हैं, वैकल्पिक रूप से सुझाव देते हैं कि एएवी कणों के ग्रहण के दौरान संभावित कैप्सिड-बाउंड डीएनए को सेल में ले जाया जा सकता है। एएवी वेक्टर तैयारियों में अतिरिक्त-वायरल डीएनए संदूषण की उपस्थिति या तो वैक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण प्रक्रिया के परिणामस्वरूप संबंधित वेक्टर लॉट की अंतर्निहित संपत्ति हो सकती है, या यह अनुचित भंडारण स्थितियों के कारण एनकैप्सुलेटेड डीएनए की रिहाई के कारण हो सकती है। . इन प्रयोगों में जांचे गए सभी वेक्टर लॉट एक ही समय अवधि के दौरान प्राप्त किए गए थे (8 AAV8 वेक्टर लॉट में से 5 की जांच की गई, जिनमें से दो "इम्यूनोजेनिक" थे (ए-एचईके -2; ए-एचईके {{15 }}) और तीन "गैर-इम्यूनोजेनिक" थे (ए-एसएफ9-2; बी-एसएफ9-1; बी-एसएफ9-2) यहां तक ​​​​कि विशेष रूप से इस अध्ययन के लिए समानांतर में उत्पादित किए गए थे), बहुत सारे प्रत्येक निर्माता को एक ही परिवहन बक्से में भेज दिया गया था और, प्राप्त होने पर, सभी लॉट के एलिकोट्स को एक साथ पिघलाने और पीडीसी पर लागू करने से पहले सभी लॉट को तापमान अलार्म-संरक्षित -80 डिग्री फ्रीजर के एक ही दराज में एक साथ संग्रहीत किया गया था। साथ-साथ प्रयोगों में. यह दृढ़ता से सुझाव देता है कि अनुचित भंडारण के बजाय एएवी उत्पादन और शुद्धिकरण प्रक्रिया, इन लॉट के अतिरिक्त-वायरल डीएनए सामग्री और इम्यूनोस्टिमुलेटरी गुणों में अंतर के लिए जिम्मेदार थी। अतीत में, जीन थेरेपी (एलीपोजेन टिपारवोवेक, ग्लाइबेरा) के लिए उत्पादित क्लिनिकल ग्रेड एएवी वेक्टर लॉट संभावित इम्युनोजेनिक अवशिष्ट मेजबान सेल डीएनए 28 सहित अशुद्धियों की उच्च मात्रा के कारण अब अधिकृत नहीं थे। वायरल सस्पेंशन से डीएनए अशुद्धियों को हटाने का काम आमतौर पर उत्पादन प्रक्रिया के दौरान किया जाता है। यहां अंतिम वायरल सस्पेंशन से अवशिष्ट डीएनए को खत्म करने के लिए बेंज़ोनेज़29 या डीनेज़30 उपचार नियमित रूप से लागू किया जाता है। यह उपचार, प्रोटोकॉल के आधार पर, 30 मिनट से 3 घंटे के बीच चलता है और फिर एंजाइम को सीज़ियम क्लोराइड साल्ट30 जैसे रसायनों द्वारा निष्क्रिय कर दिया जाता है। हमारे प्रयोगों में, आयोवा विश्वविद्यालय की वायरल वेक्टर कोर सुविधा से प्राप्त पांच एएवी8 लॉट में से चार, और विरोवेक से दोनों एएवी2 वेक्टर लॉट पीडीसी में इम्युनोजेनिक पाए गए। जैसा कि "सामग्री और विधियाँ" अनुभाग में वर्णित है, इन दोनों निर्माताओं के वेक्टर लॉट की शुद्धि प्रक्रिया में कई शुद्धिकरण चरण शामिल हैं, जिनमें से कुछ एक दूसरे से बहुत भिन्न हैं। इस प्रकार, आयोवा में कोर सुविधा में शुद्धिकरण प्रक्रिया में टर्बोन्यूक्लिज़ उपचार शामिल है, इसके बाद आयोडिक्सानॉल ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, आयन एक्सचेंज कॉलम क्रोमैटोग्राफी, स्पंदन नसबंदी और केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके बफर एक्सचेंज शामिल है। इसके विपरीत, विरोवेक बेंज़ोनेस उपचार लागू करता है, सीएससीएल में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद डीसेल्टिंग और फ़िल्टर स्टरलाइज़ेशन करता है। दूसरी ओर, विजीन की शुद्धि प्रक्रिया में DNase उपचार शामिल नहीं है, लेकिन, जैसा कि आयोवा में कोर फैसिलिटी द्वारा उपयोग किया जाता है, इसमें आयोडिक्सानॉल ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन शामिल है। हालाँकि, आश्चर्यजनक रूप से, विजीन (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 और 2) से प्राप्त तीन वेक्टर लॉट में से किसी ने भी pDCs में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं किया, जिससे पता चलता है कि "गैर-प्रतिरक्षाजन्य" "वेक्टर लॉट उन उत्पादन प्रक्रियाओं के साथ भी उत्पन्न किए जा सकते हैं जिनमें DNase उपचार शामिल नहीं है।

सिस्टैंच अनुपूरक लाभ-प्रतिरक्षा प्रणाली को कैसे मजबूत करें

कुल मिलाकर, तीन निर्माताओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले आंशिक रूप से समान और आंशिक रूप से भिन्न शुद्धिकरण चरण पीडीसी में देखे गए वैक्टर के इम्यूनोजेनिक गुणों को विनिर्माण प्रक्रिया में एक चरण से जोड़ना मुश्किल बनाते हैं। क्लिनिकल परीक्षण अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी)-ग्रेड वैक्टर का उपयोग करते हैं जो कड़े गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन होते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए गए तीन निर्माताओं में से कोई भी वेक्टर अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) ग्रेड नहीं है और इसलिए क्लिनिकल-ग्रेड वैक्टर की तुलना में कम शुद्धता वाला हो सकता है। इस प्रकार, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि मनुष्यों में नैदानिक ​​​​परीक्षणों में उपयोग किए जाने वाले जीएमपी वैक्टर वर्तमान अध्ययन में हमारे द्वारा देखे गए मतभेदों को प्रदर्शित कर सकते हैं या नहीं भी कर सकते हैं और जीन थेरेपी के नैदानिक ​​​​उपयोग के लिए हमारे निष्कर्षों की प्रासंगिकता स्पष्ट नहीं है। हालाँकि, हमारे अपने अनुभव में, मेजबान सेल प्रोटीन जैसे दूषित घटकों की सांद्रता में काफी विशिष्ट अंतर जीएमपी-ग्रेड वैक्टर के साथ भी हो सकते हैं, और यहां तक ​​कि जीएमपी-ग्रेड वैक्टर में भी कोई समान रूप से सहमत विनिर्देश नहीं हैं कि कौन से स्तर हैं स्वीकार्य5. सामूहिक रूप से, एएवी वैक्टर की निर्माण प्रक्रिया में सुधार करना वायरल सस्पेंशन में अवशिष्ट अशुद्धियों की उपस्थिति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि अनपेक्षित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की संभावना को कम किया जा सके। निष्कर्ष में, हमने प्रदर्शित किया कि अतिरिक्त-वायरल डीएनए अशुद्धियाँ मानव पीडीसी में एएवी वैक्टर के इम्युनोजेनिक गुणों को प्रभावित कर सकती हैं। पशु मॉडल या मानव रोगियों में एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी की सुरक्षा के लिए इन निष्कर्षों के निहितार्थ की जांच के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

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