आरपीटीईसी/टीईआरटी1 मानव वृक्क कोशिका मॉडल का उपयोग करते हुए पी-जीपी-मध्यस्थ दवा-औषधि अंतःक्रियाओं के विट्रो मूल्यांकन में

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परिचय पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) निरोधात्मक क्षमता का इन विट्रो मूल्यांकन दवा विकास प्रक्रिया के दौरान एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, क्योंकि यह चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक दवा-दवा अंतःक्रियाओं (डीडीआई) [1-3] की भविष्यवाणी की अनुमति देता है। पी-जीपी एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर सुपरफैमिली से संबंधित है और मल्टीड्रग रेजिस्टेंस जीन एमडीआर1 (जिसे एबीसीबी1 भी कहा जाता है) द्वारा एन्कोड किया गया है। इस झिल्ली ट्रांसपोर्टर को ट्यूमर कोशिकाओं में अतिप्रवाहित होने और कई कैंसर विरोधी दवाओं [4] के प्रतिरोध के कारण जाना जाता है। आंत, यकृत, और सहित सभी शारीरिक बाधाओं के भीतर स्थित हैगुर्देपी-जीपी पाचन तंत्र से इन सबस्ट्रेट्स के अवशोषण को सीमित करके और पित्त और मूत्र में उनके उत्सर्जन को सुगम बनाकर ज़ेनोबायोटिक्स से बचाता है। इस प्रकार, पी-जीपी विभिन्न चिकित्सीय वर्गों [5–7] के फार्माकोकाइनेटिक्स में एक उल्लेखनीय भूमिका निभाता है। ढेर सारी दवाएं जैसे कि कैंसर रोधी एजेंट, एंटीफंगल, और कार्डियोवैस्कुलर दवाएं पी-जीपी सबस्ट्रेट्स और/या इनहिबिटर के रूप में जानी जाती हैं, और उनमें से कई चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बातचीत में शामिल हैं [8-10]। इसलिए, यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) का आदेश है कि पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता का मूल्यांकन दवा के विकास के शुरुआती चरणों के दौरान किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए किए गए इन विट्रो परख आमतौर पर पी-जीपी-व्यक्त सेल लाइनों का उपयोग करके दवा परिवहन अध्ययन पर आधारित होते हैं। अधिक सटीक रूप से, एफडीए दिशानिर्देश पी-जीपी अवरोध के परिणामस्वरूप नैदानिक ​​डीडीआई के जोखिम का आकलन करने के लिए इन विट्रो हाफमैक्सिमल इनहिबिटरी कंसंट्रेशन (आईसी50) मूल्यों के निर्धारण की सलाह देते हैं। यह अंत करने के लिए, कई प्रयोगात्मक परीक्षण किए गए हैं, और उनमें से अधिकांश ने Caco-2 या MDCK-MDR1 मॉडल [11–13] का उपयोग करके आंतों के अवशोषण से संबंधित दवाओं के अंतःक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है।

किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टांचे

तब सेगुर्देदवाओं के विभिन्न वर्गों के लिए उन्मूलन भी एक सामान्य उन्मूलन मार्ग है, एबीसी ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से सक्रिय ट्यूबलर स्राव भी इन इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है [14]। हालांकि, इन विट्रो डेटा परगुर्देपी-जीपी द्वारा मध्यस्थता वाले डीडीआई सीमित हैं। यह आंशिक रूप से भविष्यवाणी के लिए इन विट्रो मॉडल के विकास और लक्षण वर्णन की कमी के कारण हैगुर्देदवा परिवहन। विभिन्न मानव सेल लाइनों के बीच, RPTEC/TERT1 मॉडल के मूल्यांकन के लिए वादा दिखाता प्रतीत होता हैगुर्देदवाओं का पारस्परिक प्रभाव। यह कोशिका रेखा एक स्वस्थ मानव दाता से ली गई है और अमर समीपस्थ नलिका कोशिकाओं से उत्पन्न हुई है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग करके पी-जीपी की अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया गया है, इस प्रकार भविष्यवाणी करने की इसकी क्षमता की पुष्टि होती हैगुर्देनशीली दवाओं के बहिर्वाह [15, 16]। इस संदर्भ में, वर्तमान अध्ययन को RPTEC/TERT1 मॉडल का उपयोग करके P-gp निरोधात्मक क्षमता की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। सबसे पहले, प्रत्येक परीक्षण की गई दवा के लिए एक निषेध प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए एक रोडामाइन 123 (R123) संचय स्क्रीनिंग परख की गई थी। इस स्क्रीनिंग के आधार पर, दो पी-जीपी सब्सट्रेट दवाओं के इंट्रासेल्युलर संचय पर उनकी एकाग्रता-निर्भर प्रभावों के आकलन के लिए चार दवाओं का चयन किया गया था: एपिक्सबैन और रिवरोक्सबैन

कीवर्ड:रीनल सेल, रीनल मॉडल, रीनल ड्रग, रीनल एलिमिनेशन, किडनी।

सामग्री और तरीके

अभिकर्मकोंApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, Warfarin, और dabigatran etexilate को Alkirch से खरीदा गया था। फ्रांस)। Verapamil, ketoconazole, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, Hank का बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (HBSS), और HEPES सॉल्यूशन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट-क्वेंटिन-फालवियर, फ्रांस) से खरीदे गए थे।

कोश पालन  RPTEC / TERT1 कोशिकाओं को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, मोल्सहाइम, फ्रांस) से प्राप्त किया गया था और हार्मोनल रूप से सुरक्षित, सीरम-मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें Dulbecco के मॉडिफाइड ईगल मीडियम F12 (ATCC) शामिल थे, जो ग्रोथ फैक्टर किट (ATCC) और ए के साथ पूरक थे। 1 प्रतिशत एंटीबायोटिक/एंटीमायोटिक मिश्रण (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, एम्फोटेरिसिन बी) 37 डिग्री पर और 5 प्रतिशत सीओ 2। सभी प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 50 के घनत्व पर रखा गया था,000 प्रति कुएं की कोशिकाएं और 14 दिनों की संस्कृति के बाद बढ़ने के लिए उपयोग की जाती थीं। माध्यम को हर 2 दिनों में नवीनीकृत किया गया था और कोशिकाओं का उपयोग 27 से पारित होने के लिए 34 तक किया गया था। Caco -2 कोशिकाओं को भी ATCC से खरीदा गया था। कोशिकाओं को ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (सिग्मा-एल्ड्रिच, मिसौरी, यूएसए) से युक्त एक संस्कृति माध्यम में बनाए रखा गया था, जिसमें 10 प्रतिशत एफबीएस, 1 प्रतिशत गैर-अमीनो एसिड और 1 प्रतिशत एंटीबायोटिक / एंटीमायोटिक मिश्रण (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, एम्फोटेरिसिन बी) शामिल थे। ) 37 डिग्री और 5 प्रतिशत CO2 पर। Caco -2 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 5 × 10 3 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रति कुएं में डाला गया था और 14 दिनों की संस्कृति के बाद विकसित होने के लिए उपयोग किया गया था। मानव समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (HPTECs) को BIOPREDIC (रेनेस, फ्रांस) से प्राप्त किया गया था और DMEM / F12 में हाइड्रोकार्टिसोन, ईजीएफ, इंसुलिन, ट्रांसफ़रिन और सोडियम सेलेनाइट के साथ पूरक किया गया था। कोशिकाओं को 6600 कोशिकाओं प्रति कुएं के घनत्व पर 96-अच्छी तरह से कोलाजेनकोटेड कल्चर प्लेट में रखा गया था और संस्कृति के 11 दिनों के बाद विकसित होने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

रोडामाइन 123 संचय स्क्रीनिंग परख  पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता विभिन्न वर्गों की दवाओं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में आरपीटीईसी / टीईआरटी1 कोशिकाओं में रोडामाइन 123 के इंट्रासेल्युलर संचय को मापकर निर्धारित की गई थी। 14 परीक्षण दवाओं में, साइक्लोस्पोरिन ए (10 माइक्रोन), केटोकोनाज़ोल (50 माइक्रोन), वेरापामिल (100 माइक्रोन), और एमियोडेरोन (50 माइक्रोन) का उपयोग पी-जीपी अवरोधकों के रूप में किया गया था। Apixaban, rivaroxaban, और dabigatran etexilate- तीन प्रत्यक्ष मौखिक थक्का-रोधी (DOACs) - का उपयोग P-gp सबस्ट्रेट्स (10 µM) के रूप में किया जाता है। Warfarin (50 µM) को एक गैर-अवरोधक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और 10 µM की एकाग्रता पर उनके निषेध प्रोफाइल को जाने बिना निलोटिनिब, क्रिज़ोटिनिब, एर्लोटिनिब, और इडेलिसिब सहित पांच एंटीकैंसर दवाओं का उपयोग किया गया था। Caco-2 कोशिकाओं के साथ कई स्थितियों का पुनरुत्पादन किया गया, जिन्हें दवा परिवहन अध्ययन के लिए FDA द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस तरह, रोडामाइन 123 का इंट्रासेल्युलर प्रतिधारण काको -2 कोशिकाओं में वेरापामिल (100 माइक्रोन), साइक्लोस्पोरिन ए (10 माइक्रोन), निलोटिनिब (10 माइक्रोन), और डीओएसी (10 माइक्रोन) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में निर्धारित किया गया था। ) संक्षेप में, 96-वेलप्लेट्स में संस्कृति के 14 दिनों के बाद, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर 10 मिनट के लिए पूर्व-ऊष्मायन किया गया था, जिसमें 10 मिमी एचईपीईएस (वी / वी) के साथ एचबीएसएस में भंग प्रत्येक दवा थी। तब कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 45 मिनट के लिए 10 µ एम रोडामाइन 123 के साथ ऊष्मायन किया गया था। अंत में, ठंडे एचबीएसएस / एचईपीईएस समाधान में तीन धोने के बाद, कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के घोल में 1 प्रतिशत सोडियम बोरेट युक्त घोल दिया गया। इंट्रासेल्युलररोडामाइन 123 की मात्रा को एक इनफ़नाइट एम नैनोस्पेक्ट्रोफ्यूरोमीटर (लाइफ साइंसेज, टीईसीएएन, स्विटज़रलैंड) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जो तरंग दैर्ध्य को 485/535 एनएम पर सेट करता है। डेटा को किसी भी संभावित पी-जीपी अवरोधकों के संपर्क में नहीं आने वाले नियंत्रण कोशिकाओं में रोडामाइन 123 संचय के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था और मनमाने ढंग से 100 प्रतिशत संचय पर सेट किया गया था।

DOAC इंट्रासेल्युलर संचय परख और IC50 निर्धारण पिछले रोडामाइन 123 स्क्रीनिंग परख से, चार दवाओं को RPTEC / TERT1 कोशिकाओं में एपिक्सबैन और रिवरोक्सबैन (1 0 माइक्रोन) के इंट्रासेल्युलर संचय पर उनके एकाग्रता-निर्भर प्रभावों की जांच के लिए चुना गया था। केटोकोनाज़ोल, क्रिज़ोटिनिब, और निलोटिनिब को पी-जीपी अवरोधक के रूप में चुना गया था, और वार्फरिन को गैर-अवरोधक के रूप में चुना गया था। साइक्लोस्पोरिन ए (10 माइक्रोन) का उपयोग ट्रांसपोर्टरों के व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोधक के रूप में किया गया था। IC5 0 मान निर्धारित करने के लिए DOACs और nilotinib के बीच बातचीत के अध्ययन को दो सेलुलर मॉडल की तुलना करने के लिए Caco-2 कोशिकाओं में पुन: प्रस्तुत किया गया था। सभी यौगिकों को या तो अकेले या एचबीएसएस परिवहन बफर में संबंधित अवरोधक के साथ 1 प्रतिशत एचईपीईएस (वी/वी) और 1 प्रतिशत डीएमएसओ (वी/वी) के साथ पूरक किया गया था। ऊष्मायन से पहले, सभी समाधानों को 37 डिग्री तक पूर्व-गर्म किया गया था और पीएच को 7.4 पर समायोजित किया गया था। एंटीकैंसर दवाओं क्रिज़ोटिनिब और निलोटिनिब के लिए, उनकी खराब घुलनशीलता और साइटोटोक्सिक क्षमता के कारण, सांद्रता 0.1 से 25 माइक्रोन तक थी। केटोकोनाज़ोल और वार्फरिन के लिए, सांद्रता 0.1 से 100 माइक्रोन तक थी। संक्षेप में, 14 दिनों की संस्कृति के बाद, एचबीएसएस में 1 प्रतिशत एचईपीईएस (वी/वी) के साथ भंग सभी दवाओं को 37 डिग्री पर 10 मिनट के लिए पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। फिर, कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 60 मिनट के लिए 10 µ एम apixaban या rivaroxaban के साथ ऊष्मायन किया गया था। अंत में, ठंडे HBSS / HEPES समाधान में तीन washes के बाद, ट्राइटन X -100 के 0.2 प्रतिशत समाधान में 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को lysed किया गया था। इंट्रासेल्युलर डीओएसी की मात्रा तब तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा निर्धारित की गई थी। डेटा को DOAC संचय में प्रतिशत वृद्धि के रूप में व्यक्त किया गया था, और DOAC इंट्रासेल ल्यूलर संचय मनमाने ढंग से नियंत्रण कोशिकाओं में 100 प्रतिशत पर सेट किया गया था। P-gp गतिविधि के निषेध के लिए IC50 मान, जो DOAC संचय को बढ़ाने के लिए अर्ध-अधिकतम प्रभावकारी एकाग्रता (EC50) मानों के अनुरूप हैं, R में 'nls ()' फ़ंक्शन के साथ बढ़े हुए संचय के बिना भार वाले गैर-रेखीय कम से कम वर्ग प्रतिगमन मॉडलिंग से निर्धारित किए गए थे। सॉफ्टवेयर, निम्नलिखित समीकरण के अनुसार (समीकरण 1):

तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषणapixaban (m/z 460.19793) और rivaroxaban (m/z 436.07285) का परिमाणीकरण एक अल्टीमेट U300{{18 का उपयोग करके किया गया था }} लिक्विड क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (डायोनेक्स, सनीवेल, सीए, यूएसए) क्यू-एक्सएक्टिव प्लस मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मोफिशर, ब्रेमेन, जर्मनी) के साथ मिलकर। हाइपरसिल गोल्ड C18 (3 माइक्रोन, 5 0 × 2.1 मिमी) विश्लेषणात्मक कॉलम (थर्मोफिशर साइंटिफक, वॉलथम, एमए, यूएसए) और 0.6 एमएल / मिनट की फाउ दर का उपयोग करके एलसी पृथक्करण प्राप्त किए गए थे। . मोबाइल चरण A 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड (FA) वाला पानी था और मोबाइल चरण B 0.1 प्रतिशत FA के साथ एसीटोनिट्राइल था। रिवरोक्सैबन के लिए, ढाल थी: 0-0.3 मिनट, 10 प्रतिशत बी; 0.3-1 मिनट, 10 प्रतिशत से 70 प्रतिशत बी तक रैखिक; 1-1.5 मिनट, 70 प्रतिशत बी; 1.51 मिनट, 3 मिनट तक प्रारंभिक स्थितियों पर लौटें। एपिक्सबैन के लिए, ढाल था: 0–0.3 मिनट, 10 प्रतिशत बी; 0.3-0.7 मिनट, 10 से 90 प्रतिशत बी तक रैखिक; 0.7-1.5, 90 प्रतिशत बी; 1.51 मिनट, 3 मिनट तक प्रारंभिक स्थितियों पर लौटें। जांच इलेक्ट्रोस्प्रे-पॉजिटिव पैरेलल रिएक्शन मॉनिटरिंग (पीआरएम) मोड में 35, 000 (एम/जेड 200) के एक रिज़ॉल्यूशन पर की गई थी। आंतरिक मानक (आईएस) थे [13सी,2एच7]-एपिक्सबैन (एम/जेड 468.2452) एपिक्सबैन के लिए और [13सी6]-रिवरोक्सबैन (एम/जेड 442.09297) रिवरोक्सैबन के लिए। प्रत्येक दवा और उसके संबंधित आईएस के लिए, एक लक्ष्य आयन (मात्रा निर्धारण के लिए) और एक पुष्टिकरण आयन की निगरानी की गई। रिवरोक्सबैन और इसके आईएस के लिए, लक्ष्य आयन एम/जेड 144.95125 था और कन्फर्मिंग आयन क्रमशः एम/जेड 231.11280 और एम/जेड 237.13298 थे। एपिक्सबैन और इसके आईएस के लिए, लक्ष्य आयन एम/जेड 199.08656 था और कन्फर्मिंग आयन क्रमशः एम/जेड 282.12387 और एम/जेड 241.06062 थे।

परिणाम

रोडामाइन 123 संचय स्क्रीनिंग परखरोडामाइन 123 संचय स्क्रीनिंग परख RPTEC / TERT1 कोशिकाओं में 14 दवाओं के साथ अलग-अलग निषेध प्रोफाइल (छवि 1) के साथ किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, साइक्लोस्पोरिन ए की उपस्थिति में रोडामाइन 123 का इंट्रासेल्युलर संचय, एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोधक, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में 75 प्रतिशत के संचय में वृद्धि के साथ उच्चतम था। एक विशिष्ट पी-जीपी अवरोधक, वेरापामिल की उपस्थिति ने पी-जीपी की भागीदारी को प्रदर्शित करते हुए रोडामाइन 123 के 57 प्रतिशत के संचय में वृद्धि की। उसी तरह, केटोकोनाज़ोल, जिसे एक मजबूत पी-जीपी अवरोधक के रूप में वर्णित किया गया है, ने वर्पामिल की तुलना में रोडामाइन 123 के इंट्रासेल्युलर संचय में अधिक वृद्धि (66 प्रतिशत) की, इसके निषेध प्रोफाइल की पुष्टि की। इसके विपरीत, एक मध्यम पी-जीपी अवरोधक के रूप में विशेषता अमियोडेरोन के अलावा, 59 प्रतिशत के संचय में वृद्धि हुई, जो कि वेरापामिल के समान है। एंटीकैंसर एजेंट नीलोटिनिब, एक्सिटिनिब, क्रिज़ोटिनिब, एर्लोटिनिब और इडेलिसिब के लिए अलग-अलग निषेध प्रोफाइल देखे गए। नीलोटिनिब के अतिरिक्त ने रोडामाइन 123 (71 प्रतिशत) के संचय में एक मजबूत वृद्धि का कारण बना, जो महत्वपूर्ण अवरोधक क्षमता का सुझाव देता है, इसके बाद एक्सिटिनिब होता है, जिससे 57 प्रतिशत की अवधारण में वृद्धि हुई। दूसरी ओर, क्रिज़ोटिनिब और एर्लोटिनिब ने मध्यम से निम्न निरोधात्मक क्षमता का प्रदर्शन किया, जिसमें रोडामाइन 123 में क्रमशः 23 प्रतिशत और 16 प्रतिशत की वृद्धि हुई। इडेलिसिब ने रोडामाइन 123 के संचय को प्रभावित नहीं किया; वार्फरिन के बारे में भी यही सच था, जो था

एक गैर-अवरोधक के रूप में चुना गया। तीन DOACs में, apixaban और rivaroxaban ने क्रमशः rhodamine 123: 33 प्रतिशत और 12 प्रतिशत की अवधारण में मामूली वृद्धि की। दिलचस्प बात यह है कि डाबीगेट्रान इटेक्सिलेट, डाबीगेट्रान का एक प्रोड्रग और पी-जीपी का एक ज्ञात सब्सट्रेट, लगभग 50 प्रतिशत के रोडामाइन 123 के प्रतिधारण में वृद्धि का कारण बना, हालांकि इसे संभावित पी-जीपी अवरोधक के रूप में वर्णित नहीं किया गया है। अंत में, सिमवास्टेटिन को जोड़ने से फ्यूरोसेंट सब्सट्रेट (32 प्रतिशत) के संचय में केवल मामूली वृद्धि हुई। इस स्क्रीनिंग के आधार पर, RPTEC/TERT1 मॉडल के भीतर एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन के इंट्रासेल्युलर संचय पर उनके एकाग्रता-निर्भर प्रभावों का आकलन करने के लिए चार दवाओं का चयन किया गया था। केटोकोनाज़ोल को पी-जीपी निषेध के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण स्थिति के रूप में चुना गया था, और वारफारिन को नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति के लिए पी-जीपी के गैर-अवरोधक के रूप में चुना गया था। निलोटिनिब और क्रिज़ोटिनिब को क्रमशः मजबूत और मध्यम पी-जीपी अवरोधक के रूप में चुना गया था। संदर्भ मॉडल, काको-2 के साथ कई स्थितियों को पुन: प्रस्तुत किया गया। कोशिकाओं में R123 के इंट्रासेल्युलर संचय को एपिक्सबैन और रिवरोक्सबैन (10 माइक्रोन), निलोटिनिब (10 माइक्रोन), और साइक्लोस्पोरिन ए (10 माइक्रोन) और वेरापामिल (100 माइक्रोन) के साथ संयोजन (या नहीं) के बाद नियंत्रण की स्थिति के लिए निर्धारित किया गया था। (चित्र 2ए)। जैसा कि अपेक्षित था, वेरापामिल और साइक्लोस्पोरिन ए ने क्रमशः 297 प्रतिशत और 275 प्रतिशत के आर123 प्रतिधारण में उच्च वृद्धि का कारण बना। इसी तरह, निलोटिनिब ने अपनी निरोधात्मक क्षमता की पुष्टि करते हुए R123 (229 प्रतिशत) के इंट्रासेल्युलर संचय में उच्च वृद्धि का कारण बना। R123 को DOAC के साथ मिलाने से अन्य दवाओं की तुलना में R123 (40-44 प्रतिशत) के संचय में मामूली वृद्धि हुई। इसके अलावा, साइक्लोस्पोरिन ए की अनुपस्थिति और उपस्थिति में रोडामाइन 123 का इंट्रासेल्युलर संचयगुर्देRPTEC/TERT1 कोशिकाओं (चित्र 2B) के साथ प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता की जांच करने के लिए इस अध्ययन में प्राथमिक मानव कोशिकाओं की भी जांच की गई। इन विश्लेषणों से पता चला है कि साइक्लोस्पोरिन ए की उपस्थिति ने R123 प्रतिधारण को 71 प्रतिशत बढ़ा दिया है। यह मान RPTEC/TERT1 कोशिकाओं (साइक्लोस्पोरिन ए के साथ 75 प्रतिशत की वृद्धि) के साथ समान शर्तों के तहत प्राप्त के करीब था। इसलिए, P-ग्लाइकोप्रोटीन गतिविधि RPTEC/TERT1 मॉडल और प्राथमिक मानव कोशिकाओं में समान थी।

DOACs इंट्रासेल्युलर संचय परख: IC50 और I1/IC50 अनुपात निर्धारण इन विट्रो में RPTEC/TERT1 कोशिकाओं में 10 µM की निरंतर सांद्रता पर और नीलोटिनिब, क्रिज़ोटिनिब, केटोकोनाज़ोल की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में, एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन के पी-जीपी-मध्यस्थता परिवहन का आकलन करने के लिए इंट्रासेल्युलर संचय अध्ययन किया गया था। , और वारफारिन (अंजीर। 2, 3)। IC50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए बढ़े हुए एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन प्रतिधारण के मॉडलिंग का मूल्यांकन किया गया था। DOACs को nilotinib के साथ मिलाने से IC50 का निम्नतम मान प्राप्त हुआ: 0.85 µM और 1.37 µM क्रमशः rivaroxaban और apixaban के लिए (अंजीर। 4, 5)। क्रिजोटिनिब के साथ संयोजन से रिवरोक्सैबन और एपिक्सबैन के लिए क्रमशः 10.1 माइक्रोन और 12.2 माइक्रोन के आईसी50 वैल ues प्राप्त हुए। आश्चर्यजनक रूप से, कीटो कोनाज़ोल के साथ DOACs के संयोजन से न्यूनतम IC50 मान (क्रमशः रिवरोक्सैबन और एपिक्सबैन के लिए 16.5 माइक्रोन और 16.9 माइक्रोन) का उत्पादन नहीं हुआ। अंत में, जैसा कि अपेक्षित था, वारफारिन के साथ संयोजन, जो था

एक गैर-अवरोधक के रूप में चुना गया, दो डीओएसी के इंट्रासेल्युलर प्रतिधारण को प्रभावित नहीं करता था। नीलोटिनिब की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में काको -2 कोशिकाओं के भीतर एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन दोनों के इंट्रासेल्युलर संचय की इसलिए सेलुलर मॉडल के साथ तुलना के लिए जांच की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि, जैसा कि RPTEC/TERT1 मॉडल के साथ देखा गया है, IC50 रिवरोक्सैबन (4.16 µM) के लिए मान apixaban (9.35 µM) के लिए प्राप्त मूल्य से कम था। यह भी ध्यान रखना दिलचस्प है कि Caco -2 कोशिकाओं में देखे गए IC5 0 मान समान अवरोधक के लिए RPTEC/TERT1 कोशिकाओं में प्राप्त मूल्यों की तुलना में अधिक थे। इन विट्रो डेटा से डीडीआई की नैदानिक ​​प्रासंगिकता का अनुमान लगाया जा सकता है। FDA के दिशानिर्देशों के अनुसार, [I1]/IC50 अनुपात की गणना दवाओं के प्रत्येक संयोजन के लिए की गई थी। यह अनुपात विवो सांद्रता में उन लोगों की तुलना करने की अनुमति देता है जो इन विट्रो में एक प्रासंगिक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए जाने जाते हैं। RPTEC/TERT1 कोशिकाओं में एपिक्सैबन के लिए, अनुपात क्रमशः 3.1, 0.06, और 17.4 थे, जिसमें निलोटिनिब, क्रिज़ोटिनिब और केटोकोनाज़ोल थे, (तालिका 1)। काको -2 कोशिकाओं में, [I1]/IC50 अनुपात 0.46 एपिक्सबैन और नीलोटिनिब (तालिका 1) के बीच बातचीत के लिए था। रिवेरोक्सबैन के लिए, अनुपात आरपीटीईसी/टीईआरटी1 कोशिकाओं में एपिक्सैबन के लिए प्राप्त अनुपातों की तुलना में थोड़ा अधिक था: नीलोटिनिब, क्रियोजोटिनिब और केटोकोनाज़ोल (तालिका 2) के लिए क्रमशः 5.1, 0.08 और 17.7। उसी तरह, [I1]/IC50 अनुपात काको -2 कोशिकाओं में रिवरोक्सैबन और नीलोटिनिब के बीच बातचीत के लिए मनाया गया, 1.03 था, जो कि एपिक्सबैन (तालिका 2) के लिए प्राप्त की तुलना में अधिक था।

बहस

हाल के दशकों में किए गए कई अध्ययनों ने ड्रग फार्माकोकाइनेटिक्स [17-19] में पी-जीपी की उल्लेखनीय भूमिका की सूचना दी है। पी-जीपी द्वारा मध्यस्थता वाली दवाओं के अंतःक्रियाओं में बढ़ती नियामक रुचि को देखते हुए, दवाओं की निरोधात्मक क्षमता की जांच करने के लिए इन विट्रो assays दवा विकास और नैदानिक ​​अभ्यास का एक महत्वपूर्ण पहलू है। यह अंत करने के लिए, कई इन विट्रो assays आयोजित किए गए हैं, और अनुमानित आंतों के अवशोषण पर संबंधित अधिकांश डेटा Caco -2 और MDCK-MDR1 सेल लाइनों [20–22] से उत्पन्न किए गए हैं। हालांकि, दवाओं के सक्रिय ट्यूबलर स्राव पर कुछ डेटा उपलब्ध हैं, जो दवा के स्वभाव में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और एबीसी ट्रांसपोर्टरों की उपस्थिति पर निर्भर करता है। यह अवलोकन स्पष्ट रूप से विशेषता की कमी से जुड़ा हुआ हैगुर्देदवा की भविष्यवाणी के लिए सेल लाइनेंगुर्देबहना इस लक्ष्य के लिए इन विट्रो की आवश्यकता हैगुर्देमॉडल जो शारीरिक बाधा की बारीकी से नकल करता है। मानव कोशिका रेखा RPTEC/ TERT1, जो कई ABC ट्रांसपोर्टरों (विशेषकर P-gp) को व्यक्त करती है, एक अच्छा विकल्प प्रतीत होता है, जैसा कि पिछले अध्ययन [16] में दिखाया गया है। इस संदर्भ में, वर्तमान कार्य ने पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए आरपीटीईसी/टीईआरटी1 मॉडल के अनुप्रयोग की जांच की। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह काम मानव का उपयोग करके पी-जीपी निषेध अध्ययन से डेटा प्रदान करने वाला पहला हैगुर्देकोशिकाएं।

पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो एसेज़ आमतौर पर एक विशिष्ट संदर्भ पी-जीपी सब्सट्रेट के उपयोग पर आधारित होते हैं, जैसे कि डिगॉक्सिन या रोडामाइन 123 [23-25]। उनके उपयोग में आसानी के कारण, उच्च-थ्रूपुट परख के लिए फ्यूरोसेंट जांच फायदेमंद होती है। इसके अलावा, रोडामाइन 123 को व्यापक रूप से अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला [26-28] में पी-जीपी गतिविधि का पता लगाने के लिए लागू किया गया है। इस तरह, 14 दवाओं के निषेध प्रोफाइल की पहचान करने के लिए इस अध्ययन में RPTEC / TERT1 कोशिकाओं में रोडामाइन 123 संचय की परख की गई। इन दवाओं में, साइक्लोस्पोरिन ए, केटोकोनाज़ोल और वेरापामिल को मजबूत पी-जीपी अवरोधक के रूप में चुना गया था। इन अवरोधकों को उनके महत्वपूर्ण पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता के लिए व्यापक रूप से चित्रित किया गया है, जो डिगॉक्सिन और रोडामाइन 123 परिवहन [27, 29, 30] दोनों के मॉड्यूलेशन की ओर जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, इन दवाओं ने RPTEC / TERT1 कोशिकाओं में उच्चतम रोडामाइन 123 प्रतिधारण का कारण बना। इसके विपरीत, वॉर्फरिन के साथ R123 की अवधारण में कोई वृद्धि नहीं देखी गई, जिसका उपयोग RPTEC/TERT1 मॉडल की विश्वसनीयता की पुष्टि करते हुए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि सभी परीक्षण की गई दवाओं में, DOACs- जिसमें dabigatran etexilate, apixaban, और rivaroxaban शामिल हैं- R123 की अवधारण में अलग-अलग वृद्धि का कारण बने, भले ही उन्हें पहले अवरोधक के रूप में नहीं दिखाया गया था, केवल P-gp सबस्ट्रेट्स [31, 32]। यह अवलोकन तथाकथित "प्रतिस्पर्धी" निषेध के अस्तित्व के कारण हो सकता है, जहां दवाएं पी-जीपी पर समान बाध्यकारी साइटों के साथ बातचीत कर सकती हैं। पी-जीपी के लिए सबसे अच्छी तरह से विशेषता वाली साइटें एच साइट (होचस्ट 33342 को बांधने के लिए) और आर साइट (रोडामाइन 123 को बांधने के लिए) हैं। हालाँकि, कई अन्य अज्ञात दवा-बाध्यकारी साइटें इन अंतःक्रियाओं में भूमिका निभा सकती हैं, जो R123 [33, 34] के संचय पर DOACs के विभिन्न प्रभावों की व्याख्या कर सकती हैं। किसी दी गई दवा के लिए मनाया गया पी-जीपी अवरोध इसलिए इन विट्रो अध्ययन [28, 35] के दौरान उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट पर निर्भर है। अलग-अलग दवा-बाध्यकारी साइटों के साथ बातचीत करने वाले अलग-अलग पी-जीपी सबस्ट्रेट्स का उपयोग इसलिए दवाओं की पी-जीपी निरोधात्मक शक्तियों का सटीक वर्णन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान रखना दिलचस्प है कि ड्रग ट्रांसपोर्ट अध्ययन में एक संदर्भ मॉडल के साथ RPTEC / TERT1 कोशिकाओं की तुलना करने के लिए Caco -2 कोशिकाओं में rhodamine 123 स्क्रीनिंग से कई शर्तें भी प्रदर्शित की गईं। जैसा कि अपेक्षित था, साइक्लोस्पोरिन ए, वेरापामिल और निलोटिनिब ने रोडामाइन प्रतिधारण में उच्चतम वृद्धि का कारण बना। Caco-2 और RPTEC/TERT1 कोशिकाओं दोनों के साथ समान अवरोध प्रोफाइल देखे गए। हालाँकि, Caco -2 मॉडल में अंतःक्रियाओं द्वारा उत्पन्न रोडामाइन 123 प्रतिधारण में वृद्धि RPTEC/TERT1 कोशिकाओं में देखी गई तुलना में अधिक थी, जो मॉडल के बीच P-ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति में संभावित अंतर का सुझाव देती है इसलिए, वर्तमान में अध्ययन, दवाओं द्वारा पी-जीपी के संभावित निषेध का आकलन और पुष्टि करने के लिए एक दूसरी विधि का उपयोग किया गया था।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के डायलिसिस में सुधार होगा

रोडामाइन 123 संचय परख के आधार पर, चार दवाओं को एपिक्सबैन और रिवरोक्सबैन के इंट्रासेल्युलर संचय पर उनकी एकाग्रता पर निर्भर प्रभावों को निर्धारित करने के लिए चुना गया था। पी-जीपी को एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन [32, 36] के प्रवाह में मुख्य भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। इसलिए निलोटिनिब, क्रिज़ोटिनिब और केटोकोनाज़ोल के IC50 मूल्यों का मूल्यांकन किया गया, जिसमें DOAC को "पीड़ित" दवाओं के रूप में चुना गया। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह अध्ययन मानव में डीओएसी के साथ इंट्रासेल्युलर संचय अध्ययन करने वाला पहला हैगुर्देकोशिकाएं। नीलोटिनिब और क्रिज़ोटिनिब के लिए प्राप्त IC50 मान रोडामाइन 123 संचय परख से प्राप्त उनके निषेध प्रोफाइल के अनुसार थे। Nilotinib, जिसने R123 की अवधारण में एक मजबूत वृद्धि का कारण बना, ने इसकी उच्च अवरोध क्षमता की पुष्टि करते हुए, दो DOAC के लिए सबसे कम IC50 मान प्रस्तुत किया। यह परिणाम पिछले अध्ययन के अनुसार भी है जिसमें एमडीआर 1- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में [3 एच] -पैक्लिटैक्सेल के इंट्रासेल्युलर संचय में एकाग्रता-निर्भर वृद्धि दिखाई गई है, यह सुझाव देते हुए कि इसमें एक अवरोधक प्रोफाइल [37] है। क्रिज़ोटिनिब के लिए, R123 परख ने मध्यम निरोधात्मक क्षमता दिखाई, जिसमें R123 प्रतिधारण में निलोटिनिब की तुलना में कम वृद्धि हुई। यह अवलोकन पिछले अध्ययन द्वारा समर्थित है जहां क्रिजोटिनिब ने एमडीआर 1-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं [38] में आर123 और डॉक्सोरूबिसिन के इंट्रासेल्युलर संचय को बढ़ाया। यह परिणाम DOACs के साथ निर्धारित IC50 मूल्यों के अनुसार भी है, जो कि इसके मध्यम निषेध प्रोफाइल की पुष्टि करते हुए, नीलोटिनिब के लिए संबंधित मूल्यों से अधिक थे। हालांकि, यह ध्यान रखना दिलचस्प है कि नीलोटिनिब या क्रिज़ोटिनिब के 10 माइक्रोन की एकाग्रता से रोडामाइन 123 और डीओएसी की अवधारण में समान वृद्धि नहीं हुई। रोडामाइन स्क्रीनिंग में, निलोटिनिब ने सब्सट्रेट की अवधारण को लगभग 71 प्रतिशत बढ़ा दिया, जबकि डीओएसी के लिए यह लगभग 40 प्रतिशत था। इसके विपरीत, क्रिज़ोटिनिब ने रोडामाइन (23 प्रतिशत) की अवधारण में थोड़ी वृद्धि की, लेकिन एक ही एकाग्रता पर डीओएसी (लगभग 50 प्रतिशत) की अवधारण में अधिक वृद्धि हुई। जैसा कि पहले चर्चा की गई थी, इस अवलोकन को पी-जीपी पर बाध्यकारी साइटों में अंतर द्वारा समझाया जा सकता है। यह ज्ञात है कि कई दवाएं आर बाध्यकारी साइट (जहां रोडामाइन 123 बांधती हैं) के बजाय एच बाध्यकारी साइट के साथ बातचीत और प्रतिस्पर्धा करती हैं, और इसके विपरीत [39]। दिलचस्प बात यह है कि केटोकोनाज़ोल, जिसे एक मजबूत पी-जीपी अवरोधक के रूप में जाना जाता है, ने निलोटिनिब की तुलना में रोडामाइन 123 की अवधारण में थोड़ी छोटी वृद्धि की (क्रमशः 66 प्रतिशत बनाम 71 प्रतिशत)। फिर भी, Caco-2 कोशिकाओं के साथ एक समान मूल्य देखा गया, जहां केटोकोनाज़ोल की उपस्थिति के कारण R123 [40] के संचय में 60 प्रतिशत की वृद्धि हुई। IC50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए DOACs के इंट्रासेल्युलर संचय ने भी नीलोटिनिब और क्रिज़ोटिनिब की तुलना में उच्च मूल्यों को दिखाया। दिलचस्प बात यह है कि एलएलसी-पीके1 या काको -2 मॉडल में पी-जीपी सब्सट्रेट के रूप में डिगॉक्सिन का उपयोग करने वाले अधिकांश IC50 मान केटोकोनाज़ोल [41, 42] के लिए 3 और 4 माइक्रोन के बीच थे। ये मान वर्तमान अध्ययन में पाए गए मूल्यों से काफी भिन्न हैं (क्रमशः एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन के साथ 16.5 µ एम और 16.9 µ एम)। यह अवलोकन पुष्टि करता है कि पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता का निर्धारण करते समय सब्सट्रेट और इस्तेमाल किए गए मॉडल के विकल्प महत्वपूर्ण प्रभाव हैं। इसके अतिरिक्त, एक हालिया अध्ययन ने बताया कि इन-विट्रो सेलुलर मॉडल में एबीसी ट्रांसपोर्टरों के अभिव्यक्ति स्तर का दवा परिवहन परख पर प्रभाव पड़ता है और इसलिए पी-जीपी [43] से संबंधित डीडीआई के मूल्यांकन पर प्रभाव पड़ता है। दरअसल, पी-जीपी सब्सट्रेट के रूप में रिवरोक्सबैन का उपयोग करते हुए वेरापामिल के लिए आईसी50 मूल्यों के निर्धारण ने एमडीसीकेएमडीआर1 और काको -2 सेल मॉडल के बीच एक विषमता का खुलासा किया, जिसमें आईसी 50 मान क्रमशः 6.94 माइक्रोन और 21.2 माइक्रोन है, [43]। इसके अलावा, इस अध्ययन में काको -2 कोशिकाओं में एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन के इंट्रासेल्युलर संचय पर नीलोटिनिब के एकाग्रता-निर्भर प्रभाव की भी जांच की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि नीलोटिनिब के लिए IC50 मान RPTEC / TERT1 कोशिकाओं की तुलना में Caco -2 कोशिकाओं में काफी अधिक थे। इस अवलोकन को इन मॉडलों के बीच पी-जीपी अभिव्यक्ति में अंतर द्वारा समझाया जा सकता है। इसके अलावा, यह ज्ञात है कि पी-जीपी वितरण माना ऊतक पर निर्भर करता है। फॉलन एट अल। ने प्रदर्शित किया कि पी-जीपी का स्तर अधिक थागुर्दामनुष्यों में यकृत ऊतक की तुलना में [45]। दूसरी ओर, P-gp का अभिव्यक्ति स्तर आंत में in . की तुलना में अधिक लगता हैगुर्दाऊतक [46]। मानव कोशिकाओं का उपयोग जैसे कि RPTEC/TERT1 मॉडल, जो ट्रांसपोर्टरों को ओवरएक्सप्रेस नहीं करते हैं, इसलिए अतिरिक्त डेटा प्रदान कर सकते हैं। इन आंकड़ों का उपयोग किया जा सकता है और कई मापदंडों को एकीकृत करके शारीरिक रूप से आधारित फार्माकोकाइनेटिक मॉडलिंग (पीबीपीके) में लगाया जा सकता है, जैसे कि ऊतक में पी-जीपी की मात्रा या इन विट्रो मॉडल या आईसी50 मान।

हालांकि RPTEC/TERT1 मॉडल में केटोकोनाज़ोल के लिए पाए गए IC5 0 मान साहित्य में देखे गए मूल्यों की तुलना में अधिक थे, [I1]/IC50 अनुपात- मौखिक रूप से प्रशासित दवाओं के लिए संभावित नैदानिक ​​​​रूप से प्रासंगिक DDI के भविष्यवक्ता के रूप में मान्य-दिखाया गया उच्च मूल्य जो एफडीए द्वारा परिभाषित 0.1 की दहलीज से ऊपर थे। यह परिणाम एक नैदानिक ​​अध्ययन के अनुसार है जिसमें केटोकोनाज़ोल [44] के सह-प्रशासन के साथ एपिक्सबैन जोखिम में दो गुना वृद्धि हुई है। एक साथ लिया गया, ये सभी परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि RPTEC / TERT1 मॉडल P-gp निरोधात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण है।

सिस्टैन्च से किडनी/गुर्दे के दर्द में सुधार होगा

निष्कर्ष

हमारे अध्ययन ने प्रदर्शित किया कि विभिन्न वर्गों की दवाओं की पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता के मूल्यांकन के लिए आरपीटीईसी/टीईआरटी1 मॉडल का प्रयोग सुविधाजनक है। Rhodamine 123 संचय assays ने एक प्रारंभिक दवा स्क्रीनिंग की अनुमति दी। हालांकि, पी-जीपी की आर साइट के साथ बातचीत नहीं करने वाली दवाओं की पी-जीपी निरोधात्मक क्षमता की भी भविष्यवाणियों की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त सबस्ट्रेट्स का उपयोग करके जांच की जानी चाहिए। एपिक्सबैन और रिवरोक्सैबन के इंट्रासेल्युलर संचय से निर्धारित IC50 मान रोडामाइन 123 के साथ देखे गए निषेध प्रोफाइल के अनुसार हैं। इसके अलावा, केटोकोनाज़ोल और वारफेरिन का उपयोग एक मजबूत अवरोधक और पी-जीपी के एक गैर-अवरोधक के रूप में, क्रमशः पुष्टि की गई RPTEC/TER1 मॉडल की विश्वसनीयता जब इसका उपयोग P-gp की ओर दवाओं की निरोधात्मक क्षमता के बारे में इन विट्रो डेटा प्राप्त करने के लिए किया जाता है। अंत में, RPTEC / TERT1 मॉडल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों की तुलना Caco -2 कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त की गई, किसी दिए गए दवा के लिए निरोधात्मक प्रोफाइल की पुष्टि करने के लिए विभिन्न सेलुलर मॉडल में इन विट्रो अध्ययन आयोजित करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया।