जीका वायरस गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 4बी वायरल संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए डीएचसीआर7 के साथ परस्पर क्रिया करता है

अमूर्त

ज़िका वायरस (ZIKV) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने और मेजबान कोशिकाओं में कुशल प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए गैर-संरचनात्मक प्रोटीन विकसित करता है। हाल ही में बताया गया कि कोलेस्ट्रॉल मेटाबॉलिक एंजाइम डिहाइड्रोकोलेस्ट्रोल रिडक्टेस (DHCR7) ZIKV संक्रमण में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। हालाँकि, डीएचसीआर में शामिल महत्वपूर्ण गैर-संरचनात्मक प्रोटीन और तंत्र को अच्छी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया कि ZIKV संक्रमण ने DHCR7 अभिव्यक्ति को सुविधाजनक बनाया। विशेष रूप से, अपग्रेडित DHCR7 ने बदले में ZIKV संक्रमण को सुविधाजनक बनाया, और DHCR7 को अवरुद्ध करने से ZIKV संक्रमण दब गया। यंत्रवत्, ZIKV गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 4B (NS4B) ने DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए DHCR7 के साथ बातचीत की। इसके अलावा, डीएचसीआर7 ने टैंक-बाइंडिंग काइनेज 1 (टीबीके1) और इंटरफेरॉन नियामक कारक 3 (आईआरएफ3) फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया, जिसके परिणामस्वरूप इंटरफेरॉन-बीटा (आईएफएन-) और इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (आईएसजी) उत्पादन में कमी आई। इसलिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि ZIKV NS4B TBK1 और IRF3 सक्रियण को दबाने के लिए DHCR7 से जुड़ता है, जो बदले में IFN- और ISG को रोकता है, जिससे ZIKV चोरी की सुविधा मिलती है। यह अध्ययन इस अंतर्दृष्टि को विस्तृत करता है कि कैसे वायरल गैर-संरचनात्मक प्रोटीन कोलेस्ट्रॉल चयापचय एंजाइमों और मध्यवर्ती के माध्यम से वायरल संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा का विरोध करते हैं।

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1 परिचय

मच्छर जनित फ्लेविवायरस के रूप में, जीका वायरस (ZIKV) की पहचान सबसे पहले 1947 में युगांडा में रीसस मकाक से की गई थी। दुनिया भर में कई बार फैलने के बाद, ZIKV महामारी मच्छरों के मार्गों, दुनिया भर में यात्रा के माध्यम से विस्फोटक विस्तार के कारण एक संचयी वैश्विक स्वास्थ्य खतरा बन गई है। स्पर्शोन्मुख ट्रांसपोर्टर, और यौन संचरण। पिछली महामारियों में अधिकांश ZIKV संक्रमण स्पर्शोन्मुख या हल्के थे (वांग एट अल।, 2016), हालांकि, पिछले कई महामारियों में, ZIKV संक्रमण ने विनाशकारी बीमारियों को जन्म दिया है, जिसमें गर्भावस्था के दौरान न्यूरोलॉजिकल सीक्वेल (माइक्रोसेफली और भ्रूण की मृत्यु) और तंत्रिका संबंधी विकार शामिल हैं। (गुइलेन-बैरी सिंड्रोम) वयस्कों में (काओ-लोर्मेउ एट अल., 2016; पियर्सन एंड डायमंड, 2020; रासमुसेन एट अल., 2016)। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली वायरल संक्रमण के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा रक्षा की पहली और महत्वपूर्ण पंक्ति है। ZIKV संक्रमण के बाद, वायरल आरएनए को इंट्रासेल्युलर रेटिनोइक एसिड-इंड्यूसिबल जीन I (RIG-I) (चाज़ल एट अल., 2018; हर्टज़ोग एट अल., 2018; काटो एट अल., 2006) द्वारा पहचाना गया, जिसने डाउनस्ट्रीम जन्मजात प्रतिरक्षा की शुरुआत की। प्रतिक्रियाएं, जिसमें TANK बाइंडिंग काइनेज 1 (TBK1) सक्रियण, इंटरफेरॉन नियामक कारक 3 (IRF3) फॉस्फोराइलेशन और फिर टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I) उत्पादन (फिट्जगेराल्ड एट अल।, 2003; ग्रांट एट अल।, 2016) शामिल हैं; ज़िया एट अल., 2018) और विभिन्न एंटीवायरल प्रभावों के साथ दर्जनों इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (आईएसजी) की अभिव्यक्ति (सेविडिस एट अल., 2016; श्नाइडर एट अल., 2014)। मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली वायरल संक्रमण को प्रतिबंधित करने के लिए आईएफएन और आईएसजी का उत्पादन करती है, हालांकि, ZIKV ने मेजबान कोशिका में सफल अस्तित्व और प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न प्रकार के भागने के तंत्र विकसित किए हैं, जैसे कि विशिष्ट गैर-संरचनात्मक (एनएस) प्रोटीन को एन्कोड करना। ZIKV जीनोमिक RNA NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B और NS5 (बर्थौक्स, 2020) सहित सात गैर-संरचनात्मक प्रोटीन उत्पन्न करता है। ZIKV NS1 कैसपेज़ को स्थिर करने के लिए होस्ट ड्यूबिकिटिनेज़ USP8 को भर्ती करता है-1 और ZIKV संक्रमण को लाभ पहुंचाने के लिए टाइप I IFN सिग्नलिंग को क्षीण करता है (झेंग एट अल।, 2018)। बताया गया है कि एक उत्परिवर्ती NS1 TBK1 से जुड़ जाता है और TBK1 के फॉस्फोराइलेशन को कम कर देता है, जिससे IFN- उत्पादन कम हो जाता है (Xia et al., 2018)। ZIKV NS3 मानव स्कैफोल्ड प्रोटीन (14-3-3ε और 14-3-3η) (रीडल एट अल., 2019) को बांधता है और अलग करता है, जबकि NS4A RIG-I- और MDA को कमजोर करने के लिए MAVS के साथ इंटरैक्ट करता है। }मध्यस्थता वाली जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं (मा एट अल., 2018)। विशेष रूप से, ZIKV NS5 टाइप I IFN सिग्नलिंग को कमजोर करने के लिए सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 2 (STAT2) के एक्टिवेटर को बांधता है और ख़राब करता है (ग्रांट एट अल।, 2016; कुमार एट अल।, 2016)। इसके अलावा, NS5 RIG-I के साथ इंटरैक्ट करने और RIG-I के K-लिंक्ड पॉलीयूबिकिटेशन को दबाने में भी सिद्ध हुआ है, जिससे IFN- उत्पादन को दबाया जा सकता है (Li et al., 2020)। इसके अलावा, ZIKV NS2A, NS2B, NS4A और NS4B को भी RIG-I मार्ग में अलग-अलग तत्वों को लक्षित करके IFN- उत्पादन पर हावी होने के लिए प्रदर्शित किया गया है (Xia et al., 2018)। स्तनधारी कोशिकाओं में कुशल प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, ZIKV एक लिफाफा बनाने और वायरल कण असेंबली (चेन एट अल।, 2020; लीयर एट अल।, 2020) बनाने के लिए मेजबान सेलुलर लिपिड चयापचय घटकों पर भी निर्भर करता है। कोलेस्ट्रॉल कोशिका झिल्ली के लिपिड घटकों में से एक है और कई जैविक कार्यों में भाग लेता है (इकोनेन, 2008)। सेलुलर कोलेस्ट्रॉल होमियोस्टेसिस को कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण द्वारा बारीकी से नियंत्रित किया जाता है, जिसमें लिपोप्रोटीन कणों से अवशोषण और बाह्य कोशिकीय स्वीकर्ता को जारी करना शामिल है। वस्तुतः सभी स्तनधारी कोशिकाएं कोलेस्ट्रॉल चयापचय पर निर्भर हैं (लुओ एट अल., 2020)। एकत्रित साक्ष्यों से संकेत मिलता है कि कोलेस्ट्रॉल चयापचय वायरल संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग लेता है (ब्लैंक एट अल., 2013; पीटरसन एट अल., 2014; यॉर्क एट अल., 2015)। वायरल संक्रमण होने पर, कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण में स्पष्ट रूप से बदलाव आया और मैक्रोफेज में आईएफएन-आई और आईएसजी की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के साथ (ली एट अल।, 2017; लियू एट अल।, 2008; यॉर्क एट अल।, 2015)। कोलेस्ट्रॉल चयापचय में प्रमुख एंजाइम के रूप में, कोलेस्ट्रॉल हाइड्रॉक्सिलेज़ (CH25H) कोलेस्ट्रॉल को हाइड्रॉक्सीकोलेस्ट्रोल (25HC) में परिवर्तित करता है, जिसे जैविक उत्पाद के रूप में पहचाना गया है जो बड़ी संख्या में लोगों के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में योगदान देता है। ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस 1 (एचआईवी-1), वेसिकुलर स्टामाटाइटिस वायरस (वीएसवी), हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी-1), इबोला वायरस (ईबीओवी), ZIKV, म्यूरिन गामा हर्पीस वायरस ( MHV68), रिफ्ट वैली फीवर वायरस (RVFV), और रूसी स्प्रिंग-समर एन्सेफलाइटिस वायरस (RSSEV) (ब्लैंक एट अल., 2013; ली एट अल., 2017; लियू एट अल., 2013)। वर्तमान अध्ययन इस बात की जांच करने में सीमित हैं कि कोलेस्ट्रॉल चयापचय उत्पाद (जैसे 25एचसी) सिग्नल ट्रांसडक्शन में कैसे हेरफेर कर सकते हैं और जन्मजात प्रतिरक्षा में भाग ले सकते हैं। आज तक, कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण के अपस्ट्रीम एंजाइम या मध्यवर्ती अभी भी अच्छी तरह से स्पष्ट नहीं हैं। महत्वपूर्ण कोलेस्ट्रॉल मेटाबॉलिक एंजाइम के रूप में, 7-डीहाइड्रोकोलेस्ट्रोल रिडक्टेस (डीएचसीआर7) स्टेरोल्स के बी रिंग में सी (7-8) डबल बॉन्ड को मिटा सकता है और 7-डीहाइड्रोकोलेस्ट्रोल ({{100}) से कोलेस्ट्रॉल को उत्प्रेरित कर सकता है। }डीएचसी) (लू एट अल., 2015)। 7-डीएचसी भी विटामिन डी का अग्रदूत है, और डीएचसीआर7 उत्परिवर्तन उच्च विटामिन डी से जुड़े हुए हैं, सुझाव देते हैं कि डीएचसीआर7 कोलेस्ट्रॉल और विटामिन डी के रूपांतरण में जटिल जैविक प्रभाव प्रदर्शित करता है (कुआन एट अल., 2013; प्रभु एट अल। , 2016ए)। एक अच्छी तरह से प्रस्तुत अध्ययन से पता चला है कि DHCR7 मौन PI3K-AKT3 मार्ग को सक्रिय कर सकता है, जिससे IRF3 Ser385 फॉस्फोराइलेशन हो सकता है और इन विट्रो और विवो में कई वायरल संक्रमण को रोकने के लिए IFN- उत्पादन को बढ़ावा मिल सकता है (जिओ एट अल।, 2020)। हालाँकि, ZIKV NS प्रोटीन-मध्यस्थ प्रतिरक्षा चोरी में DHCR7-मध्यस्थता वाले कोलेस्ट्रॉल चयापचय की समझ को खराब रूप से परिभाषित किया गया है। यहां, हम एक विशिष्ट तंत्र को स्पष्ट करते हैं जो IFN-I प्रतिक्रिया को कम करने और ZIKV संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण में एक प्रमुख एंजाइम, DHCR7 पर ZIKV NS4B को लक्षित करता है। हमने पाया कि ZIKV संक्रमण ने DHCR7 अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया। दिलचस्प बात यह है कि उन्नत DHCR7 ZIKV संक्रमण को बढ़ावा देता है, जबकि अवरोधकों के साथ DHCR7 को नष्ट करने या लक्षित करने से ZIKV संक्रमण को दबाया जा सकता है। इसके अलावा, ZIKV NS4B DHCR7 को बांध सकता है और इस प्रकार DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है, जिससे TBK1 और IRF3 सक्रियण बाधित हो गया और IFN- और ISG उत्पादन कम हो गया। इसलिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि ZIKV NS4B को DHCR7 से बांधने से IRF3 सक्रियण कम हो जाता है, जो बदले में ZIKV चोरी को सुविधाजनक बनाने के लिए IFN- और ISG को रोकता है। यह अध्ययन इस नवीन अंतर्दृष्टि को विस्तृत करता है कि कैसे ZIKV गैर-संरचनात्मक प्रोटीन कोलेस्ट्रॉल चयापचय एंजाइमों के साथ बातचीत के माध्यम से वायरल संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा को समाप्त करता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

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2। सामग्री और विधि

2.1. सेल लाइनों

U251 सेल चाइना सेंटर फॉर टाइप कल्चर कलेक्शन (CCTCC) (वुहान, चीन) से खरीदे गए थे। सर्कोपिथेकस एथियोप्स किडनी (वेरो) कोशिकाएं, मानव भ्रूण किडनी (HEK 293T) कोशिकाएं, और मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (A549) कोशिकाएं अमेरिकन टिश्यू कल्चर कलेक्शन (ATCC) से खरीदी गई थीं। कोशिकाओं को डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) (गिब्को) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (गिब्को), पेनिसिलिन (100 यू/एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (100 यूजी/एमएल) के साथ 37 सी और 5 पर बनाए रखा गया था। % CO2. एडीज़ एल्बोपिक्टस (सी6/36) कोशिकाओं को न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) में 10% एफबीएस, पेनिसिलिन (100 यू/एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (100 यूजी/एमएल) के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ संवर्धित किया गया।

2.2. ZIKV प्रवर्धन, अनुमापन, और संक्रमण

ZIKV आइसोलेट z16006 (जेनबैंक एक्सेशन नंबर, KU955589.1) को C6/36 कोशिकाओं में संवर्धित किया गया था, और ZIKV को फ्रीजिंग शीशियों में विभाजित किया गया था और 80 C पर संग्रहीत किया गया था। ZIKV टाइटर्स को प्लाक परख द्वारा मापा गया था। कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए संक्रमण की संकेतित बहुलता (एमओआई) पर ZIKV से संक्रमित किया गया, इसके बाद फॉस्फेट बफर सलाइन (पीबीएस) से धोया गया, और फिर सुसंस्कृत, काटा और जांच की गई।

2.3. प्लास्मिड और अभिकर्मक

एक्सप्रेशन प्लास्मिड PCDNA3.1(þ)-3 फ़्लैग का उपयोग ZIKV cDNA के संबंधित टुकड़ों से व्यक्तिगत ZIKV जीन को क्लोन करने के लिए किया गया था। pGEX6p-1-NS4B के निर्माण के लिए, ZIKV NS4B को क्लोनएक्सप्रेस II वन स्टेप क्लोनिंग किट (वाज़ाइम बायोटेक, नानजिंग, चीन) का उपयोग करके pGEX6p-1 वेक्टर में उप-क्लोन किया गया था। मानव DHCR7, RIG-I, TBK1 और IRF3 को एन्कोड करने वाले cDNAs को pCAGGS-HA वेक्टर या PCDNA3.1 (þ)-3 में क्लोन किया गया है। फ्लैग वेक्टर का निर्माण मानक आणविक क्लोनिंग विधि द्वारा किया गया था। DHCR7 के मिसेंस उत्परिवर्तन G410S का निर्माण साइट साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन विधि का उपयोग करके किया गया था। मोनोक्लोनल खरगोश एंटी-ZIKV लिफाफा (GTX133314) GeneTex (इरविन, CA, यूएसए) से खरीदा गया था। खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-डीएचसीआर7 (ए8049), खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-आईएसजी15 (ए2416), खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-टीबीके1 (ए3458), खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-पी-टीबीके1 और सेर172 (एपी1026), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-आईआरएफ3 (ए11118), एंटी -खरगोश आईजीजी (एसी005), और एंटी-माउस आईजीजी (एसी011) एबीक्लोनल टेक्नोलॉजी (वुहान, चीन) से खरीदे गए थे। एंटीमाउस FITC और एंटी-खरगोश Cy3 माध्यमिक एंटीबॉडी एबकाइन (वुहान, चीन) से खरीदे गए थे। Ser396 (29047S) पर खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-पी-आईआरएफ3 और खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-आईएसजी56 (14769S) सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (सीएसटी, बोस्टन, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। माउस मोनोक्लोनल एंटी-फ्लैग (F3165), खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-HA (H6908), और माउस मोनोक्लोनल एंटी-GAPDH (G9295) सिग्मा (सेंट लुइस, MO, यूएसए) से खरीदे गए थे। माउस मोनोक्लोनल एंटीफ्लैविवायरस समूह एंटीजन-एंटीबॉडी (MAB10216) मिलिपोर (मास, यूएसए) से खरीदा गया था। लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (11668-027) और ट्राइज़ोल (15596018) इनविट्रोजन कॉर्पोरेशन (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। पॉली(I:C) को इनविवोजेन (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था।

2.4. पट्टिका परख

सतह पर तैरनेवाला युक्त ZIKV को सीरम मुक्त DMEM और संक्रमित वेरो कोशिकाओं के साथ 2 घंटे के लिए एक 12-वेल प्लेट में पतला किया गया, इसके बाद 1 एमएल पीबीएस से दो बार धोया गया। 2% FBS और 2% कम पिघलने बिंदु agarose युक्त DMEM को 1:1 मात्रा अनुपात के अनुसार अच्छी तरह मिलाया गया था, और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल मिश्रण जोड़ा गया था। संक्रमित कोशिकाओं को 5-7 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धित किया गया। कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और 30 मिनट के लिए 0.5% क्रिस्टल वायलेट से रंगा गया। 12-वेल प्लेट को पानी से धोया गया, और प्लाक की गणना की गई।

2.5. लेंटवायरस का उत्पादन और संक्रमण

मानव DHCR7 के लिए shRNAs के लक्ष्यीकरण क्रम इस प्रकार थे: sh-DHCR 7-1: {{3}ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR 7-2: {{7}CGTGATTGACTTCTTCTGGAA { {8}}. नकारात्मक नियंत्रण (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) या विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रम के लिए एक स्क्रैम्बल shRNA वाले pLKO.1 वेक्टर को लिपोफ़ेक्टामाइन 2 के साथ psPAX2 और pMD2.G के साथ HEK293T कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। }00. सतह पर तैरनेवाला युक्त वायरल कणों को अभिकर्मक के बाद 36 घंटे में काटा गया और फिर 10 मिनट के लिए 210 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। कोशिका के मलबे को हटाने के लिए कोशिका-मुक्त सतह पर तैरनेवाला चरण को 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। U251 कोशिकाएं 8 ug/mL पॉलीब्रिन की उपस्थिति में लेंटीवायरल कणों से संक्रमित थीं। 48 घंटे के कल्चर के बाद, यू251 कोशिकाओं को पौरोमाइसिन (2 यूजी/एमएल, सिग्मा) के साथ चुना गया। Sh-DHCR7 की नॉक-डाउन दक्षता आरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी।

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2.6. पश्चिमी ब्लॉट

कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए बर्फ पर प्रोटीज इनहिबिटर और फॉस्फेटस इनहिबिटर के साथ पूरक आरआईपीए बफर द्वारा लाइज़ किया गया, फिर सेल को इकट्ठा करने के लिए 4 सी, 13, 000 जी पर 1 {{1 {{12 }}}} मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। lysate. सेल लाइसेट में प्रोटीन सांद्रता को बाइसिनकोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख द्वारा मापा गया था। प्रोटीन को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और फिर एक पॉलीविनाइल डिफ्लुओराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया। पीवीडीएफ झिल्ली को 1 घंटे के लिए 5% बीएसए युक्त इम्युनोब्लॉटिंग ब्लॉकिंग बफर टीबीएसटी (10 मिमीोल/एल ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 0.15 मोल/एल NaCl, और 0.05% ट्विन-20) से अवरुद्ध किया गया था। टीबीएसटी से धोने के बाद, झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी और दूसरे एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया और बाद में केमिलुमिनसेंस इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड) का उपयोग करके पता लगाया गया।

2.7. कुल कोलेस्ट्रॉल परख

कोशिकाओं में कुल कोलेस्ट्रॉल का पता अप्लाईजेन टेक्नोलॉजीज इंक. (बीजिंग, चीन) के ऊतक कुल कोलेस्ट्रॉल परख किट का उपयोग करके लगाया गया था। मानक वक्र खींचने के लिए 5 mmol/L कोलेस्ट्रॉल मानक को निर्जल इथेनॉल के साथ क्रमिक कमजोर पड़ने के अधीन किया गया था, और सेलुलर कुल कोलेस्ट्रॉल की मात्रा की गणना मानक वक्र के अनुसार की गई थी। निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रक्रिया का पालन करते हुए प्रयोग किया गया।

2.8. सह-प्रतिरक्षी अवक्षेपण परीक्षण

HEK293T कोशिकाओं को संकेतित प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। कोशिकाओं को एकत्र किया गया और प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक RIPA लिसीस बफर के साथ लाइज़ किया गया। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 18, {2}} ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल लाइसेट्स को एकत्र किया गया और फ्लैग-ट्रैप प्रोटीनजी सेफ़रोज़ (जीई हेल्थकेयर, मिल्वौकी, डब्ल्यूआई, यूएसए) द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्रतिरक्षित किया गया। बाध्य प्रोटीन 2 लोडिंग बफर के साथ सुधार किया गया और इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया।

2.9. वास्तविक समय पीसीआर

TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen Life Technologies) का उपयोग करके कोशिकाओं से कुल RNA निकाले गए, और M-MLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट (Promega, Madison, WI, USA) के साथ cDNA का उत्पादन किया गया। रोश एलसी480 पर एसवाईबीआर आरटी-पीसीआर किट (डीबीआई बायो-साइंस) का उपयोग करके आरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। ग्लिसराल्डिहाइड -3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच) एमआरएनए को एमआरएनए को सामान्य करने के लिए अंतर्जात संदर्भ के रूप में सेट किया गया था और जीन अभिव्यक्ति के स्तर की गणना 2 ΔΔCT विधि का उपयोग करके की गई थी। आरटी-पीसीआर प्राइमरों के क्रम को पूरक तालिका एस1 में दिखाया गया है। 2.10. संनाभि माइक्रोस्कोपी

U251 कोशिकाओं को प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 3 0 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया, फिर पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटनएक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ प्रवेश कराया गया। पीबीएस से धोने के बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 5% बीएसए युक्त पीबीएस से सील कर दिया गया। कोशिकाओं को पीबीएस से तीन बार धोया गया और एंटी-एचए, एंटी-फ्लैग और एंटी-फ्लेविवायरस के साथ इनक्यूबेट किया गया, फिर एंटी-माउस एफआईटीसी और एंटी-खरगोश Cy3 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को 40,6-डायमिडीनो-2-फिनाइलिंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (डीएपीआई) से रंगा गया और एक ओलंपस कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया।

2.11. जीएसटी पुल-डाउन परख

प्लास्मिड pGEX6p-1-NS4B को एस्चेरिचिया कोली (ई. कोली) स्ट्रेन BL21 में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। जीएसटी और जीएसटी-एनएस4बी को आईपीटीजी द्वारा 0.5 एमएमओएल/एल की अंतिम सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया था, और संस्कृतियों को 37 सी पर अतिरिक्त 6-8 घंटे के लिए उगाया गया था। और फिर जीएसटी प्रोटीन और जीएसटी- NS4B प्रोटीन को ई. कोलाई बैक्टीरिया से शुद्ध किया गया। जीएसटी या जीएसटी-एनएस4बी प्रोटीन को ग्लूटाथियोन सेफ़रोज़ बीड्स (नोवाजेन) के साथ इनक्यूबेट किया गया और पीबीएस से तीन बार धोया गया। जीएसटी और जीएसटी-एनएस4बी प्रोटीन को यूकेरियोटिक संलयन प्रोटीन एचए-डीएचसीआर7 के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जो प्लास्मिड एन्कोडिंग एचए-डीएचसीआर से उत्पन्न हुआ था, जो HEK293T सेल लाइसेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए व्यक्त करता है। अवक्षेप को पांच बार धोया गया, उबाला गया। 2 एसडीएस लोडिंग बफर, और एंटी-जीएसटी और एंटी-एचए एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा पता लगाया गया।

2.12. HA-DHCR7 साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन

उत्परिवर्तजन प्राइमरों (पूरक तालिका एस 1) के उपयुक्त जोड़े को संश्लेषित किया गया और पीसीआर द्वारा उत्परिवर्तित निर्माण उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया। HA-DHCR7 का उपयोग प्राइमस्टार® एचएस प्रीमिक्स (तकरा) के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था। पीसीआर के बाद, पीसीआर उत्पाद में बचे जंगली प्रकार के प्लास्मिड को डीपीएनआई (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) द्वारा चुनिंदा रूप से पचाया गया। पचे हुए पीसीआर उत्पाद को ई. कोली स्ट्रेन डीएच5 में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। वांछित उत्परिवर्ती की पुष्टि सेंगर अनुक्रम विश्लेषण द्वारा की गई थी।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

2.13. सांख्यिकीय विश्लेषण

समान परिणामों के साथ सभी प्रयोगों को कम से कम तीन बार दोहराया गया। डेटा को माध्य मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। परिवर्तनशीलता का महत्व दो-समूह के लिए छात्र के दो-पूंछ वाले अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा या डननेट के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा या ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एकाधिक समूह तुलनाओं के लिए सिडक के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था। (संस्करण 8.0.1). P < 0.{{10}}5 के मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था, और P > 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन के रूप में पहचाना गया था। सभी डेटा के लिए, महत्व को *P <0.05, **P <0.01 और ***P <0.001 के रूप में प्रस्तुत किया गया था।

3। परिणाम

3.1. ZIKV संक्रमण DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है

एकत्रित साक्ष्यों से पता चला है कि कोलेस्ट्रॉल चयापचय, ZIKV और डेंगू वायरस (DENV) जैसे फ्लेविवायरस संक्रमण के खिलाफ मेजबान की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है (लेयर एट अल।, 2020; रान्डेल, 2018)। डीएचसीआर7 एक एंजाइम को एनकोड करता है जो डीएचसी को कोलेस्ट्रॉल में बदल देता है, जो कोलेस्ट्रॉल के जैवसंश्लेषण का अंतिम चरण है (मोएबियस एट अल., 1998)। हमने पहली बार ZIKV संक्रमण पर DHCR7 अभिव्यक्ति का पता लगाया। मानव एस्ट्रोसाइट U251 ZIKV से संक्रमित था, जिसने खुराक पर निर्भर होकर mRNA और प्रोटीन दोनों पर DHCR7 अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया (चित्र 1A-C)। घटना की पुष्टि करने के लिए, हमने अगली बार वेरो कोशिकाओं में DHCR7 अभिव्यक्ति की जांच की और पाया कि ZIKV संक्रमण ने DHCR7 अभिव्यक्ति (चित्र 1D-F) को काफी हद तक प्रेरित किया, जो U251 कोशिकाओं में परिणामों के अनुरूप था।

सिस्तांचे के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत बनाना

3.2. DHCR7 को लक्षित करने से एक महत्वपूर्ण ZIKV विरोधी गतिविधि प्राप्त होती है

ZIKV संक्रमण के विरुद्ध DHCR7 के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, U251 और A549 कोशिकाओं को HA-DHCR7 एन्कोडिंग प्लास्मिड से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और फिर ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया। परिणामों से पता चला कि DHCR7 ओवरएक्सप्रेशन ने ZIKV mRNA अभिव्यक्ति (छवि 2 ए और बी) को काफी बढ़ाया है। विशेष रूप से, DHCR7 प्रोटीन के संचय के साथ, ZIKV संरचनात्मक प्रोटीन E की अभिव्यक्ति भी बढ़ गई थी (चित्र 2C और D)। इसके अलावा, हमने चित्र 2सी से सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करके एक पट्टिका परख की और पाया कि नियंत्रण समूह (चित्र 2ई और एफ) की तुलना में डीएचसीआर7 ओवरएक्सप्रेशन काफी हद तक पट्टिका बनाने वाली इकाइयों में बढ़ गया है। बताया गया है कि डीएचसीआर7 का गलत उत्परिवर्तन जी410एस एंजाइम गतिविधि को खत्म कर देता है (फिट्ज़की एट अल., 1998; शिम एट अल., 2004; विट्च-बॉमगार्टनर एट अल., 2000)। ZIKV संक्रमण पर DHCR7 के प्रभावों को और अधिक निर्धारित करने के लिए, हमने DHCR7 (G410S) के एक निष्क्रिय उत्परिवर्ती का निर्माण किया। DHCR7 के जंगली-प्रकार की तुलना में, G410S उत्परिवर्ती ZIKV संक्रमण को महत्वपूर्ण रूप से रोक सकता है (चित्र 2G)। हमने अवलोकन की पुष्टि के लिए एक कन्फोकल माइक्रोस्कोपी परख भी की। जैसा कि चित्र 2H में दिखाया गया है, DHCR7 की अधिक अभिव्यक्ति से ZIKV संक्रमण बढ़ गया। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अंतर्जात DHCR7 एंजाइम गतिविधि ZIKV संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है, हमने विशेष रूप से DHCR7 को लक्षित करते हुए दो छोटे हेयरपिन आरएनए (shDHCR 7-1 और sh-DHCR 7-2) डिज़ाइन किए और DHCR 7- मौन U251 सेल उत्पन्न किया। shRNA प्रणाली वाली लाइनें (चित्र 3ए)। अंत में, हमने इसकी उच्च साइलेंसिंग दक्षता के लिए एक sh-DHCR7-1 का चयन किया। सेल लाइन ट्रांसड्यूस्ड कंट्रोल shRNA की तुलना में, इन DHCR7 नॉकडाउन कोशिकाओं ने ZIKV संक्रमण के प्रति कम संवेदनशीलता दिखाई (चित्र 3बी और सी)। इसके बाद हमने चयनात्मक DHCR7 अवरोधक AY9944 का उपयोग किया, जो कि DHC को कोलेस्ट्रॉल (जू एट अल., 2011) में परिवर्तित होने से रोकता है, जिसे डीएचसीआर7 एंजाइम गतिविधि को बाधित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है (हॉर्लिक, 1966; मोएबियस एट अल., 1998)। नियंत्रण की तुलना में, AY9944 प्रशासन खुराक-निर्भरता से U251 कोशिकाओं में ZIKV संक्रमण को रोकता है (चित्र 3D-F)। डीएचसीआर7 के प्रभावों का और अधिक आकलन करने के लिए वेरो कोशिकाओं में प्लाक परख भी की गई और दिखाया गया कि AY9944 ZIKV संक्रमण को महत्वपूर्ण रूप से दबा सकता है (चित्र 3जी और एच)। विशेष रूप से, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चला कि ZIKV E प्रोटीन AY9944 (छवि 3I) की उपस्थिति में काफी कम हो गया था। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि DHCR7 को लक्षित करने से ZIKV संक्रमण को रोका जा सकता है।

चित्र 1. ZIKV संक्रमण DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। A-F U251 और वेरो कोशिकाएं 24 घंटे के लिए ZIKV (MOI=0, 1 और 2) से संक्रमित थीं, और ZIKV (A, D) और DHCR7 (B, E) के इंट्रासेल्युलर आरएनए स्तर निर्धारित किए गए थे। आंतरिक नियंत्रण के रूप में GAPDH के साथ RT-पीसीआर। DHCR7 और ZIKV लिफ़ाफ़े के सापेक्ष प्रोटीन स्तर का पता वेस्टर्न ब्लॉट (C, F) द्वारा लगाया गया। डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब एसडी) या प्रतिनिधि डेटा (सी, एफ) से हैं। डननेट के एकाधिक तुलना परीक्षण (ए, बी, डी, ई) के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व की गणना की गई थी। **पी < 0.01, ***पी < 0.001. एसडी, मानक विचलन।

3.3. DHCR7 IFN- और ISGs उत्पादन को कम करने के लिए TBK1 और IRF3 सक्रियण को रोकता है

चूंकि DHCR7, 7-DHC को कोलेस्ट्रॉल में परिवर्तित करने के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम है (मोएबियस एट अल., 1998) और ZIKV संक्रमण DHCR7 की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है, इसलिए हमने ZIKV संक्रमण पर कोलेस्ट्रॉल के स्तर को मापा। हमने खुलासा किया कि ZIKV संक्रमण का U251 और वेरो कोशिकाओं (चित्र 4A और B) में कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है, हालाँकि DHCR7 बढ़ा हुआ था (चित्र 1A-D)। ZIKV संक्रमण पर बढ़े हुए DHCR7 और ZIKV संक्रमण का सामना करने में IFN की प्रमुख भूमिकाओं को देखते हुए, हमने आगे IFN-I सिग्नलिंग मार्ग पर DHCR7 के प्रभाव को निर्धारित किया। नियंत्रण और डीएचसीआर 7- साइलेंसिंग यू251 कोशिकाओं को ZIKV से संक्रमित किया गया था या पॉली (I: C) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और IFN- अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में, ZIKV संक्रमण या पॉली (I: C) उपचार ने DHCR में IFN-अभिव्यक्ति को स्पष्ट रूप से बढ़ाया है 7- U251 कोशिकाओं को शांत करता है (चित्र 4C और D)। आईएसजी इंटरफेरॉन क्रियाओं के प्रभावकारक हैं और ZIKV संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा रक्षा में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। हमने यह भी प्रदर्शित किया कि डीएचसीआर7 को अवरुद्ध करने से एमआरएनए और प्रोटीन दोनों स्तरों पर आईएसजी15 और आईएसजी56 अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से सुदृढ़ किया जा सकता है (चित्र 4ई-जे)। लगातार, DHCR7 अवरोधक AY9944 उपचार IFN-, ISG15 और ISG56 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है (चित्र 4K, L)। महत्वपूर्ण बात यह है कि निष्क्रिय उत्परिवर्ती G410S IFN- और ISG अभिव्यक्ति (चित्र 4M, N) पर DHCR7 के निरोधात्मक प्रभावों को आंशिक रूप से उलट सकता है। IFNs-ISGs प्रेरण के लिए TBK1 और IRF3 सक्रियण आवश्यक है, इस प्रकार, हमने अगली बार TBK1 और IRF3 अभिव्यक्ति और सक्रियण पर DHCR7 के प्रभाव की जांच की। हमने प्रदर्शित किया कि डीएचसीआर7 ने न केवल खुराक-निर्भरता से प्रोटीन स्तर को बाधित किया, बल्कि टीबीके1 और आईआरएफ3 फॉस्फोराइलेशन (चित्र 5ए-सी) के स्तर को भी दबा दिया। इसके अलावा, निष्क्रिय उत्परिवर्ती G410S ने IRF3 और TBK1 फॉस्फोराइलेशन (चित्र 5D) पर DHCR7 के निरोधात्मक प्रभावों को अपूर्ण रूप से उलट दिया। DHCR7 ओवरएक्प्रेशन के निष्कर्षों के साथ असंगत, AY9944 उपचार U251 सेल में IRF3 और TBK1 सक्रियण को प्रेरित कर सकता है (चित्र 5E)।

3.4. ZIKV NS4B TBK1 और IRF3 फॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए DHCR7 के साथ इंटरैक्ट करता है

बढ़ते सबूतों से पता चला है कि ZIKV ने विशिष्ट तंत्रों के माध्यम से मेजबान जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा से सीधे बचकर मेजबान कोशिकाओं में कुशल प्रतिकृति की सुविधा के लिए विशिष्ट एनएस प्रोटीन विकसित किया है। हमने व्यक्तिगत ZIKV NS प्रोटीन की जांच के लिए एक सह-आईपी परख की, जो DHCR7 के साथ बातचीत कर सकता है। HEK293T कोशिकाओं को pCMV-DHCR 7-HA और फ़्लैग-टैग के साथ जुड़े हुए व्यक्तिगत NS प्रोटीन को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। जैसा कि चित्र 6ए में दिखाया गया है, डीएचसीआर7 केवल एनएस4बी से बंधता है लेकिन अन्य एनएस प्रोटीन के साथ बातचीत करने में विफल रहता है। पारस्परिक सह-आईपी परीक्षण आगे किए गए और पता चला कि NS4B प्रोटीन HEK293T कोशिकाओं में DHCR7 के साथ परस्पर क्रिया करता है (चित्र 6B और C)। NS4B और DHCR7 की परस्पर क्रिया की पुष्टि करने के लिए, हमने अगली बार एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप का प्रदर्शन किया और पाया कि NS4B प्रोटीन और DHCR7 प्रोटीन साइटोप्लाज्म में कोलोकलाइज़्ड थे (चित्र 6D)। जीएसटी पुल-डाउन परख ने एनएस4बी और डीएचसीआर7 (चित्र 6ई) की परस्पर क्रिया को और प्रदर्शित किया। इसके अलावा, U251 कोशिकाओं में NS4B का क्षणिक अभिकर्मक नाटकीय रूप से DHCR7 अभिव्यक्ति (छवि 6F) को प्रेरित कर सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, NS4B खुराक-निर्भरता से TBK1 और IRF3 दोनों के फॉस्फोराइलेशन को अवरुद्ध कर सकता है, जो DHCR7 (चित्र 6G और H) के जवाब में TBK1 और IRF3 की बढ़ी हुई सक्रियता के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध था। हालाँकि, HEK293T कोशिकाओं में NS4B ओवरएक्प्रेशन ने TBK1 के प्रोटीन स्तर को काफी कम कर दिया, लेकिन IRF3 प्रोटीन (छवि 6G और H) पर बहुत कम प्रभाव पड़ा। इन अवलोकनों की और पुष्टि करने के लिए, NS4B को DHCR7 नॉकडाउन U251 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और TBK1 और IRF3 (चित्र 6I) के अंतर्जात प्रोटीन और फॉस्फोराइलेशन स्तरों पर निरोधात्मक प्रभाव दिखाया गया। एक साथ लेने पर, इन परिणामों से पता चला कि ZIKV NS4B ने DHCR7 के साथ बातचीत की और TBK1 और IRF3 सक्रियण को अवरुद्ध करने और फिर ZIKV संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए DHCR7 अभिव्यक्ति को बढ़ाया।

चित्र 2. DHCR7 की अत्यधिक अभिव्यक्ति ZIKV प्रतिकृति को बढ़ावा देती है। A-D U251 और A549 कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए संकेतित सांद्रता पर HA-वेक्टर या HA-DHCR7 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और फिर अगले 36 घंटे के लिए ZIKV से संक्रमित किया गया। ZIKV RNA स्तर का पता आंतरिक नियंत्रण (A, B) के रूप में GAPDH के साथ RT-पीसीआर द्वारा लगाया गया था, और ZIKV लिफाफे, HA-DHCR7 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता वेस्टर्न ब्लॉट (C, D) द्वारा लगाया गया था। ई, एफ वेरो कोशिकाओं को प्लाक परख द्वारा ZIKV प्रतियां निर्धारित करने के लिए 48 घंटे के लिए चित्र 2C से ZIKV युक्त सतह पर तैरनेवाला से संक्रमित किया गया था। G U251 कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए HA-वेक्टर, HA-DHCR7, या HA-DHCR7 (G410S) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 36 घंटे के लिए ZIKV से संक्रमित किया गया, और ZIKV लिफाफे के प्रोटीन स्तर, HA-DHCR7 और GAPDH का पता वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा लगाया गया। H U251 कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए HA-वेक्टर या HA-DHCR7 (1 ug) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 36 घंटे के लिए ZIKV से संक्रमित किया गया, और बाद में FITC-संयुग्मित एंटीमाउस के साथ दागने के बाद माउस एंटी-फ्लेविवायरस और खरगोश एंटी-HA एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। Cy3-संयुग्मित खरगोश-विरोधी माध्यमिक एंटीबॉडी। केन्द्रक डीऐपीआई के धब्बे वाले थे। छवियों को कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था। स्केल बार ¼ 100 μm. डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब एसडी) या प्रतिनिधि डेटा (सी, डी, ई, जी, एच) से हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के दो-पूंछ वाले अयुग्मित टी-परीक्षण (एफ) या डननेट के एकाधिक तुलना परीक्षण (ए, बी) के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की गई थी। *पी <0.05, ***पी <0.001। एसडी, मानक विचलन।

4। चर्चा

टाइप I IFN और उनके डाउनस्ट्रीम ISG रोगजनकों की एक बड़ी श्रृंखला का सामना करते हैं और ZIKV के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं (Lazear et al., 2016)। IFN-मध्यस्थता निगरानी से बचने और पर्याप्त प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, ZIKV सेलुलर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली से भागने के लिए IFN सिग्नलिंग मार्ग के विभिन्न बिंदुओं को लक्षित करने वाले NS प्रोटीन विकसित करता है (ली एट अल।, 2021)। बढ़ते अध्ययनों से पता चला है कि ZIKV NS1, NS3, NS4A, और NS5 RIG-I/IFN-I मार्ग के अलग-अलग मॉड्यूल को रोकते हैं और स्वतंत्र और विविध तंत्रों का उपयोग करके वायरल संक्रमण की सुविधा प्रदान करते हैं (ग्रांट एट अल., 2016; कुमार एट अल., 2016) ; मा एट अल., 2018; रीडल एट अल., 2019; ज़िया एट अल., 2018; झेंग एट अल., 2018)। हालाँकि, प्रतिरक्षा प्रतिबंध का प्रतिकार करने वाले ZIKV NS4B के विशिष्ट तंत्र को खराब रूप से परिभाषित किया गया है। ZIKV NS4B एक अत्यंत हाइड्रोफोबिक प्रोटीन है जिसमें 251 अमीनो एसिड होते हैं और यह एन-टर्मिनल (ज़ोउ एट अल., 2014) के साथ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली में स्थित होता है। IFN-I सिग्नलिंग मार्ग के NS4B निषेध को विभिन्न फ्लेविवायरस (डिंग एट अल., 2013; मुनोज-जॉर्डन एट अल., 2003, 2005; शान एट अल., 2021; यी एट अल., 2016; झांग एट) में पहचाना गया है। अल., 2021). एक हालिया अध्ययन में बताया गया है कि ब्राजील में अलग किया गया ZIKV INMI1 स्ट्रेन STAT1 फॉस्फोराइलेशन को कुचलकर IFN-I सिग्नलिंग मार्ग के डाउनस्ट्रीम को रोकने के लिए NS4B का उपयोग करता है और परिणामस्वरूप STAT1 परमाणु परिवहन को बाधित करता है (फैनुंजा एट अल।, 2021)। इस अध्ययन में, हमें एक अलग तंत्र मिला जिसमें ZIKV NS4B ने IFN-I सिग्नलिंग मार्ग के अपस्ट्रीम घटक, TBK1 और IRF3 फॉस्फोराइलेशन को दबाकर IFN- उत्पादन को समाप्त कर दिया। विशेष रूप से, ZIKV NS4B में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन (G18R) की खोज की गई है, जिसने IFN- उत्पादन में कमी और ISG अभिव्यक्ति को कमजोर करने में योगदान दिया, और परिणामस्वरूप चूहों में वायरल संक्रमण को सुविधाजनक बनाया, जो रोगजनन के निर्धारक के रूप में NS4B के महत्व को दर्शाता है (गोर्मन एट अल) ., 2018). उभरते साक्ष्यों ने जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग लेने वाले कोलेस्ट्रॉल चयापचय के महत्वपूर्ण महत्व का संकेत दिया (अकुला एट अल., 2016; डांग एट अल., 2017; रेबोल्डी एट अल., 2014; यॉर्क एट अल., 2015)। हालाँकि कोलेस्ट्रॉल चयापचय में कई मध्यवर्ती पदार्थों में व्यापक एंटीवायरल प्रभाव होने का दस्तावेजीकरण किया गया है (ब्लैंक एट अल., 2013; ली एट अल., 2017; लियू एट अल., 2013; जिओ एट अल., 2020), हमारे अध्ययन ने एक उपन्यास तंत्र का वर्णन किया है वायरल संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए TBK1 और IRF3 सक्रियण को कम करके कोलेस्ट्रॉल चयापचय एंजाइम DHCR7 ZIKV संक्रमण में शामिल था। डेस्मोस्टेरॉल और कोलेस्ट्रॉल चयापचय में शामिल एक प्रमुख एंजाइम के रूप में, डीएचसीआर7 यूवीबी के संपर्क में आने वाली त्वचा कोशिकाओं में डीएचसी को विटामिन डी में परिवर्तित करने के स्विच का प्रतिनिधित्व करता है (प्रभु एट अल।, 2016बी)। इसके अलावा, डीएचसीआर7 न केवल बलोच मार्ग के प्रवेश द्वार पर स्थित है, बल्कि कांडुतश-रसेल मार्ग (प्रभु एट अल., 2016ए, 2016बी) के अंत में भी स्थित है, जो कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। डीएचसीआर7 का क्रॉसस्टॉक और कई मार्गों में अन्य एंजाइमों के साथ इसकी बातचीत विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं या अंगों में कई कार्यों को सशक्त बना सकती है। पिछले अध्ययन से पता चला है कि डीएचसीआर7 को अवरुद्ध करने से कोलेस्ट्रॉल बायोसिंथेसिस के तत्काल अग्रदूत डेस्मोस्टेरॉल कम हो सकता है, जिससे एचसीवी संक्रमण के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षा मिलती है (लू एट अल., 2015; रोजर्स एट अल., 2012)। महत्वपूर्ण रूप से, जिओ एट अल। दिखाया गया है कि वीएसवी संक्रमण से डीएचसीआर7 की अभिव्यक्ति कम हो जाती है, जिससे कोलेस्ट्रॉल कम हो जाता है, लेकिन मैक्रोफेज और लीवर में डीएचसी का संचय बहुत अधिक हो जाता है (जिओ एट अल., 2020)। 7-डीएचसी से उपचारित मैक्रोफेज ने एक उन्नत एंटीवायरल प्रतिक्रिया प्रदान की; जबकि कोलेस्ट्रॉल के जुड़ने से मामूली सुरक्षा दिखाई दी। डीएचसीआर7 अवरोधक और 7-डीएचसी का प्रशासन एचआईएन1, एचएसवी और वीएसवी जैसे वायरल संक्रमणों से निपटने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण हो सकता है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि DHCR7 अवरोधक AY9944 ZIKV संक्रमण को दबा सकता है। हालाँकि, हमारे अध्ययन से पता चला कि ZIKV संक्रमण ने DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, लेकिन ग्लियाल कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण पर बहुत कम प्रभाव पड़ा। हमने ZIKV संक्रमण के बाद DHC अभिव्यक्ति के स्तर की जांच नहीं की, फिर भी, यह आगे की जांच के लायक है कि क्या ZIKV से संक्रमित रोगियों के इलाज के लिए DHC और AY9944 में सहक्रियात्मक रूप से चिकित्सीय प्रभावकारिता है। मस्तिष्क में संक्रमण. DHCR7 ओवरएक्प्रेशन ने ZIKV संक्रमण को बढ़ावा दिया, जबकि DHCR7 चयनात्मक अवरोधक (AY9944) उपचार ने ZIKV संक्रमण के खिलाफ IFN- उत्पादन में जोरदार वृद्धि की। IFN-I सिग्नलिंग को भड़काने के लिए TBK1 और IRF3 सक्रियण महत्वपूर्ण है। पिछली जांच से पता चला है कि DHCR7 साइलेंसिंग या 7-DHC उपचार ने IRF3 को फॉस्फोराइलेट करने के लिए PI3K-AKT3 मार्ग को सक्रिय किया है, लेकिन मैक्रोफेज में TBK1 को नहीं (जिओ एट अल।, 2020)। फिर भी, हमारे निष्कर्षों से पता चला कि DHCR7 खुराक-निर्भरता ने IRF3 और TBK1 अभिव्यक्ति, साथ ही IRF3 और TBK1 फॉस्फोराइलेशन दोनों को कम कर दिया। इन जांचों से पता चला कि DHCR7 मस्तिष्क में कोलेस्ट्रॉल चयापचय-स्वतंत्र तंत्र में ZIKV संक्रमण में योगदान दे सकता है। यह अच्छी तरह से स्पष्ट किया गया है कि ZIKV ने प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने और वायरल प्रतिकृति की सुविधा के लिए RIG-I/IFN-I मार्ग के विभिन्न घटकों के साथ सीधे बातचीत करने के लिए NS प्रोटीन का उपयोग किया। हमने पहले IFN- उत्पादन को कम करने के लिए RIG-I के साथ ZIKV NS5 की परस्पर क्रिया की सूचना दी थी (Li et al., 2020)। दूसरों ने प्रदर्शित किया कि ZIKV NS1 और NS2B ने TBK1 को लक्षित किया, NS3 ने IFN-I और ISGs उत्पादन को कम करने के लिए RIG-I और MDA5 को लक्षित किया (ली एट अल., 2021; रिडल एट अल., 2019)। हालाँकि, कोलेस्ट्रॉल चयापचय को लक्षित करने वाले ZIKV NS प्रोटीन का कार्य काफी हद तक मायावी बना हुआ है। इस अध्ययन में, हमने कोलेस्ट्रॉल चयापचय एंजाइम DHCR7 और ZIKV NS प्रोटीन के बीच एक अप्रमाणित बातचीत का भी वर्णन किया है। हमने दिखाया कि डीएचसीआर7 विशेष रूप से एनएस4बी से जुड़ा है, अन्य एनएस प्रोटीन से नहीं। हमने महत्वपूर्ण सबूत प्रदान किए कि ZIKV NS4B ने DHCR7 के साथ बातचीत की, और इसकी अभिव्यक्ति को काफी हद तक प्रेरित किया, जो ZIKV संक्रमण पर U251 कोशिकाओं के परिणामों के अनुरूप था। महत्वपूर्ण रूप से, DHCR7 और ZIKV NS4B की सहभागिता को सीधे प्रदर्शित करने के अलावा, हमने यह भी पाया कि ZIKV NS4B ने TBK1 और IRF3 फॉस्फोराइलेशन को रोकने और ZIKV संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए DHCR7 अभिव्यक्ति को बढ़ाया। हमारे परिणामों से सहमत होकर, एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि डीएचसीआर7 की कमी मैक्रोफेज में वीएसवी और अन्य वायरस को रोकने के लिए आईआरएफ3 और आईएफएन-सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकती है।

चित्र 3. DHCR7 के नष्ट होने से U251 कोशिकाओं में ZIKV संक्रमण कम हो जाता है। U251 कोशिकाओं को DHCR7 (shDHCR 7-1 और sh-DHCR 7-2) या एक गैर-लक्ष्य अनुक्रम (sh-NTC) के विरुद्ध shRNA युक्त लेंटिवायरल कणों के साथ स्थानांतरित किया गया, इसके बाद 14 दिनों के लिए पौरोमाइसिन का चयन किया गया। नॉकडाउन दक्षता आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। B, C DHCR7-साइलेंसिंग U251 (sh-DHCR7) और sh-NTC U251 कोशिकाएं 36 घंटे के लिए नकली संक्रमित या ZIKV संक्रमित (MOI=1) थीं। इंट्रासेल्युलर ZIKV RNA स्तर का पता RT-पीसीआर द्वारा GAPDH के साथ आंतरिक नियंत्रण (B) के रूप में लगाया गया था और ZIKV लिफाफे, DHCR7 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता वेस्टर्न ब्लॉट (C) द्वारा लगाया गया था। D, E U251 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए संकेतित सांद्रता पर DHCR7 अवरोधक AY9944 के साथ इलाज किया गया, फिर 48 घंटे के लिए ZIKV (MOI=1) के साथ संक्रमण किया गया। ZIKV RNA (D) का पता लगाने के लिए कोशिकाओं को RT-पीसीआर के अधीन किया गया। ZIKV लिफाफे, DHCR7 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता वेस्टर्न ब्लॉट (E) द्वारा लगाया गया। F U251 कोशिकाओं को 36 घंटे के लिए संकेतित एकाग्रता पर DHCR7 अवरोधक AY9944 के साथ इलाज किया गया था, और DHCR7 और GAPDH का पश्चिमी धब्बा द्वारा पता लगाया गया था। जी, एच वेरो कोशिकाओं को प्लाक परख द्वारा ZIKV प्रतियां निर्धारित करने के लिए 48 घंटे के लिए चित्र 3E से ZIKV युक्त सतह पर तैरनेवाला से संक्रमित किया गया था। I U251 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए संकेतित एकाग्रता पर AY9944 के साथ इलाज किया गया, फिर 36 घंटे के लिए MOI ¼ 1 पर ZIKV के साथ संक्रमण किया गया। छवियों को कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था। स्केल बार ¼ 100 μm. डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब एसडी) या प्रतिनिधि डेटा (सी, ई, एफ, जी, और आई) से हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना डननेट के एकाधिक तुलना परीक्षण (ए, डी, एच) के साथ एक-तरफ़ा एनोवा या सिडक के एकाधिक तुलना परीक्षण (बी) के साथ दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की जाती है। ***पी <0.001. एसडी, मानक विचलन।

चित्र 4. DHCR7 IFN- और ISG उत्पादन को रोकता है। A, B U251, और वेरो कोशिकाएं 24 घंटे के लिए ZIKV (MOI=0, 0.5, और 1) से संक्रमित थीं और सेलुलर कोलेस्ट्रॉल को ऊतक कुल कोलेस्ट्रॉल परख किट द्वारा मापा गया था। C-H DHCR7-साइलेंसिंग U251 (sh-DHCR7) और sh-NTC U251 कोशिकाओं को ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया या 6 घंटे के लिए पॉली (I: C) (1 ug/mL) से उपचारित किया गया। कुल सेलुलर आरएनए को निकाला गया और आंतरिक नियंत्रण के रूप में जीएपीडीएच के साथ एमआरएनए अभिव्यक्ति के लिए आरटी-पीसीआर के अधीन किया गया। मॉक ग्रुप में आईएफएन- और आईएसजी की सापेक्ष अभिव्यक्ति को एसएच-एनटीसी नमूनों के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और गुना परिवर्तन अनियमित दिखाए गए थे। आईएफएन- (सी, डी), आईएसजी15 (ई, एफ) और आईएसजी56 (जी, एच)। I, J DHCR7-साइलेंसिंग U251 (sh-DHCR7) और sh-NTC U251 कोशिकाओं को ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया या 24 घंटे के लिए पॉली (I: C) (1 ug/mL) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। और ISG15, ISG56 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा लगाया गया। K U251 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए AY9944 की संकेतित खुराक के साथ इलाज किया गया, फिर 6 घंटे के लिए ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया। आंतरिक नियंत्रण के रूप में GAPDH के साथ RT-पीसीआर द्वारा IFN- RNA स्तर का पता लगाया गया। L U251 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए AY9944 की संकेतित खुराक के साथ इलाज किया गया और फिर 24 घंटे के लिए ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा ISG15, ISG56 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता लगाया गया। एम यू251 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एचए-वेक्टर, एचए-डीएचसीआर7, या एचए-डीएचसीआर7 (जी410एस) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 6 घंटे के लिए ज़िकवी (एमओआई=1) से संक्रमित किया गया। आंतरिक नियंत्रण के रूप में GAPDH के साथ RT-पीसीआर द्वारा IFN- RNA स्तर का पता लगाया गया। एन यू251 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एचए-वेक्टर, एचए-डीएचसीआर7, या एचए-डीएचसीआर7 (जी41{{77%)एस) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और फिर 24 घंटे के लिए ज़िकवी (एमओआई=1) से संक्रमित किया गया। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा ISG15, ISG56 और GAPDH के प्रोटीन स्तर का पता लगाया गया। डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब एसडी) या प्रतिनिधि डेटा (आई, जे, एल, एन) से हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना डननेट के एकाधिक तुलना परीक्षण (ए, बी, के, एम) के साथ एक-तरफ़ा एनोवा या सिडक के एकाधिक तुलना परीक्षण (सी-एच) के साथ दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की जाती है। एनएस, पी > 0.05, ***पी < 0.001। एसडी, मानक विचलन।

चित्र 5. DHCR7 TBK1 और IRF3 सक्रियण को रोकता है। ए, बी HEK293T कोशिकाओं को प्लास्मिड या खाली वेक्टर (ए) को व्यक्त करने वाले डीएचसीआर 7- के साथ टीबीके {{6}कोडिंग प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। HEK293T कोशिकाओं को IRF एन्कोडिंग प्लास्मिड, RIG-I एन्कोडिंग प्लास्मिड, साथ में DHCR व्यक्त प्लास्मिड या खाली वेक्टर (बी) के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को एकत्र किया गया और संकेतित एंटीबॉडीज [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी-आईआरएफ3, एंटी-पीआईआरएफ3(एस396), एंटी-एचए और एंटी-जीएपीडीएच के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया। ]. सी यू251 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए प्लास्मिड या खाली वेक्टर व्यक्त करते हुए डीएचसीआर7 की संकेतित खुराक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। कोशिकाओं को संक्रमण के 6 घंटे बाद ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया और संकेतित एंटीबॉडी [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी-आईआरएफ3, एंटी-पी-आईआरएफ3() के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया। S396), एंटी-एचए, और एंटी-जीएपीडीएच]। D U251 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए HA-वेक्टर, HA-DHCR7 या HA-DHCR7 (G410S) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। कोशिकाओं को संक्रमण के 6 घंटे बाद ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी-आईआरएफ3, एंटी-पीआईआरएफ3(एस396) , एंटी-एचए, और एंटी-जीएपीडीएच]। E U251 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए AY9944 की संकेतित खुराक के साथ इलाज किया गया और 6 घंटे के लिए ZIKV (MOI=1) से संक्रमित किया गया, फिर संकेतित एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी -IRF3, एंटी-P-IRF3(S396), और एंटी-GAPDH]। डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से हैं और प्रतिनिधि डेटा (ए-ई) के रूप में दिखाए गए हैं।

चित्र 6. ZIKV NS4B TBK1 और IRF3 फॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए DHCR7 के साथ इंटरैक्ट करता है। HEK293T कोशिकाओं को प्लास्मिड एन्कोडिंग HA-DHCR7, और प्लास्मिड एन्कोडिंग ZIKV गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B, और FLAG-NS5) या 3 के लिए खाली नियंत्रण प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। 0 एच. सेल लाइसेट्स को एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षित किया गया और फिर संकेतित एंटीबॉडी के साथ इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया। बी, सी HEK293T कोशिकाओं को प्लास्मिड एन्कोडिंग HA-DHCR7, प्लास्मिड एन्कोडिंग FLAG-NS4B, या 30 घंटे के लिए खाली नियंत्रण प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। सेल लाइसेट्स को एंटी-एचए एंटीबॉडी (बी) या एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी (सी) के साथ प्रतिरक्षित किया गया और फिर संकेतित एंटीबॉडी के साथ इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया। D U251 कोशिकाओं को HA-DHCR7 के साथ प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ FLAG-NS4B प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। FLAG-NS4B (हरा), HA-DHCR7 (लाल), न्यूक्लियस मार्कर DAPI (नीला) और मर्ज के स्थानीयकरण का विश्लेषण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से किया गया। स्केल बार ¼ 10 μm. एचए-डीएचसीआर7 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए HEK293T कोशिकाओं से ई सेल लाइसेट्स को जीएसटी प्रोटीन या जीएसटी-एनएस4बी प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसे ग्लूटाथियोन-सेफ़रोज़ मोतियों के साथ इनक्यूबेट किया गया था। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा एंटी-एचए और एंटी-जीएसटी एंटीबॉडी (शीर्ष) के साथ मिश्रण का पता लगाया गया। ट्रांसफ़ेक्टेड HEK293T कोशिकाओं से लाइसेट्स और शुद्ध प्रोटीन का पता वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा एंटी-एचए और एंटी-जीएसटी एंटीबॉडी (नीचे) के साथ लगाया गया। F U251 कोशिकाओं को प्लास्मिड एन्कोडिंग FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा DHCR7, FLAG-NS4B और GAPDH के सापेक्ष प्रोटीन स्तर का पता लगाया गया। G, H HEK293T कोशिकाओं को NS4B-व्यक्त प्लास्मिड या खाली वेक्टर के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, साथ ही TBK{65}}कोडिंग प्लास्मिड (F), IRF{66}}व्यक्त प्लास्मिड, और प्लास्मिड एन्कोडिंग RIG-I (G) के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। . अभिकर्मक के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को एकत्र किया गया और संकेतित एंटीबॉडीज [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी-आईआरएफ3, एंटी-पी-आईआरएफ3(एस396), एंटी-फ्लैग और एंटीजीएपीडीएच के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया। ]. I DHCR7-साइलेंसिंग U251 (sh-DHCR7) और sh-NTC U251 कोशिकाओं को NS4B-एक्सप्रेसिंग प्लास्मिड या खाली वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। अभिकर्मक के 6 घंटे बाद कोशिकाओं को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडीज [एंटी-टीबीके1, एंटी-पी-टीबीके1(एस172), एंटी-आईआरएफ3, एंटी-पी-आईआरएफ3(एस396), एंटी-फ्लैग और एंटीजीएपीडीएच के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के अधीन किया गया। ]. डेटा, तीन स्वतंत्र अनुभवों के प्रतिनिधि हैं।

प्र. 5। निष्कर्ष

संक्षेप में, पिछले अध्ययन से पता चला है कि कोलेस्ट्रॉल चयापचय एंजाइम डीएचसीआर7 विभिन्न वायरल संक्रमणों के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल है। हमारे अध्ययन से पता चला है कि ZIKV NS4B ने DHCR7 के साथ बातचीत की और DHCR7 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। बढ़ा हुआ DHCR7 TBK1 और IRF3 सक्रियण को काफी हद तक रोकता है और परिणामस्वरूप IFN- और ISG उत्पादन कम हो जाता है, जिससे ग्लियाल कोशिकाओं में ZIKV संक्रमण की सुविधा मिलती है। इन निष्कर्षों ने एक नए वायरल प्रतिरक्षा से बचने के तंत्र को उजागर किया है जो ZIKV NS4B के साथ सीधे DHCR7 को लक्षित करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर काबू पाता है।

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