एएमपीके सक्रियण द्वारा ब्लूबेरी एंथोसायनिन के हाइपोग्लाइसेमिक और हाइपोलिपिडेमिक प्रभाव: इन विट्रो और विवो स्टडीज भाग 1 में

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सार:ब्लूबेरी बायोएक्टिव एंथोसायनिन से भरपूर होती है, जिसमें उच्च स्तर का मालवीडिन होता है, जो एंटीऑक्सिडेंट लाभों से जुड़ा होता है जो मधुमेह के जोखिम को कम करने में योगदान देता है। इस अध्ययन का उद्देश्य ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क (बीएई) के हाइपोग्लाइसेमिक और हाइपोलिपिडेमिक प्रभावों की जांच करना था।मालविदिन(Mv), malvidin-3-ग्लूकोसाइड (Mv-3-GLC), और malvidin-3-galactoside (Mv-3-gal) मानव हेपेटोकार्सिनोमा कोशिका रेखा HepG2 और उच्च- स्ट्रेप्टोजोटोकिन-प्रेरित मधुमेह चूहों के संयोजन वाला वसा आहार। उच्च ग्लूकोज उपचार ने हेपेटिक ऑक्सीडेटिव तनाव को 6- गुना तक बढ़ा दिया और हेपजी 2 सेल व्यवहार्यता में कमी आई। बीएई, एमवी, एमवी -3-जीएलसी, और एमएलवी-3-गैल के साथ प्रीट्रीटमेंट ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को 87,80,76 और 91 प्रतिशत तक कम करके और सेल व्यवहार्यता में वृद्धि करके इन नुकसानों को काफी कम कर दिया। क्रमशः 88,79,73, और 98 प्रतिशत। इन पूर्व उपचारों ने ग्लूकोनोजेनेसिस और लिपोजेनेसिस में भाग लेने वाले एंजाइमों की अभिव्यक्ति के स्तर को कम करके और ग्लाइकोजेनोलिसिस और लिपोलिसिस में शामिल लोगों को बढ़ाकर क्रमशः हाइपरग्लाइसेमिया और हाइपरलिपिडिमिया को प्रभावी ढंग से रोक दिया, हेपजी 2 कोशिकाओं में एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एएमपीके) सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से। निर्धारित करने के लिए, विवो में ग्लूकोज और लिपिड चयापचय की बीएई-प्रेरित प्रतिक्रिया में एएमपीके की भूमिका, 100 मिलीग्राम / किग्रा (ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क-कम एकाग्रता, बीएई-एल) और 400 मिलीग्राम / किग्रा (ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क - उच्च एकाग्रता) की खुराक , बीएई-एच) प्रति दिन मधुमेह के चूहों को 5 सप्ताह के लिए प्रशासित किया गया था। बीएई उपचारों का एक महत्वपूर्ण (पी .) था<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">anthocyaninsब्लूबेरी निकालने-प्रेरित करने में योगदान दियाहाइपोग्लाइसीमियाऔर मधुमेह और बीएई में हाइपोलिपिडेमिक प्रभाव मधुमेह के उपचार के लिए एक आशाजनक कार्यात्मक भोजन या दवा हो सकता है।

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1 परिचय

मधुमेह मेलेटस (डीएम) एक प्रसिद्ध बीमारी है जो आमतौर पर सामान्य रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने में असमर्थता की विशेषता है। यह क्रोनिक मेटाबॉलिक डिसऑर्डर मानव स्वास्थ्य को गंभीर नुकसान पहुंचाता है और दुनिया भर में स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर भारी वित्तीय बोझ डालता है [1]। रक्त शर्करा के असंतुलन के कारण के आधार पर इस रोग को दो मुख्य प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है। टाइप 1 डीएम बीटा-कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश के कारण होता है जिससे इंसुलिन का उत्पादन करने में असमर्थता होती है जबकि टाइप 2 मधुमेह में इंसुलिन प्रतिरोध इंसुलिन रिसेप्टर्स की विशेषता होती है, जो कम कार्य करते हैं, कोशिकाओं को बढ़ते रक्त शर्करा के लिए पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया करने की अनुमति नहीं देते हैं।

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

हाइपरग्लेसेमिया के अलावा, मधुमेह रोगियों में होता हैhyperlipidemiaदोनों स्थितियों के परिणामस्वरूप ग्लाइकोक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि के माध्यम से अंगों और ऊतकों को नुकसान हो सकता है [2]। इंसुलिन उत्पादन और इंसुलिन रिसेप्टर क्षति उन कारकों में से हैं जो मधुमेह रोगियों में हाइपरग्लेसेमिया का कारण बनते हैं। यकृत में, ग्लूकोनेोजेनेसिस और ग्लाइकोजेनोलिसिस की अति-अभिव्यक्ति ग्लूकोज को रक्तप्रवाह में पुनः पट्टे पर देती है [3] जबकि, छोटी आंत में, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 2 (GLUT2) की अति-अभिव्यक्ति ग्लूकोज परिवहन में वृद्धि का कारण बनती है [4]। वसा ऊतक [5] में लिपोजेनेसिस की अति-अभिव्यक्ति के कारण हाइपरलिपिडिमिया भी बिगड़ा हुआ इंसुलिन-उत्तेजित ग्लूकोज तेज और ग्लाइकोजन संश्लेषण का कारण बन सकता है जिससे इंसुलिन प्रतिरोध होता है और इस प्रकार मधुमेह की प्रगति में योगदान होता है। मधुमेह से संबंधित दीर्घकालिक जटिलताएं विभिन्न अंगों को प्रभावित करती हैं और इसमें उच्च रक्तचाप, एथेरोस्क्लेरोसिस, रेटिनोपैथी, नेफ्रोपैथी, पैर के अल्सर और परिधीय न्यूरोपैथी [7] शामिल हैं।

वर्तमान में मधुमेह का कोई इलाज नहीं है, हालांकि, इसके प्रभावों को कम किया जा सकता है [8]। टाइप 1 मधुमेह के निदान वाले लोगों के लिए, आहार विनियमन का संयोजन, और खपत किए गए कार्बोहाइड्रेट के अनुसार इंसुलिन का उचित सेवन सामान्य उपचार है। टाइप 1 मधुमेह रोगियों के लिए वर्तमान चुनौतियों में कुल कार्बोहाइड्रेट और उचित इंसुलिन खुराक का आकलन करने में असमर्थता या कठिनाइयां शामिल हैं; हालांकि, निकट-आदर्शग्लाइसेमिकइंसुलिन पंप [9] सहित तकनीकी प्रगति को देखते हुए स्तर संभव हैं। टाइप 2 मधुमेह से पीड़ित रोगियों के लिए, उपचार अधिक जटिल हो सकता है, जिसमें आहार नियमन, व्यायाम, इंसुलिन और अन्य दवाओं के संयोजन शामिल हैं, जो रक्त शर्करा को कम करने के लिए काम करते हैं।[10] सामान्य आहार अनुशंसा का पालन करना है कम कार्बोहाइड्रेट वाला आहार [11,12]।

ब्लूबेरी उन फलों में से एक है जिसका मधुमेह के रोगी सेवन कर सकते हैं और टाइप 2 डायबिटीज मेलिटस (T2DM) के जोखिम को कम कर सकते हैं [13,14]। ब्लूबेरी मानव स्वास्थ्य के लिए लाभकारी यौगिकों की एक विस्तृत विविधता में समृद्ध हैं जिनमें खनिज, फाइबर कार्बनिक अम्ल, फेनोलिक एसिड, और फ्लेवोनोल्स और एंथोसायनिन सहित फ्लेवोनोइड शामिल हैं [15,16]। हालांकि, विशिष्ट एंथोसायनिन प्रोफाइल में गैलेक्टोसाइड्स, ग्लूकोसाइड्स, और डेल्फ़िनिडिन, माल्विडिन, साइनाइडिन, पेटुनीडिन, और पेओनिडिन [17] के अरबीनोसाइड शामिल हैं, जिसमें माल्विडिन और डेल्फ़िनिडिन आमतौर पर कुल एंथोसायनिन सामग्री [18,19] में प्रमुख योगदानकर्ता होते हैं। हमारे पिछले अध्ययन [20] में, माल्विडिन सबसे प्रचुर मात्रा में एंथोसायनिडिन था, जो रबीबेटे ब्लूबेरी फलों के अर्क के साथ-साथ डेल्फ़िनिडिन, साइनाइडिन, पेटुनीडिन और पेओनिडिन में पाया जाता था, जो अन्य लेखकों के साथ समझौता करता है, जिन्होंने कुल एंथोसायनिन सामग्री में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता होने के लिए माल्विडिन भी पाया। विभिन्न प्रकार के ब्लूबेरी में [17,21]।

ब्लूबेरी एंथोसायनिन एंटीऑक्सिडेंट क्षमता के माध्यम से और अन्य नियामक इंटरैक्शन के माध्यम से इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं क्योंकि उनके प्रभावों को पूर्व [13,22] द्वारा पूरी तरह से समझाया नहीं जा सकता है। अध्ययनों से मधुमेह से संबंधित अन्य चिंताओं के लिए ब्लूबेरी एंथोसायनिन के लाभ भी मिले हैं। इन विट्रो अध्ययन में, हुआंग एट अल। [23] पाया गया कि ब्लूबेरी एंथोसायनिन का उच्च ग्लूकोज स्थितियों में मानव रेटिना कोशिकाओं पर विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव था। उच्च ग्लूकोज के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में 64 प्रतिशत व्यवहार्यता थी जबकि ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क, माल्विडिन, माल्विडिन-ग्लूकोसाइड, या माल्विडिन-गैलेक्टोसाइड के संपर्क में आने पर, उनकी व्यवहार्यता 7-9 प्रतिशत, 83 प्रतिशत, 91- प्रतिशत, या { {11}} प्रतिशत, क्रमशः। दूसरी ओर, सॉन्ग एट अल। [24] पाया गया कि ब्लूबेरी एंथोसायनिन ने डायबिटिक रैट रेटिना में ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम किया। मधुमेह के चूहों को 20, 40 और 80 मिलीग्राम/किलोग्राम ब्लूबेरी एंथोसायनिन मौखिक रूप से 12 सप्ताह के लिए दिए गए थे। ब्लूबेरी एंथोसायनिन की उच्च खुराक वाले चूहों में कम रक्त शर्करा, उच्च एंटीऑक्सीडेंट क्षमता और रेटिना में कम सूजन, और ब्लूबेरी एंथोसायनिन के बिना कम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां थीं।

हालांकि ब्लूबेरी एंथोसायनिन मधुमेह रोगियों के लिए यकृत और अन्य अंगों को स्वास्थ्य लाभ प्रदान करते हैं, मानव यकृत कोशिकाओं में ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क (बीएई) की हाइपोग्लाइसेमिक और हाइपोलिपिडेमिक क्रियाएं स्पष्ट नहीं हैं। वर्तमान अध्ययन में, यह अनुमान लगाया गया था कि BAE, साथ ही Mv, Mv-3-glc, और Mv-3-gal, में मानव हेपेटोकार्सिनोमा कोशिकाओं (HepG2) और चूहों में हाइपोग्लाइसेमिक और हाइपोलिपिडेमिक गतिविधियाँ होती हैं और वे ग्लूकोलिपिड होमियोस्टेसिस को बनाए रख सकता है जिससे मधुमेह के विकास को कम किया जा सकता है।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. रासायनिक और अभिकर्मक

ब्राइटवेल रैबिटेय ब्लूबेरी (वैक्सीनियम ऐशी को फ़ुज़ियाबियन ऑर्चर्ड पिकिंग (नानजिंग, चीन) से काटा गया था और उनके एंथोसायनिन के अर्क को तब प्राप्त किया गया था और अंधेरे में {{0}} डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। पुन: एजेंट 3- (4,5 डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-2,5 डिपेनिल-2एच-टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) और मानक माल्विडिन (एमवी), माल्विडिन-3-ग्लूकोज (एमवी{ {11}}glc), और malvidin-3-galactose(Mv-3-gal) सिग्मा एल्ड्रिच (शंघाई, चीन) से प्राप्त किए गए थे। HepG2 प्राथमिक कोशिकाएं, बाइसीनोनिक एसिड (BCA) प्रोटीन परख किट, और संवर्धित केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन अभिकर्मकों को सीडब्ल्यू बायोटेक्नोलॉजी (बीजिंग, चीन) से प्राप्त किया गया था। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन गिब्को (ऑकलैंड, न्यूजीलैंड) से प्राप्त किए गए थे। BioFroxx streptozotocin (STZ) को Saiguo Biotech (गुआंगज़ौ, चीन) से खरीदा गया था। Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) डिटेक्शन किट Beyo-time Institute of Technology (Shan) से खरीदी गई थी। घई, चीन)। बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) को शुआनये (शंघाई, चीन) से प्राप्त किया गया था। उच्च वसा और उच्च चीनी फ़ीड (वसा 35.5 प्रतिशत, प्रोटीन 20 प्रतिशत, कार्बोहाइड्रेट 36.4 प्रतिशत, 0.1 प्रतिशत सेलूलोज़) और सामान्य फ़ीड (वसा 4.5 प्रतिशत, प्रोटीन 23 प्रतिशत, कार्बोहाइड्रेट 31.9 प्रतिशत, 3.7 प्रतिशत फ्रक्टोज़, और 5.3 प्रतिशत) सेलुलोज) चूहों के लिए Xietong Bioengineering Co., Ltd (नानजिंग, चीन) से प्राप्त किए गए थे। इंसुलिन, ट्राइग्लिसराइड (टीजी), कुल कोलेस्ट्रॉल (टीसीएचडी, ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच-पीएक्स), और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) परख किट जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग रिसर्च इंस्टीट्यूट (नानजिंग, चीन) से खरीदे गए थे। एंडीजीन ह्यूमन फोर्कहेड बॉक्स O1 (FOXO1) , ग्लूकोज-6-फॉस्फेट (G6Pase), ग्लाइकोजन सिंथेज़-फॉस्फोराइलेशन (p-GS), ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज -3 बीटा-फॉस्फोराइलेशन (p-GSK3), ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 2 (GLUT2), एसिटाइल कोएंजाइम ए कार्बोक्सिलेज (एसीसी), हार्मोन-संवेदनशील ट्राइग्लिसराइड लाइपेस (एचएसएल), 3- हाइड्रॉक्सी -3- मिथाइलग्लुटरीएल-कोएंजाइम रिडक्टेस (एचएमजीसीआर) और माउस फास्टिंग इंसुलिन एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) किट सभी ब्लूजीन बायोटेक से खरीदे गए थे। (शंघाई, चीन) इस अध्ययन में प्रयुक्त रसायन और अभिकर्मक सभी शुद्ध विश्लेषणात्मक ग्रेड थे।

2.2. एंटीबॉडी

GS, p-GS (Ser641), स्टेरोल रेगुलेटरी एलिमेंट-बाइंडिंग प्रोटीन-1c(SREBP-1c), और फ़ॉस्फ़ोएनोलपाइरूवेट कार्बोक्सीकाइनेज़ (PEPCK) के विरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी Abcam (कैम्ब्रिज, यूनाइटेड किंगडम) से प्राप्त किए गए थे। . एडीनोसिन मोनोफॉस्फेट-सक्रिय प्रोटीन किनसे अल्फा (एएमपीकेए), पी-एएमपीके ए (थ्र 172), पेरोक्सीसोम-प्रोलिफरेटर-सक्रिय रिसेप्टर-वाई-कोएक्टीवेटर -1 (पीजीसी -1), एसीसी, पी- के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी एसीसी (सेर 79), और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -कंजरेबल सेकेंडरी एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (बेवर्ली, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। ग्लिसराल्डिहाइड के खिलाफ एंटीबॉडी 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) को नानजिंग बेदी बायोमेड टेक्नोलॉजी (नानजिंग, चीन) से खरीदा गया था, जबकि -एक्टिन के खिलाफ एंटीबॉडी को सिग्मा एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग 1:1000 कमजोर पड़ने पर किया गया जबकि 1:4000 कमजोर पड़ने का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए किया गया।

2.3. ब्लूबेरी एंथोसायनिन निकालने की तैयारी (बीएई)

ब्लूबेरी एंथोसायनिन का निष्कर्षण हमारे हुआंग एट अल की पिछली पद्धति का उपयोग करके किया गया था। [25]। जमे हुए रबीबाइटे ब्लूबेरी को डीफ़्रॉस्ट होने तक कमरे के तापमान पर रखा गया था। फिर, उन्हें एक T18 मूल ULTRA-TURRAX होमोजेनाइज़र (IKA वर्क्स ग्वांगझू, चीन) का उपयोग करके 30 सेकंड के लिए 10 000 आरपीएम पर पीटा गया। 250 ग्राम ब्लूबेरी की मात्रा को 24 घंटे के लिए 1 प्रतिशत एचसीएल युक्त 1000 एमएल मेथनॉल के घोल में भिगोया गया। अर्क को तब 15 मिनट के लिए 5000 × g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एकत्र किया गया था। वैक्यूम में 40 डिग्री पर विलायक के वाष्पीकरण के बाद, अवशेषों को 1:1 (v/v) एथिल एसीटेट के साथ तीन बार निकाला गया। एंथोसायनिन युक्त पानी के चरण को कच्चे एंथोसायनिन अर्क प्राप्त करने के लिए वैक्यूम वाष्पीकरण का उपयोग करके एकत्र और केंद्रित किया गया था। अर्क को आगे AB -8 मैक्रोपोरस रेजिन (सिग्मा एल्ड्रिच, शंघाई, चीन) से शुद्ध किया गया था। फ्रुक्टोज और प्रोटीन को हटाने के लिए, अर्क को 24 घंटे के अवशोषण के लिए 1000 ग्राम एबी -8 मैक्रोपोरस रेजिन पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था और फिर डबल डिस्टिल्ड वॉटर से मिलाया गया था। एंथोसायनिन अंश को 80 प्रतिशत इथेनॉल से युक्त किया गया था जिसमें 1 प्रतिशत एचसीएल घोल था, जो वेकुओ में केंद्रित था, और फिर ब्लूबेरी एंथोसायनिन अर्क (बीएई) प्राप्त करने के लिए एक आईला एफडीयू -1200 फ्रीज ड्रायर (टोक्यो रिकाकाई, जापान) का उपयोग करके सुखाया गया था। पाउडर

2.4. सेल कल्चर और उपचार

विशिष्ट-विशिष्ट मानव हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा से व्युत्पन्न हेपजी2 सेल लाइनों में यकृत-विशिष्ट प्रोटीन का उच्च अनुपात होता है। इस कारण से, उन्हें आमतौर पर मानव यकृत कोशिका अध्ययन [26] के लिए प्रयोगशाला मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। हेपजी2 कोशिकाओं को डीएमईएम में विकसित किया गया था जिसमें सामान्य डी-ग्लूकोज (5.5 एमएम) था, जो 10 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक था और 37 डिग्री सेल्सियस और 5 प्रतिशत सीओ2 वायुमंडल इनक्यूबेटर (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) में रखा गया था। 70-80 प्रतिशत संगम पर पहुंचने के बाद, HepG2 कोशिकाओं को उपसंस्कृत किया गया। प्रयोग से चार घंटे पहले, हेपजी 2 कोशिकाओं को कम सीरम माध्यम में बंद कर दिया गया था। 24 घंटे के लिए 5 कुरूप/एमएलओफ़ एमवी, एमवी -3-जीएलसी, एमवी-3-गैल, या बीएई के साथ दिखावा करने के बाद, कोशिकाओं को सामान्य (5.5 मिमी) या उच्च (30 मिमी) ग्लूकोज सांद्रता के संपर्क में लाया गया। सामान्य और मधुमेह की स्थिति की नकल करें। कोशिकाओं को पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए तैयार किया गया था और सतह पर तैरनेवाला एलिसा विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया था।

2.5. पशु और प्रयोगात्मक डिजाइन

C57BL/6J स्वस्थ नर चूहों (20 ± 2 g) को GemPharmatech (नानजिंग, जिआंगसु, चीन) से मानक प्रयोगशाला स्थितियों में रखा गया था, जिसमें 25 डिग्री का निरंतर तापमान और एक 12-h दिन, और रात का विकल्प शामिल है। अनुसंधान पशु देखभाल और उपयोग समिति पर जिआंगसू कृषि विज्ञान उपसमिति ने पहले सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी थी। इस्लाम और लूट [27] द्वारा इस्तेमाल की जाने वाली विधि के अनुसार पशु मॉडल में T2DM को प्रेरित करने के लिए एक उच्च वसा वाले आहार और स्ट्रेप्टोज़ोटोसीन (STZ) का उपयोग किया गया था। एक सामान्य आहार का सेवन करने वाले नियंत्रण समूह को छोड़कर सभी चूहों को उच्च वसा और उच्च चीनी वाले आहार के साथ खिलाया गया था। 4 सप्ताह के बाद, चूहों को 12 घंटे के लिए उपवास किया गया और सोडियम साइट्रेट बफर समाधान (पीएच 4. 2-4.5) में भंग 100 मिलीग्राम / किग्रा एसटीजेड के साथ अंतःक्षिप्त रूप से इंजेक्ट किया गया। एसटीजेड शामिल होने के एक हफ्ते बाद, चूहों की पूंछ की नस से रक्त के नमूने लिए गए, जिन्होंने रात भर उपवास किया था। चूहे जो मधुमेह के लक्षण प्रस्तुत करते हैं, जिनमें पॉल्यूरिया, पॉलीडिप्सिया और हाइपरग्लाइसेमिया (उपवास रक्त शर्करा का स्तर> 11.1 मिमीोल / एल) शामिल हैं, को T2DM के रूप में मान्यता दी गई और भविष्य के अध्ययन के लिए उपयोग किया गया। मॉडल की T2DM स्थिरता की जांच करने के लिए, सभी चूहों को एक सप्ताह के लिए सामान्य आहार दिया गया। सामान्य चूहों को नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया था। मधुमेह के चूहों को तब बेतरतीब ढंग से तीन समूहों में विभाजित किया गया था: मॉडल, कम खुराक बीएई (100 मिलीग्राम / किग्रा), और उच्च खुराक बीएई (400 मिलीग्राम / किग्रा)। लगातार 6 दिनों के लिए, विलायक 100 μL）, 100 मिलीग्राम / किग्रा या 400 मिलीग्राम / किग्रा बीएई की समान मात्रा का इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन नियंत्रण समूह, मॉडल समूह, कम खुराक बीएई और उच्च खुराक बीएई को दिया गया था। क्रमश। सातवें दिन, शरीर के वजन और उपवास रक्त शर्करा को मापा गया। वही इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन 5 सप्ताह तक जारी रहा। चूहों को रात भर उपवास किया गया, और अवर वेना कावा से सीरम तैयार करने के लिए रक्त के नमूने एकत्र किए गए और -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। रक्त के नमूने के बाद, सभी चूहों को एनेस्थेटाइज किया गया और उनकी बलि दी गई। चूहों के जिगर, प्लीहा, गुर्दे और थाइमस के ऊतकों को हटा दिया गया, तौला गया और आगे के प्रयोगों के लिए -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

2.6. सेल व्यवहार्यता का पता लगाना

सेल व्यवहार्यता एमटीटी विधि द्वारा निर्धारित की गई थी। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं के ढोंग के लिए Mv, Mv {0}}glc, Mv-3-gal या BAE के पांच कुरूप / एमएल का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को तब 24 घंटे के लिए 5 मिमी 30 मिमी ग्लूकोज के साथ इलाज किया गया था और 10 μL 0.5 प्रतिशत 5 मिलीग्राम / एमएल） एमटीटी को उन कोशिकाओं में जोड़ा गया था जिन्हें फिर से सुसंस्कृत किया गया था। 4 घंटे के बाद, एमटीटी समाधान हटा दिया गया था, और सेल क्रिस्टल को भंग करने के लिए मिश्रण को धीरे-धीरे 10 मिनट तक हिलाने से पहले 100 μL डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़ा गया था। ऑप्टिकल घनत्व (OD) मान प्राप्त करने के लिए 490 एनएम पर अवशोषण को स्टेटफैक्स -2100 माइक्रोप्लेट रीडर (अवेयरनेस टेक-नोलॉजी इंक, प्लाम, एफएल, यूएसए) पर मापा गया था। सामान्य ग्लूकोज स्तर (5.5 mmol/L) के साथ संवर्धित कोशिकाओं को नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किया जाता था, जबकि कोशिकाओं के बिना कुओं को रिक्त के रूप में उपयोग किया जाता था। सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग किया गया था: सेल व्यवहार्यता (प्रतिशत)=(नमूना समूह OD मान-रिक्त समूह OD मान)/(नियंत्रण समूह OD मान-रिक्त समूह OD मान) x 100 प्रतिशत।

2.7. आरओएस फ्लोरेसेंस विज़ुअलाइज़ेशन

HepG2 कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का मूल्यांकन DCFH-DA डिटेक्शन किट का उपयोग करके किया गया था। 24 घंटे के लिए Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal, या BAE के 5 कुरूप/एमएल के साथ प्रारंभिक उपचार के बाद बाद में 24 घंटे के लिए 5 मिमी या 30 मिमी ग्लूकोज उपचार के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया था, और फिर प्रत्येक कुएं में 10 μM DCFH-DA जोड़ा गया और 37 डिग्री पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई। कोशिकाओं को फिर से पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया गया था और फिर इन कोशिकाओं के एक समूह को तुरंत IX53 उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (ओलिंप, टोक्यो, जापान) के तहत 530 एनएम उत्सर्जन और 485 एनएम उत्तेजना फिल्टर पर देखा गया था। छवियों को 200 × आवर्धन के तहत प्रस्तुत किया गया है। पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं का एक और समूह एकत्र किया गया था और उनके प्रतिदीप्ति को एक सिनर्जी H4 मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक इंस्ट्रूमेंट्स इंक, वीनोस्की, वीटी, यूएसए) द्वारा दर्ज किया गया था। प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता को नोट किया गया था, और आरओएस पीढ़ी को नियंत्रण की तह के रूप में मापा गया था।

2.8. एलिसा

एलिसा किट का उपयोग ग्लूकोनोजेनेसिस (FOXO1, G6Pase, p-GS), ग्लाइकोजेनोलिसिस (p-GSK3), ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर (GLUT2), लिपोजेनेसिस (ACC और HMGCR), और लिपोलिसिस (HSL) में शामिल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। कोशिकाएं। चूहों के लीवर में GLUT2 की मात्रा भी निर्धारित की गई थी। सतह पर तैरनेवाला के कुल सेल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग किया गया था। प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक स्टेटफैक्स -2100 माइक्रोप्लेट रीडर (अवेयरनेस टेक्नोलॉजी इंक, प्लाम, एफएल, यूएसए) पर 450 एनएम पर अवशोषण 37 डिग्री पर मापा गया था।

2.9. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण

AMPK, p-AMPK, ग्लूकोनेोजेनेसिस (PGCl, PEPCK, ग्लाइकोजेनोलिसिस (GS, p-GS), और लिपोलिसिस (ACC, p-ACC, SREBP) के प्रोटीन स्तर को मापने के लिए HepG2 lysates पर वेस्टर्न ब्लॉटिंग किया गया था {{4} } c) कोशिकाओं में। मधुमेह प्रेरित चूहों के जिगर पर AMPK, p-AMPK की मात्रा निर्धारित करने के लिए पश्चिमी सोख्ता भी किया गया था। या तो GAPDH या -एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। LAS-3000 इमेजिंग सिस्टम (फ़ूजी, टोक्यो, जापान) का उपयोग प्रोटीन बैंड का निरीक्षण करने के लिए किया गया था, और बायो प्रोफाइल 1D प्लस प्लस (विलबर्ट लौर-मैट, मार्ने ला वैली, फ्रांस) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उनके घनत्व को निर्धारित किया गया था। सभी डेटा को एक गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया गया था नियंत्रण।

2.10. उपवास रक्त ग्लूकोज और ग्लूकोज सहिष्णुता परख

उपवास रक्त ग्लूकोज को सप्ताह में एक बार 12-एच उपवास अवधि के बाद 5 सप्ताह की अवधि के लिए मापा गया था। ग्लूकोज टॉलरेंस परख के लिए, चूहों को 16 घंटे के लिए उपवास किया गया और 2 ग्राम/किग्रा 20 प्रतिशत ग्लूकोज （200 μL-इंट्रा-गैस्ट्रिकली (ig) के साथ खिलाया गया ताकि 0 पर रक्त शर्करा का निर्धारण किया जा सके। ,0.5,1,1.5, और 2h। रक्त को पूंछ की नस से एकत्र किया गया था और ग्लूकोमीटर (सिनोकेयर, चांग्शा, चीन) का उपयोग करके ग्लूकोज के स्तर को मापा गया था। आईजी प्राप्त करने वाले चूहों के मूत्र में ग्लूकोज का स्तर भी पांच सप्ताह की अवधि के लिए मापा गया था।

2.11. चूहों के जिगर में सीरम जैव रासायनिक सूचकांक और एंजाइम गतिविधि का आकलन

सीरम में इंसुलिन, ट्राइग्लिसराइड और कुल कोलेस्ट्रॉल की मात्रा को मापा गया, जबकि एसओडी और जीएसएच-पीएक्स एंजाइम गतिविधि का अनुमान निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक किट का उपयोग करके लगाया गया था। ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) और कुल कोलेस्ट्रॉल (टीसीएच) के लिए 500 एनएम पर अवशोषण, और अन्य के लिए 450 एनएम (इंसुलिन, एसओडी, और जीएसएच-पीएक्स) को स्टेटफैक्स -2100 माइक्रोप्लेट रीडर (जागरूकता प्रौद्योगिकी) पर 37 डिग्री पर मापा गया था। इंक।, प्लाम, एफएल, यूएसए)।

2.12. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत मान ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 8 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक।, सीए, यूएसए) का उपयोग करके आंकड़े प्राप्त किए गए थे। विभिन्न समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर को निर्धारित करने के लिए विचरण (ANOVA), t -ests, या Sidak के कई तुलना परीक्षण का एक-तरफ़ा विश्लेषण किया गया। P . पर अंतर को महत्वपूर्ण माना गया<>

यह लेख https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 से लिया गया है, 21 जुलाई 2021 को प्राप्त हुआ; 9 अगस्त 2021 को संशोधित रूप में प्राप्त; स्वीकृत 11 अगस्त 2021