सामग्री और तरीके

6. सेल्युलर तेज जांच

कोशिकाओं में ईवी के आंतरिककरण की निगरानी लिपोफिलिक डीआईआई (एमओपी-डी -3911) (इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) के साथ पहले धुंधला एलईवी और एसईवी द्वारा की गई थी। 1, 3, 6, 12, 24, और 48 घंटे के लिए दाग वाले ईवीएस के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, विकास माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (वाको, जापान) के साथ तय किया गया। Hoechst 33342 (Invitrogen) जोड़ा गया था और नाभिक (नीला) को दागने के लिए कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। अंत में, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया जिसमें 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन था, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेटज़लर, जर्मनी) के तहत प्रतिदीप्ति (लाल और नीला) देखा गया था। ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कम से कम तीन क्षेत्रों का चयन और विश्लेषण किया गया।

7. मेलेनिन सामग्री का मापन

मेलेनिन सामग्री का आकलन करने के लिए, B16BL6 मेलेनोमा कोशिकाओं को पहले 24-वेल प्लेट्स (5 × 104 सेल/वेल) में 500 μL की मात्रा में टीका लगाया गया था। ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं100 nM -MSH (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) अकेले या 50 μL LEVs और SEVs के साथ 1, 5, और 10 µg/mL पर 48 घंटों के लिए उपचारित किया गया। उपचार के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और फिर अलगाव के लिए 2.5 प्रतिशत ट्रिप्सिन (गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ ऊष्मायन किया गया। सेल microspheres 1n सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल (सिग्मा-एल्ड्रिच) में 1 प्रतिशत DMSO (सिग्मा-एल्ड्रिच) युक्त 1 घंटे के लिए 80 डिग्री पर भंग कर दिया गया था। सेल lysates को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया था और मेलेनिन सामग्री को एंजाइम मार्कर (बायोटेक) का उपयोग करके 405 एनएम पर अवशोषण को मापकर निर्धारित किया गया था। मेलेनिन सामग्री को 0-100 μg/mL सिंथेटिक मेलेनिन समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच) से निर्मित मेलेनिन मानक वक्र का उपयोग करके निर्धारित किया गया था (बाह्य पुटिका चित्र निम्नानुसार है)। मेलेनिन सामग्री की गणना नियंत्रणों के साथ तुलना करके की गई थी।

8. टायरोसिनेस गतिविधि परख

TYR गतिविधि को L-DOPA ऑक्सीडेज गतिविधि का उपयोग करके मापा गया था। B16BL6 कोशिकाओं को 100 nM सिग्मा-एल्ड्रिच -MSH (500 μL) वाले -MEM माध्यम में टीका लगाया गया और 24-वेल कल्चर प्लेट्स में 1 × 10 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर संवर्धित किया गया। 24 घंटे के लिए 10, 50, और 100 μg/mL की सांद्रता पर LEV और SEV के 50 μL के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ लाइज़ किया गया। लाइस्ड कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए - 80 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया और फिर 10 मिनट के लिए आरटी पर लाइफिलाइज्ड और स्टोर किया गया। परिणामी नमूनों को 15 मिनट के लिए 12, 000 × g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया, जिसके बाद 2 mg/mL L-DOPA (सिग्मा-एल्ड्रिच) जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। अवशोषण को तब एंजाइम मार्कर (बायोटेक) का उपयोग करके 490 एनएम पर मापा गया था। अवशोषण को तब बायोटेक का उपयोग करके 490 एनएम पर मापा गया था।

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9. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

पूरे सेल के अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एंटी-मेलेनोजेनिक मार्ग से जुड़े प्रोटीन का स्तर इंट्रासेल्युलर रूप से निर्धारित किया गया था। B16BL6 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं के 5 0 0 μL की मात्रा को 24- वेल प्लेट्स (1 × 10 सेल/वेल) में टीका लगाया गया था। कोशिकाओं को RIPA बफर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में 20 मिनट के लिए प्रोटीज इनहिबिटर मिश्रण (Roche, जर्मनी) की उपस्थिति में ऊष्मायन द्वारा lysed किया गया था और 24 घंटे के लिए 10, 50 के 50 μL और EV के 100 μg / mL के साथ इलाज किया गया था। सेल lysates को 15 मिनट के लिए 17 709 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और परिणामी lysates में प्रोटीन सांद्रता BCA परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके निर्धारित की गई। समान मात्रा में प्रोटीन (10-20 ug/sample) बोल्ट 4-12 प्रतिशत Bis-Tris Plus जैल (Invitrogen) के कुओं में लोड किए गए और PVDF (पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड) मेम्ब्रेन (GE Healthcare, Chicago, आईएल, यूएसए)। झिल्लियों को 0.2 प्रतिशत (v/v) दस -20 (TBST) युक्त ट्रिस-बफर खारा से धोया गया, 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत (w/v) स्किम मिल्क (गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक) युक्त TBST के साथ बंद किया गया आरटी पर, और फिर 1 प्रतिशत (डब्ल्यू/वी) स्किम दूध के साथ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन रातोंरात किया गया था। उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी में एंटी-टीआरपी -1 (1:1000), एंटी-टीआरपी -2 (1:1000), और एबीकैम, कैम्ब्रिज, यूके से एंटी-एमआईटीएफ (1:1000) एंटीबॉडी शामिल हैं; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) से एंटी-टीआईआर (1: 500) एंटीबॉडी। प्रोटीन स्तर पर मानकीकरण के लिए एंटी - -एक्टिन एंटीबॉडी (1:500; सांता क्रूज़) का उपयोग किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी का पता जेनेटेक्स (इरविन, सीए, यूएसए) से हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -लेबेल्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ लगाया गया। झिल्ली को टीबीएसटी से धोया गया और टीबीएसटी में द्वितीयक एंटीबॉडी के 1:2000 कमजोर पड़ने के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। टीबीएसटी के साथ झिल्ली को धोने और संवर्धित रसायनयुक्त (ईसीएल) अभिकर्मक (जीई हेल्थकेयर) के साथ ऊष्मायन के बाद उत्पन्न संकेत को इमेजक्वांट 350 जेल इमेजिंग सिस्टम (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग करके पता लगाया गया था।

10. इंट्रासेल्युलर मेलेनिन उत्पादन की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पहचान

कोशिकाओं को एलईवी या एसईवी के साथ संसाधित किया गया और 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। उपचार के बाद, कोशिकाओं को 200 मिमी कैकोडायलेट बफर के साथ ऊष्मायन द्वारा तय किया गया था जिसमें 8 प्रतिशत ग्लूटारलडिहाइड और 20 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (वाको) था। एक बार इथेनॉल के साथ निर्जलित होने के बाद, Leica EM UC7 माइक्रोटोम (Leica) का उपयोग करके अल्ट्रा-थिन सेक्शन तैयार किए गए और 200-मेश कॉपर ग्रिड पर एकत्र किए गए। वर्गों को 1 प्रतिशत यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट के साथ दाग दिया गया था और छवियों को 80 kV पर JEOL JEM 1010 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL) के साथ अधिग्रहित किया गया था।

सिस्टैंच का अर्क

11. मानव त्वचा मॉडल का उपयोग करके श्वेत प्रभाव का मापन

एलईवी के श्वेत प्रभाव का परीक्षण करने के लिए डर्म-मी (टेगो साइंस, सियोल, कोरिया) मानव त्वचा मॉडल का उपयोग किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 7 दिनों के लिए मानव त्वचा के ऊतकों को 1 0 μ g/mL लेव के साथ इलाज किया गया था। Arbutin की एकाग्रता 70 μg/mL थी । मानव त्वचा के ऊतकों को 1 एन NaOH में भंग कर दिया गया था और मेलेनिन सामग्री को निर्धारित करने के लिए एंजाइम मार्कर (बायोटेक) का उपयोग करके 405 एनएम पर अवशोषण मापा गया था। 7वें दिन, त्वचा रंजकता की तुलना फोंटाना - राजमिस्त्री के दाग वाले नमूनों के सूक्ष्म विश्लेषण से की गई। Fontana-Masson धुंधला होने के लिए, त्वचा के नमूने रातोंरात आरटी में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (वाको) में तय किए गए, और पैराफिन मोम में एम्बेडेड थे। पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों को 1 घंटे के लिए सूखने के लिए 60 डिग्री पर ओवन में गर्म किया गया था। वर्गों को तब ज़ाइलीन में तीन बार, 95 प्रतिशत इथेनॉल में दो बार और 100 प्रतिशत इथेनॉल में दो बार भिगोया गया और फिर आसुत जल से धोया गया। Fontana-Masson धुंधला हो जाना 56 डिग्री पर अमोनिया के चांदी के घोल का उपयोग करके किया गया था और आसुत जल से धोया गया था। इसके बाद स्लाइड्स को 0.2 प्रतिशत गोल्ड क्लोराइड के घोल में फिक्स किया गया और कमरे के तापमान पर 5 प्रतिशत सोडियम थायोसल्फेट के घोल में डुबोया गया। अंत में, ताजा शराब में स्लाइड्स को निर्जलित किया गया।

12. सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। हमने गतिविधि के चार बैचों, मेलेनिन सामग्री और TYR गतिविधि (अनुपूरक चित्र। S3) के साथ प्रयोग किए। ग्राफपैड प्रिज्म (ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके विचरण (एनोवा) और डननेट के परीक्षण का एकतरफा विश्लेषण किया गया। पी <अंतर; 0.05,="" p="" <0.01,="" p="" <0.001="" को="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="">

सिस्टैंच ट्यूबलोसा एक्सट्रैक्ट

बहस

अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं के विपरीत, पौधों में एक जटिल कोशिका भित्ति होती है, जो एक्सोसोम की गति के लिए एक महत्वपूर्ण अवरोध बन जाती है। परिणामस्वरूप, पादप कोशिकाएं प्लाज़्मा झिल्ली से जुड़े बहुकोशिकीय पिंडों की एक श्रृंखला के माध्यम से एक्सोसोम छोड़ती हैं। पादप स्रावों द्वारा जारी स्रावी उत्पाद प्लाज्मा झिल्ली से सटे पेरिप्लास्मिक गैप के भीतर जमा होते हैं; जैसे ही वे जमा होते हैं, वे एक दबाव उत्पन्न करते हैं जो स्राव को कोशिका दीवार की बाधा को पार करने की अनुमति देता है। नतीजतन, गुप्त सामग्री, एक्सोसोम सहित, ऊर्जा की आवश्यकता के बिना जारी की जा सकती है। पादप-व्युत्पन्न ईवीएस आकार में प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले पशु कोशिका एक्सोसोम के समान या बड़े होते हैं और सूरजमुखी के एक्सोसोमल द्रव (50-200 एनएम) और अरबिडोप्सिस ईवी (50-300 एनएम) में देखे गए समान होते हैं। सेलुलर तेज दक्षता को प्रभावकारिता का एक प्रमुख निर्धारक माना जाता है, क्योंकि कई चिकित्सीय एजेंटों के लक्ष्य इंट्रासेल्युलर रूप से स्थित होते हैं। इसलिए, हमने मेलेनोमा कोशिकाओं द्वारा इष्टतम समय और तेज गति का निर्धारण किया और 12 घंटे के भीतर मेलेनोमा कोशिकाओं में एलईवी और एसईवी के तेजी से स्थानांतरण को देखा।

TYR एक ग्लाइकोप्रोटीन है जो l -tyrosinase को L-DOPA में बदलने को उत्प्रेरित करता है, मेलेनिन संश्लेषण में दर-सीमित कदम। दोनों ईवीएस एक एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं, लेकिन एलईवी का एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव एसईवी की तुलना में काफी अधिक है।

मेलेनिन उत्पादन को -MSH-MC1R द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और PKC का निषेध त्वचा और बालों के रंजकता को कम करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, कई आनुवंशिक, जैव रासायनिक और औषधीय अध्ययनों से पता चलता है कि -MSH-MC1R सिग्नलिंग मार्ग मेलानोजेनेसिस का एक प्रमुख चालक है। हालांकि हमारे प्रयोगों ने MITF और TYR के बीच सीधा संपर्क नहीं दिखाया, यह प्रदर्शित किया गया था कि LEVs UV-निर्भर -MSHMC1R पाथवे के माध्यम से MITF अभिव्यक्ति को कम करके मेलेनोजेनेसिस को रोकते हैं, जो बदले में TYR, TRP -1 की अभिव्यक्ति को कम करता है। और टीआरपी-2। हम परिकल्पना करते हैं कि टीआरपी परिवार के प्रोटीन अप्रत्यक्ष रूप से एक-दूसरे से जुड़े हुए हैं, लेकिन उनके बीच सीधा संपर्क प्रदर्शित करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, पुनर्निर्मित मानव त्वचा मॉडल दिखाते हैं कि यूवी-प्रेरित मेलेनिन संश्लेषण और मेलेनिन सामग्री एलईवी द्वारा प्रभावी रूप से बाधित होती हैं।

सिस्टैंच डल्सिस

निष्कर्ष

हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि LEV उपन्यास विरोधी मेलानोजेनिक दवाओं के लिए उम्मीदवार हैं जो मेलेनिन से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को रोककर मेलानोजेनेसिस को कम करते हैं। परिणामों ने पुष्टि की कि LEVs ने MITF को कम किया और इस प्रकार B16BL6 मेलेनोमा कोशिकाओं में TRPs को विनियमित किया। लेव और अर्बुटिन ने क्रमशः 66 प्रतिशत और 67 प्रतिशत तक टीआरवाई को रोक दिया। LEVs-उपचारित पुनर्निर्मित त्वचा की मेलेनिन सामग्री क्रमशः अनुपचारित नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अर्बुटिन की तुलना में 43 प्रतिशत और 28 प्रतिशत कम हो गई थी।

शुरुआती निष्कर्षों के आधार पर, हम मानते हैं कि प्राकृतिक सौंदर्य प्रसाधनों के विकास के लिए पौधों से प्राप्त ईवीएस एंटी-मेलेनोजेनिक एजेंट के रूप में उपयोगी हो सकते हैं। त्वचा में सुधार के लिए एक प्रभावी घटक के रूप में पौधे-व्युत्पन्न ईवी को विकसित करने के लिए भविष्य में और अधिक शोध की आवश्यकता है और मानव त्वचा मॉडल पर पौधे-व्युत्पन्न ईवी की सुरक्षा को प्रदर्शित करना आवश्यक है। हमारे परिणाम बताते हैं कि EV का उपयोग मेलेनिन को कम करने और त्वचा को चमकदार बनाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ईवी का त्वचा पर विषाक्त प्रभाव हो सकता है, और अन्य प्रयोग जैसे एलर्जी परीक्षण या एम्स परीक्षण किए जाने चाहिए।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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