गुर्दे की इमेजिंग: प्रकाश से सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तक

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मारिया लूसिया एंजेलोटी^1,2, गिउलिया एंटोनेलि^1,2कैरोलिना कोंटे^1,2और पाओला रोमाग्नानी^1,2

सार

में महत्वपूर्ण उपलब्धियांगुर्दामाइक्रोस्कोपी की तकनीक में प्रगति के लिए शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र को काफी हद तक जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। की वास्तुकला के बारे में हम जो कुछ जानते हैं, उसमें से अधिकांशगुर्दाप्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और बाद में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण द्वारा संरचनात्मक सूक्ष्मदर्शी के मूलभूत विवरणों पर आधारित है। इन दो तकनीकों का उपयोग गुर्दे की बीमारियों की पहली वर्गीकरण प्रणाली और उनके निरंतर अद्यतन के लिए किया गया था। हाल ही में, उपन्यास इमेजिंग तकनीकों की एक श्रृंखला ने समय और स्थान के आगे के आयामों में विश्लेषण जोड़ा। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने हमें z- अक्ष के साथ ऑप्टिकल अनुभागों की क्रमिक रूप से कल्पना करने की अनुमति दी और विशिष्ट विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की उपलब्धता ने मोटे ऊतक नमूनों का त्रि-आयामी प्रतिपादन प्रदान किया। मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी ने हमें एक साथ जांच करने की अनुमति दीगुर्दावास्तविक समय में कार्य और संरचना। प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी ने हमें मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने की अनुमति दी। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी ने नैनो-स्केल स्तरों तक संवेदनशीलता और रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाया। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ, शोधकर्ता अलग-अलग बायोमोलेक्यूल्स को परमाणु स्तर पर सीधे ऊतकों में देख सकते हैं और उप-कोशिकीय स्तरों पर उनकी बातचीत को समझ सकते हैं। अंत में, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्शन/आयनीकरण इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने उच्च रिज़ॉल्यूशन पर ऊतक वर्गों पर एक ही समय में सैकड़ों विभिन्न अणुओं को मापने की अनुमति दी। यह समीक्षा उपलब्ध का एक सिंहावलोकन प्रदान करती हैगुर्दाइमेजिंग रणनीतियों, नवीनतम तकनीकी सुधारों के संभावित प्रभाव पर ध्यान देने के साथ।

कीवर्ड:इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री,गुर्दाबायोप्सी, पोडोसाइट्स,समीपस्थछोटी नली, मूल कोशिका

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परिचय

गुर्दे काइसके विविध शारीरिक कार्यों को पूरा करने के लिए आकर्षक संरचनात्मक जटिलता की आवश्यकता होती है। शुरुआत में, अध्ययनगुर्दामैक्रोस्कोपिक अवलोकनों तक सीमित था और गुर्दे की बीमारियों के निदान में उनका योगदान निर्विवाद रूप से सीमित था। नैदानिक अभिव्यक्तियों का वर्णन किया गया था लेकिन अंतर्निहित रोगजनक तंत्र अज्ञात थे। गुर्दा शरीर क्रिया विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी को समझने में उपलब्धियों को काफी हद तक माइक्रोस्कोपी क्षेत्र में निरंतर प्रगति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। पर प्रयासगुर्दाइमेजिंग बहुत पहले शुरू हुई थी [1]। 1666 में, एनाटोमिस्ट माल्पीघी ने जांच कीगुर्दाएक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के साथ ऊतक जिसकी क्षमता 25-30 होने का अनुमान लगाया गया था और पहली बार ग्लोमेरुलस को 'एक ग्रंथि जिसमें मूत्र को रक्त से अलग किया गया था' के रूप में वर्णित किया गया था। इस योगदान को 1842 तक नजरअंदाज कर दिया गया था जब सर विलियम बोमन द्वारा नेफ्रॉन संरचनाओं को 10 गुना अधिक शक्तिशाली प्रकाश माइक्रोस्कोप से सुलझाया गया था। बोमन ने पेरिग्लोमेरुलर कैप्सूल (जिसे बाद में बोमन कैप्सूल नाम दिया) की खोज की, जो शारीरिक रूप से नलिका के पहले भाग से जुड़ा हुआ था [3]। 1862 में, जैकब हेनले ने लूप-जैसे ट्यूब्यूल सेगमेंट का वर्णन किया, जिसने उनका नाम लिया, कॉर्टिकल ट्यूब्यूल और रीनल पैपिला को जोड़ते हुए।

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प्रकाश माइक्रोस्कोपी की शुरुआत के लिए धन्यवाद, का एक हिस्टोमोर्फोलॉजिकल वर्गीकरणगुर्दाबीमारीसंभव हुआ [1] रोगग्रस्त गुर्दे में क्या हो रहा था, यह देखने का मौका किसी को यह समझने की अनुमति देता है कि समान नैदानिक अभिव्यक्तियों वाले रोगियों के बीच रोग संबंधी परिवर्तन काफी भिन्न होते हैं। हालांकि, गुर्दे के ऊतकों में रोग संबंधी परिवर्तनों पर पहला अध्ययन शव परीक्षण के नमूनों पर किया गया था, जिससे ज्यादातर पुरानी बीमारियों का वर्णन किया गया था। गुर्दे की विकृति के विकास और ऑटोलिटिक घटना की तकनीकी समस्या के बारे में जानकारी की कमी, पोस्टमार्टम ऊतकों के उपयोग से संबंधित, मानव रोगों के ज्ञान को सीमित करती है। 1951 में, की शुरूआतगुर्दाबायोप्सी ने न केवल पुरानी बल्कि तीव्र गुर्दे की बीमारियों के प्रत्यक्ष अवलोकन और अध्ययन की अनुमति दी। इस बीच, माइक्रोस्कोपी धीरे-धीरे अधिक परिष्कृत हो गई और नैनोस्केल स्तर तक उत्तरोत्तर वृद्धि हुई संवेदनशीलता और संकल्प के साथ। इस समीक्षा में, हम सबसे हाल के तकनीकी विकास से विकसित होने वाली संभावनाओं पर ध्यान देने के साथ, माइक्रोस्कोपी तकनीक में प्रगति द्वारा संभव किए गए मौलिक गुर्दे की खोजों का एक सिंहावलोकन प्रदान करेंगे।

गुर्दे की इम्यूनोपैथोलॉजी की कल्पना करना

इम्यूनोलेबलिंग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

जीवित ऊतक के एक प्रतिनिधि टुकड़े को प्राप्त करने की संभावना ने उभरती हुई तकनीकों के अनुप्रयोग की अनुमति दी, जिसमें अधिकतम ऊतक संरक्षण की आवश्यकता होती है, जैसे कि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तरीके (फ्लोरोसेंट पहले, फिर एंजाइमेटिक)। वास्तव में, 1950 में, Coons ने अपने ऊतक प्रतिजनों के साथ विशेष रूप से प्रतिक्रिया करने की क्षमता को नष्ट किए बिना, फ्लोरेसिन आइसोसाइनेट, यानी इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एंटीबॉडी को लेबल करने की विधि विकसित की। तब से जमे हुए गुर्दे की बायोप्सी नमूनों के मूल्यांकन के लिए नैदानिक प्रक्रिया में इम्यूनोफ्लोरेसेंस को शामिल किया गया है। पहली बार, इन तकनीकों ने ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस से प्रभावित रोगियों में इंट्रारेनल इम्युनोग्लोबुलिन (Igs) और पूरक जमा के अवलोकन की अनुमति दी, उदाहरण के लिए, अर्धचंद्राकार ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस [4] में कुछ विशिष्ट ऊतक घावों के अंतर्निहित विभिन्न पैथोफिज़ियोलॉजी के भेदभाव में योगदान दिया। इसके अलावा, इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के अलावा एंटीबॉडी के लिए एक विशिष्ट धुंधला पैटर्न और फ्लोरेसिन के युग्मन का निरीक्षण करने की संभावना ने आईजीए नेफ्रोपैथी में इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) जमा की पहचान के साथ-साथ संक्रामक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में पूरक जमा की पहचान की। और मेम्ब्रेनोप्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस [4]।

संनाभि माइक्रोस्कोपी

1980 के दशक के उत्तरार्ध में कंफोकल माइक्रोस्कोपी की शुरुआत के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में काफी तकनीकी सुधार हुआ। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी में प्रमुख तत्व बिंदु रोशनी हैं जो नमूने पर केंद्रित और स्कैन किए गए हैं और डिटेक्टर के सामने एक चर कन्फोकल एपर्चर (पिनहोल) है जो फोकल प्लेन (ऑप्टिकल सेक्शन कहा जाता है) के चारों ओर केवल एक पतले खंड से प्रकाश के संग्रह की अनुमति देता है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने प्रायोगिक मॉडल में किडनी के विवो अध्ययन में पहला सक्षम बनाया और अक्षुण्ण में नलिकाओं के माध्यम से फ्लोरोसेंट अणुओं के उत्थान और परिवहन का अवलोकन किया।गुर्देमाइक्रोपंचर के बाद। इसने शारीरिक और रोग स्थितियों [5] में ट्यूबलर फ़ंक्शन के अध्ययन की अनुमति दी।

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 एनएम, दृश्य प्रकाश, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी की विवर्तन सीमा के कारण।

ग्लोमेरुलर फिल्ट्रेशन बैरियर को समझना: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

प्रकाश और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की संकल्प सीमा को पार करने का पहला प्रयास 1931 में हुआ था जब अर्नस्ट रुस्का और मैक्स नॉल ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) का आविष्कार किया था, जो एक उत्तेजना स्रोत के रूप में प्रकाश की किरण के बजाय त्वरित इलेक्ट्रॉनों के एक बीम का उपयोग करता है। और इसमें प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (0.2 एनएम तक) की तुलना में उच्च संकल्प शक्ति होती है। इस नवाचार के लिए 1986 में अर्न्स्ट रुस्का को भौतिकी में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था। बढ़ी हुई संकल्प शक्ति के लिए धन्यवाद, यह जल्द ही स्पष्ट हो गया कि ग्लोमेरुलस केवल एक यांत्रिक फिल्टर नहीं था, बल्कि तीन परतों से बना एक अत्यंत जटिल अंग था: एंडोथेलियल कोशिकाएं, ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन (GBM), और पॉडोसाइट्स [9]। ट्रांसमिशन ईएम (टीईएम) ने अंदर से ग्लोमेरुलर कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति दी [10] और पता चला कि एंडोथेलियल कोशिकाओं में पतले फेनेस्ट्रेटेड सेल बॉडी होते हैं, जबकि पॉडोसाइट्स में बड़े सेल बॉडी होते हैं, और प्राथमिक और माध्यमिक 'फुट' प्रक्रियाओं का विस्तार जीबीएम से जुड़ा होता है और इसके माध्यम से जुड़ा होता है। रैखिक जंक्शन (मामूली डायाफ्राम) (चित्र 1ख)। इसके अलावा, ईएम (एसईएम) को स्कैन करना, बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों को कैप्चर करना, उनकी बाहरी सतह से ग्लोमेरुलर कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है [10] और पता चला कि पड़ोसी पॉडोसाइट्स की पैर प्रक्रियाओं को इंटरडिजिट किया गया और जीबीएम (चित्रा 1 सी) को कवर किया गया। ईएम न केवल सामान्य ग्लोमेरुलर अवसंरचना की समझ के लिए बल्कि समझने के लिए भी एक शक्तिशाली उपकरण बना हुआ हैगुर्दाफिजियोलॉजी और पैथोफिजियोलॉजी [11]। मानव नमूनों पर या प्रायोगिक मॉडल में किए गए कई अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न रोग प्रक्रियाएं अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों के विशिष्ट पैटर्न के एक सेट से जुड़ी हुई हैं, जिसका अर्थ है कि एक विकसित वर्गीकरण प्रणाली पर और अपडेट।गुर्दाबीमारी। गुर्दे की संरचना की एक और जटिलता की कल्पना करने की तकनीकी क्षमता ने 'नेफ्रो'पैथोलॉजिस्ट की विशेषज्ञता का समर्थन किया।

अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टर पर आधारित एक हालिया SEM तकनीक ने स्लिट डायफ्राम के सबसे गहरे हिस्से के अध्ययन की अनुमति दी और पता चला कि यह अलग-अलग आकार के छिद्रों द्वारा विशेषता थी [12]। चूहों में, प्रोटीनुरिया की शुरुआत बड़े छिद्रों से जुड़ी हुई थी, इस संभावना को बढ़ाते हुए कि स्लिट डायफ्राम के अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तन ग्लोमेरुलर पारगम्यता में परिवर्तन का कारण हो सकते हैं [12]। एक और तकनीकी प्रगति के रूप में, ब्लॉक-फेस एसईएम ने स्वस्थ चूहों, रोगग्रस्त चूहों में सबसे पतली सेलुलर प्रक्रियाओं के नैनोस्ट्रक्चर का पालन करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा के 2 डी से 3 डी दृश्य में पारित होने की अनुमति दी।गुर्दाविकास [13, 14]।

अंत में, एक्स-रे माइक्रोएनालिसिस सिस्टम (एक्स-रे माइक्रोस्कोपी) के लिए ईएम के युग्मन ने एक संरचनात्मक स्तर पर कोशिकाओं या कोशिकाओं के कुछ हिस्सों के एक मौलिक विश्लेषण की अनुमति दी। एक्स-रे माइक्रोस्कोपी नमूने को उत्तेजित करने के लिए एक संकीर्ण इलेक्ट्रॉन बीम के साथ स्कैनिंग टीईएम का उपयोग करता है। नमूनों में परमाणुओं के साथ बीम से उच्च-ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों का प्रभाव एक्स-रे फोटॉन के रूप में ऊर्जा पैदा करता है। ऊर्जा-फैलाने वाले अर्धचालक डिटेक्टर के साथ एकत्र किए गए इस एक्स-रे सिग्नल का उपयोग नमूने में मौजूद तत्वों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जिसमें सबसे अच्छा, 30 एनएम का संकल्प होता है। मेंगुर्दाक्षेत्र में, एक्स-रे माइक्रोएनालिसिस का सफलतापूर्वक उपयोग बेक और थुराउ द्वारा ट्रान्सपीथेलियल ट्यूब्यूल आयन ट्रांसपोर्ट [15] और ट्यूबलर कोशिकाओं [16] में इंट्रासेल्युलर मौलिक एकाग्रता का अध्ययन करने के लिए किया गया था।

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मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी के साथ गुर्दे की फिजियोलॉजी को देखना

मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी (MPM) ने में और प्रगति प्रदान कीगुर्दाअनुसंधान, अर्थात्, वास्तविक समय में गुर्दे के कार्य और संरचना संबंधों की एक साथ जांच करने की संभावना [17]। पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी से भिन्न, दो-फोटॉन उत्तेजना दो फोटॉनों के एक साथ अवशोषण पर निर्भर करती है जिसमें डबल उत्तेजना तरंग दैर्ध्य होता है जो क्लासिक एक-फोटॉन उत्तेजना (चित्रा 1डी) में फ्लोरोफोर को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पंदित अवरक्त, कम-ऊर्जा उत्तेजना लेज़रों के उपयोग ने गहरी ऊतक पैठ में वृद्धि की और फोटोटॉक्सिसिटी को कम किया (चित्र 1डी)। इसने शोधकर्ताओं को सीधे जीवित जानवरों में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना करने में सक्षम बनाया, एक ऐसी सुविधा जो पहले किसी अन्य तकनीक से प्राप्त नहीं की जा सकती थी। एमपीएम बुनियादी गुर्दे के कार्यों और ग्लोमेरुलर पारगम्यता, संवहनी रक्त प्रवाह, एकल-नेफ्रॉन ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर और ट्यूबलर प्रवाह [17] (चित्रा 1ई और एफ) जैसे रोग संबंधी परिवर्तनों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा, एमपीएम चोट के जवाब में इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है, जिसमें सेल डेथ और शेडिंग, ल्यूकोसाइट रोलिंग, और जीबीएम [17] की भर्ती और व्यवधान शामिल हैं। आगे के तकनीकी सुधारों ने दिनों से लेकर हफ्तों तक लंबे समय तक इंट्रावाइटल इमेजिंग की अनुमति दी है [18] कि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के संयोजन में, स्वस्थ और घायल गुर्दे में सीधे विवो में एकल कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया गया है [19] और रीनल सेल टर्नओवर और पुनर्जनन के तंत्र को बेहतर ढंग से समझें।

एमपीएम के साथ लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक भी संभव थी, चोट के बाद ट्यूबलर कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति का अध्ययन करने के लिए निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड हाइड्रेट (एनएडीएच) के प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस का शोषण [20]। इसके अलावा, फाइब्रिलर कोलेजन से दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी का उपयोग कोलेजन जमाव को मापने के लिए किया गया था, जो वृक्क फाइब्रोसिस का एक मार्कर है [21]। दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी एक गैर-रेखीय ऑप्टिकल प्रक्रिया है जिसमें एक ही तरंग दैर्ध्य वाले दो उत्तेजना फोटॉन जैविक ऊतकों में गैर-सेंट्रोसिमेट्रिक संरचनाओं के साथ बातचीत करते हैं, जैसे कोलेजन या सूक्ष्मनलिकाएं, और आधे तरंग दैर्ध्य के साथ एक नया फोटॉन उत्पन्न करते हैं।

FIGURE 1: (A) 3D reconstruction of a glomerulus from a 50-lm-thick kidney section, showing de novo podocyte regeneration in a transgenic mouse model of adriamycin-induced nephropathy.

इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का एक हालिया नवाचार एक लघुकृत मल्टीफोटोन एंडोस्कोप की शुरूआत थी जिसका उपयोग जीवित संवेदनाहारी चूहों में गुर्दे की छवि के लिए सफलतापूर्वक किया गया था [22]। यह न्यूनतम इनवेसिव एमपीएम ऊतक हटाने के बिना, और बहुत कम समय में विवो निदान में वास्तविक समय का मार्ग प्रशस्त कर सकता है।

3डी में किडनी: ऊतक-समाशोधन तकनीक और विस्तार माइक्रोस्कोपी

तकनीकी सुधारों के बावजूद, गहरी वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए प्रमुख सीमाओं में से एक वृक्क ऊतक अस्पष्टता है, जो बनाता हैगुर्दासबसे वैकल्पिक रूप से चुनौतीपूर्ण अंगों में से एक। यही कारण है कि ऊतक-समाशोधन तकनीकों ने बहुत रुचि पैदा की है [23]। इन दृष्टिकोणों का उद्देश्य एक अपारदर्शी ऊतक को एक पारदर्शी एक में परिवर्तित करना है, प्रोटीन और अंततः फ्लोरोसेंट मार्करों को संरक्षित करना, मोटी ऊतक स्लाइस की छवि बनाना है। अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी के साथ ऑप्टिकल समाशोधन का संयोजन मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण की संभावना प्रदान करता है, जैसे कि ग्लोमेरुलर मात्रा और संख्या की मात्रा, मोटे ऊतकों में या यहां तक कि बरकरार गुर्दे में [24]। अन्य अनुप्रयोगों में अलग-अलग नलिका खंडों का विश्लेषण [25], उनके कार्य [26], और पॉडोसाइट हानि की मात्रा निर्धारित करना [27] शामिल हैं।

ऊतक की बड़ी मात्रा की छवि बनाने और, साथ ही, ठीक संरचनात्मक विवरणों को हल करने के लिए, हाल ही में एक नया तकनीकी दृष्टिकोण पेश किया गया था, जो कि विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) है। विचार समग्र संरचना और 3D प्रोटिओम सामग्री को संरक्षित करते हुए एक संपूर्ण अंग को 4- से 5- गुना करने के लिए भौतिक रूप से विस्तारित करना है। नमूने के भीतर सीधे संश्लेषित एक विस्तारित बहुलक का उपयोग करके, प्रकाश की विवर्तन सीमा के करीब अणुओं को अंतरिक्ष में अधिक दूरी तक आइसोट्रोपिक रूप से अलग किया जाता है और इसलिए पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा भी वैकल्पिक रूप से हल किया जा सकता है। इसके अलावा, ExM अधिक ऑप्टिकल पारदर्शिता प्रदान करता है और प्रकाश के बिखरने को कम करता है, जिससे किसी को ऊतक की एक बड़ी मात्रा की कल्पना करने की अनुमति मिलती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, भट्ठा डायाफ्राम और जीबीएम में कई प्रोटीनों के स्थानीयकरण को एक सामान्य कन्फोकल माइक्रोस्कोप [28] के साथ भी विच्छेदित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह 2डी और 3डी दोनों में प्रोटीन्यूरिक चूहों में पैर की प्रक्रिया के क्षरण को प्रकट कर सकता है, एक नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर जो [29] से पहले कभी नहीं पहुंचा। हाल ही में एक्सएम का उपयोग पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों के नैदानिक हिस्टोपैथो तर्क मूल्यांकन के लिए किया गया है जो पहले से ही हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन [30] से सना हुआ है। यह तकनीक एक नैनोस्केल स्तर पर पैर की प्रक्रिया के क्षरण को देख सकती है जो पहले केवल ईएम के साथ संभव था। वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग में प्रगति पूरे अंग के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी विश्लेषण को इस तरह से अनुमति देती है कि गहरी इमेजिंग के लिए मुख्य सीमा अब ऊतक में प्रवेश करने के लिए एंटीबॉडी की क्षमता द्वारा भेजी जाती है।

मेटाबोलिक प्रोफाइल का अध्ययन: फ्रीक्वेंसी-डोमेन फ्लोरेसेंस-लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी

गुर्दामाइटोकॉन्ड्रिया की उच्च सामग्री वाला एक चयापचय अंग है। एनएडीएच और अन्य मेटाबोलाइट्स का कम रूप स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट होता है और इस ऑटोफ्लोरेसेंस को रेडॉक्स राज्य [20] के सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन अंतर्जात फ्लोरोफोर्स के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा अतिव्यापी हैं, और उन्हें अलग से पहचानना असंभव था। लेकिन प्रतिदीप्ति जीवनकाल (अर्थात प्रतिदीप्ति का समय क्षय) काफी भिन्न पाया गया। इसलिए प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) चयापचय प्रोफाइल [31] के अध्ययन की अनुमति देता है। हाल ही में, एमपीएम और एफएलआईएम के संयोजन का उपयोग करते हुए, सेल-विशिष्ट चयापचय हस्ताक्षरों को चिह्नित करना और विवो में चयापचय परिवर्तनों की निगरानी करना संभव हो गया है।गुर्दारोग [32]। FLIM से और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करने की अपेक्षा की जाती हैगुर्दास्वास्थ्य और रोग में विवो में चयापचय।

संकल्प को सीमा से परे धकेलना: गुर्दे की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी 200 एनएम से अधिक ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की सीमा का सामना करता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के रूप में संदर्भित नई प्रौद्योगिकियां, अब फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को नैनोस्कोपी के युग के शुरुआती बिंदु के रूप में अपनी विवर्तन सीमा से परे छवि की अनुमति देती हैं [33]। ये दृष्टिकोण बहुरंगा प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लाभों के साथ नैनोस्कोपिक संकल्प को जोड़ते हैं। इन नवाचारों के संभावित प्रभाव की मान्यता में, एरिक बेटज़िग, स्टीफन हेल और विलियम मोरनर को 'सुपर-सॉल्व्ड फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी के विकास के लिए रसायन विज्ञान में 2014 का नोबेल पुरस्कार दिया गया था। विभिन्न जैविक प्रश्नों के समाधान के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की विभिन्न रणनीतियों को लागू किया जा सकता है। इन दृष्टिकोणों को दो मुख्य श्रेणियों में बांटा जा सकता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन का एकल अणुओं के स्तर पर शोषण किया जाता है या पहनावा [33]।

एसेंबल-आधारित तकनीक

एसेंबल-आधारित तकनीक अस्थायी और स्थानिक रूप से उत्तेजना प्रकाश किरण को संशोधित करके विवर्तन सीमा को तोड़ती है। उनमें से, सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) इमेजिंग दो लेजर, एक उत्तेजना लेजर और एक डोनट आकार के साथ एक सुपरिम्पोज्ड, रेड-शिफ्टेड, डिक्लेक्शन लेजर (एसटीईडी लेजर) का उपयोग करता है, जो बंद फ्लोरोफोर्स से फ्लोरोसेंस उत्सर्जन को दबाने के लिए होता है। उत्तेजना का केंद्र। यह दमन उत्तेजित उत्सर्जन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और केवल विवर्तन सीमा (चित्रा 2ए) के नीचे एक आयाम के साथ एक फोकल स्थान से उत्पन्न होने वाले संकेत को एकत्र करने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से साफ किए गए स्लिट डायाफ्राम की छवि के लिए एसटीईडी इमेजिंग का उपयोग किया गया थागुर्दाऊतक (चित्र 2बी-सी') और नैनोमीटर पैमाने पर पॉडोसिन और नेफ्रिन के स्थानिक वितरण को कम से कम 30 एलएम गहराई [34] तक के स्थानीयकरण की अनुमति दी। इसके अलावा, एक प्रयोगात्मक मॉडल में पैर प्रक्रिया अपक्षय का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करने की संभावना ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा [34] के अध्ययन के लिए एसटीईडी इमेजिंग को उपयोगी बना सकती है।

एसटीईडी माइक्रोस्कोपी को नमूना तैयार करने, विशेष फ्लोरोफोर्स और तकनीकी प्रशिक्षण के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। इस कारण से, पिछले कुछ वर्षों में एक और सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) पर अधिक ध्यान दिया गया है, जो पार्श्व और अक्षीय रूप से दो के कारक द्वारा विवर्तन सीमा को बढ़ा सकता है। सिम एक महीन-धारीदार रोशनी पैटर्न के साथ एक विस्तृत-क्षेत्र माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग करता है, जिससे कम स्थानिक आवृत्तियों पर उच्च-आवृत्ति जानकारी (नमूने में बारीक विवरण के अनुरूप) को कैप्चर करने की अनुमति मिलती है। विभिन्न चरणों और झुकावों के रोशनी पैटर्न के साथ कई छवियों को प्राप्त करके, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि का पुनर्निर्माण किया जा सकता है (चित्र 3ए)। सिम मानक fluorophores के साथ संगत है, विशिष्ट नमूना तैयार करने की आवश्यकता नहीं है, और 3D विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इन सभी लाभों को देखते हुए, सिम को तेजी से निदान उपकरण के रूप में उपयोग करने की संभावना का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न अध्ययन किए गए [35], उदाहरण के लिए, ईएम की तुलना में संभावित कम टर्नअराउंड समय के साथ। हाल ही में एक 3डी सिम और स्वचालित छवि प्रसंस्करण का उपयोग पैर की प्रक्रिया के क्षरण के तेजी से नैदानिक उपकरण के रूप में किया गया है, जिसमें न्यूनतम परिवर्तन रोग [36] (चित्रा 3बी और सी) के रोगियों की बायोप्सी से नियमित पैराफिन वर्गों का उपयोग किया गया है। नैनोस्केल पैथोलॉजी को प्रदर्शित करने के लिए ज्ञात रोगों में परिवर्तनों की सफलतापूर्वक पहचान करने की यह क्षमता सिम को नियमित निदान के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में पुष्टि करती है।

एकल-अणु स्थानीयकरण-आधारित इमेजिंग विधियां

ये तकनीकें व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट अणुओं को चक्रीय रूप से चालू और बंद करने की संभावना पर निर्भर करती हैं जो हल होने के बहुत करीब हैं। इन दृष्टिकोणों में, एक विवर्तन-सीमित क्षेत्र के भीतर अणुओं को अलग-अलग समय बिंदुओं पर सक्रिय किया जा सकता है ताकि उन्हें व्यक्तिगत रूप से चित्रित किया जा सके और बाद में उनके केंद्रों को कम्प्यूटेशनल रूप से ढूंढकर नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सके (चित्र 3डी)। इन दृष्टिकोणों में, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (STORM) को पहली बार में पेश किया गया थागुर्दा[37] के भीतर अणुओं के उन्मुखीकरण सहित, नैनोमीटर परिशुद्धता पर जीबीएम के जटिल आणविक संगठन का खुलासा करने वाले एक अध्ययन के साथ 2013 में अनुसंधान। एक दुर्लभ जन्मजात नेफ्रोटिक सिंड्रोम के माउस मॉडल में, STORM ने अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद GBM के भीतर लेमिनिन 521 के एकीकरण और सही अभिविन्यास का खुलासा किया, जिससे रोगियों के लिए उन्नत चिकित्सीय विकल्पों का रास्ता खुल गया [38]। एक अन्य अध्ययन में पोडोसाइट्स में एक्टिन साइटोस्केलेटन के संगठन का आणविक पैमाने पर संकल्प [39] (चित्र 3ई-1) पर वर्णन किया गया है। एक नई खोज के रूप में, पोडोसाइट्स में पैर की प्रक्रियाओं में गैर-संकुचित एक्टिन बंडलों से जुड़े सिकुड़ा हुआ एक्टिन बंडल होते हैं। पॉडोसाइट चोट मॉडल में, पैर की प्रक्रियाओं में एक्टिन संरचना विघटित हो जाती है, जिससे मुख्य शरीर में सिकुड़ा हुआ ढांचा ढह जाता है [39]।

परमाणु स्तर पर मौलिक बायोमोलेक्यूल्स की 3डी संरचनाओं को देखना: क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

कुछ समय पहले तक, मौलिक जैव-अणुओं की संरचना का अध्ययन करने की संभावना कुछ नैनोमीटर के संकल्प के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तक सीमित थी। तकनीकी बाधाएं, जैसे तीव्र इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा नमूना क्षति, कम छवि विपरीत, और इलेक्ट्रॉनों के साथ बातचीत के बाद अणु आंदोलनों या ईएम कक्ष के अंदर लागू वैक्यूम में जैविक नमूनों में पानी को संरक्षित करने में कठिनाइयों, जिससे इस आकार के नीचे अणुओं को हल करना असंभव हो जाता है। . नमूने को ठंडा करने से पानी का वाष्पीकरण और इलेक्ट्रॉन-प्रेरित क्षति [40] कम हो सकती है। इस विचार से, क्रायो-ईएम को 1950 के दशक में पेश किया गया था। कुछ साल पहले, एक नए सिंगल-इलेक्ट्रॉन काउंटिंग डिटेक्टर की शुरुआत ने आखिरकार रिज़ॉल्यूशन को पिछली सीमा से आगे बढ़ा दिया। 2017 में, रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार जैक्स डुबोचेट, जोआचिम फ्रैंक और रिचर्ड हेंडरसन को 'समाधान में जैव-अणुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विकास' के लिए दिया गया था। ये प्रगति अब समाधान में जैव-अणुओं के संरचनात्मक निर्धारण की अनुमति देती है [41]।

FIGURE 2: (A) The Jablonski diagram (left) shows the process of stimulated emission in STED microscopy. In normal fluorescence, a fluorophore can absorb a photon from the excitation light (blue arrow) and jump from the ground state to the excited state.

FIGURE 3: (A) A schematic drawing shows the basic principle of SIM. SIM uses a wide-field microscope setup with a fine-striped illumination pattern. The interaction between illumination patterns and structures in the sample produces moire´ fringes, allowing the capture of high-frequency information (corresponding to fine details in the sample) at lower spatial frequencies

मेंगुर्दाअनुसंधान, मौलिक प्रोटीन की संरचना परमाणु स्तर [42, 43] पर निर्धारित की गई थी। उनमें से, मानव पॉलीसिस्टिन की संरचना -2, जिनके उत्परिवर्तन ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक के लिए जिम्मेदार हैंगुर्दारोग [44], और क्षणिक रिसेप्टर संभावित विहित 6 आयन चैनलों की संरचना, जिनके उत्परिवर्तन मनुष्यों में एफएसजीएस का कारण बनते हैं [43], कुछ एंगस्ट्रॉम [44] के संकल्प के साथ निर्धारित किए गए थे।

Table 1. Imaging techniques and their contribution to the comprehension of renal physiology and pathology so far

गुर्दे की बीमारियों के आणविक आधार को समझना: एकीकृत किडनी माइक्रोस्कोपी

पिछले कुछ वर्षों में विशेष रूप से और साथ ही ऊतकों में अणुओं के कुल स्पेक्ट्रम को मैप करने में सक्षम लेबल-मुक्त दृष्टिकोणों में रुचि बढ़ी है [45]। उनमें से, मैट्रिक्स-एज़-सिस्टेड लेज़र डिसोर्शन/आयनाइज़ेशन इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-IMS) उच्च रिज़ॉल्यूशन पर सीधे ऊतक वर्गों पर एक ही समय में सैकड़ों विभिन्न अणुओं की माप की अनुमति देता है। मालदी-आईएमएस प्रयोग में, एक पतला ऊतक खंड, जमे हुए या पैराफिन-एम्बेडेड, एक मैट्रिक्स के साथ लेपित होता है जो लेजर ऊर्जा को अवशोषित करता है और ऊतक विश्लेषणों के आयनीकरण को बढ़ावा देता है। मास स्पेक्ट्रोमीटर में विश्लेषण प्रत्येक x/y निर्देशांक के लिए एक स्पेक्ट्रम उत्पन्न करता है। MALDI माप के बाद, एक ही ऊतक खंड को हिस्टोलॉजिकल विवरण के साथ आणविक पैटर्न को एकीकृत करने के लिए पारंपरिक हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रक्रियाओं के साथ दाग दिया जा सकता है। गुर्दे के अनुसंधान में, MALDI-IMS का उपयोग सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों में दवाओं, मेटाबोलाइट्स, लिपिड, पेप्टाइड्स और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है [45]।

MALDI-IMS के सबसे लगातार अनुप्रयोगों में से एक है वृक्क कोशिका कार्सिनोमा [46] को वर्गीकृत करने के लिए आणविक मार्करों की पहचान और आणविक के साथ-साथ ऊतकीय स्तर [47] पर कैंसर और सामान्य ऊतक के बीच सही अंतर स्थापित करना। MALDI-IMS का उपयोग गुर्दे की दवा विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है ताकि विषाक्त पदार्थों का शीघ्र पता लगाया जा सकेगुर्दाफार्मास्युटिकल उम्मीदवारों द्वारा मध्यस्थता क्षति के तंत्र [48]। इसके अलावा, MALDI-IMS का उपयोग लिपिड और गुर्दे की विकृति में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जैसे कि मधुमेह अपवृक्कता [49], तीव्र गुर्दे की चोट [50], और पॉलीसिस्टिकगुर्दारोग [51], और रोग संबंधी तंत्रों की गहरी समझ के लिए अंतर्जात चयापचय प्रोफाइल को प्रकट करना [52]। संभावित बायोमार्कर के लिए आणविक प्रोफाइल की पहचान को भी अंतिम रूप दिया गया था जो नए संभावित नैदानिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर [53, 54] हो सकते हैं।

निष्कर्ष और भविष्य के परिप्रेक्ष्य

इमेजिंग तकनीकों में लगातार सुधार ने कई महत्वपूर्ण तकनीकी बाधाओं को उत्तरोत्तर हल किया हैगुर्दाअनुसंधान और सामान्य और रोगग्रस्त गुर्दे में संरचना और कार्य के एक गतिशील चित्रण की अनुमति दी है। दरअसल, नई माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के आगमन ने मौलिक वैज्ञानिक खोजों को सक्षम किया है और बाद में किडनी फिजियोलॉजी और पैथोफिजियोलॉजी के हमारे दृष्टिकोण को बदल दिया है जिसे अब 3 डी में देखा जा सकता है और यहां तक कि वीडियो में भी फिल्माया जा सकता है, जहां समय चौथे आयाम का प्रतिनिधित्व करता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के हालिया तकनीकी नवाचार और आणविक इमेजिंग तकनीकों की प्रगति के साथ, शोधकर्ता अब व्यक्तिगत जैव-अणुओं को सीधे ऊतकों में देख सकते हैं और यह निर्धारित कर सकते हैं कि वे सेलुलर और उप-कोशिकीय स्तरों पर कैसे बातचीत करते हैं।

इन उपकरणों को पैथोलॉजिकल में लागू करने की संभावनागुर्दानैदानिक बायोप्सी में आणविक और उपकोशिकीय विवरणों पर ध्यान केंद्रित करने वाले नमूनों को रोग के पुन: वर्गीकरण में मदद करनी चाहिए। यह कब और कब गुर्दे की बीमारी के निदान पर या यहां तक कि रोगी प्रबंधन पर प्रभाव डालेगा, फिलहाल यह स्पष्ट नहीं है।

वित्तपोषण

यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता 648274) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।

to prevent kidney disease

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