मानव गुर्दे और मूत्र पथ में मानव अल्फा डिफेंसिन 5 अभिव्यक्ति

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जॉन डेविड स्पेंसर एट अल

सार

पार्श्वभूमि:मूत्र पथ में बाँझपन बनाए रखने वाले तंत्र को अपूर्ण रूप से समझा जाता है। हाल के अध्ययनों ने मूत्र पथ को संक्रमण से बचाने में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) के महत्व को फंसाया है। यहां, हम मानव में एएमपी मानव अल्फा-डिफेंसिन 5 (एचडी5) की अभिव्यक्ति और प्रासंगिकता की विशेषता बताते हैंगुर्दाऔर सामान्य और संक्रमित विषयों में मूत्र पथ।

कार्यप्रणाली/प्रधान निष्कर्ष:मानव से पृथक आरएनए का उपयोग करनागुर्दा, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय के ऊतक, हमने यह दिखाने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन किया कि DEFA5, जीन एन्कोडिंग HD5, संवैधानिक रूप से पूरे मूत्र पथ में व्यक्त किया गया है। पायलोनेफ्राइटिस के साथ, DEFA5 अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई हैगुर्दा. इम्युनोब्लॉट विश्लेषण का उपयोग करते हुए, पाइलोनफ्राइटिस के साथ HD5 उत्पादन भी बढ़ा। मूत्राशय और मूत्रवाहिनी के यूरोटेलियम में स्थानीयकृत HD5 का प्रतिरक्षण। गुर्दे में, HD5 मुख्य रूप से डिस्टल नेफ्रॉन और एकत्रित नलिकाओं में उत्पन्न होता था। इम्युनोब्लॉट और एलिसा एसेज़ का उपयोग करते हुए, गैर-संक्रमित मानव मूत्र के नमूनों में एचडी5 का नियमित रूप से पता नहीं चला था, जबकि ई.कोली मूत्र पथ के संक्रमण के साथ मूत्र एचडी5 उत्पादन में वृद्धि हुई थी।

निष्कर्ष/महत्व:गैर-संक्रमित विषयों में DEFA5 पूरे मूत्र पथ में व्यक्त किया जाता है। विशेष रूप से, HD5 निचले मूत्र पथ के पूरे यूरोटेलियम में और एकत्रित नलिकाओं में व्यक्त किया जाता हैगुर्दा. संक्रमण के साथ, HD5 अभिव्यक्ति बढ़ जाती हैगुर्दा, और स्तर मूत्र में पता लगाने योग्य हो जाते हैं। हमारे ज्ञान के लिए, हमारे निष्कर्ष मानव गुर्दे में HD5 अभिव्यक्ति और उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने वाले पहले व्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, संक्रमित मूत्र के नमूनों में एचडी5 की उपस्थिति का पता लगाने वाली यह पहली रिपोर्ट है। हमारे परिणाम बताते हैं कि मूत्र पथ की बाँझपन को बनाए रखने में HD5 की महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है।

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परिचय

मूत्र पथ, मूत्रमार्ग के मांस के अलावा, आमतौर पर फेकल वनस्पतियों के साथ निकटता के बावजूद बाँझ होता है। सटीक तंत्र जिसके द्वारा मूत्र पथ अपनी बाँझपन बनाए रखता है, अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। मूत्र पथ की रक्षा में योगदान करने वाले प्रस्तावित तंत्रों में मूत्र प्रवाह, मूत्र पीएच और ऑस्मोलैरिटी में परिवर्तन, नियमित रूप से मूत्राशय खाली करना, यूरोपिथेलियम के रासायनिक-रक्षा घटक, और जीवाणु उत्तेजना के साथ प्रभावकारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपकला बहा / प्रवाह शामिल हैं [1]। इसके अलावा, रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) को हाल ही में मूत्र पथ की बाँझपन को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए दिखाया गया है [2]। एएमपी, जो लगभग सभी जीवों द्वारा उत्पादित प्राकृतिक एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में काम करते हैं, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक सर्वव्यापी घटक हैं। एएमपी फागोसाइटिक सफेद कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए धनायनित अणु हैं। मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों में, डिफेंसिन एएमपी का एक प्रमुख परिवार है। डिफेंसिन में आमतौर पर ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया, वायरस, कवक और प्रोटोजोआ [2,3] के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी गतिविधि होती है। डिफेंसिंस को शुरू में प्रीप्रोप्रोटीन के रूप में संश्लेषित किया जाता है और परिपक्व, जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स बनने के लिए प्रसंस्करण से गुजरना पड़ता है [4]। मनुष्यों में, डिफेंसिन को उनके डाइसल्फ़ाइड ब्रिजिंग पैटर्न के आधार पर दो परिवारों में से एक में वर्गीकृत किया जाता है - अल्फा-डिफेंसिन या बीटा-डिफेंसिन [5]।

मूत्र पथ में, बीटा-डिफेंसिन पूरे यूरोपिथेलियम में व्यापक रूप से व्यक्त किए जाते हैं। उपकला कोशिकाएं अस्तर करती हैंगुर्दाहेनले का लूप, डिस्टल ट्यूब्यूल, और कलेक्टिंग डक्ट संवैधानिक रूप से मानव बीटा-डिफेंसिन 1 (hBD1) को व्यक्त करते हैं। हालांकि एचबीडी1 का मूत्र स्तर हमलावर बैक्टीरिया को मारने के लिए अपर्याप्त है, एचबीडी1 ट्यूबलर लुमेन की तेजी से काम करने वाली रोगाणुरोधी कोटिंग प्रदान करता है और यूरोटेलियम [6] के लिए बैक्टीरिया के लगाव को रोककर संक्रमण को रोकता है। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि hBD1 की रेडॉक्स-स्थिति रोगाणुरोधी क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है, जैसे कि कम पेप्टाइड डाइसल्फ़ाइड से जुड़े ऑक्सीकृत रूप [7] की तुलना में बहुत अधिक शक्तिशाली है। यूरोटेलियल सतह पर इसका महत्व निर्धारित नहीं किया गया है। एक अन्य डिफेन्सिन, मानव बीटा-डिफेंसिन 2 (hBD2) स्वस्थ किडनी ऊतक में संवैधानिक रूप से व्यक्त नहीं किया जाता है; हालाँकि, hBD2 अभिव्यक्ति संक्रमण [8] से प्रेरित है।

बीटा-डिफेंसिन के विपरीत, उपकला-व्युत्पन्न अल्फा-डिफेंसिन की भूमिका मूत्र पथ में अच्छी तरह से वर्णित नहीं है। अल्फा-डिफेंसिन एचडी5 और एचडी6 की अभिव्यक्ति और कार्य ज्यादातर छोटी आंत में बताए गए हैं जहां वे पैनेथसेल्स द्वारा आंतों के क्रिप्ट में स्रावित होते हैं और आंतों के माइक्रोबायोटा [9] के संतुलन में योगदान करते हैं। HD5 को पुरुष और महिला जननांग पथ में भी स्थानीयकृत किया गया है, इस बात के प्रमाण के साथ कि यह संक्रमण को मिटाने के लिए प्रेरक और महत्वपूर्ण है [10,11,12]। उन रोगियों में मूत्र HD5 का पता चला है, जो इलियल नियोब्लैडर पुनर्निर्माण और इलियल नाली मूत्र मोड़ से गुजर चुके हैं, जिससे HD5 उत्पादन का स्रोत मुख्य रूप से इलियल पैनेथ कोशिकाओं [13,14] को श्रेय दिया गया था। HD5 में सामान्य यूरोपैथोजेनिक ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया [15] के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि है। HD5 में एडेनोवायरस और बीके वायरस [16,17,18] जैसे यूरोपैथोजेनिक वायरस के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि भी है। इस अध्ययन में, हम मानव में HD5 अभिव्यक्ति का प्रारंभिक विवरण और परिमाणीकरण प्रदान करते हैंगुर्दाऔर आगे बाँझपन और संक्रमण के दौरान निचले मूत्र पथ में इसकी अभिव्यक्ति को परिभाषित करते हैं।

परिणाम

DEFA5 mRNA संवैधानिक रूप से मानव मूत्राशय, मूत्रवाहिनी और गुर्दे में व्यक्त किया जाता है

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर दर्शाता है कि सभी परीक्षण किए गए मूत्राशय, मूत्रवाहिनी, औरगुर्दासंक्रमण के बिना नमूनों ने संवैधानिक रूप से DEFA5 व्यक्त किया। DEFA5 की अभिव्यक्ति ऊपरी मूत्र पथ (p= 0.014) की तुलना में निचले मूत्र पथ में काफी अधिक थी। मूत्राशय में (n=4), माध्य DEFA5 अभिव्यक्ति 4,656637 प्रति 10 एनजी आरएनए प्रतिलेख थी और मूत्रवाहिनी (एन=4) में मतलब DEFA5 अभिव्यक्ति 4,1126170 प्रतिलेख प्रति 10 एनजीआरएनए (चित्रा 1ए) थी। . गुर्दे में (n=6), माध्य DEFA5 अभिव्यक्ति 2,9376274 प्रति 10 एनजी आरएनए प्रतिलेख थी। DEFA5 अभिव्यक्ति का वृक्क प्रांतस्था, मज्जा और श्रोणि में अलग से विश्लेषण किया गया था। DEFA5 अभिव्यक्ति गुर्दे के क्षेत्र (p=0.45) द्वारा महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थी।

DEFA5 अभिव्यक्ति और HD5 पेप्टाइड अभिव्यक्ति पाइलोनफ्राइटिस के साथ बढ़ जाती है

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण पर किया गयागुर्दे के ऊतकों के साथपाइलोनफ्राइटिस ने गैर-संक्रमित गुर्दे के ऊतकों की तुलना में DEFA5 अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। पायलोनेफ्राइटिस (n=6) के साथ, मतलब DEFA5 अभिव्यक्ति बढ़कर 7,82961,052 प्रति 10 एनजी आरएनए (पी=0.019) (चित्रा 2 ए) हो गई।

पाइलोन-फ्राइटिस के साथ अभिव्यक्ति में इस वृद्धि का और अधिक मूल्यांकन करने के लिए, हमने उसी पर इम्युनोब्लॉट विश्लेषण कियागुर्दाएचडी5 पेप्टाइड उत्पादन (चित्रा 2बी, मध्य पैनल) में समवर्ती वृद्धि के मूल्यांकन के लिए वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक। पॉलीक्लोनल एचडी5 एंटीसेरा का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण ने पाइलोनफ्राइटिस (एन {{5}) के साथ गुर्दे के ऊतकों में काफी अधिक एचडी 5 पेप्टाइड उत्पादन का प्रदर्शन किया। }) गैर-संक्रमित की तुलना मेंगुर्दाऊतक (एन=6)। गैर संक्रमितगुर्दाऊतकों ने 300625 एनजी एचडी5/ग्राम गीला ऊतक वजन व्यक्त किया जबकिगुर्दापायलोनेफ्राइटिस के साथ ऊतक 600621 एनजी एचडी5/ग्राम गीला ऊतक वजन (पी,0.0001) व्यक्त किया। एक लोडिंग कंट्रोल(चित्रा 2बी,मध्य पैनल) के रूप में काम करने के लिए जीएपीडीएच के साथ ब्लॉट्स की फिर से जांच की गई और बराबर प्रोटीन लोडिंग (चित्रा 2बी, शीर्ष पैनल) की पुष्टि करने के लिए एक चांदी का दाग भी लगाया गया।

HD5 पेप्टाइड पूरे मानव गुर्दे और मूत्र पथ में निर्मित होता है

मूत्र पथ में HD5 उत्पादन को स्थानीय बनाने के लिए प्रतिरक्षण किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) ने दिखाया कि एचडी5इम्यूनोरेक्टिविटी सभी जांच किए गए नमूनों के मूत्रवाहिनी और मूत्राशय के पूरे यूरोटेलियम में मौजूद थी (एन=4, चित्रा 3)। आईएचसी ने यह भी दिखाया कि एचडी 5 सभी के वृक्क प्रांतस्था और मज्जा के नलिकाओं में उत्पन्न हुआ था। नमूने (n= 6, चित्र 4)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) ने प्रदर्शित किया कि एचडी5 अभिव्यक्ति डिस्टल नेफ्रॉन और एकत्रित नलिकाओं में सबसे बड़ी थी (चित्र 5)। इंटरस्टिटियम और ग्लोमेरुली ने HD5 प्रतिरक्षण क्षमता नहीं दिखाई। चित्र 3, 4 और 5 में दिखाया गया इम्यूनोस्टेनिंग एक माउस मोनोक्लोनल एंटी-एचडी5 एंटीबॉडी (8C8) का उपयोग करके किया गया था जो HD5 प्रोपेप्टाइड (Abcam, कैम्ब्रिज, MA) को पहचानता है। एचडी5 प्रोपेप्टाइड और परिपक्व पेप्टाइड (डेटा नहीं दिखाया गया) को पहचानने वाले खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-एचडी5 एंटीबॉडी का उपयोग करते समय परिणाम समान थे - यह सुझाव देते हुए कि एचडी 5 को प्रोपेप्टाइड के रूप में संग्रहीत किया जाता है।

पायलोनेफ्राइटिस के साथ, HD5 इम्यूनोस्टेनिंग में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई। HD5 इम्युनोएक्टिविटी समीपस्थ नेफ्रॉन, डिस्टल नेफ्रॉन और एकत्रित नलिकाओं (चित्रा 4 और चित्रा 5) में बढ़ गई। गैर-संक्रमित नमूनों की तरह, ग्लोमेरुली और इंटरस्टिटियम ने संक्रमण के साथ कोई HD5 अभिव्यक्ति नहीं दिखाई। नकारात्मक नियंत्रणों ने कोई HD5 प्रतिरक्षण क्षमता नहीं दिखाई।

संक्रमित मानव मूत्र में एचडी5 पेप्टाइड की मापनीय सांद्रता होती है

इम्युनोब्लॉट विश्लेषण, खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीसेरम का उपयोग करते हुए, जो पूर्ववर्ती प्रोएचडी 5 का पता लगाता है और आगे संसाधित रूपों ने यूरोपैथोजेनिक ई.कोली (चित्रा 6 ए और बी) से संक्रमित 15 परीक्षण किए गए मूत्र नमूनों में से 13 में एचडी 5 के औसत दर्जे के स्तर की पहचान की। मौजूद होने पर, एचडी5 का स्तर, मूत्र क्रिएटिनिन के लिए सामान्यीकृत, 299.8-669.7630 एनजी एचडी5/मिलीग्राम मूत्र सीआर (110.67 एनजी/एमएल-276.67 एनजी/एमएल) से था, जो 11.10–27.67 एनएमओएल/एल से मेल खाती है। असंक्रमित मूत्र के नमूने (n=15), HD5 पता लगाने की सीमा (,50 एनजी) से कम या कम थे। एक ही मूत्र के नमूनों पर एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा), माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (8C8) का उपयोग करते हुए, जो केवल अग्रदूत proHD5 का पता लगाता है, परीक्षण किए गए 15 संक्रमित नमूनों में से 13 में proHD5 के औसत दर्जे का स्तर का पता लगाया। मूत्र proHD5 सांद्रता 122.78-490.060.03 एनजी एचडी5/मिलीग्राम मूत्र सीआर (30.02 एनजी/एमएल-200.5 एनजी/एमएल) से लेकर मौजूद होने पर (चित्र 7)।

बहस

इस अध्ययन में, हम मानव में HD5 का प्रारंभिक लक्षण वर्णन प्रदान करते हैंगुर्दा, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय। HD5 को एक महत्वपूर्ण AMP के रूप में दिखाया गया है जो आंत में आक्रामक संक्रमण को रोकता है और संक्रमण के दौरान जननांग पथ में ऊपर-विनियमित होता है [11,18,19,20,21]। एपिथेलियल-व्युत्पन्न एएमपी, जैसे एचडी5, को मूत्र पथ में बाँझपन बनाए रखने में महत्वपूर्ण दिखाया गया है [8,22,23,24]। इन जन्मजात श्लैष्मिक सुरक्षा में कमी के परिणामस्वरूप तीव्र और/या जीर्ण संक्रमण हो सकता है [25,26]।

हमारे मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि DEFA5 संवैधानिक रूप से मानव में व्यक्त किया गया हैगुर्दे, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय। DEFA5 की अभिव्यक्ति ऊपरी मूत्र पथ से निचले मूत्र पथ तक बढ़ जाती है - मूत्र प्रवाह के प्रवाह और माइक्रोबायोटा के आक्रमण के बिंदु से बढ़ती निकटता के बाद। हमारे ज्ञान के लिए, मानव गुर्दे और मूत्राशय में DEFA5 अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने वाला यह पहला अध्ययन है। हाल ही में, टाउन्स एट अल ने प्रदर्शित किया कि सामान्य डिस्टल मूत्रवाहिनी DEFA5 [14] को व्यक्त कर सकती है। हमारे परिणाम यह भी बताते हैं कि DEFA5 संवैधानिक रूप से डिस्टल यूरेटर द्वारा व्यक्त किया जाता है। यद्यपि मूत्र पथ में DEFA5 की अभिव्यक्ति गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऊतकों में पाए जाने वाले की तुलना में लगभग 100- गुना कम है, DEFA5 की बेसल यूरोपेथेलियल अभिव्यक्ति कैथेलिसिडिन, एचबीडी -1, एचबीडी जैसे पहले वर्णित मूत्र ट्रैक एम्प्स की अभिव्यक्ति के बराबर है। -2, और राइबोन्यूक्लीज 7[6,8,22,24,27]।

परिपक्व जठरांत्र संबंधी मार्ग के विपरीत जहां DEFA5 स्वास्थ्य और संक्रमण / सूजन दोनों राज्यों में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है, हमारा मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर डेटा प्रदर्शित करता है कि DEFA5 अभिव्यक्ति मेंगुर्दासंक्रमण के साथ महत्वपूर्ण रूप से विनियमित है [27,28,29]। अभिव्यक्ति का यह प्रेरक पैटर्न महिला प्रजनन पथ में DEFA5 अभिव्यक्ति के अनुरूप है जहां DEFA5 अभिव्यक्ति सल्पिंगिटिस [30] के साथ बढ़ जाती है। मूत्र पथ में, टाउन्स एट अल ने यूटीआई के रोगियों में DEFA5 की अधिक मूत्रवाहिनी अभिव्यक्ति की ओर रुझान दिखाया है, जो इलियल नाली मूत्र मोड़ से गुजर चुके हैं [14]

हमारा इम्युनोब्लॉट विश्लेषण वास्तविक समय के पीसीआर डेटा को यह प्रदर्शित करके पूरक करता है कि एचडी 5 पेप्टाइड उत्पादन पाइलोनफ्राइटिस के साथ बढ़ता है। HD5 उत्पादन का यह प्रेरक पैटर्न बीटा-डिफेंसिन परिवार के कुछ सदस्यों के समान है। hBD2 मूत्र पथ और/या क्रोनिक पाइलोनफ्राइटिस [8,31,32] के संक्रमण के साथ उत्पादन का एक प्रेरक पैटर्न दिखाता है। HD5पेप्टाइड उत्पादन को ऊपरी महिला जननांग पथ और पुरुष मूत्रमार्ग में सूजन [11,30] के साथ वृद्धि के लिए दिखाया गया है।

इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि HD5 मूत्रवाहिनी और मूत्राशय के पूरे यूरोटेलियम में समान रूप से उत्पन्न होता है। चूंकि अधिकांश यूटीआई मूत्राशय में चढ़ने वाले फेकल फ्लोरा से उत्पन्न होते हैं, इन परिणामों से पता चलता है कि एचडी5 अभिव्यक्ति उन स्थानों पर मौजूद है जहां माइक्रोबियल एक्सपोजर सबसे अधिक बार होता है [33]। इसलिए, बढ़ते माइक्रोबियल संक्रमण को रोकने के लिए HD5 आदर्श स्थिति में है। मेंगुर्दा, HD5 मुख्य रूप से डिस्टल नेफ्रॉन और एकत्रित नलिका में उत्पन्न होता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि HD5 उन स्थानों पर निर्मित होता है जहां इसे इष्टतम रोगाणुरोधी गतिविधि के लिए तैनात किया जाएगा। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डिफेंसिन के रोगाणुरोधी गुण नमक की सांद्रता पर निर्भर होते हैं - उच्च नमक सांद्रता के साथ रोगाणुरोधी गतिविधि [23,34,35] कम हो जाती है। हम अनुमान लगाते हैं कि डिस्टल नेफ्रॉन और एकत्रित नलिकाओं की कम नमक सांद्रता HD5 रोगाणुरोधी गतिविधि के लिए एक अनुकूल वातावरण प्रदान करती है।

इम्युनोब्लॉट और एलिसा विश्लेषण यह भी प्रदर्शित करते हैं कि एचडी 5 निम्न स्तर पर मूत्र में स्रावित होता है। आकार (8.1 kDa और 3.7 kDa) और proHD5 के धनात्मक आवेश और पूरी तरह से संसाधित HD5 को देखते हुए, यह संभव है कि कुछ मूत्र HD5 पेप्टाइड प्लाज्मा छानना से, कम से कम भाग में उत्पन्न होते हैं। फिर भी, इस बात के बहुत कम प्रमाण हैं कि HD5 प्लाज्मा में बना रहता है [27]। इसके अतिरिक्त, मूत्र में प्रकट होने के लिए, HD5 को समीपस्थ नलिका [6,36] में कुशल पेप्टाइड अवशोषण तंत्र से बचने की आवश्यकता होगी। अंत में, HD5 के सेलुलर स्रोतों को हटाते हुए, मूत्र के नमूनों ने assays के प्रदर्शन से पहले सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया।

पता चला सांद्रता पर, मूत्र HD5 यूरोपैथोजेनिक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ सीधे रोगाणुरोधी होने की संभावना नहीं है क्योंकि पूरी तरह से संसाधित HD5 में सामान्य ग्राम-नकारात्मक यूरोपैथो जीनिक बैक्टीरिया [15] के खिलाफ 6-10 मिलीग्राम / एमएल के बीच न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) है। हालांकि, म्यूकोसल सतह सांद्रता अधिक होने की संभावना है। इसके अलावा, इम्युनोब्लॉट विश्लेषण दर्शाता है कि HD5 सांद्रता में काफी अधिक हैंगुर्दा. ये परिणाम बताते हैं कि HD5 मूत्र पथ के म्यूकोसल रक्षा में शामिल है। एक समान पैटर्न withhBD1 देखा जाता है, जहां hBD1 की मूत्र सांद्रता रोगाणुरोधी गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए अपर्याप्त है, लेकिन वृक्क नलिकाओं के पास उच्च पेप्टाइड सांद्रता का पता लगाया जाता है [6,31]।

क्योंकि IHC दर्शाता है कि proHD5, HD5 का एक प्रमुख रूप हैगुर्दाऔर क्योंकि मूत्र में परिपक्व और proHD5 दोनों का पता लगाया जाता है, हम अनुमान लगाते हैं कि HD5 मुख्य रूप से एक अग्रदूत अणु स्रावित होता है और फिर परिपक्व रूपों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण से गुजरता है - जठरांत्र और जननांग पथ के समान [11,30,37]। छोटी आंत में, पैनेथ कोशिकाएं ट्रिप्सिन का उत्पादन करती हैं, जो एचडी5 प्रोपेप्टाइड को साफ करती है ताकि पूरी तरह से संसाधित पेप्टाइड आंतों के लुमेन [37] में प्रमुख रूप हो। पुरुष मूत्रमार्ग में, HD5 के लिए प्रमुख प्रसंस्करण और सक्रिय करने वाले एंजाइम न्यूट्रोफिल प्रोटीज हैं जो संक्रमण के स्थल पर भर्ती किए गए न्यूट्रोफिल द्वारा योगदान करते हैं [11]। संक्रमण के दौरान मूत्र पथ में HD5 प्रसंस्करण पर एपिथेलियल ट्रिप्सिनोजेन, यूरिनरी ट्रिप्सिन और/या न्यूट्रोफिल प्रोटीज का योगदान निर्धारित किया जाना बाकी है। इसके अलावा, HD5 फ़ंक्शन (परासरणता, पीएच, और धनायन सांद्रता में परिवर्तन) पर मूत्र के वातावरण में परिवर्तन का प्रभाव भी निर्धारित किया जाना बाकी है।

अंत में, मूत्र पथ में HD5 की अभिव्यक्ति और उत्पादन की पहचान और मात्रा निर्धारित करने वाला यह पहला अध्ययन है। हमारे परिणाम बताते हैं कि HD5 एक उपकला-व्युत्पन्न एएमपी है जो मानव यूरोपिथेलियम की जन्मजात प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है जो आक्रमणकारी रोगजनकों को संचलन में बदलने से रोकता है। HD5 उत्पादन को विनियमित करने वाले कारकों की व्याख्या यूटीआई के जोखिम वाले रोगियों और पुराने संक्रमण वाले रोगियों में यूटीआई के रोगजनन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।

तरीकों

अध्ययन की स्वीकृति

इस अध्ययन में भाग लेने वाले सभी रोगियों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। 18 वर्ष से कम आयु के विषयों के लिए, लिखित माता-पिता/अभिभावक की सहमति प्राप्त की गई थी। नेशनवाइड चिल्ड्रेन्स हॉस्पिटल (NCH) इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने सहमति प्रक्रिया और दस्तावेजों (IRB07-00383) के साथ इस अध्ययन को मंजूरी दी।

मानव ऊतक और मूत्र के नमूने

गैर-संक्रमित डिस्टल यूरेटर और ब्लैडर टिश्यू (n=4) उन बच्चों से प्राप्त किया गया था, जो बार-बार होने वाले संक्रमण के अलावा अन्य कारणों से यूरेटरल री-इम्प्लांटेशन करवा रहे थे। गैर संक्रमितगुर्दागुर्दे के ट्यूमर के लिए नेफरेक्टोमी से गुजर रहे रोगियों से नमूने (n=6) प्राप्त किए गए थे। ऊतक के नमूने रोग या सूजन के मैक्रोस्कोपिक संकेतों से मुक्त थे।गुर्दाक्रोनिक पाइलोनफ्राइटिस के रोगियों के ऊतक सहकारी मानव ऊतक नेटवर्क (n=6) [38] द्वारा प्रदान किए गए थे। दो स्वतंत्र रोगविदों ने पाइलोनफ्राइटिस के हिस्टोपैथोलॉजिक निदान की पुष्टि की। ऊतक के नमूने स्नैप-फ्रोजन थे या तटस्थ फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों के रूप में संरक्षित थे। गैर-संक्रमित गुर्दे के ऊतकों के वर्गों को भंडारण से पहले प्रांतस्था, मज्जा, या वृक्क श्रोणि में विच्छेदित किया गया था (n=4)।

गैर-संक्रमित और संक्रमित मूत्र के नमूने एनसीएच आपातकालीन विभाग या थेनेफ्रोलॉजी क्लिनिक में पेश करने वाले बच्चों से प्राप्त किए गए थे। अमेरिकन एकेडमी ऑफ पीडियाट्रिक्स गाइडलाइन्स [39] के अनुसार यूटीआई का निदान एक सकारात्मक मूत्र संस्कृति द्वारा किया गया था। सभी संक्रमित मूत्र के नमूनों में ई.कोलाई का .106 सीएफयू/एमएल था। मूत्र पीएच मान 5.5 से 8.5 (मतलब मूत्र 6.9) के बीच था। मूत्र आयनिक संरचना को मापा नहीं गया था। मूत्र तलछट को हटाने के लिए मूत्र के नमूनों को सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल जोड़ा गया था (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए)।

राइबोन्यूक्लिक एसिड अलगाव और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

PromegaTotal RNA अलगाव प्रणाली (Promega, Madison, WI, USA) का उपयोग करके कुल RNA को जमे हुए ऊतक से अलग किया गया था। ForcDNA संश्लेषण, कुल RNA का 4-8 मिलीग्राम, आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) के अनुसार एक oligo- (dT) 12-18प्राइमर का उपयोग करते हुए सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के साथ रिवर्स ट्रांसकोड किया गया था।

मानक वक्रों के लिए जीन विशिष्ट प्लास्मिड का क्लोनिंग

सीडीएनए एन्कोडिंग DEFA5 और GAPDH को निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एक 4- टोपो प्लास्मिड वेक्टर (इनविट्रोजन) में क्लोन किया गया था। प्लास्मिड को यह पुष्टि करने के लिए अनुक्रमित किया गया था कि सही

निर्माण प्राप्त हुए थे। जीन-विशिष्ट प्लास्मिड के सीरियल कमजोर पड़ने की मात्रा निर्धारित की गई (260 पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अवशोषण और एथिडियम ब्रोमाइड-सना हुआ agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा) और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए मानक घटता उत्पन्न करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर में उपयोग किया जाता है।

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर

मानव से एकल-फंसे सीडीएनए का उपयोग करके मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन किया गया थागुर्दा7500 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर जोड़े के साथ मूत्रवाहिनी, और मूत्राशय के ऊतक। पीसीआर एक्सॉन जंक्शन फैले हुए प्राइमरों को डिजाइन किया गया था और डीएनएस्टारएच लेजर जीन सेकबिल्डर (डीईएफए 5 फॉरवर्ड प्राइमर) का उपयोग करके अनुक्रमों की पुष्टि की गई थी। : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 और DEFA5 रिवर्स प्राइमर 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39)।

संक्षेप में, 1 0 एनजी आरएनए के अनुरूप सीडीएनए ने 25 मिली रिएक्शन में एटेम्पलेट के रूप में कार्य किया जिसमें 2.0 प्रत्येक प्राइमर का एमएम और 16 लाइट-साइक्लर-फास्ट स्टार्ट डीएनए मास्टर एसवाईबीआर ग्रीन मिक्स। पीसीआर स्थितियां थीं: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण, इसके बाद 40 चक्रों के साथ 40 चक्र जिसमें 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण होता है, 30 सेकंड के लिए 64 डिग्री सेल्सियस पर और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार होता है। चक्र-दर-चक्र प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की निगरानी 530 एनएम पर की गई और 7500 सॉफ्टवेयर वी2.0.3 (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। प्रतिक्रियाओं के हर सेट के साथ जीन-विशिष्ट प्लास्मिड मानकों को शामिल किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, टर्मिनल इलियम आरएनए को प्रतिक्रियाओं के प्रत्येक सेट के साथ शामिल किया गया था, और परिणामों की तुलना पहले प्रकाशित मानकों [27] से की गई थी।

इच्छित उत्पाद के पीसीआर प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए, 1.5 प्रतिशत agarose जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रस्तुत नमूने का विश्लेषण किया गया था। उत्पादों की कल्पना एथिडियम ब्रोमाइडस्टेनिंग द्वारा की गई थी और डीएनए आकार मानकों की तुलना में अनुमानित उत्पाद आकार (नहीं दिखाया गया) की पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, प्रत्येक प्रतिक्रिया के अंत में प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया का एक पिघलने वाला तापमान प्रोफ़ाइल वक्र निर्धारित किया गया था।

HD5 एंटीबॉडी

HD5 प्रोपेप्टाइड (AA20-94) और आंशिक रूप से संसाधित रूपों (AA36-94 और 56-94) की पहचान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस मोनोक्लोनल (8C8) एंटी-HD5 एंटीबॉडी (Abcam) का उपयोग करके की गई थी। HD5 प्रोपेप्टाइड और परिपक्व पेप्टाइड (एए 63-94) की पहचान पहले वर्णित खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीसेरम [13,40] का उपयोग करके की गई थी।

इम्युनोब्लॉट

उसी के खंडगुर्दामात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण (3–6 मिलीग्राम गीला वजन) के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों को तरल नाइट्रोजन में मोर्टार और मूसल का उपयोग करके चूर्णित किया गया और प्रोटीज अवरोधकों के साथ आरआईपीए बफर में भंग कर दिया गया। प्रोटिओस्पिनटीएम यूरिन प्रोटीन कंसंट्रेशन माइक्रो किट (नॉरगेन बायोटेक कॉर्पोरेशन, थोरोल्ड, ओन, कनाडा) का उपयोग करके मूत्र के नमूनों से मूत्र के प्रोटीन निकाले गए। एक संशोधित ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके गुर्दे और मूत्र प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित की गई और एनओडी 280 एनएम रीडिंग का उपयोग करके पुष्टि की गई। गुर्दे के ऊतकों या मूत्र प्रोटीन की समान सांद्रता को 18 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट ग्रेडिएंट जैल पर लोड किया गया और वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया गया। समान प्रोटीन लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए, एक चांदी के दाग का प्रदर्शन किया गया।

इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण के बाद, प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया। टीबीएस में 0.05 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ निर्धारण के बाद, झिल्लियों को 30 से 60 मिनट के लिए 5 प्रतिशत वसा रहित दूध में अवरुद्ध कर दिया गया और रात भर खरगोश पॉलीक्लोनल एचडी5 एंटीसेरम के 1:1,000 कमजोर पड़ने में लगाया गया। . धोने के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी, एक एंटी-खरगोश हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-खरगोश आईजीजी पतला 1:10, 000 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए), कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए लागू किया गया था। से इम्युनोब्लॉट्सगुर्दाऊतकों को भी कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए एंटी-जीएपीडीएच एंटीबॉडी (सिग्मा एल्ड्रिच) के साथ जांचा गया और फिर ऊपर वर्णित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। निर्माता के निर्देशों (BioExpress, Kaysville, UT, USA) के अनुसार एक ECL डिटेक्शन सिस्टम और केमिलुमिनेसेंस फिल्म का उपयोग करके प्रोटीन की कल्पना की गई थी।

HD5 को पुनः संयोजक मानक proHD5 प्रोटीन (पेप्टाइड्स इंटरनेशनल, लुइसविले, केवाई, यूएसए) के सीरियल कमजोर पड़ने के साथ परिणामी बैंड तीव्रता की तुलना करके परिमाणित किया गया था।गुर्दाHD5 सांद्रता को गीले ऊतक भार के लिए मानकीकृत किया गया था। यूरिनरीएचडी 5 सांद्रता को मूत्र क्रिएटिनिन द्वारा विभाजित किया गया था ताकि मूत्र कमजोर पड़ने के लिए मानकीकृत मूत्र एचडी5-से-क्रिएटिनिन अनुपात (मिलीग्राम/मिलीग्राम) स्थापित किया जा सके। ऑक्सफोर्ड बायोमेडिकल रिसर्च क्रिएटिनिन माइक्रोप्लेट परख (रोचेस्टर हिल्स, मिशिगन, यूएसए) का उपयोग करके मूत्र क्रिएटिनिन सांद्रता निर्धारित की गई थी।

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

डीपराफिनाइजेशन, रिहाइड्रेशन और एंटीजन रिट्रीवल के बाद, एक बायोटिन ब्लॉक और एक सीरम-मुक्त प्रोटीन ब्लॉक (सुपरब्लॉक, साइटेक लेबोरेटरीज, लोगान, यूटी, यूएसए) का प्रदर्शन किया गया। स्लाइड्स को मोनोक्लोनल माउस HD5 (8C8) एंटीबॉडी (1:2 {{1 0} 0; Abcam) या खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीसेरम (1:500) के साथ रातोंरात 4uC पर इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद एंटी-पॉलीवैलेंट बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी मिलावटी स्ट्रेप्टाविडिन/एचआरपी (साइटेक लेबोरेटरीज)। वर्गों को 0.02 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ 0.1 प्रतिशत डायमिनोबेंज़िडाइन टेट्राक्लोराइड का उपयोग करके विकसित किया गया था और हेमटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेड किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण वर्गों को एचडी 5 एंटीबॉडी के स्थान पर गैर-प्रतिरक्षा सीरम के साथ जोड़ा गया था।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस

HD5 अभिव्यक्ति को स्थानीय बनाने में मदद करने के लिए डबल-लेबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया गयागुर्दा. बकरी पॉलीक्लोनल एंटी-ह्यूमन एक्वापोरिन -2 एंटीबॉडी (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) [41] के साथ प्रमुख कोशिकाओं के लिए एकत्रित वाहिनी को डबल-लेबल किया गया था। हेनले के लूप को माउस पॉलीक्लोनल एंटी-ह्यूमन यूरोमोडुलिन एंटीबॉडी (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ डबल-लेबल किया गया था और समीपस्थ नलिका को बकरी पॉलीक्लोनलैन्टीह्यूमन एक्वापोरिन -1 (सांता क्रूज़) [41,42] के साथ डबल-लेबल किया गया था। रोडामाइन गधा पॉलीक्लोनल एंटी-बकरी (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च लेबोरेटरीज, वेस्ट ग्रोव, पीए, यूएसए), रोडामाइन बकरी एंटी-माउस (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च लेबोरेटरीज), और एफआईटीसी गधा पॉलीक्लोनल एंटी-खरगोश (सांता क्रूज़) द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में कार्य करता है।

सभी वर्गों को ऊपर उल्लिखित के रूप में तैयार किया गया था। उन्हें HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) के खिलाफ माउस एंटीसेरा के मिश्रण से इनक्यूबेट किया गया था। 90 मिनट के लिए तापमान। द्वितीयक एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए लागू किया गया था और डीएपीआई के साथ बढ़ते मीडिया का उपयोग करके वर्गों को माउंट किया गया था। गैर-प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। स्लाइड्स की जांच aLeica DM4000B माइक्रोस्कोप से की गई और स्पॉट आरटी कैमरा / सॉफ्टवेयर (डायग्नोस्टिक इंस्ट्रूमेंट्स, स्टर्लिंगहाइट्स, एमआई, यूएसए) का उपयोग करके डिजिटल रूप से फोटो खिंचवाए गए।

एलिसा

लिंक बायोटिन एंटीबॉडी लेबलिंग किट, नोवस बायोलॉजिकल) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर, स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्स मूली पेरोक्सीडेज (बायोलेगेंड, सैन डिएगो सीए, यूएसए) को 30 मिनट के लिए जोड़ा गया था। 15 मिनट (केम-एन-टेक डायग्नोस्टिक्स) के लिए टीएमबी सब्सट्रेट समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया को STOP समाधान (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए) के साथ समाप्त कर दिया गया और 450 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर पढ़ा गया। एलिसा परख से HD5 सांद्रता को यूरिनक्रिएटिनिन द्वारा विभाजित किया गया था ताकि ऊपर वर्णित मूत्र के कमजोर पड़ने के लिए मानकीकृत मूत्र एचडी 5- से क्रिएटिनिन अनुपात (मिलीग्राम / मिलीग्राम) स्थापित किया जा सके।

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