मानव आंत और त्वचीय लीशमैनियासिस के खिलाफ क्रॉस-इम्यूनिटी का लाभ उठाने वाले एक उपन्यास पॉलीवैलेंट मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन की सिलिको डिजाइनिंग में: एक इम्यूनोइंफॉर्मेटिक्स-आधारित दृष्टिकोण

अमूर्त

संदर्भ लीशमैनियासिस वेक्टर-जनित संक्रामक रोगों का एक समूह है जो 20 से अधिक रोगजनक लीशमैनिया प्रजातियों के कारण होता है जो कई उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय देशों में स्थानिक हैं। दवा-प्रतिरोधी उपभेदों का उद्भव, एंटी-लीशमैनिया दवाओं के प्रतिकूल दुष्प्रभाव और निवारक टीकाकरण रणनीति की अनुपस्थिति संवेदनशील आबादी को खतरे में डालती है। हाल ही में, शोधकर्ताओं के कई समूहों ने टीके विकसित करने के लिए रिवर्स वैक्सीनोलॉजी के क्षेत्र का उपयोग किया है, मुख्य रूप से आंत या त्वचीय लीशमैनियासिस के खिलाफ प्रतिरक्षा उत्पन्न करने पर ध्यान केंद्रित किया है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा - सूजन रोधी

तरीकोंइस वर्तमान कार्य में यूनीप्रोट डेटाबेस से बारह प्रयोगात्मक रूप से मान्य लीशमैनियल एंटीजेनिक प्रोटीन अनुक्रमों को पुनः प्राप्त करना शामिल है, इसके बाद ANTIGENpro और Vaxijen 2.0 सर्वरों का उपयोग करके उनकी एंटीजेनेसिटी प्रोफाइलिंग की जाती है। इसके लिए MHC बाइंडिंग एपिटोप्स की भविष्यवाणी NetCTL 1.2 और SYFPEITHI सर्वर दोनों का उपयोग करके की गई थी, जबकि B कोशिकाओं के लिए एपिटोप्स की गणना ABCpred और BepiPred 2.0 सर्वरों का उपयोग करके की गई थी। काफी अधिक स्कोर वाले स्क्रीन किए गए एपिटोप्स का उपयोग उचित लिंकर्स और प्राकृतिक सहायक के साथ वैक्सीन निर्माण को डिजाइन करने के लिए किया गया था। सिंथेटिक पेप्टाइड की माध्यमिक और तृतीयक संरचनाएं क्रमशः सशर्त यादृच्छिक क्षेत्रों, उथले तंत्रिका नेटवर्क और पुनरावृत्त संरचना असेंबली सिमुलेशन के साथ प्रोफ़ाइल-प्रोफ़ाइल थ्रेडिंग संरेखण द्वारा निर्धारित की गईं। {{7}डी वैक्सीन मॉडल को सीएएसपी-परीक्षणित शोधन और मोलप्रोबिटी वेब सर्वर के माध्यम से मान्य किया गया था। सर्वोत्तम वैक्सीन-टीएलआर कॉम्प्लेक्स का विश्लेषण करने के लिए आणविक डॉकिंग और मल्टी-स्केल सामान्य मोड विश्लेषण सिमुलेशन किया गया था। अंत में, कम्प्यूटेशनल प्रतिरक्षा सिमुलेशन निष्कर्षों ने आशाजनक सेलुलर और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का खुलासा किया, जिससे पता चला कि इंजीनियर काइमेरिक पेप्टाइड आंत और त्वचीय लीशमैनियासिस के खिलाफ एक संभावित व्यापक स्पेक्ट्रम टीका है।

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कीवर्ड लीशमैनियासिस · रिवर्स वैक्सीनोलॉजी · टीएलआर · मल्टी-एपिटोप वैक्सीन · आणविक गतिशील सिमुलेशन · होमोलॉजी मॉडलिंग

परिचय

लीशमैनियासिस परजीवी रोगों का एक समूह है जो लीशमैनिया जीनस के विभिन्न सदस्यों के कारण होता है, जो एक डिमॉर्फिक इंट्रासेल्युलर परजीवी प्रोटोजोआ है [1]। लीशमैनियासिस दुनिया भर के उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय देशों की निम्न सामाजिक-आर्थिक स्थिति से अधिकांश आबादी को प्रभावित करता है [2]। यह एक वेक्टर जनित बीमारी है, और परजीवी संक्रमित मादा फ़्लेबोटोमाइन रेत मक्खियों (डब्ल्यूएचओ, 2019) के काटने से फैलता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन की नवीनतम रिपोर्ट के अनुसार, सालाना 700, 000 से 1 मिलियन नए मामले और कुछ 26, 000 से 65, 000 मौतें होती हैं (डब्ल्यूएचओ, 2019)। पूर्वी अफ़्रीका में, आंत संबंधी लीशमैनियासिस का प्रकोप अक्सर होता रहता है। पूर्वी भूमध्यसागरीय क्षेत्र में दुनिया भर में त्वचीय लीशमैनियासिस के 70% मामले होते हैं (डब्ल्यूएचओ, 2019)। 2017 में, WHO को रिपोर्ट किए गए 22,145 (94%) नए मामलों में से 20,792 मामले सात देशों में हुए: ब्राज़ील, इथियोपिया, भारत, केन्या, सोमालिया, दक्षिण सूडान और सूडान (WHO, 2017)। चिंताजनक परिदृश्य के कारण, हमारे देश में भी इस बीमारी को नियंत्रित करने और खत्म करने के उपायों पर जोर दिया जाना चाहिए। लीशमैनियासिस में विभिन्न प्रकार की नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियाँ होती हैं, और रोग के तीन प्राथमिक रूप होते हैं- आंत (जिसे काला-अज़ार भी कहा जाता है और यह रोग का सबसे गंभीर रूप है), त्वचीय (सबसे आम), और श्लेष्मा (डब्ल्यूएचओ, 2019) . त्वचीय लीशमैनियासिस (सीएल) के कुछ मामलों में स्व-उपचार के साक्ष्य और परिणामस्वरूप पुन: संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा, अवधि के दौरान लीशमैनियासिस को नियंत्रित करने के लिए एक व्यवहार्य विधि के रूप में टीकाकरण के संभावित दायरे का अनुमान लगाती है [3]। हालाँकि, आज तक, मानव लीशमैनियासिस के खिलाफ कोई लाइसेंस प्राप्त टीका उपलब्ध नहीं है। हालाँकि कुछ संभावित उम्मीदवार टीके नैदानिक ​​​​परीक्षण के लिए आगे बढ़े हैं, लेकिन कई अभी भी प्रारंभिक अनुसंधान और विकास चरण में हैं [4]। पेप्टाइड टीकों का उत्पादन इस क्षेत्र में अनुसंधान का एक प्रमुख और आशाजनक क्षेत्र है। संपूर्ण जीवित या क्षीण परजीवियों या उनके सबयूनिट-आधारित टीकों के विपरीत, सिंथेटिक पेप्टाइड्स के कई फायदे हैं जिनमें संभावित हानिकारक सामग्रियों की अनुपस्थिति, कम एंटीजन जटिलता, अच्छी स्थिरता और बड़े पैमाने पर कम लागत शामिल है [1, 5]। नए टीके विकसित करने के लिए प्रतिरक्षा विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान और रासायनिक इंजीनियरिंग में गहरी अंतर्दृष्टि की आवश्यकता होती है। इसलिए, इन सभी क्षेत्रों के वैज्ञानिक सुरक्षित, प्रभावी टीकों को डिजाइन और उत्पादित करने के लिए हाथ से काम करते हैं [6]। लीशमैनियासिस के खिलाफ एक आदर्श टीके को लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा और संतुलित टीएच -1 और टीएच {36}मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करनी चाहिए [4, 7]। इस तरह के एक नए उम्मीदवार वैक्सीन को डिजाइन करने के लिए इम्यूनोइंफॉर्मेटिक्स-आधारित दृष्टिकोण एक नई रणनीति है जो मुख्य रूप से कम समय के भीतर संरचनात्मक रूप से स्थिर और इम्युनोजेनिक मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन की भविष्यवाणी करने के लिए कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करती है। प्रायोगिक पशु मॉडल या अन्य सिलिको विश्लेषणों से जुड़े पिछले प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में जिन प्रोटीनों में मुख्य रूप से रोग के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रदान करने के लिए आवश्यक प्रतिरक्षात्मक विशेषताएं पाई गईं, वे सर्वोत्तम संभव एपिटोप उम्मीदवार थे [1, 8-10]। जांच के तहत प्रोटीनों में, LACK (लीशमैनिया-सक्रिय सी-किनेज एंटीजन) प्रोटीन लीशमैनिया प्रजातियों में एक अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन है, और इसे मानव लीशमैनियासिस के खिलाफ एक व्यवहार्य टीका उम्मीदवार माना जाता है [11]। यह संवेदनशील BAL b/c चूहों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक प्रमुख लक्ष्य साबित हुआ है [12]। KMP-11 (कीनेटोप्लास्टिड मेम्ब्रेन प्रोटीन-11) सभी कीनेटोप्लास्टिड प्रोटोजोआ में मौजूद होता है और इसे एक संभावित वैक्सीन उम्मीदवार भी माना जाता है, जो म्यूरिन मॉडल में IL{50}} के स्तर को बढ़ाता है, जो इसकी इम्युनोजेनिक क्षमता को दर्शाता है। [13]. लीशमैनोलिसिन, या जीपी63, एक सतह प्रोटीनेज है जिसे मेजबान मैक्रोफेज रिसेप्टर [14] के साथ परजीवी की सीधी बातचीत में शामिल एक विषाणु कारक के रूप में माना गया है। झिल्ली प्रोटीन LCR1 और GP46 भी IFN-गामा उत्पादन को बढ़ाने के लिए पाए जाते हैं, और इसलिए, लीशमैनिया संक्रमण के खिलाफ एक सामान्य टीका विकसित करने में सहायक माने जाते हैं [5, 15]। हीट शॉक प्रोटीन (एचएसपी) अत्यधिक संरक्षित अणु हैं जो अनुकूली प्रतिरक्षा के एमएचसी-आई और एमएचसीआईआई दोनों मार्गों को प्रेरित करने के लिए अत्यधिक प्रतिरक्षात्मक हैं और संक्रामक लीशमैनियासिस के खिलाफ टीका विकास में एक प्रासंगिक भूमिका मानी जाती है [16]। लीशमैनिया हाइड्रोफिलिक एसाइलेटेड सतह प्रोटीन-बी (एचएएसपी-बी) केवल संक्रामक परजीवियों में व्यक्त किया जाता है जो परजीवी विषाणु में भूमिका का सुझाव देता है और इसलिए, एक संभावित टीका उम्मीदवार [17] है। काइनेटोप्लास्टिड पैराफैगेलर रॉड (पीएफआर) प्रोटीन भी अपने प्रतिबंधित विकासवादी वितरण, उच्च-क्रम संगठन और उच्च इम्युनोजेनेसिटी [18] के कारण चिकित्सीय और रोगनिरोधी महत्व के हैं। इसी तरह, सिस्टीन प्रोटीज और प्रोटीओफॉस्फोग्लाइकन्स भी स्तनधारी मेजबानों में परजीवियों के लिए आवश्यक विषाणु कारक के रूप में कार्य करते हैं और लीशमैनियासिस के लिए आकर्षक दवा लक्ष्य हैं [19-21]। इसके अलावा, बीटा-ट्यूबुलिन प्रोटीन को पहले लीशमैनिया से टी सेल-उत्तेजक एंटीजन के रूप में भी जाना जाता था, हालांकि वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में इसकी प्रभावकारिता की अभी तक कोशिश नहीं की गई है [22]। एल डोनोवानी के बीटा-ट्यूबुलिन को आंत के लीशमैनियासिस के खिलाफ एक संभावित दवा लक्ष्य भी माना जाता है [23]। अंत में, एल. ब्राज़ीलेंसिस से अनुवाद कारक प्रोटीन ईआईएफ5ए को एक अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ संयोजन में टीके के रूप में प्रशासित किए जाने पर जानवरों में लीशमैनियासिस के खिलाफ विषम सुरक्षा उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। यह टीका लगाए गए पशुओं में परजीवी-विशिष्ट साइटोकिन्स के स्राव को बढ़ाता है। eIF5A प्रोटीन सभी यूकेरियोट्स में भी संरक्षित है [24]। इससे पहले खातून आदि ने मो. एल डोनोवानी [6] के स्रावी प्रोटीन की खोज करके आंत के लीशमैनियासिस (वीएल) के खिलाफ एक मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन डिजाइन करने के लिए एक इम्यूनोइन्फॉर्मेटिक्स-आधारित दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। यहां, हमने परजीवी की विभिन्न संक्रामक प्रजातियों में विभिन्न लीशमैनियल एंटीजन का चयन किया। साथ ही, इन सभी प्रोटीनों की पहले से ही पहचान की जा चुकी है (या तो इन विट्रो पशु अध्ययन द्वारा या कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करके) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को उत्तेजित करने के लिए। चयनित प्रोटीन अनुक्रम लीशमैनिया की पांच रोगजनक प्रजातियों में से किसी एक से संबंधित थे, अर्थात्, लीशमैनिया मेजर, लीशमैनिया मेक्सिकाना, लीशमैनिया डोनोवानी, लीशमैनिया चागासी, और लीशमैनिया अमेज़ॅन, जिनमें से एल डोनोवानी आंत संबंधी लीशमैनियासिस (वीएल) पैदा करने वाला प्राथमिक परजीवी है, जबकि अन्य मुख्य रूप से त्वचीय (सीएल) या म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस (एमसीएल) पैदा करने के लिए जिम्मेदार हैं। लीशमैनिया की विभिन्न प्रजातियों में ऐसे विविध प्रकार के संरक्षित और इम्युनोजेनिक प्रोटीन की पसंद के पीछे तर्क एक सामान्य पेप्टाइड वैक्सीन डिजाइन करना था जो लीशमैनियासिस (वीएल और सीएल) के दोनों रूपों के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम क्रॉस-इम्युनिटी प्रदान करेगा जो आमतौर पर मनुष्यों को प्रभावित करते हैं। .

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सामग्री और तरीके

लीशमैनिया एंटीजेनिक प्रोटीन अनुक्रमों का चयन और पुनर्प्राप्ति

बारह लीशमैनिया-विशिष्ट एंटीजेनिक प्रोटीन के पूर्ण अमीनो एसिड अनुक्रमों को यूनीप्रोट (यूनिवर्सल प्रोटीन रिसोर्स) डेटाबेस (https://www.unipr ot.org/uniprot/) से FASTA प्रारूप में पुनर्प्राप्त किया गया (21 पर एक्सेस किया गया)। }3.2022). जैसा कि पहले कहा गया है, इन सभी प्रोटीनों को इम्युनोजेनिक, अत्यधिक संरक्षित और संभावित वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में रिपोर्ट किया गया था, जैसा कि पशु मॉडल या सिलिको भविष्यवाणी विधियों में कम्प्यूटेशनल से जुड़े पिछले प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में पाया गया था। चयनित प्रोटीन की एंटीजेनेसिटी की गणना ANTIGENpro सर्वर (http://scrat.proteomics.ics.uci.edu/) का उपयोग करके की गई थी, जो दस गुना द्वारा मान्य एसवीएम-आधारित दो-चरण क्लासिफायर का उपयोग करके इनपुट प्रोटीन अनुक्रम की एंटीजेनेसिटी की गणना करता है। क्रॉस-सत्यापन दृष्टिकोण [25]। शास्त्रीय स्रावी और गैर-स्रावी (ट्रांसमेम्ब्रेन) प्रोटीन के बीच भेदभाव करने के लिए प्रोटीन को सिग्नलपी 4.1 सर्वर (सिग्नलपी-4.1- सर्विसेज-डीटीयू हेल्थ टेक) का उपयोग करके सिग्नल पेप्टाइड विश्लेषण के अधीन किया गया था। इस पद्धति में कई कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क के संयोजन के आधार पर दरार स्थलों की भविष्यवाणी और एक सिग्नल पेप्टाइड/गैर-सिग्नल पेप्टाइड भविष्यवाणी शामिल है [26]। सभी प्रोटीनों के लिए स्थानीयकरण की भविष्यवाणियां डीपलॉक (डीपलॉक-1.0-सर्विसेज-डीटीयू हेल्थ टेक) का उपयोग करके की गईं, जो एक टेम्पलेट-मुक्त एल्गोरिदम है जो प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण की भविष्यवाणी करने के लिए गहरे तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करता है, केवल अनुक्रम जानकारी का शोषण करता है, अच्छी सटीकता प्राप्त करता है [27]। सिग्नलपी 4.1 सर्वर से प्राप्त सभी कार्यात्मक प्रोटीन अनुक्रमों को अगले एंटीजेनिक निर्धारकों (एपिटोप्स) की उपस्थिति की भविष्यवाणी के अधीन किया गया था जिन्हें बी और टी सेल रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जाएगा। यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि डिज़ाइन किए गए वैक्सीन निर्माण में केवल इम्यूनो-प्रमुख टी सेल और बी सेल एपिटोप्स शामिल हैं और, इसलिए, प्रतिरक्षा तंत्र के ह्यूमरल और सेल-मध्यस्थ मार्ग दोनों को शामिल करते हुए एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया चलाने में सक्षम होंगे।

साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) एपिटोप भविष्यवाणी

साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) एपिटोप की भविष्यवाणी एक आदर्श पेप्टाइड को डिजाइन करने का एक अनिवार्य पहलू है [28]। सभी चयनित प्रोटीनों के लिए सीटीएल एपिटोप्स की भविष्यवाणी करने के लिए एक स्वतंत्र रूप से सुलभ वेब सर्वर, अर्थात्, NetCTL1.2 (https://www. cbs.dtu.dk/services/NetCTL) का उपयोग किया गया था। विधि पेप्टाइड एमएचसी वर्ग I बाइंडिंग, प्रोटीसोमल सी टर्मिनल क्लीवेज और टीएपी परिवहन दक्षता [29] की भविष्यवाणी को एकीकृत करती है, ये सभी आवश्यक विशेषताएं हैं जो सीटीएल-बाइंडिंग एपिटोप के अनुक्रम में होनी चाहिए। सर्वर 12 एमएचसी वर्ग I सुपरटाइप्स तक सीमित सीटीएल एपिटोप्स की भविष्यवाणियों की अनुमति देता है, जिनमें से वर्तमान अध्ययन के लिए केवल ए1 सुपरटाइप का उपयोग किया गया था। एमएचसी क्लास I बाइंडिंग और प्रोटीसोमल क्लीवेज कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करके किया जाता है। टीएपी परिवहन दक्षता का अनुमान वजन मैट्रिक्स [29] का उपयोग करके लगाया जाता है। उच्च बाइंडिंग स्कोर वाले अनुक्रमों को शक्तिशाली सीटीएल एपिटोप्स माना जाता है। NetCTL 1.2 के अलावा, एक और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध वेब सर्वर-आधारित दृष्टिकोण, अर्थात्, SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), का भी CTL एपिटोप्स की भविष्यवाणी के लिए लाभ उठाया गया था। सभी चयनित लीशमैनिया प्रोटीन। पूर्वानुमान प्रकाशित रूपांकनों पर आधारित है और एंकर और सहायक एंकर पदों और अन्य लगातार अमीनो एसिड में अमीनो एसिड पर विचार करता है [30]। इस सर्वर में प्रदान किए गए एमएचसी प्रकारों की सूची से, एचएलए-ए*01, एचएलए-ए*02:01, और एचएलए-ए*03 को भविष्यवाणी के लिए चुना गया था। नेटसीटीएल 1.2 सर्वर द्वारा दिए गए परिणामों के साथ समान तुलना के लिए नॉनमर अनुक्रमों के लिए एपिटोप खोज निर्दिष्ट की गई थी। प्रत्येक प्रोटीन (यदि कोई हो) से केवल सामान्य एपिटोप्स, जिनकी भविष्यवाणी NetCTL 1.2 और SYFPEITHI दोनों सर्वरों द्वारा संगत उच्च स्कोर के साथ की गई थी, को अंतिम वैक्सीन निर्माण के लिए चुना गया था।

हेल्पर टी लिम्फोसाइट (एचटीएल) एपिटोप भविष्यवाणी

हेल्पर टी लिम्फोसाइट्स सबसे महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं क्योंकि सभी प्रकार की अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में उनकी आवश्यकता होती है। इसलिए, एचटीएल एपिटोप्स (मुख्य रूप से Th-1 प्रकार की) की भविष्यवाणी, एक प्रभावी पेप्टाइड वैक्सीन को डिजाइन करने के लिए एक आवश्यक तत्व बन जाती है। वर्तमान अध्ययन में, IEDB (इम्यूनो एपिटोप डेटान बेस एंड एनालिसिस) सर्वर (http://tools.iedb.org/mhcii/) में MHC-II बाइंडिंग विश्लेषण उपकरण को 15-mer HTL की भविष्यवाणी के लिए नियोजित किया गया था। तीन मानव एलील्स के सेट के लिए एपिटोप्स, अर्थात्, HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02, और HLA-DRB1*01:03। मानव एचएलए एलील्स को एपिटोप्स के एमएचसी-II बाइंडिंग संबंध के अधिक यथार्थवादी अनुमान के लिए चुना गया था क्योंकि टीका मानव लीशमैनियासिस के खिलाफ डिजाइन किया जा रहा था। अनुमानित आउटपुट कॉम्बिनेटरियल लाइब्रेरी और एसएमएम संरेखण के लिए IC50nM की इकाइयों में दिया गया है। इसलिए, कम संख्या उच्च संबंध को इंगित करती है। इस दृष्टिकोण में IEDB अनुशंसित भविष्यवाणी पद्धति का उपयोग किया गया था जिसमें कम समायोजित रैंक उपयुक्त MHC-II बाइंडर्स का संकेत है और इसलिए, इसे शक्तिशाली HTL एपिटोप्स के रूप में परिभाषित किया जा सकता है।

साइटोकिन-उत्प्रेरण एचटी एपिटोप्स की पहचान और चयन

प्रतिरक्षा प्रणाली के समुचित कार्य के लिए साइटोकिन्स का अत्यधिक महत्व है। साइटोकिन्स जैसे आईएल -2, आईएल -4, आईएल -6, और इंटरफेरॉन- की बैटरी सीटीएल-मध्यस्थता और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों को प्रेरित कर सकती है [31]। इसलिए, एचटीएल एपिटोप्स जो साइटोकिन उत्पादन को गति प्रदान कर सकते हैं, एक प्रतिरक्षा-रोगनिरोधी वैक्सीन को डिजाइन करने के लिए बेहतर हैं। इस दृष्टिकोण से, IFNepitope सर्वर (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) का उपयोग साइटोकिन-उत्प्रेरण क्षमताओं वाले HTL एपिटोप्स की पहचान के लिए किया गया था। IFNepitope एक ऑनलाइन पूर्वानुमान सर्वर है जिसका उद्देश्य प्रोटीन अनुक्रमों से पेप्टाइड्स की भविष्यवाणी करना है जो CD{9}} T कोशिकाओं से जारी IFN-गामा को प्रेरित कर सकते हैं। वेब सर्वर को एक डेटासेट के आधार पर विकसित किया गया है जिसमें आईएफएन-गामा-उत्प्रेरण और गैर-उत्प्रेरण एमएचसी वर्ग II बाइंडर्स [32] शामिल हैं। IEDB सर्वर द्वारा उच्च MHC-II-बाइंडिंग एफ़िनिटी (कम समायोजित रैंक) के साथ अनुमानित HTL एपिटोप्स को IFNepitope सर्वर द्वारा उनकी साइटोकिन-उत्पादक क्षमता की जांच करने के लिए इनपुट के रूप में प्रदान किया गया था। इस प्रकार पहचाने गए एपिटोप्स को IL4pred सर्वर (IFNepitope(iiitd.edu.in) और IL10Pred सर्वर (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3) द्वारा अगले स्तर के विश्लेषण के अधीन किया गया। .php) ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चयनित एचटीएल एपिटोप्स क्रमशः आईएल -4 और आईएल -10 का स्राव उत्पन्न करेंगे। वे अमीनो एसिड अवशेषों और अमीनो एसिड संरचना के स्थितिगत संरक्षण पर भी विचार करते हैं। अधिक सटीक भविष्यवाणी के लिए पेप्टाइड्स [33, 34]। सभी तीन सर्वरों द्वारा सकारात्मक होने की भविष्यवाणी की गई एमएचसी-द्वितीय-बाइंडिंग एचटीएल एपिटोप्स को अंतिम वैक्सीन निर्माण में शामिल करने के लिए चुना गया था। इस रणनीति को वैक्सीन की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए अपनाया गया था क्योंकि यह उकसा सकता है एक तीव्र प्रतिक्रिया जिसमें विभिन्न प्रकार के साइटोकिन्स (आईएफएन-गामा, आईएल -4, और आईएल -10) शामिल हैं, जिससे त्वरित और लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा होती है।

एपिटोप संरक्षण विश्लेषण

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (डिफ़ॉल्ट)।

मल्टी-एपिटोप वैक्सीन अनुक्रम की डिजाइनिंग

इम्यूनोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण के आधार पर, चयनित सीटीएल और एचटीएल एपिटोप अनुक्रमों को शामिल करके सबयूनिट वैक्सीन का एक प्राथमिक अनुक्रम बनाया गया था। ये एपिटोप्स क्रमशः एएवाई और जीपीजीपीजी लिंकर्स द्वारा एक साथ जुड़े हुए थे [28, 31]। वैक्सीन निर्माण के कुशल कामकाज के लिए आवश्यक व्यक्तिगत एपिटोप्स के उचित पृथक्करण के लिए लिंकर्स डाले गए हैं [28, 36]। दूसरे, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए एक सबयूनिट वैक्सीन में एक उपयुक्त सहायक को शामिल करना महत्वपूर्ण है [31]। मानव परीक्षणों के लिए टीके डिजाइन करने में उपयुक्त सहायक का चुनाव महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आईएल-12 लीशमैनियासिस के खिलाफ कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा विकसित करने के लिए आवश्यक है, और लीशमैनियासिस के खिलाफ टीकों में सहायक के रूप में आईएल{7}} की क्षमता म्यूरिन मॉडल में बताई गई है [3, 37, 38]. इस आईएल -12 को वैक्सीन डिजाइन करने के लिए एक सहायक के रूप में चुना गया था, और उसी के अनुक्रम को ईएएके लिंकर [28, 31] का उपयोग करके वैक्सीन निर्माण के एन टर्मिनल में शामिल किया गया था। मानव आईएल -12 अल्फा श्रृंखला का अनुक्रम यूनिप्रोट डेटाबेस (www.uniprot.org; परिग्रहण संख्या P29459) से पुनर्प्राप्त किया गया था। अंत में, पेप्टाइड वैक्सीन का निर्माण एन टर्मिनल से सी टर्मिनल तक जाने वाले अनुक्रम में सहायक, लिंकर, सीटीएल एपिटोप्स और एचटीएल एपिटोप्स (इंट्रा-एपिटोपिक एएवाई और जीपीजीपीजी लिंकर्स के साथ) प्राप्त किया गया था।

गठनात्मक और रैखिक बी सेल एपिटोप भविष्यवाणी

ह्यूमोरल इम्युनिटी में सक्रिय बी कोशिकाओं द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी का संश्लेषण और स्राव शामिल होता है, जिसके लिए एंटीजेनिक निर्धारकों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है जो बी लिम्फोसाइटों की सतह पर मौजूद बी सेल रिसेप्टर्स द्वारा पहचाने जाते हैं। एक आदर्श प्रतिरक्षा-सुरक्षात्मक पेप्टाइड वैक्सीन में ऐसे घटक होने चाहिए ताकि वे बी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकें और उन्हें उत्तेजित कर सकें। इसलिए, डिज़ाइन किए गए टीके के प्राथमिक अनुक्रम में बी सेल एपिटोप्स की सटीक भविष्यवाणी के लिए दो सर्वर, अर्थात् एबीसीप्रेड और बेपीप्रेड 2. 0 लागू किए गए थे। एबीसीप्रेड सर्वर (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) एक कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (एएनएन) आधारित दृष्टिकोण है जो किसी दिए गए एंटीजन अनुक्रम में बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी करता है निश्चित लंबाई पैरामीटर। इस पद्धति में उपयोग किए जाने वाले प्रशिक्षण डेटासेट में बी सेल एपिटोप डेटाबेस (बीसीआईपीईपी) से बी सेल एपिटोप शामिल हैं। सर्वर आवर्ती तंत्रिका नेटवर्क [39] का उपयोग करके 65.93% सटीकता के साथ एपिटोप्स की भविष्यवाणी करने में सक्षम है। अंतिम वैक्सीन निर्माण का प्राथमिक अनुक्रम एक सादे प्रारूप में इनपुट के रूप में प्रदान किया गया था, और एबीसीप्रेड सर्वर डिफ़ॉल्ट पैरामीटर, जिसमें 16 अमीनो एसिड अवशेषों की विंडो लंबाई के साथ 0.51 का थ्रेशोल्ड मान शामिल था, का उपयोग किया गया था भविष्यवाणी. दूसरी ओर, BepiPred 2.0 सर्वर (BepiPred—2.0—सेवाएँ—DTU हेल्थ टेक), एपिटोप्स पर प्रशिक्षित एक यादृच्छिक वन एल्गोरिदम द्वारा इनपुट अनुक्रम से अनुक्रमिक बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी करता है और गैर-एपिटोप अमीनो एसिड क्रिस्टल संरचनाओं से निर्धारित होते हैं जिसके बाद अनुक्रमिक भविष्यवाणी चौरसाई होती है [40]। वैक्सीन का प्राथमिक अनुक्रम इनपुट के रूप में FASTA प्रारूप में प्रदान किया गया था। दो अलग-अलग एल्गोरिदम के आधार पर बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी करने वाले दो अलग-अलग सर्वरों का अनुप्रयोग भविष्यवाणी को अधिक यथार्थवादी बनाता है। बी सेल रिसेप्टर और एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने वाले अधिकांश एंटीजेनिक निर्धारक असंतुलित होते हैं, जिसका अर्थ है कि उनमें इम्युनोजेन की प्राथमिक संरचना में दूर स्थित अमीनो एसिड अवशेष होते हैं, लेकिन प्रोटीन की तह के दौरान एक दूसरे के निकट आ जाते हैं [41]। वैक्सीन की मान्य तृतीयक संरचना में ऐसे असंतुलित बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी आईईडीबी पोर्टल के भीतर शामिल एलीप्रो सर्वर (http://tools.iedb.org/ellip ro/) का उपयोग करके की गई थी। एलीप्रो एक स्वतंत्र रूप से सुलभ वेब टूल है जो संशोधित थ्रोनटन की विधि को लागू करता है और सी परमाणुओं के बजाय प्रत्येक अवशेष के द्रव्यमान केंद्र को ध्यान में रखता है। ऐसा करने से प्रत्येक एपिटोप्स को एपिटोप अवशेषों पर औसत पीआई (प्रलोभन सूचकांक) के रूप में परिभाषित एक निर्दिष्ट स्कोर से संबंधित किया जाता है। असंतत एपिटोप्स को उनके संबंधित पीआई मूल्यों के आधार पर निर्धारित किया जाता है और अवशेषों के द्रव्यमान केंद्रों (आर) के बीच की दूरी के आधार पर क्लस्टर किया जाता है। आर के बड़े मान भविष्यवाणी किए जा रहे अधिक महत्वपूर्ण असंतत एपिटोप्स से संबंधित हैं [42]। साथ ही, एलीप्रो का उपयोग करके इनपुट प्रोटीन मॉडल में रैखिक बी सेल एपिटोप्स की भी भविष्यवाणी और कल्पना की जा सकती है। वैक्सीन के परिष्कृत 3डी मॉडल में रैखिक और असंतत बी सेल एपिटोप्स दोनों का पता लगाना एक सफल वैक्सीन-डिजाइनिंग रणनीति सुनिश्चित करता है।

वैक्सीन निर्माण की एंटीजेनिसिटी, एलर्जेनिसिटी और विषाक्तता की प्रोफाइलिंग

प्रतिरक्षा-रोगनिरोधी टीके के लिए एंटीजेनेसिटी एक आवश्यक मानदंड है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डिज़ाइन किया गया टीका निर्माण बी और टी सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करके लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करेगा, इसकी एंटीजेनेसिटी का मूल्यांकन ANTIGENpro और VaxiJen 2.0 सर्वर का उपयोग करके किया गया था। ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci. edu/) सर्वर केवल प्रोटीन माइक्रोएरे डेटासेट का उपयोग करके प्रशिक्षित होने पर 82% ज्ञात सुरक्षात्मक एंटीजन को सही ढंग से वर्गीकृत करता है। संयुक्त डेटासेट की सटीकता दस गुना क्रॉस-वैलिडेशन प्रयोगों द्वारा 76% अनुमानित है जो एंटीजेनिक पेप्टाइड्स की काफी बेहतर पहचान की अनुमति देती है। यह दो-चरणीय आर्किटेक्चर पर चलता है, जिसमें एसवीएम-आधारित दूसरे-चरण क्लासिफायरियर भी शामिल है। एक नए इनपुट प्रोटीन अनुक्रम के लिए, दूसरे चरण एसवीएम भविष्यवक्ता द्वारा गणना की गई संभावना अंतिम ANTIGENpro भविष्यवाणी स्कोर है [25]। VaxiJen2। मुख्य अमीनो एसिड गुणों के समान वैक्टर में प्रोटीन अनुक्रमों के ऑटो क्रॉस-कोवरियन्स (एसीसी) परिवर्तन पर और अनुक्रम संरेखण का संदर्भ दिए बिना केवल प्रोटीन के विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के आधार पर एंटीजन वर्गीकरण की अनुमति देता है [43]। दूसरे, किसी भी संभावना को खारिज करने के लिए कि वैक्सीन निर्माण से किसी व्यक्ति में एलर्जी प्रतिक्रिया हो सकती है, AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) सर्वर का उपयोग किया गया था इसकी एलर्जीजन्यता निर्धारित करें। सर्वर टूल विभिन्न प्रकार के दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसमें आईजीई एपिटोप्स की मैपिंग, एमईएमई/एमएएसटी मोटिफ, डाइपेप्टाइड संरचना पर आधारित एसवीएम विधि और ब्लास्ट एआरपी शामिल हैं, जिनमें से सभी का सटीक भविष्यवाणी के लिए उपयोग किया जाता है। उच्च भविष्यवाणी परिशुद्धता के लिए सीमा को 0.4 (डिफ़ॉल्ट) पर सेट किया गया था। इसके अलावा, AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dogs-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), एक स्वतंत्र रूप से पहुंच योग्य वेब सर्वर-आधारित टूल भी लागू किया गया था वैक्सीन निर्माण की गैर-एलर्जी प्रकृति की पुष्टि करने के लिए। यह विधि प्रोटीन अनुक्रमों के ऑटो-कोवेरिएंस (एसीसी) परिवर्तन पर समान समान-लंबाई वाले वैक्टर में आधारित है। इसे विभिन्न लंबाई वाले पेप्टाइड्स के मात्रात्मक संरचना-गतिविधि संबंधों (क्यूएसएआर) अध्ययन पर लागू किया गया है, और प्रोटीन को के-निकटतम पड़ोसी एल्गोरिदम [44] द्वारा वर्गीकृत किया गया है। विषाक्तता, यदि कोई हो, का पूर्वानुमान ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php) सर्वर का उपयोग करके किया गया था। यह भविष्यवाणी उपकरण मशीन लर्निंग तकनीक और मात्रात्मक विधि दोनों पर आधारित है जो स्विसप्रोट और ट्रेमबीएल [45] से प्राप्त विभिन्न विषाक्त और गैर-विषैले पेप्टाइड्स के डेटासेट पर प्रशिक्षित है। वैक्सीन और ऐसे अन्य इम्युनोथेराप्यूटिक पेप्टाइड्स की सुरक्षा का आकलन करने के लिए विषाक्तता प्रोफाइलिंग महत्वपूर्ण है जो मानव परीक्षण के लिए हैं। विश्लेषण मोटिफ-आधारित पद्धति के लिए 1{35}}.0 के ई मान सीमा और 0.1 की एसवीएम सीमा पर एसवीएम (टीआरईएमबीएल)+मोटिफ-आधारित दृष्टिकोण को चुनकर किया गया था।

भौतिक रसायन गुणों का मूल्यांकन

काइमेरिक पेप्टाइड की भौतिक और रासायनिक विशेषताओं का वर्णन करना महत्वपूर्ण हो जाता है, क्योंकि जब इसे एक टीके के रूप में प्रशासित किया जाता है, तो यह एक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में सक्षम होना चाहिए। ExPASY (विशेषज्ञ प्रोटीन विश्लेषण प्रणाली) पोर्टल (https://web.expasy.org/ प्रोग्राम/) के साथ उपलब्ध ProtParam सर्वर का उपयोग प्राथमिक वैक्सीन निर्माण के विभिन्न भौतिक रासायनिक मापदंडों की गणना करने के लिए किया गया था जिसमें आणविक भार, सैद्धांतिक पीआई जैसी विशेषताएं शामिल थीं। अस्थिरता सूचकांक, स्निग्ध सूचकांक, विवो और इन विट्रो आधा जीवन, हाइड्रोफोबिसिटी का भव्य औसत (ग्रेवी), और अन्य।

वैक्सीन पेप्टाइड की माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी

डिज़ाइन किए गए वैक्सीन निर्माण के माध्यमिक संरचनात्मक तत्वों की भविष्यवाणी PSIPRED सर्वर (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) और RaptorX प्रॉपर्टी सर्वर (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/) को लागू करके की गई थी। भविष्यवाणी/) दोनों स्वतंत्र रूप से सुलभ ऑनलाइन प्रोटीन संरचना विश्लेषण सर्वर हैं। वैक्सीन पेप्टाइड का प्राथमिक अनुक्रम इनपुट के रूप में प्रदान किया गया था। पीएसआईपीआरईडी दो फीड-फ़ॉरवर्ड न्यूरल नेटवर्क का उपयोग करके इनपुट प्रोटीन अनुक्रम की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी करता है जो पीएसआई-ब्लास्ट [46] द्वारा उत्पन्न स्थिति-विशिष्ट स्कोरिंग मैट्रिक्स (पीएसएसएम) के आधार पर कार्य करता है। इसमें पीएसआई-ब्लास्ट द्वारा हमारे वैक्सीन निर्माण के अनुरूप अनुक्रमों की पहचान शामिल है, इसके बाद पीएसएसएम की पीढ़ी शामिल है। पीएसआईपीआरईडी 3.2 और उच्चतर संस्करणों को 81.6% का औसत क्यू3 स्कोर प्राप्त करने के लिए पाया गया, जैसा कि एक कठोर तीन-गुना क्रॉसवैलिडेशन विधि द्वारा मूल्यांकन किया गया है जो इस दृष्टिकोण को काफी सटीक और सटीक बनाता है। रैप्टरएक्स प्रॉपर्टी वेब सर्वर एक साथ माध्यमिक संरचना, विलायक पहुंच और अव्यवस्थित क्षेत्रों जैसी विभिन्न विशेषताओं की भविष्यवाणी करने के लिए डीपसीएनएफ (डीप कन्वेन्शनल न्यूरल फील्ड) नामक एक हालिया मशीन लर्निंग तकनीक का उपयोग करता है। डीपसीएनएफ एक एकीकृत दृष्टिकोण है जो सशर्त यादृच्छिक क्षेत्रों (सीआरएफ) और उथले तंत्रिका नेटवर्क दोनों को जोड़ता है जो एक गहरी पदानुक्रमित वास्तुकला द्वारा जटिल अनुक्रम-संरचना संबंधों को मॉडल करता है और एक 3- वर्ग माध्यमिक संरचना के लिए लगभग 84% क्यू3 सटीकता प्राप्त कर सकता है [47] .

तृतीयक संरचना भविष्यवाणी

अंतिम वैक्सीन पेप्टाइड की तृतीयक संरचना की भविष्यवाणी ऑनलाइन वेब सर्वर I-TASSER (https:// zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) का उपयोग करके की गई थी। I-TASSER एक पदानुक्रमित प्रोटीन संरचना मॉडलिंग दृष्टिकोण है जो प्रोफ़ाइल-प्रोफ़ाइल थ्रेडिंग संरेखण (पीपीए) और पुनरावृत्त संरचना असेंबली सिमुलेशन के बाद परमाणु-स्तरीय संरचना शोधन पर आधारित है। यह तीन चरणों में काम करता है: संरचनात्मक टेम्पलेट पहचान, पुनरावृत्त संरचना असेंबली, और संरचना-आधारित फ़ंक्शन एनोटेशन। वैश्विक और स्थानीय सटीकता अनुमानों के साथ शीर्ष क्रम के संरचना मॉडल उनके प्रतिनिधि सी-स्कोर और टीएम स्कोर के साथ लौटाए जाते हैं, जो अनुमानित मॉडल की गुणवत्ता के साथ सहसंबद्ध होते हैं। I-TASSER कार्यक्रम प्रोटीन संरचना और कार्य की स्वचालित भविष्यवाणियों के लिए CASP में प्रदर्शित सबसे सफल तरीकों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है [48, 49]।

वैक्सीन तृतीयक संरचना का शोधन

अकेले प्रोटीन संरचना का पारंपरिक कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग पूर्वानुमानित मॉडल की प्रामाणिकता और सटीकता की गारंटी नहीं देता है क्योंकि ऐसी मॉडलिंग रणनीतियां काफी हद तक उपलब्ध टेम्पलेट संरचनाओं के साथ इनपुट (लक्ष्य) की संभावना की डिग्री पर निर्भर करती हैं। इसलिए, टेम्पलेट-आधारित मॉडल की गुणवत्ता को सटीकता से परे बढ़ाना आवश्यक समझा गया, और इसे संपूर्ण प्रोटीन संरचना को परिष्कृत करके प्राप्त किया जा सकता है। इस परिप्रेक्ष्य के साथ, सर्वश्रेष्ठ सी-स्कोर के साथ I-TASSER सर्वर से त्रिआयामी मॉडल आउटपुट को GalaxyRefne सर्वर (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type) द्वारा और अधिक परिष्कृत किया गया था। {4}} परिष्कृत करें)। यह एक सीएएसपी परीक्षणित शोधन दृष्टिकोण है जिसमें पहले प्रोटीन साइड चेन का पुनर्निर्माण किया जाता है, और फिर साइड चेन की रीपैकिंग और समग्र संरचना विश्राम आणविक गतिशीलता सिमुलेशन द्वारा किया जाता है। इससे लक्ष्य प्रोटीन की स्थानीय और वैश्विक तृतीयक संरचनाओं में सटीक सुधार होता है [50]।

सिस्टैंच अनुपूरक लाभ—विरोधी-भड़काऊ

वैक्सीन तृतीयक संरचना का सत्यापन

अनुमानित 3डी मॉडल में होने वाली संभावित त्रुटियों का पता लगाने के लिए वैक्सीन की परिष्कृत तृतीयक संरचना को मान्य करने की आवश्यकता है। GalaxyRefne सर्वर से प्राप्त परिष्कृत मॉडल को a.pdb प्रारूप में इनपुट संरचना के रूप में प्रदान किया गया था। इसके अलावा, अमीनो एसिड साइड चेन के फाई (ϕ) और पीएसआई (ψ) डायहेड्रल कोणों के ऊर्जावान रूप से अनुमत और अस्वीकृत क्षेत्रों को देखने के लिए रामचंद्रन प्लॉट एक और बहुत उपयोगी दृष्टिकोण है, जिन्हें प्रोटीन संरचना के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण घटक माना जाता है। इसलिए, MolProbity सर्वर [मुख्य पृष्ठ-MolProbity (duke.edu)] को नियोजित किया गया था जो पायथन-आधारित MolProbity शैली Phenix सत्यापन [51] के आधार पर वैक्सीन के दिए गए मॉडल के लिए एक रामचंद्रन प्लॉट उत्पन्न करता है। हमने आगे ERRAT सर्वर [SAVESv6.0—स्ट्रक्चर वैलिडेशन सर्वर (UCLA. edu)] का उपयोग किया है जो मॉडल में विभिन्न परमाणुओं के बीच गैर-बंधित इंटरैक्शन के आंकड़ों का विश्लेषण करता है और त्रुटि फ़ंक्शन के मान को {{ के विरुद्ध प्लॉट करता है। 6}}अवशेषों का खिसकना [52]। ProSA वेब सर्वर (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), मानक ProSA प्रोग्राम पर आधारित एक इंटरैक्टिव वेब-आधारित प्लेटफ़ॉर्म, का उपयोग इस उद्देश्य के लिए किया गया था [53]। यह चरण मॉडल की गई संरचना का अधिक परिष्कृत और सटीक सत्यापन प्राप्त करने के लिए किया गया था।

वैक्सीन पेप्टाइड की डाइसल्फ़ाइड इंजीनियरिंग

डाइसल्फ़ाइड बांड गठनात्मक एन्ट्रापी को कम करके और विकृत अवस्था की मुक्त ऊर्जा को बढ़ाकर प्रोटीन स्थिरता में योगदान करते हैं। देशी, मुड़े हुए प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी में सुधार के लिए नवीन डाइसल्फ़ाइड बांड की शुरूआत को एक महत्वपूर्ण जैव प्रौद्योगिकी उपकरण माना गया है। डिज़ाइन 2 (डीबीडी 2) वी 2.12 सर्वर द्वारा डाइसल्फ़ाइड का उपयोग डाइसल्फ़ाइड लिंकेज पेश करके डिज़ाइन किए गए टीके की समग्र संरचनात्मक स्थिरता को बढ़ाने के लिए किया गया था। यह विधि मूल ज्यामिति का उपयोग करती है और प्रत्येक संभावित डाइसल्फ़ाइड के लिए ऊर्जा मूल्य की गणना करती है, जिससे उम्मीदवार डाइसल्फ़ाइड बांड को रैंक करने का साधन प्रदान किया जाता है। डाइसल्फ़ाइड बांड जो अधिकतम स्थिरता प्रदान करते हैं वे उच्च chi3 मान, बांड ऊर्जा और बी कारक [54] वाले उम्मीदवार थे। पेप्टाइड के लचीले क्षेत्रों को पहले उल्लिखित मापदंडों के आधार पर चुना गया था, और चुने गए अवशेषों के जोड़े के बीच डाइसल्फ़ाइड लिंकेज बनाकर संबंधित स्थिर उत्परिवर्तन बनाए गए थे।

प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स (मानव टीएलआर-2, 4, 5, 8, और माउस टीएलआर-9) के साथ वैक्सीन निर्माण की आणविक डॉकिंग

टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रमुख गुण हैं जो रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) को पहचानते हैं और संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं। बाद में लीशमैनिया घटकों के साथ टीएलआर -2 का प्रत्यक्ष सक्रियण रिपोर्ट किया गया [55]। अन्य संबंधित प्रयोगात्मक अध्ययनों में, टीएलआर -4 की कमी के परिणामस्वरूप परजीवी वृद्धि में वृद्धि हुई और एल प्रमुख संक्रमणों के कारण त्वचीय घावों के ठीक होने में देरी हुई, जो लीशमैनिया के खिलाफ प्रतिरक्षा उत्पन्न करने में टीएलआर -4 की प्रशंसनीय भूमिका को दर्शाता है [56] ]. दूसरी ओर, टीएलआर -2, 4, और 9 को एल. ब्रेज़िलेंसिस और एल. अमेज़ोनेंसिस [57] के कारण होने वाले सीएल के इम्युनोपैथोलॉजिक स्पेक्ट्रम में शामिल पाया गया। मनुष्यों में वीएल के रोगजनन में डेंड्राइटिक कोशिकाओं के सक्रियण में टीएलआर -9 को एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में भी मूल्यांकन किया गया था [58]। इस क्षेत्र में किए गए अधिकांश अध्ययनों में लीशमैनिया-व्युत्पन्न कुछ घटकों को टीएलआर -2, 4, और 9 को सक्रिय करते हुए दिखाया गया है। ये अवलोकन इस तथ्य पर जोर देते हैं कि विभिन्न टीएलआर लीशमैनिया के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को ट्रिगर करने में शामिल हैं। इसलिए, लीशमैनिया संक्रमण के खिलाफ प्रभावी प्रतिरक्षा प्राप्त करने के लिए टीएलआर और डिज़ाइन किए गए वैक्सीन निर्माण के बीच बातचीत को आवश्यक माना गया था। इसे पैचडॉक सर्वर [पैचडॉक सर्वर (tau.ac.il) का उपयोग करके मानव टीएलआर -2, 4, 5, 8, और माउस टीएलआर -9 के साथ मल्टी-एपिटोपिक वैक्सीन पेप्टाइड की आणविक डॉकिंग करके जांचा गया था। )]. पैचडॉक एल्गोरिदम के तीन मुख्य चरण हैं, अर्थात् आणविक आकार प्रतिनिधित्व, सतह पैच मिलान, और फ़िल्टरिंग और स्कोरिंग। यह एक ज्यामिति-आधारित आणविक डॉकिंग एल्गोरिदम है जो मुख्य रूप से रिसेप्टर और लिगैंड के बीच आणविक आकार की पूरकता पर काम करता है। पूरक पैच का मिलान किया जाता है, और उम्मीदवार परिवर्तन उत्पन्न होते हैं। इनमें से प्रत्येक परिवर्तन को एक स्कोरिंग फ़ंक्शन निर्दिष्ट करके आगे रैंक किया गया है जो परमाणु विघटन ऊर्जा और ज्यामितीय फीट [59, 60] दोनों पर विचार करता है। हमारे अध्ययन में, मानव टीएलआर -2 (पीडीबी आईडी: 6एनआईजी), टीएलआर -4 (पीडीबी आईडी: 4जी8ए), टीएलआर {31}} (पीडीबी आईडी: 3जे 0ए), और टीएलआर -8 (पीडीबी आईडी: 4क्यूसी 0), और माउस टीएलआर -9 (पीडीबी आईडी: 3डब्ल्यूपीएफ) को रिसेप्टर्स के रूप में चुना गया था, और उनकी अलग पीडीबी फाइलें प्रोटीन डेटाबैंक (www) से पुनर्प्राप्त की गईं थीं। .rcsb.org). वैक्सीन पेप्टाइड के परिष्कृत 3डी मॉडल का उपयोग सभी डॉकिंग सिमुलेशन के लिए लिगैंड के रूप में किया गया था। पैचडॉक सर्वर को डिफ़ॉल्ट पैरामीटर (क्लस्टरिंग आरएमएसडी: 4.0) पर सेट किया गया था। हमने संभावित बॉन्ड रोटेशन एल्गोरिदम के आधार पर क्लूसप्रो सर्वर का उपयोग करके सर्वोत्तम डॉकिंग मॉडल का विश्लेषण किया, और बॉन्ड का मूल्यांकन PyMOL सॉफ़्टवेयर [61] का उपयोग करके किया गया।

कोडन अनुकूलन, एमआरएनए संरचना भविष्यवाणी, और वैक्सीन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सिलिको क्लोनिंग में

मेजबान जीव में विदेशी जीन की अधिकतम अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए कोडन के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जब मेजबान द्वारा कोडन का उपयोग मूल मेजबान से काफी भिन्न होता है, जहां से अंतिम टीका निर्माण के लिए मूल अनुक्रमों को हटा दिया गया था। JCat (जावा कोडन एडाप्टेशन टूल), जो सार्वजनिक रूप से (http://www. jcat.de/) पर उपलब्ध है, का उपयोग इनपुट के रूप में अंतिम वैक्सीन निर्माण का प्राथमिक अनुक्रम प्रदान करके रिवर्स ट्रांसलेशन और कोडन अनुकूलन के लिए किया गया था। कोडन का उपयोग सबसे अनुक्रमित प्रोकैरियोटिक जीव, ई. कोली K12 [6] के लिए अनुकूलित किया गया था। आरएचओ-स्वतंत्र ट्रांस्क्रिप्शन टर्मिनेटर, प्रोकैरियोटिक राइबोसोम-बाइंडिंग साइट्स और अवांछित प्रतिबंध क्लीवेज साइट्स से बचने के लिए टूल द्वारा प्रदान किए गए तीन अतिरिक्त विकल्पों का चयन किया गया था। जेकैट टूल द्वारा गणना किए गए कोडन अनुकूलन सूचकांक (सीएआई) और जीसी सामग्री से पता चलता है कि अनुकूलन कितना अच्छा था। बेहतर अनुकूलन वैक्सीन प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, क्लोनिंग की सुविधा के लिए एंजाइम XhoI और NdeI के लिए प्रतिबंध साइटों को JCat टूल द्वारा प्रदान किए गए अनुकूलित सीडीएनए अनुक्रम में शामिल किया गया था। स्नैपजीन टूल [6, 31, 62, 63] के प्रतिबंध क्लोनिंग मॉड्यूल का उपयोग करके संशोधित अनुक्रम (प्रतिबंध साइटों के साथ) को ई. कोली पीईटी 28-ए(+) प्लास्मिड वेक्टर में डाला गया था। SnapGene सॉफ़्टवेयर वेब पर (https://www.snapgene.com/) पर उपलब्ध है। इसके अलावा, हमने mRNA द्वारा एन्कोड की गई द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी के लिए mfold वेब सर्वर (http:// Unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) का भी उपयोग किया। काइमेरिक पेप्टाइड के जीन। JCat टूल से प्राप्त रिवर्स-अनुवादित अनुकूलित अनुक्रम इनपुट के रूप में प्रदान किया गया था। एमफोल्ड प्रोग्राम एक कोर एल्गोरिदम पर आधारित है जो न्यूनतम मुक्त ऊर्जा, ∆ जी, और किसी विशेष आधार जोड़ी वाले फोल्डिंग के लिए न्यूनतम मुक्त ऊर्जा की भविष्यवाणी करता है। तह ऊर्जा की सटीक भविष्यवाणी के लिए विभिन्न तह बाधाएं भी लागू की जाती हैं। आरएनए फोल्डिंग के लिए फोल्डिंग ऊर्जा 37 डिग्री पर तय की गई है, जबकि आयनिक स्थितियां [Na+]=1 M और [Mg++]=0 [64] पर तय की गई हैं।

सी-इमसिम-आधारित प्रतिरक्षा सिमुलेशन

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) एक सर्वर-आधारित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भविष्यवाणी उपकरण है जो एजेंट-आधारित वर्ग का उपयोग करता है, और इसकी भविष्यवाणी तंत्रिका नेटवर्क पर निर्भर करती है। यह ह्यूमरल और कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों की भविष्यवाणी कर सकता है। सी-इमसिम सक्रिय, आराम करने वाली और स्मृति कोशिकाओं और उनकी दीर्घायु की भविष्यवाणी को चिह्नित करने के लिए सेल्डा सेडेन मॉडल, बिट-स्ट्रिंग पॉलीक्लोनल लैटिस मॉडल और सिम्पसन इंडेक्स का उपयोग करता है। यह सूजन संबंधी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए किसी दी गई प्रतिक्रिया के साइटोकिन प्रोफाइल की भविष्यवाणी करने में मदद करता है [65]।

सिस्टैंच अर्क पाउडर

आणविक गतिशील अनुकरण

आईएमओडी (आईमॉड सर्वर होम पेज (सीएसआईसी.ईएस) सर्वर) का उपयोग करके प्रस्तावित वैक्सीन के साथ हमारे सर्वोत्तम कॉम्प्लेक्स, यानी टीएलआर की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए आणविक गतिशील सिमुलेशन किया गया था। यह वेब-आधारित सर्वर बेहतर सामान्य मोड विश्लेषण (एनएमए) का उपयोग करता है। अंतर-परमाणु बल क्षेत्र के माध्यम से प्रोटीन लचीलेपन और स्थिरता जैसे जैव अणुओं के विभिन्न गतिशील गुणों के लक्षण वर्णन के लिए। इस वर्तमान अध्ययन में, हमने मुख्य श्रृंखला विकृति, बी कारक, ईजेनवैल्यू, सहप्रसरण कारक और लोचदार नेटवर्क मॉडल का विश्लेषण किया। सिलिको दृष्टिकोण में प्राप्त प्रोटीन-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के मूल्यांकन के लिए मानक एनएमए मापदंडों के रूप में [66-69]।

परिणाम

लीशमैनिया एंटीजेनिक प्रोटीन अनुक्रमों का चयन और पुनर्प्राप्ति

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), वैक्सीन डिजाइन के लिए उनकी उच्च क्षमता को दर्शाता है (तालिका 1)। सिग्नलपी 1.4 सर्वर द्वारा सिग्नल पेप्टाइड क्लीवेज साइटों की भविष्यवाणी के आधार पर प्रोटीन को स्रावी और गैर-स्रावी के रूप में भेदभाव किया गया था। चयनित लीशमैनिया प्रोटीन में से दो। एल. मेक्सिकाना सिस्टीन प्रोटीनएज़ ए (यूनिप्रोट आईडी: पी25775) और एल. अमेज़ोएन्सिस सतह ग्लाइकोप्रोटीन जीपी -46/एम2 (यूनिप्रोट आईडी: पी21978) में सिग्नल पेप्टाइड्स पाए गए और इसलिए, स्रावी प्रोटीन के रूप में भविष्यवाणी की गई। बाकी दस लीशमैनिया एंटीजन में कोई सिग्नल पेप्टाइड नहीं पाया गया जो उनकी गैर-स्रावी प्रकृति को दर्शाता हो। स्थानीयकरण विश्लेषण ने भविष्यवाणी की है कि एल. मेक्सिकाना (यूनिप्रोट आईडी: पी25775) का प्रोटीन सिस्टीन प्रोटीनएज ए लाइसोसोम/रिधानिका में स्थानीयकृत होगा, प्रोटीन लीशमैनोलिसिन सी1 और एल. मेक्सिकाना का प्रोटीओफॉस्फोग्लाइकन (यूनिप्रोट आईडी: पी43150 और क्यू9टीडब्ल्यू13, क्रमशः) झिल्ली प्रोटीन होंगे। , एल. डोनोवानी (यूनिप्रोट आईडी: क्यू9बीआईजे5) के सुरक्षात्मक एंटीजन की कमी, नाभिक में होना और एल. मेजर (यूनिप्रोट आईडी: पी12076) के हीट शॉक 70 संबंधित प्रोटीन 1 का माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीयकृत होना। अन्य सभी प्रोटीनों की भविष्यवाणी साइटोप्लाज्मिक (तालिका 1) के रूप में की गई थी। इसके अलावा, अंतिम वैक्सीन निर्माण में सहायक के रूप में उपयोग करने के लिए मानव आईएल की अल्फा श्रृंखला का अमीनो एसिड अनुक्रम भी यूनिप्रोट डेटाबेस (यूनिप्रोट आईडी: पी29459) से प्राप्त किया गया था।

सीटीएल और एचटीएल एपिटोप्स की भविष्यवाणी

जांच किए जा रहे सभी प्रोटीनों से, NetCTL 1.2 और SYFPEITHI सर्वर द्वारा संयुक्त रूप से 59 सामान्य गैर-नाममात्र CTL एपिटोप्स की कुल संख्या की पहचान की गई। अनुमानित सीटीएल एपिटोप्स में से प्रत्येक को संबंधित सर्वर द्वारा गणना किया गया एक विशेष स्कोर सौंपा गया था। इनमें से केवल 26 सामान्य 9-मेर ​​सीटीएल रूपांकनों को उनके उच्च स्कोर (उच्च एमएचसी आई-बाइंडिंग एफ़िनिटी का संकेत) के कारण चुना गया था। संगत उच्च स्कोर वाले दोनों सर्वरों द्वारा आमतौर पर पहचाने जाने वाले इन छब्बीस सीटीएल एपिटोप्स को अंतिम वैक्सीन निर्माण (पूरक तालिका एस 1) में शामिल किया गया था। इसी तरह, IEDB MHCII-बाइंडिंग विश्लेषण उपकरण ने तीन मानव HLA एलील्स (HLA- DRB1*01:01, HLA- DRB1*01:02 और HLADRB1*) के एक सेट के विरुद्ध सभी चयनित प्रोटीनों से 15-मेर ​​HTL एपिटोप्स की भविष्यवाणी की। 01:03). इनमें से प्रत्येक एलील के लिए न्यूनतम समायोजित रैंक वाले अनुमानित एचटीएल एपिटोप्स को पूरक तालिका एस2 के रूप में प्रलेखित किया गया है। इस पूल से, कुल नौ अनुक्रमों को उनके कम समायोजित रैंक (तालिका 2) के आधार पर चुना गया था जो इन एचटीएल एपिटोप्स को तीन एचएलए एलील्स में से किसी के लिए सबसे शक्तिशाली एमएचसी-द्वितीय बाइंडर्स बनाता है। चयनित एचटीएल एपिटोप्स को उनकी साइटोकिन-उत्पादक क्षमताओं की भविष्यवाणी करने के लिए आगे के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के अधीन किया गया था।

तालिका 1 लीशमैनिया की विभिन्न प्रजातियों से बारह संभावित एंटीजेनिक पेप्टाइड्स का उपयोग वैक्सीन निर्माण के लिए किया गया है और एंटीजनप्रो सर्वर द्वारा भविष्यवाणी के अनुसार उनके उच्च एंटीजन स्कोर के आधार पर चुना गया है।

साइटोकिन-उत्प्रेरण क्षमताओं वाले एचटीएल एपिटोप्स के लिए स्क्रीनिंग

चुने गए सभी नौ एचटीएल एपिटोप्स (तालिका 2) का मूल्यांकन IFNepitope सर्वर को नियोजित करके इंटरफेरॉन का उत्पादन करने की उनकी क्षमता के लिए किया गया था। सर्वर ने भविष्यवाणी की (आईएफएन- बनाम नॉनआईएफएन, एसवीएम और मोटिफ-आधारित हाइब्रिड विश्लेषण का उपयोग करके) केवल तीन पेप्टाइड्स जैसे कि एल मेजर के पैराफैगेलर रॉड प्रोटीन 2 सी से एफआरआरलीकेटीएलजीक्यूएलवीवाईकेके, एल मेक्सिकाना के प्रोटीओफॉस्फोग्लाइकन से डीएनजीएवाईएलजीएमईपीएसवीएए, और ट्यूबुलिन बीटा श्रृंखला से आरएलएचएफएफएमएमजीएफएपीएलटीएसआर एल. मेक्सिकाना 1 से कम स्कोर के साथ "सकारात्मक" के रूप में। 0 (तालिका 3)। इन तीन पेप्टाइड्स को क्रमशः IL4pred सर्वर और IL10pred सर्वर का उपयोग करके उनकी IL -4 और IL {{9} उत्पादन क्षमताओं के लिए जांचा गया। दोनों सर्वर एक एसवीएम क्लासिफायरियर का उपयोग करते हैं और भविष्यवाणी के लिए विभिन्न एसवीएम इनपुट मापदंडों जैसे अमीनो एसिड संरचना, डाइपेप्टाइड संरचना, अमीनो एसिड प्रवृत्ति और भौतिक रासायनिक गुणों पर विचार करते हैं [32, 33]। संबंधित सर्वरों ने अनुमान लगाया कि ये तीन 15-मेर ​​आईएफएन- -उत्पादक एपिटोप्स आईएल-4 और आईएल-10 के लिए भी प्रेरक थे (पूरक तालिका एस3)। इसलिए, इन तीन MHC-II-बाइंडिंग 15-मेर ​​HTL एपिटोप्स को अंततः साइटोकिन्स IFN-, IL-4, और IL{24) के उत्पादन को प्राप्त करने की उनकी क्षमता को ध्यान में रखते हुए वैक्सीन के निर्माण के लिए चुना गया था। }} जिससे एक बढ़ी हुई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में मध्यस्थता होती है।

एपिटोप संरक्षण विश्लेषण

IEDB सर्वर के भीतर उपलब्ध IEDB मॉड्यूल "एंटीजन में संरक्षण" का उपयोग चयनित CTL और HTL एपिटोप्स के संरक्षण की डिग्री का पता लगाने के लिए किया गया था, जिन्हें अंतिम वैक्सीन निर्माण में शामिल किया जाएगा। छब्बीस सीटीएल एपिटोप्स और तीन एचटीएल एपिटोप्स में से प्रत्येक को यूनिप्रोट ब्लास्ट द्वारा प्राप्त समरूप प्रोटीन अनुक्रमों के एक विशिष्ट सेट के खिलाफ व्यक्तिगत रूप से जांचा गया था। ब्लास्ट परिणामों ने लीशमैनिया की विभिन्न प्रजातियों और अन्य संबंधित परजीवी प्रोटोजोआ, ज्यादातर ट्रिपैनोसोमा में चयनित प्रोटीन के उच्च स्तर के संरक्षण को दिखाया। विश्लेषण में उपयोग किए गए संबंधित लीशमैनिया प्रोटीन के सेट में सभी एचटीएल एपिटोप्स को अत्यधिक संरक्षित (1 0 0%) पाया गया, जबकि चयनित सीटीएल एपिटोप्स के लिए संरक्षण की सीमा 0 से 100% तक भिन्न थी (पूरक तालिका) एस4). अंतिम वैक्सीन निर्माण में ऐसे संरक्षित सीटीएल और एचटीएल एपिटोप्स को शामिल करने से रोगजनक लीशमैनिया की कई प्रजातियों के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम क्रॉस-प्रतिरक्षा सुनिश्चित होगी जो आमतौर पर मनुष्यों को संक्रमित करती हैं।

तालिका 2 चयनित एचटीएल एपिटोप्स (15 मेर) का उनके स्रोत प्रोटीन, संबंधित बाइंडिंग एलील और आईईडीबी एमएचसी-II-बाइंडिंग टूल द्वारा अनुमानित समायोजित रैंक के साथ विवरण

तालिका 3 IFNepitope सर्वर ने MHC II-उत्प्रेरण एपिटोप्स की भविष्यवाणी की है जो इंटरफेरॉन-उत्पादन में सक्षम हैं

मल्टी-एपिटोप वैक्सीन अनुक्रम का निर्माण

मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन का प्राथमिक अनुक्रम छब्बीस सीटीएल एपिटोप्स और तीन एचटीएल एपिटोप्स के अनुक्रमों को उनकी एंटीजेनेसिटी, एमएचसी-बाइंडिंग एफ़िनिटी और साइटोकिन-उत्प्रेरण क्षमता के आधार पर विलय करके बनाया गया था। व्यक्तिगत सीटीएल और एचटीएल एपिटोप्स को क्रमशः एएवाई और जीपीजीपीजी लिंकर्स का उपयोग करके समामेलित किया गया था, और परिणामी वैक्सीन पेप्टाइड की कुल लंबाई 369 अमीनो एसिड थी। सहायक, 219 अमीनो एसिड मानव आईएल की लंबी अल्फा श्रृंखला -12 (यूनिप्रोट आईडी: पी 29459), ईएएके लिंकर द्वारा डिज़ाइन किए गए पेप्टाइड के एन टर्मिनल में जोड़ा गया था। प्राकृतिक सहायक के रूप में आईएल -12 को शामिल करने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में तेजी लाकर टीके की प्रभावशीलता में वृद्धि होनी थी, जैसा कि पहले से ही जानवरों के अध्ययन में मान्य है [3, 37]। इसके अलावा, पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी द्वारा इसके उत्पादन के बाद प्रोटीन की पहचान और शुद्धिकरण की सुविधा के लिए पेप्टाइड के सी टर्मिनल में एक 6XHis टैग भी जोड़ा गया था। लिंकर्स, एडजुवेंट और हिस्टिडाइन टैग को जोड़ने के बाद, अंतिम वैक्सीन पेप्टाइड की लंबाई 598 अमीनो एसिड अवशेष (चित्र 1) पाई गई।

रैखिक, निरंतर और असंतत बी सेल एपिटोप की भविष्यवाणी

अधिक प्रभावी भविष्यवाणी के लिए, डिज़ाइन किए गए टीके के प्राथमिक अनुक्रम में एंटीजेनिक निर्धारकों की उपस्थिति की पहचान दो अलग-अलग सर्वरों, अर्थात् एबीसीप्रेड और बेपीप्रेड 2. 0 को नियोजित करके की गई थी। ABCpred सर्वर एक प्रशिक्षित आवर्तक तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करके बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी करता है और उम्मीदवार अनुक्रमों को उनके बाइंडिंग स्कोर (पूरक तालिका S5) के अनुसार 16-मेर ​​पेप्टाइड्स के रूप में प्रस्तुत करता है। पेप्टाइड के उच्च स्कोर का मतलब एपिटोप होने की अधिक संभावना है। डिज़ाइन किए गए वैक्सीन पेप्टाइड में सात गैर-अतिव्यापी {{5}मेर पेप्टाइड्स पाए गए, जिनका अनुमानित स्कोर 0.9{8}} और डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड मान 0.51 पर अधिक था। , बी कोशिकाओं को बांधने और उत्तेजित करने की उनकी बहुत उच्च क्षमता को दर्शाता है। अन्य सर्वर, BepiPred 2.0, इनपुट अनुक्रम में प्रत्येक अमीनो एसिड अवशेष के बी सेल एपिटोप का हिस्सा होने की संभावना की भविष्यवाणी करता है और आउटपुट को नारंगी रंग के ग्रेडेशन के साथ एक चित्रण के रूप में दर्शाता है जो कि डिग्री का संकेत देता है। संभावना। अनुमानित अवशेष जो बी सेल एपिटोप्स से संबंधित हैं, उन्हें "ई" के रूप में चिह्नित किया गया है। सर्वर ने बड़ी संख्या में अवशेषों की पहचान रैखिक बी सेल एपिटोप्स के रूप में की, जिसमें पेप्टाइड की 38 {{18 }} - 53 {{2 {{23 }}}} स्थिति के अवशेष विस्तार के भीतर उच्च संभावना थी (चित्र 2) जब एपिटोप थ्रेशोल्ड 0.5 (डिफ़ॉल्ट) पर सेट किया गया था। इस प्रकार, दो स्वतंत्र सर्वरों द्वारा बी सेल रिसेप्टर्स के लिए एंटीजेनिक निर्धारकों की पहचान ने इस तथ्य को स्थापित किया कि पेप्टाइड, जब एक वैक्सीन के रूप में प्रशासित किया जाता है, तो व्यक्तियों को लीशमैनिया संक्रमण से बचाने के लिए बी कोशिकाओं द्वारा एंटीबॉडी के उत्पादन को प्रोत्साहित करने में सक्षम होगा। एलिप्रो सूट (आईईडीबी पोर्टल के भीतर उपलब्ध) ने पेप्टाइड वैक्सीन की परिष्कृत तृतीयक संरचना में आठ असंतत बी सेल एपिटोप्स में स्थित कुल 323 अमीनो एसिड अवशेषों की भविष्यवाणी की, जिनका स्कोर 0.509 से 0.802 तक था। उनमें से, सबसे बड़े गठनात्मक एपिटोप में 0.772 के अनुमानित स्कोर के साथ 107 अमीनो एसिड अवशेष थे। विश्लेषण के लिए सर्वर के डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग किया गया था। एलीप्रो ने 0.535-0.885 (पूरक तालिका एस6 और पूरक छवि एम1) के स्कोर रेंज के भीतर 324 अवशेषों की कुल संख्या के साथ बारह रैखिक बी सेल एपिटोप्स की भी भविष्यवाणी की।

वैक्सीन निर्माण की एंटीजेनिसिटी, एलर्जेनिसिटी और विषाक्तता प्रोफाइलिंग

अंतिम वैक्सीन अनुक्रम (सहायक के साथ) की एंटीजेनेसिटी का मूल्यांकन ANTIGENpro और VaxiJen 2.0 सर्वर द्वारा किया गया था। ANTIGENpro सर्वर ने 0.745396 के एंटीजेनिसिटी स्कोर के साथ एक संभावित-सक्षम एंटीजन होने की भविष्यवाणी की। VaxiJen 2.0 सर्वर ने संभावित एंटी-जन के रूप में वैक्सीन पेप्टाइड का मूल्यांकन 0.5325 के स्कोर के साथ {{1{14}}}}.5 की सीमा पर किया जब लक्ष्य जीव परजीवी के रूप में चुना गया (तालिका 4)। हालाँकि, जब सहायक के बिना मूल वैक्सीन अनुक्रम का विश्लेषण VaxiJen 2.0 द्वारा किया गया था, तो इसे भी परजीवी मॉडल में 0.5768 के स्कोर के साथ एक संभावित एंटीजन के रूप में भविष्यवाणी की गई थी। मूल अनुक्रम के लिए ANTIGENpro भविष्यवाणी स्कोर 0.714582 था। इसलिए, दोनों निर्मित वैक्सीन अनुक्रम (सहायक के साथ और बिना) प्रकृति में एंटीजेनिक पाए गए, इस तथ्य का समर्थन करते हुए कि टीके के पेप्टाइड घटक स्वयं एंटीजेनिक थे, यहां तक ​​कि अतिरिक्त सहायक की अनुपस्थिति में भी (तालिका 4)। जहां तक ​​एलर्जी पैदा करने की क्षमता का सवाल है, अंतिम टीका अनुक्रम को AlgPred द्वारा गैर-एलर्जेन पाया गया, जिसका अनुमानित स्कोर 0.4{28}}18 था, जो कि 0.4 की सीमा पर था। इसके अलावा, प्रोटीन अनुक्रम में कोई प्रयोगात्मक रूप से सिद्ध आईजीई एपिटोप शामिल नहीं पाया गया, और एलर्जेन-प्रतिनिधि पेप्टाइड्स (एआरपी) के लिए ब्लास्ट परिणामों के लिए कोई हिट नहीं पाया गया, जो वैक्सीन की गैर-एलर्जेन प्रकृति को दर्शाता है। AllerTOP v.2.0 सर्वर ने प्रोटीन को एक संभावित गैर-एलर्जेन के रूप में भी परिभाषित किया है। टॉक्सिनप्रेड सर्वर द्वारा विषाक्तता विश्लेषण ने पेप्टाइड के गैर विषैले होने की भविष्यवाणी की जब एसवीएम (टीआरईएमबीएल) + मोटिफ-आधारित दृष्टिकोण 0.1 की एसवीएम सीमा पर अपनाया गया था, और मोटिफ-आधारित के लिए ई मूल्य कट-ऑफ 10.0 पर सेट किया गया था। इसलिए, उत्पन्न वैक्सीन अनुक्रम को संभावित एंटीजन, नॉनएलर्जेन और गैर विषैले के रूप में अनुमानित किया गया था, जो सभी एक आदर्श मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन के लिए महत्वपूर्ण मानदंड हैं।

चित्र 1 डिज़ाइन किए गए मल्टी-एपिटोप पेप्टाइड वैक्सीन का योजनाबद्ध चित्रण जिसमें कुल 598 अमीनो एसिड अनुक्रम शामिल हैं जो एएवाई (नीला) लिंकर का उपयोग करके 26 सीटीएल (नारंगी) के साथ ईएएके (बैंगनी) से जुड़े एन टर्मिनल प्राकृतिक सहायक (हरा) के साथ संभावित वैक्सीन निर्माण का प्रतिनिधित्व करते हैं। , और 3HTL (पीला) GPGPG (लाल) लिंकर से जुड़े हुए हैं। यह शुद्धिकरण प्रयोजनों के लिए सी टर्मिनल पर उसके टैग के साथ समाप्त होता है

चित्र 2 बी सेल एपिटोप की भविष्यवाणी बेपिप्रेड 2.0 सर्वर द्वारा की गई है। 1 से 590 अमीनो एसिड अनुक्रमों के विभिन्न बिंदुओं पर खिंचाव की भविष्यवाणी डिफ़ॉल्ट सीमा स्तर से ऊपर संभावित एपिटोप के साथ की गई थी। ई के रूप में चिह्नित पहली पंक्ति अनुमानित एपिटोप स्थान को दर्शाती है

भौतिक रासायनिक मापदंडों का मूल्यांकन

अंतिम वैक्सीन निर्माण के भौतिक रासायनिक मापदंडों की गणना दिए गए अनुक्रम में मौजूद अमीनो एसिड अवशेषों के आधार पर प्रोटपरम सर्वर द्वारा की गई थी। डिज़ाइन किए गए पेप्टाइड के आणविक भार (मेगावाट) की गणना 65.68 kDa की गई थी जो इसे इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए उपयुक्त बनाता है। सैद्धांतिक पीआई (आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट) की गणना 5.98 के रूप में की गई थी, जो पेप्टाइड को प्रकृति में थोड़ा अम्लीय बताता है। पेप्टाइड में धनावेशित और ऋणावेशित अवशेषों की कुल संख्या क्रमशः 48 और 55 थी। आधे जीवन की गणना इन विट्रो में स्तनधारी रेटिकुलोसाइट्स में 3 {{15 }} घंटे, यीस्ट में 20 घंटे से अधिक और ई. कोली में 10 घंटे से अधिक के रूप में की गई थी। स्तनधारी कोशिकाओं (मनुष्यों सहित) में 30 घंटे तक प्रोटीन की दृढ़ता वांछनीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त थी क्योंकि तंत्र को प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा प्रोटीन के प्रसंस्करण और प्रस्तुति की आवश्यकता होती है। स्निग्ध सूचकांक (स्निग्ध पक्ष श्रृंखलाओं द्वारा व्याप्त सापेक्ष मात्रा) 78.34 होने का अनुमान लगाया गया था, जो दर्शाता है कि प्रोटीन प्रकृति में थर्मोस्टेबल है क्योंकि एलिफैटिक सूचकांक को गोलाकार प्रोटीन की थर्मोस्टैबिलिटी में वृद्धि में योगदान देने वाला एक सकारात्मक कारक माना जा सकता है। अस्थिरता सूचकांक की गणना 47.10 पर की गई। वैक्सीन निर्माण के अनुमानित ग्रैंड एवरेज ऑफ हाइड्रोपैथी (ग्रेवी) मूल्य का अनुमान −0.140 था; नकारात्मक मान इसे प्रकृति में हाइड्रोफिलिक के रूप में परिभाषित करता है और पानी के अणुओं के साथ बातचीत करेगा [28, 70-72]। निष्कर्ष निकालने के लिए, इम्यूनोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण ने डिज़ाइन किए गए पेप्टाइड निर्माण को एंटीजेनिक, थर्मोस्टेबल, स्तनधारी कोशिकाओं में स्थायी और हाइड्रोफिलिक के रूप में भविष्यवाणी की। ये सभी कारक संभावित वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में निर्माण की प्रभावशीलता को प्रभावित करते हैं।

माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी

पीएसआईपीआरईडी सर्वर द्वारा 592 अवशेष लंबे काइमेरिक पेप्टाइड के लिए द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी से 45.77% अल्फा हेलिक्स, 4.89% बीटा-शीट और 49.32% कॉइल्स की उपस्थिति का पता चलता है, जैसा कि निम्नलिखित चित्र 3 में दर्शाया गया है। इसके अलावा, रैप्टरएक्स संरचना भविष्यवाणी सर्वर ने पेप्टाइड के लिए प्रासंगिक विलायक पहुंच का विश्लेषण किया जिसमें 36% अवशेषों के उजागर होने की भविष्यवाणी की गई, 28% को मध्यम दफन के रूप में भविष्यवाणी की गई, और 35% अवशेषों को दफन के रूप में भविष्यवाणी की गई, यह दर्शाता है कि प्रोटीन का समग्र रूप से निष्पक्ष संपर्क होगा पानी (विलायक) के साथ. रैप्टरएक्स सर्वर द्वारा प्रोटीन के अव्यवस्थित डोमेन में केवल 32 अवशेष (पेप्टाइड का 5%) होने की भविष्यवाणी की गई थी।

तृतीयक संरचना भविष्यवाणी

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 सही तह वाले मॉडल को इंगित करता है। टीएम स्कोर समान एससीओपी/सीएटीएच फोल्ड परिवार [47] में अन्य समान प्रोटीन के साथ अनुमानित मॉडल की संरचनात्मक समानता को मापने के लिए एक अनुक्रम-लंबाई स्वतंत्र पैरामीटर है।

तालिका 4 एंटीजेनसिटी परिणाम ANTIGENpro सर्वर और Vaxijen2 से गणना की गई। एंटीजन के साथ और बिना एंटीजन सर्वर।

चित्र 3 PSIPRED सर्वर द्वारा रैखिक वैक्सीन अनुक्रम की माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी

चित्र 4 तृतीयक संरचना भविष्यवाणी और परिशोधन 3- I-TASSER सर्वर द्वारा भविष्यवाणी के अनुसार वैक्सीन संरचना का डी मॉडलिंग। b GalaxyRefne सर्वर द्वारा क्रूड 3-D मॉडल का शोधन

वैक्सीन 3‑डी मॉडल का शोधन और सत्यापन

पेप्टाइड वैक्सीन के लिए "क्रूड" तृतीयक मॉडल को GalaxyReone सर्वर के माध्यम से संसाधित करके उप-क्रमिक रूप से परिष्कृत किया गया था। GalaxyRefne से पांच मॉडल प्राप्त हुए, जिनमें से GDT-HA (0.8826) जैसे संबंधित मापदंडों के मूल्यांकन और तुलना के बाद मॉडल 1 को सबसे अच्छा पाया गया; आरएमएसडी (0.608); मोलप्रोबिटी (2.398); क्लैश स्कोर (21.1); ख़राब रोटामर्स (0.6); और बाकी मॉडलों के साथ राम-अनुकूल क्षेत्र (88.8) (चित्र 4बी)। मोलप्रोबिटी सर्वर द्वारा उत्पन्न रामचंद्रन प्लॉट से पता चला कि परिष्कृत 3-डी मॉडल में पसंदीदा क्षेत्र में 88.8% अवशेष, अनुमत क्षेत्र में 98.6% अवशेष, और केवल 0.013% आउटलेयर हैं। इसके विपरीत, प्रारंभिक क्रूड मॉडल में पसंदीदा, स्वीकृत और बाहरी क्षेत्रों में क्रमशः 77.1%, 94.2% और 0.057% अवशेष पाए गए। इन परिणामों से स्पष्ट रूप से निष्कर्ष निकलता है कि परिष्कृत तृतीयक मॉडल की गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है। परिष्कृत मॉडल के अतिरिक्त सत्यापन के लिए ERRATA सर्वर का भी उपयोग किया गया। ERRATA सर्वर ने 43.542 के समग्र गुणवत्ता कारक के साथ मॉडल का विश्लेषण किया, जो वास्तव में इनपुट प्रोटीन मॉडल के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है जो 95% अस्वीकृति सीमा से नीचे आता है। इस प्रकार, हमने वैक्सीन निर्माण के लिए एक सराहनीय रूप से परिष्कृत और मान्य तृतीयक संरचना सफलतापूर्वक प्राप्त की। मोलप्रोबिटी सर्वर और ईआरआरएटी सर्वर से प्राप्त प्लॉट के साथ वैक्सीन की परिष्कृत तृतीयक संरचना को चित्र 5 में दर्शाया गया है। प्रोएसए वेब सर्वर ने −1.08 (पूरक छवि एम 2) का जेड स्कोर दिखाया था, जिसमें नकारात्मक मान इंगित करता है कि मॉडल तुलनीय आकार वाले समान प्रोटीन के स्कोर की सीमा से बाहर है जिनकी संरचना एक्स-रे विवर्तन या एनएमआर [51] द्वारा निर्धारित की गई थी।

वैक्सीन पेप्टाइड की डाइसल्फ़ाइड इंजीनियरिंग

डिज़ाइन 2.12 सर्वर द्वारा डाइसल्फ़ाइड ने अमीनो एसिड अवशेषों के 45 जोड़े लौटाए जो डाइसल्फ़ाइड बांड गठन के लिए संभावित साइट हैं। हमने चार सबसे महत्वपूर्ण उम्मीदवार अवशेष जोड़े की पहचान की है जो उनकी उच्च बंधन ऊर्जा और ची 3 मूल्यों (पूरक तालिका एस 7) के आधार पर वैक्सीन प्रोटीन के लचीले लूप क्षेत्र में स्थित हो सकते हैं। ये अवशेष, THR{{5}PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3) :+121.54), और TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), को अंतिम वैक्सीन प्रोटीन के परिष्कृत तृतीयक मॉडल में सिस्टीन से प्रतिस्थापित किया गया, जिससे थर्मल स्थिरता में सुधार हुआ पेप्टाइड का (चित्र 6)। हालाँकि बी कारक की सटीकता प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में अणुओं की तापीय गति द्वारा न्यूट्रॉन प्रकीर्णन या एक्स-रे के क्षीणन तक सीमित है। इस प्रकार, हमने इस कंप्यूटर-सहायता प्राप्त परिष्कृत वैक्सीन मॉडल [73, 74] के लिए बी कारक पर उच्च बांड ऊर्जा और ची 3 मूल्यों का सख्ती से चयन किया।

टीएलआर के साथ वैक्सीन पेप्टाइड की डॉकिंग इंटरैक्शन का विश्लेषण

प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स (मानव टीएलआर (मानव टीएलआर, 4, 5, 8 और माउस टीएलआर) के साथ काइमेरिक पेप्टाइड की बातचीत का अध्ययन पैचडॉक सर्वर का उपयोग करके डॉकिंग विश्लेषण करके किया गया था, जिसमें बाइंडिंग थी। विभिन्न टीएलआर (रिसेप्टर्स) के साथ वैक्सीन (लिगैंड) की समानता का मूल्यांकन किया गया। प्रत्येक डॉकिंग के लिए पैचडॉक द्वारा तैयार किए गए शीर्ष दस मॉडलों पर विचार किया गया, जिनमें से प्रत्येक मामले के लिए उच्चतम डॉकिंग स्कोर वाले सर्वश्रेष्ठ रैंकिंग वाले मॉडल का चयन किया गया। स्कोर रिसेप्टर्स और लिगेंड के बीच आकार और इलेक्ट्रोस्टैटिक पूरक दान का प्रतिनिधित्व करते हैं। सबसे अच्छी संपूरकता मानव टीएलआर {{6 }} (पीडीबी आईडी: 6 एनआईजी) के मामले में पाई गई, जिसका स्कोर 18,714, सतह क्षेत्र 3963.1 {{41 }}, और परमाणु संपर्क ऊर्जा (एसीई) 217.99 (चित्र 7ए) है। . वैक्सीन ने 18,258 के डॉकिंग स्कोर के साथ टीएलआर -5 (पीडीबी आईडी: 3 जे 0 ए) और टीएलआर -9 (पीडीबी आईडी: 3 डब्ल्यूपीएफ) के साथ कुशल बाइंडिंग भी प्रदर्शित की; सतह क्षेत्र 2879.80 और एसीई-666.94 और डॉकिंग स्कोर 18,164; और सतह क्षेत्र क्रमशः 4090.70 और एसीई 495.74 है। अन्य टीएलआर के साथ डॉकिंग ने कमजोर बाइंडिंग समानताएं दिखाईं, जैसा कि पैचडॉक द्वारा उत्पन्न कम डॉकिंग स्कोर से परिलक्षित होता है, टीएलआर के लिए 16,708 (पीडीबी आईडी: 4जी8ए), और टीएलआर के लिए 17,800 (पीडीबी आईडी: 4क्यूसी0)। इस प्रकार, हमारा टीका निर्माण अलग-अलग बंधन समानता वाले विभिन्न प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स के साथ जुड़ने में सक्षम था। लीशमैनिया संक्रमण को रोकने के लिए उचित और उन्नत प्रतिरक्षा उत्पन्न करने के संदर्भ में एक प्रभावी टीके के लिए यह अत्यधिक वांछनीय होगा। इसके अलावा, फायरडॉक वेब टूल को सर्वोत्तम कॉम्प्लेक्स (टीएलआर {{42 }} वैक्सीन कॉम्प्लेक्स) के शोधन और पुनर्स्कोरिंग के लिए नियोजित किया गया था, जिसने न्यूनतम वैश्विक ऊर्जा -19.01, वैन डेर वाल्स एसोसिएशन (-25.74), परमाणु संपर्क के साथ इसे परिष्कृत किया। ऊर्जा (−0.03), और बंधन मुक्त ऊर्जा (−24.26)। ये परिणाम इस तथ्य की पुष्टि करते हैं कि वैक्सीन पेप्टाइड मानव टीएलआर के साथ सबसे अधिक कुशलता से संपर्क करता है और इस प्रकार, एक यथोचित स्थिर कॉम्प्लेक्स बनाता है जो लीशमैनिया परजीवियों के खिलाफ एक उल्लेखनीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है। इसके अलावा, हम टीएलआर-2 और वैक्सीन के बीच डॉकिंग की भी जांच करते हैं; क्लसप्रो वेब सर्वर का उपयोग करते हुए, शीर्ष मॉडल (छवि 7 बी) को 5 डी रोटेशनल एफएफटी और सीएपीआरआई (अनुमानित इंटरैक्शन का महत्वपूर्ण मूल्यांकन) के आधार पर संतुलित भारित स्कोर -1192.5 के साथ 42 सदस्यों के सबसे बड़े क्लस्टर आकार के साथ चुना जाता है। तालिका 5 में चित्र 7बी से 10 परस्पर क्रिया करने वाले अमीनो एसिड अवशेषों की एक सूची है जो एक स्थिर रिसेप्टर-लिगैंड कॉम्प्लेक्स बनाते हैं।

चित्र 5 GalaxyRefne मॉडल के लिए एक रामचन्द्रन प्लॉट। b ERRAT सर्वर ने प्रोटीन संरचना के गुणवत्ता मूल्यांकन की भविष्यवाणी की

चित्र 6 डिजाइन 2 के अनुसार डाइसल्फ़ाइड। अंतिम वैक्सीन निर्माण की थर्मल स्थिरता में सुधार के लिए चार (तीर द्वारा चिह्नित) संभावित डाइसल्फ़ाइड बांड संरचनाओं की भविष्यवाणी की गई है।

वैक्सीन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोडन अनुकूलन और सिलिको क्लोनिंग में

कोडन पूर्वाग्रह की समस्या को दूर करने के प्रयास में, कोडन अनुकूलन के लिए जेसीएटी उपकरण का उपयोग किया गया था, जो 1 के अनुकूलित सीएआई मान के साथ रिवर्स अनुवादित सीडीएनए अनुक्रम के रूप में वैक्सीन पेप्टाइड के इनपुट अमीनो एसिड अनुक्रम को लौटाता था। यह मान निहित है स्वीकृत CAI मान सीमा 0.8–1.0 के भीतर [28], जो मेजबान जीव, ई. कोली K12 में जीन की अभिव्यक्ति की उच्च दर सुनिश्चित करता है। सीएआई का मूल्य जितना अधिक होगा, विदेशी जीन की अभिव्यक्ति दर उतनी ही बेहतर होगी। इसके अलावा, बेहतर अनुक्रम की जीसी सामग्री 51.85% पाई गई, जो एक अच्छे कोडन अनुकूलन का संकेत देती है। बेहतर जीन अभिव्यक्ति के लिए, 35-70% जीसी सामग्री की आवश्यकता होती है [63]। एंजाइम XhoI और NdeI के लिए प्रतिबंध साइटें अनुक्रम के 5/ और 3/ सिरों पर बनाई गईं, इसके बाद संशोधित अनुक्रम को pET28 a(+) वेक्टर में डाला गया। लाल रंग में दर्शाया गया क्लोन इंसर्ट, वेक्टर में निर्दिष्ट प्रतिबंध साइटों के बीच स्थित है। पुनः संयोजक वैक्सीन प्रोटीन के उत्पादन के बाद शुद्धिकरण प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए क्लोन अनुक्रम के दोनों सिरों पर छह हिस्टिडीन अवशेषों का एक खंड भी स्थित है [6, 31]। सम्मिलित जीन टुकड़े के साथ अंतिम प्लास्मिड वेक्टर निर्माण का आकार लगभग 7 केबी (चित्र 8) था। एमफोल्ड वेब सर्वर ने एमआरएनए की कुल पचास फोल्डिंग अनुरूपताओं की भविष्यवाणी की, जिनमें से शीर्ष संरचना को उसके सबसे कम ऊर्जा स्कोर (ΔG= −492.50) के कारण चुना गया था। अनुमान लगाया गया था कि इस विशेष रूप से मुड़ी हुई संरचना में एक बाहरी लूप और न्यूनतम मुक्त ऊर्जा वाले चार स्टैक शामिल होंगे जो संरचना की स्थिरता का संकेत देते हैं। लूप का निर्माण 21 एकल-फंसे हुए आधारों और दो समापन हेलिकॉप्टरों के साथ किया गया था। एनर्जी डॉट प्लॉट ने इष्टतम ऊर्जा (δG) की गणना 494.4 kcal/mol की की। फ़ील्ड में अलग-अलग रंग के बिंदु सर्वर द्वारा गणना किए गए δG पर विचार करते हुए mRNA में मौजूद एक विशेष आधार जोड़ी के विभिन्न ऊर्जा ग्रेड को संदर्भित करते हैं [64]। कथानक के अनुसार, अधिकांश आधार युग्मों की मुक्त ऊर्जाएँ -487.5 के भीतर हैं<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

तालिका 5 PyMOL ने चित्र 7बी से रिसेप्टर और लिगैंड के दस इंटरैक्टिंग अमीनो एसिड अवशेष उत्पन्न किए, और () में संख्या रिसेप्टर और लिगैंड में अमीनो एसिड की संबंधित स्थिति को इंगित करती है।

प्रतिरक्षा अनुकरण

सी-इमसिम वेब सर्वर का उपयोग करके सिलिको प्रतिरक्षा सिमुलेशन में इंजेक्शन की प्रारंभिक खुराक के 2 दिनों के भीतर एंटीजेनिक गिनती 6.9× 1 0 5 /एमएल तक पहुंचने की भविष्यवाणी की गई, और चौथे दिन एंटीजन स्तर 0 तक गिर गया। एंटीजन गिनती में यह वृद्धि प्रारंभिक संक्रमण अवधि के दौरान अकेले आईजीएम आईजीजी स्तर और आईजीएम स्तर दोनों की एकाग्रता में उल्लेखनीय वृद्धि और एक मनमाने पैमाने पर संक्रमण चक्र के लगभग 12 दिनों के भीतर चरम स्तर तक पहुंचने के साथ संबंधित है। आईजीजी के अन्य उपप्रकार 1+ द्वितीयक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप आईजीजी2 स्तर और आईजीजी1 में स्पष्ट रूप से वृद्धि होती है (चित्र 9ए)। साइटोकाइन प्रोफाइल में इंफ्लेमेटरी मध्यस्थों जैसे कि आईएनएफ- 12वें दिन 4×106 एनजी/एमएल तक के स्तर तक पहुंच जाता है, जबकि अन्य साइटोकिन का स्तर काफी कम रहता है (चित्र 9बी)। सक्रिय और आराम करने वाले साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइटों की उपस्थिति से सुझाई गई कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाएं प्रारंभिक इंजेक्शन के 2-3 दिनों के बाद बढ़ जाती हैं, और प्रोलिफ़ेरेटिव मेमोरी हेल्पर टी सेल की उपस्थिति भी प्रमुख थी (चित्र 9सी और डी)। प्राथमिक खुराक के प्रशासन के 1 सप्ताह के बाद मेमोरी बी कोशिकाओं के निर्माण के साथ-साथ 2-3 दिनों के भीतर कुल बी सेल की आबादी भी बढ़ जाती है (चित्र 9ई)।

चित्र 8 लीशमैनिया वैक्सीन अभिव्यक्ति प्रणाली pET28 a(+) वेक्टर का उपयोग करते हुए, लाल क्षेत्र NdeI और XhoI प्रतिबंध साइटों से घिरे वैक्सीन के सम्मिलित न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम को इंगित करता है

आणविक गतिशील सिमुलेशन की व्याख्या

टीएलआर 2- वैक्सीन कॉम्प्लेक्स द्वारा प्राप्त सर्वोत्तम डॉकिंग स्कोर का एनएमए-सहायता प्राप्त आणविक गतिशील सिमुलेशन द्वारा आगे विश्लेषण किया गया था। मुख्य श्रृंखला की विकृति को उच्च टिकाओं (छवि 10 ए) द्वारा दर्शाया गया है, जिसका अर्थ है उच्च विकृति। बी फैक्टर (छवि 10 बी) की गणना एनएमए द्वारा की गई थी, जो परमाणु विस्थापन मापदंडों के आधार पर प्रोटीन लचीलेपन को दर्शाता है [73]। आइगेनवैल्यू (चित्र 10सी) संरचना को विकृत करने के लिए आवश्यक ऊर्जा के बारे में बताता है। टीएलआर-2 वैक्सीन कॉम्प्लेक्स लगभग 7.778× 10−7 का स्वदेशी मान दिखाता है। प्रसरण (चित्र 10d) eigenvalue से विपरीत रूप से संबंधित है। सहप्रसरण मैट्रिक्स (चित्र 10ई) दर्शाता है कि क्या अवशेषों के जोड़े सहसंबद्ध (लाल), असंबद्ध (सफेद), या विरोधी सहसंबद्ध (नीला) हैं। इलास्टिक नेटवर्क मॉडल (छवि 10 एफ) संबंधित परमाणु जोड़े के बीच स्प्रिंग्स की गणना करता है, ग्राफ़ में डॉट्स को रंग ढाल द्वारा दर्शाया जाता है जो स्प्रिंग की कठोरता या लचीलेपन को दर्शाता है, और गहरा रंग कठोर स्प्रिंग को दर्शाता है। इस प्रकार, आणविक गतिशील सिमुलेशन के परिणामों ने सुझाव दिया कि हमारा प्रस्तावित पेप्टाइड टीका स्थिर है।

बहस

लीशमैनियासिस को सबसे अधिक उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोगों में से एक माना जाता है जो मुख्य रूप से भारत सहित विकासशील देशों के गरीबी-ग्रस्त क्षेत्रों में रहने वाले लोगों को प्रभावित करता है [2]। डब्ल्यूएचओ की रिपोर्ट के अनुसार भारत इस बीमारी के दोनों रूपों, सीएल और वीएल के लिए स्थानिक है। एल. ट्रोपिका और एल. मेजर के कारण होने वाला सीएल भारत के उत्तर-पश्चिमी राज्यों, पंजाब और राजस्थान में होता है, जो इसका केंद्र बिंदु है (https://www.who.int/leishmaniasis/burden/Leishmaniasis_India/en/ ). इसके अलावा, दुनिया भर में मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) महामारी की बढ़ती घटना के साथ, लीशमैनियासिस एड्स रोगियों में एक अवसरवादी रोगज़नक़ के रूप में उभरा है जिससे स्थिति और भी भयानक हो गई है [22, 38]। वर्तमान अध्ययन में, हमारा लक्ष्य लीशमैनियासिस के लिए एक नया पॉलीवैलेंट सामान्य टीका डिजाइन करना है जो सामान्य रोगजनक परजीवी प्रजातियों से विषम सुरक्षा प्रदान कर सके। हमने बारह लीशमैनिया-विशिष्ट प्रोटीनों का चयन किया जिसमें परजीवी के पांच रोगजनक उपभेद शामिल हैं जो मनुष्यों में वीएल और सीएल संक्रमण का कारण बनते हैं। इन प्रोटीनों का पहले से ही विभिन्न प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में विषाणु और प्रतिरक्षाजन्यता में उनकी भूमिका और वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में उनकी क्षमता का मूल्यांकन किया जा चुका है [1, 8-10, 75]। इसलिए, लीशमैनिया की विभिन्न रोगजनक प्रजातियों से ऐसे अच्छी तरह से विशेषता वाले और अत्यधिक संरक्षित इम्युनोजेनिक प्रोटीन को शामिल करके सिलिको में डिज़ाइन किया गया एक टीका मानव लीशमैनियासिस (मुख्य रूप से वीएल और सीएल) के सभी रूपों के खिलाफ क्रॉस-प्रतिरक्षा प्रदान कर सकता है और इसलिए, इसका उपयोग किया जा सकता है। मनुष्यों में लीशमैनिया संक्रमण को रोकने के लिए एक सामान्य टीकाकरण कार्यक्रम। चयनित प्रोटीनों की मुख्य रूप से संभावित सीटीएल और एचटीएल एपिटोप्स की उपस्थिति के लिए जांच की गई। टी सेल एपिटोप्स का पता लगाना महत्वपूर्ण है क्योंकि टी कोशिकाएं केवल तभी एंटीजन को पहचान सकती हैं जब उन्हें अंतर्जात या बहिर्जात मार्ग से संसाधित किया जाता है, एमएचसी वर्ग I या एमएचसी वर्ग II अणुओं के साथ जटिल किया जाता है, और बाद में एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं द्वारा टी सेल रिसेप्टर्स को प्रस्तुत किया जाता है ( एपीसी)। एमएचसी-I, सीडी8+सीटीएल के लिए विशिष्ट है, जबकि एमएचसी-II विशेष रूप से सीडी4+एचटीएल रिसेप्टर्स से जुड़ता है। दो स्वतंत्र सर्वरों को एक साथ नियोजित करके सीटीएल एपिटोप्स की पहचान सख्ती से की गई। दोनों सर्वरों द्वारा काफी अधिक एमएचसी-बाध्यकारी समानता वाले केवल उन एपिटोप्स की भविष्यवाणी की गई थी जिन्हें अंततः वैक्सीन पेप्टाइड में शामिल किया गया था। तीन वेब सर्वरों का उपयोग करके पहचाने गए एचटीएल एपिटोप्स का उनकी साइटोकिन-उत्प्रेरण क्षमताओं के लिए आगे मूल्यांकन किया गया। जो साइटोकिन्स की एक विस्तृत विविधता के उत्पादन को प्रोत्साहित कर सकते हैं, जैसे कि, आईएफएन-, आईएल {{2 0}}, और आईएल -10, उन्हें यह सुनिश्चित करने के लिए काइमेरिक पेप्टाइड वैक्सीन को डिजाइन करने के लिए चुना गया था। यह मेजबान में इन सभी परजीवी-विशिष्ट साइटोकिन्स के उत्पादन को प्रेरित करेगा। यह अत्यंत महत्वपूर्ण है क्योंकि केडज़िएर्स्की और सहकर्मियों ने प्रस्तावित किया था कि आईएल का स्राव आईएफएन के स्राव जितना ही महत्वपूर्ण है - यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक टीका एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है और यदि आईएल नहीं है तो उचित प्रतिरक्षा प्रेरित नहीं होती है। -10 स्तर आनुपातिक रूप से ऊंचे नहीं हैं [8, 75]। काइमेरिक पेप्टाइड के निर्माण के लिए एएवाई और जीपीजीपीजी लिंकर्स का उपयोग करके विशिष्ट सीटीएल और एचटीएल एपिटोप्स को जोड़ा गया। एएवाई और जीपीजीपीजी लिंकर्स को पहले मल्टी-एपिटोप वैक्सीन डिजाइन के लिए उपयोगी बताया गया है क्योंकि वे न्यूनतम जंक्शन इम्यूनोजेनेसिटी की अनुमति देते हैं और एमएचसी-द्वितीय [6, 28, 71] द्वारा चयनित एपिटोप्स के प्रसंस्करण और प्रस्तुति की सुविधा प्रदान करते हैं। मानव आईएल की सहायक अल्फा श्रृंखला EAAK लिंकर के माध्यम से परिणामी पेप्टाइड के एन टर्मिनल से जुड़ी हुई थी। आईएल -12 को एक सहायक के रूप में चुना गया था क्योंकि यह पशु मॉडल में लीशमैनिया वैक्सीन के लिए सबसे प्रभावी सहायक में से एक है, जैसा कि पिछले इम्यूनोजेनिक अध्ययनों में प्रलेखित किया गया है [3, 37, 71]। चूंकि टीका मानव प्रशासन के लिए है, इसलिए किसी सिंथेटिक टीएलआर एगोनिस्ट के बजाय प्राकृतिक सहायक के रूप में मानव आईएल को शामिल करने से प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा किए बिना प्रतिरक्षा को बढ़ावा मिलने की उम्मीद है। प्रोटीन और पॉलीसेकेराइड वैक्सीन एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने और पर्याप्त स्थानीय सूजन को प्रेरित करने में इसकी क्षमता के कारण टीकों के लिए एक सामान्य सहायक के रूप में आईएल की भूमिका को भी रेखांकित किया गया है, जिससे आईजीजी उत्सर्जन की अनुमति मिलती है जिससे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ जाती है [72]। ईएएके लिंकर को अभिव्यक्ति की उच्च दर प्राप्त करने और वैक्सीन डोमेन के बीच बातचीत को प्रतिबंधित करके संलयन पेप्टाइड के जैविक कार्य को बढ़ावा देने के लिए जोड़ा गया था [76, 77]। इम्यूनोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण से पता चला है कि हमारे वैक्सीन निर्माण में कई रैखिक बी सेल एपिटोप्स हैं जो इम्यूनोप्रोफिलैक्टिक उपयोग के लिए बनाई गई वैक्सीन के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं। फिर, हमने अधिक सटीक भविष्यवाणियों के लिए दो अलग-अलग टूल का उपयोग किया। दोनों सर्वरों ने वैक्सीन अनुक्रम में पर्याप्त बी सेल एपिटोप्स की भविष्यवाणी की। अनुमान लगाया गया था कि डिज़ाइन किया गया टीका गैर-एलर्जेन, गैर-विषाक्त और उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त रूप से प्रतिरक्षात्मक होगा। इसके बाद के भौतिक-रासायनिक विश्लेषण से पता चला कि वैक्सीन पेप्टाइड थोड़ा अम्लीय (पीआई 5.98) है और इसमें एलिफैटिक इंडेक्स (78.34) काफी अधिक है, जो इसकी थर्मोस्टेबल प्रकृति का सुझाव देता है। एक नकारात्मक ग्रेवी मान (−0.14) इंगित करता है कि पेप्टाइड हाइड्रोफिलिक है, जो वैक्सीन के रूप में इसकी क्षमता में योगदान देता है। वैक्सीन के द्वितीयक संरचनात्मक तत्व PSIPRED v 4.0 सर्वर द्वारा निर्धारित किए गए थे, जो प्रोटीन द्वितीयक संरचना भविष्यवाणी के लिए सबसे सटीक और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले कम्प्यूटेशनल तरीकों में से एक है। इसके अलावा, डिज़ाइन किए गए पेप्टाइड के लिए 3डी संरचना की भविष्यवाणी I-TASSER सर्वर का उपयोग करके भी की गई थी, जो प्रोटीन के महत्वपूर्ण अवशेषों के निर्देशांक के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करती है, जो कि टीके की गतिशीलता, जैव सक्रियता और अंतःक्रिया का अध्ययन करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। अन्य लिगेंड्स के साथ. अनुमानित मॉडल की साइड चेन या रीढ़ की हड्डी में संभावित त्रुटियों का पता लगाने और उन्हें सुधारने के लिए प्रोटीन संरचना सत्यापन उपकरणों का उपयोग करके प्रारंभिक तृतीयक संरचना को परिष्कृत और मान्य किया गया था। रामचंद्रन प्लॉट विश्लेषण से पता चला कि परिष्कृत मॉडल के 90% से अधिक अवशेष आउटलेर्स के एक छोटे प्रतिशत के साथ अनुमत क्षेत्र के भीतर आते हैं, जबकि ईआरआरएटी सर्वर ने 43.542 का गुणवत्ता कारक दिखाया जो सभी संतोषजनक मॉडल गुणवत्ता के संकेत हैं। एलीप्रो सर्वर द्वारा मान्य 3डी मॉडल में पर्याप्त संख्या में कंफर्मेशनल बी सेल एपिटोप्स पाए गए, जिससे पता चलता है कि यह एक वांछनीय बी सेल प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है और मेजबान में विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन को उत्तेजित कर सकता है। बी सेल सक्रियण प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति में भी महत्वपूर्ण है और टीका लगाए गए व्यक्तियों में लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा के लिए जिम्मेदार है। डॉकिंग विश्लेषण करके प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स (टीएलआर) के साथ वैक्सीन की बातचीत का भी मूल्यांकन किया गया था। वैक्सीन पेप्टाइड में टीएलआर के लिए सबसे अधिक आकर्षण पाया गया, इसके बाद टीएलआर के लिए सबसे अधिक आकर्षण था, हालांकि यह कुछ हद तक अन्य टीएलआर के साथ बंधने में सक्षम था। सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्राप्त करने के लिए टीएलआर के साथ बातचीत आवश्यक है क्योंकि पशु मॉडल से जुड़े पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लीशमैनिया की विभिन्न प्रजातियां या उनके एंटीजेनिक घटक विभिन्न टीएलआर के साथ बातचीत करते हैं जिससे चुनौतीपूर्ण मेजबानों में तीव्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। ई. कोली (K12) होस्ट सिस्टम में पुनः संयोजक वैक्सीन प्रोटीन की संतोषजनक अभिव्यक्ति की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, JCat टूल को लागू करके कोडन अनुकूलन किया गया था जिसने अनुक्रम की CAI और GC सामग्री को समायोजित किया, जिससे यह अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त हो गया। ई कोलाई। सिलिको में पुनः संयोजक वैक्सीन प्रोटीन के बढ़े हुए उत्पादन को प्राप्त करने के लिए क्लोनिंग और ओवरएक्सप्रेशन के अनुक्रम की व्यवहार्यता दिखाने के लिए प्लास्मिड-आधारित अभिव्यक्ति वेक्टर pET28a (+) का उपयोग करके क्लोनिंग भी की गई थी। काइमेरिक जीन अनुक्रम द्वारा एन्कोड किए गए एमआरएनए की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी एमआरएनए की मुड़ी हुई संरचना की स्थिरता को दिखाने के लिए की गई थी जो बैक्टीरिया होस्ट में कुशल अनुवाद प्रक्रिया को प्रभावित करेगी। वैक्सीन प्रोटीन में नवीन डाइसल्फ़ाइड लिंकेज जोड़कर स्थिर उत्परिवर्तन बनाए गए क्योंकि यह मूल प्रोटीन की ताकत में योगदान देगा, जिससे यह अतिरिक्त जैव रासायनिक, प्रतिरक्षाविज्ञानी और जैव प्रौद्योगिकी अन्वेषण के लिए उपयुक्त हो जाएगा।

चित्र 9 सी-इमसिम सर्वर-आधारित प्रतिरक्षा सिमुलेशन। ए कुल एंटीजन और संबंधित एंटीबॉडी पीढ़ी, बी साइटोकिन उत्पादन प्रोफ़ाइल, सहायक टी सेल की सी और डी पीढ़ी और कुल (सक्रिय और आराम करने वाली) साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट गिनती, ई टीका प्रशासन के बाद बी सेल प्रतिक्रिया

चित्र 10 आणविक गतिशील अनुकरण। ए टिकाओं द्वारा इंगित मुख्य श्रृंखला विकृति, बी एनएमए ने प्रोटीन स्थिरता दिखाने वाला बी कारक उत्पन्न किया, सी डॉकिंग कॉम्प्लेक्स की संरचना को विकृत करने के लिए ईजेनवैल्यू, डी संरचना के विचरण और संचयी (हरा) का व्यक्तिगत (बैंगनी)%, ई सहप्रसरण मैट्रिक्स सहसंबद्ध (लाल), परमाणुओं के जोड़े के बीच असंबद्ध (सफ़ेद) या विरोधी-सहसंबद्ध (नीला), एफ लोचदार नेटवर्क मॉडल परमाणु के जोड़े के बीच जुड़े स्प्रिंग्स दिखा रहा है, गहरे भूरे रंग ने कठोर स्प्रिंग्स का संकेत दिया और इसके विपरीत

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निष्कर्ष

वर्तमान कार्य में, हमने मानव लीशमैनियासिस (आंत और त्वचीय दोनों) के खिलाफ एक पॉलीवैलेंट मल्टी-सबयूनिट पेप्टाइड वैक्सीन के सिलिको डिजाइनिंग के लिए एक रिवर्स वैक्सीनोलॉजी दृष्टिकोण का उपयोग किया है जो मनुष्यों को संक्रमित करने वाले सामान्य लीशमैनिया परजीवियों से विषम सुरक्षा प्रदान करने में सक्षम हो सकता है और, इस प्रकार, इसे प्रकृति में व्यापक-स्पेक्ट्रम माना जा सकता है। इसका उपयोग वर्तमान में उपलब्ध कीमोथेराप्यूटिक एजेंटों के साथ एक पूरक रणनीति के रूप में बीमारी को नियंत्रित करने और खत्म करने के लिए सामान्य टीकाकरण कार्यक्रम के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हमने किसी भी गैर-मानवीकृत सिंथेटिक पेप्टाइड के बजाय प्राकृतिक सहायक के रूप में आईएल -12 का उपयोग किया है। सहायक के रूप में आईएल का उपयोग करने से मेजबान शरीर में कोई प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा किए बिना टीके की प्रतिरक्षा क्षमता में वृद्धि होगी। बशर्ते कि वैक्सीन पेप्टाइड रोगजनक लीशमैनिया की पांच प्रजातियों से प्राप्त विभिन्न प्रकार के अत्यधिक संरक्षित और संभावित इम्युनोजेनिक पेप्टाइड्स से बना हो, यह टीका लगाए गए व्यक्तियों में क्रॉस-प्रतिरक्षा प्राप्त करने में सहायक है, इस प्रकार चिकित्सीय और रोगनिरोधी लाभ भी हैं। कई कम्प्यूटेशनल उपकरणों का उपयोग करते हुए विभिन्न कड़े इम्यूनोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषणों ने प्रस्तावित वैक्सीन को एक पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में इम्यूनोजेनिक, स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मानव परीक्षणों के लिए सुरक्षित पाया है। बहरहाल, सुरक्षात्मक और लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा की उचित प्राप्ति की गारंटी और विषाक्तता को दूर करने के लिए प्रयोगात्मक सत्यापन किया जाना बाकी है।

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