एमटीटी परख के साथ सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से फेनिलेथेनॉयड ग्लाइकोसाइड का हस्तक्षेप

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यू-जी वांग, सी-मिन झोउ, गैंग जू और यू-क्यू गाओ

सार:

एमटीटी परख, एक स्क्रीनिंग विधि के रूप में, व्यापक रूप से कोशिकाओं की व्यवहार्यता और प्रसार को मापने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एमटीटी परख सटीक रूप से के प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसाEA.hy926 कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर एथेनॉलिक अर्क। एमटीटी परख, इचिनाकोसाइड, और एक्टोसाइड के विरोधाभासी अवलोकनों के लिए जिम्मेदार घटकों की जांच और पहचान करने के लिए, सी। ट्यूबुलोसा एथेनॉलिक अर्क से दो मुख्य फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड अलग किए गए थे। CCK-8, Hoechst 33342 और एनेक्सिन V-FITC/PI assays से प्राप्त डेटा से पता चलता है कि दोनों पृथक यौगिकों में मौजूद caffeoyl समूह MTT परख के परस्पर विरोधी परिणामों के लिए जिम्मेदार था। ये डेटा भ्रामक परिणाम उत्पन्न करने से बचने के लिए सेल व्यवहार्यता पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता पर जोर देते हैं।

कीवर्ड: एमटीटी परख;फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड; कैफिक एसिड; सेल व्यवहार्यता; दखल अंदाजी

परिचय

परजीवी पौधासिस्टैंच ट्यूबुलोसा(श्रेंक) आर. वाइट (ओरोबंचेसी परिवार) उत्तरी अफ्रीकी, अरब और एशियाई देशों में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है [1]। से उपजा हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसातथासिस्टांचे डेजर्टिकोलापारंपरिक चीनी चिकित्सा में महत्वपूर्ण हैं, जिनका उपयोग नपुंसकता, बाँझपन, लम्बागो और कोलोनिक जड़ता के कारण कब्ज के उपचार के लिए किया जाता है [2]। इसके अलावा, सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के एथेनॉलिक अर्क को चूहों [3] में सेरेब्रल हाइपोक्सिया के खिलाफ एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया गया है।

एंडोथेलियल कोशिकाएं हाइपोक्सिक पल्मोनरी हाइपरटेंशन के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। EA.hy926 एंडोथेलियल सेल लाइन काफी हद तक प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के समान है। एंटी-हाइपोक्सिक प्रभाव के हमारे अपने अध्ययन के दौरानसिस्टैंच ट्यूबुलोसाEA.hy926 एंडोथेलियल सेल पर एथेनॉलिक अर्क, हमने देखा कि 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) परख, जो आमतौर पर साइटोटोक्सिसिटी और साइटोस्टैटिक गतिविधि के अध्ययन में सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, उपचार के बाद बढ़ी हुई EA.hy926 सेल व्यवहार्यता दिखाकर परस्पर विरोधी परिणाम उत्पन्न करता है।

एक औषधीय एजेंट के संभावित साइटोटोक्सिक या साइटोप्रोटेक्टिव प्रभावों की पहचान करने के लिए सेल व्यवहार्यता का सटीक मूल्यांकन आवश्यक है। इसलिए, हमने जांच की कि सी। ट्यूबुलोसा एथेनॉलिक अर्क में कौन से घटक मौजूद हैं, जो एमटीटी परख के साथ देखे गए परस्पर विरोधी परिणामों के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। हमने सी. ट्यूबुलोसा एथेनॉलिक सत्त, इचिनाकोसाइड (इसके बाद यौगिक 1) और एक्टोसाइड (इसके बाद यौगिक 2) से दो मुख्य फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (PhGs) को अलग किया, और विभिन्न तरीकों का उपयोग करके EA.hy926 सेल व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव को निर्धारित किया। इसके अलावा, आगे यह स्पष्ट करने के लिए कि विरोधाभासी परिणामों के लिए यौगिक 1 और 2 का कौन सा विकल्प जिम्मेदार हो सकता है, हमने उनके एग्लीकोन्स, कैफिक एसिड (इसके बाद यौगिक 3) और 3, 4-डायहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (इसके बाद यौगिक 4) का परीक्षण किया। समान विधियों का उपयोग करके EA.hy926 सेल व्यवहार्यता पर।

परिणाम और चर्चा

यौगिकों की पहचान

सी. ट्यूबुलोसा एथेनॉलिक सत्त से पृथक किए गए दो यौगिकों की संरचनाओं की पहचान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणों द्वारा की गई थी और चित्र 1 में दर्शाए गए हैं। यौगिक 1 को पहले रिपोर्ट किए गए एनएमआर (तालिका तालिका) की तुलना में इचिनाकोसाइड के रूप में पहचाना गया था। 1) और एमएस (एम/जेड 785 [एम-एच]-) डेटा [4]। कंपाउंड 2 एनएमआर स्पेक्ट्रा कंपाउंड 1 के समान ही थे, एक -डी-ग्लूकोपाइरानोसिल समूह (तालिका 1) की अनुपस्थिति को छोड़कर। यौगिक 2 (m/z 623 [M−H]− ) की पहचान ऐक्टोसाइड [5] के रूप में की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, दोनों यौगिकों में एक ही एग्लिकोन होता है, जिसमें कैफिक एसिड (यौगिक 3) और 3, 4-डायहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (यौगिक 4) शामिल हैं।

सेल व्यवहार्यता परख

EA.hy926 सेल व्यवहार्यता पर यौगिकों 1-4 के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए MTT और CCK {{0}} assays का उपयोग किया गया था। MTT परख ने दिखाया कि EA.hy926 कोशिकाओं की व्यवहार्यता 25 और 5 0 μM यौगिक 1, 2, या 3 (166.3 प्रतिशत और यौगिक 1, 205.8 प्रतिशत के लिए 174.1 प्रतिशत और यौगिक के लिए 224.3 प्रतिशत) के उपचार के बाद काफी बढ़ गई। 2, और 164.8 प्रतिशत और 189.6 प्रतिशत यौगिक 3 के लिए, क्रमशः; p < 0.05),="" जब="" नियंत्रण="" कक्षों="" की="" तुलना="" में="" (चित्र="" 2क)।="" इसके="" अलावा,="" कोशिकाओं="" के="" एक="" रूपात्मक="" निरीक्षण="" ने="" निर्धारित="" किया="" कि="" 50="" माइक्रोन="" यौगिक="" 1,="" 2,="" या="" 3="" के="" साथ="" उपचार="" ने="" बैंगनी="" फॉर्मेज़ान="" क्रिस्टल="" के="" गठन="" में="" वृद्धि="" की,="" जिसे="" जीवित="" कोशिकाओं="" (चित्रा="" 3)="" के="" अनुपात="" का="" प्रत्यक्ष="" संकेत="" माना="" जाता="" है।="" इसके="" विपरीत,="" सीसीके="" -8="" परख="" ने="" सुझाव="" दिया="" कि="" 12.5,="" 25,="" और="" 50="" μm="" यौगिक="" 1,="" 2,="" या="" 3="" (75.5="" प्रतिशत,="" 45.1="" प्रतिशत,="" और="" यौगिक="" 1,="" 85.5="" प्रतिशत="" के="" लिए="" 43.7="" प्रतिशत)="" के="" साथ="" उपचार="" के="" बाद="" सेल="" व्यवहार्यता="" में="" काफी="" कमी="" आई="" है।="" 51.8="" प्रतिशत,="" और="" यौगिक="" 2="" के="" लिए="" 34.3="" प्रतिशत,="" और="" 64.5="" प्रतिशत,="" 48.2="" प्रतिशत,="" और="" यौगिक="" 3="" के="" लिए="" 36.4="" प्रतिशत,="" क्रमशः;="" पी=""><0.05), नियंत्रण="" कोशिकाओं="" की="" तुलना="" में="" (चित्र="" 2बी)।="" यौगिक="" 4="" ने="" एमटीटी="" या="" सीसीके="" -8="" परख="" में="" सेल="" व्यवहार्यता="" को="" प्रभावित="" नहीं="" किया।="" दो="" assays="" के="" साथ="" प्राप्त="" परिणामों="" के="" बीच="" विसंगति="" से="" पता="" चलता="" है="" कि="" दो="" assays="" में="" से="" एक="" ea.hy926="" सेल="" व्यवहार्यता="" पर="" यौगिकों="" 1="" और="" 2="" के="" प्रभावों="" को="" सटीक="" रूप="" से="" प्रतिबिंबित="" नहीं="" कर="" सकता="">

होचस्ट स्टेनिंग द्वारा एपोप्टोसिस का आकलन

Hoechst 33342 एक कोशिका-पारगम्य डीएनए दाग है जो पराबैंगनी प्रकाश से उत्तेजित होता है और 460 से 490 एनएम पर नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। एपोप्टोटिक कोशिकाओं के संघनित क्रोमैटिन सामान्य कोशिकाओं के क्रोमैटिन की तुलना में अधिक चमकीले रंग के होते हैं [6]। जबकि नियंत्रण कोशिकाओं ने समान रूप से बिखरे हुए क्रोमैटिन, सामान्य ऑर्गेनेल और अक्षुण्ण कोशिका झिल्ली का प्रदर्शन किया, 48 घंटे के लिए 50 माइक्रोन यौगिकों 1, 2, या 3 के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं ने एपोप्टोटिक कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) के विशिष्ट धुंधलापन को दिखाया। इसके विपरीत, यौगिक 4 के 50 μM तक कोशिकाओं के संपर्क ने नियंत्रण उपचार की तुलना में एपोप्टोटिक नाभिक की संख्या में वृद्धि नहीं की।

एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई डबल-धुंधला परख एपोप्टोटिक कोशिकाओं की पहचान एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के फॉस्फेटिडिलसेरिन के उच्च-आत्मीयता बंधन द्वारा करता है, जो एपोप्टोसिस [7] से गुजरने वाली कोशिकाओं में बाहरी है। इस परख में, व्यवहार्य कोशिकाएं या तो एनेक्सिन वी और न ही पीआई से बंधती हैं और इसलिए दागदार नहीं होती हैं (निचला बायां चतुर्थांश), प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं एनेक्सिन वी-एफआईटीसी (निचले दाएं चतुर्थांश), और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं के बंधन से हरे रंग की होती हैं। एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के फॉस्फेटिडिलसेरिन और पीआई से नेक्रोटिक कोशिकाओं के बंधन द्वारा क्रमशः हरे और लाल रंग के होते हैं, (ऊपरी दाएं चतुर्थांश)। जैसा कि चित्र 4ख में दिखाया गया है, 48 घंटे के लिए 50 माइक्रोन यौगिकों 1, 2, या 3 के साथ कोशिकाओं को ऊष्मायन किया गया, एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत क्रमशः 3.74 प्रतिशत (नियंत्रण कोशिकाओं) से बढ़कर 10.32 प्रतिशत, 12.95 प्रतिशत और 11.30 प्रतिशत हो गया। नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, यौगिक 4 ने एपोप्टोटिक EA.hy926 कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि नहीं की।

CCK-8 परख और Hoechst 33342 धुंधला द्वारा प्राप्त परिणामों के अनुरूप, प्रवाह cytometry परख ने दिखाया कि EA.hy926 कोशिकाओं में यौगिक 1, 2, और 3 प्रेरित एपोप्टोसिस हैं। कुल मिलाकर, इन टिप्पणियों से पता चलता है कि EA.hy926 सेल व्यवहार्यता में वृद्धि एमटीटी परख के साथ 1–3 यौगिकों के साथ उपचार के बाद एक गलत-सकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करती है।

बहस

1983 में, मोसमैन ने सेल प्रसार और साइटोटोक्सिसिटी [8] को मापने के लिए एक वर्णमिति एमटीटी माइक्रोप्लेट परख विकसित की। यह सरल परख, और इसके संशोधन, अब दुनिया भर में कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में फ्रैक्शनेशन अध्ययन ने संकेत दिया कि कम पाइरीडीन न्यूक्लियोटाइड कॉफ़ेक्टर, एनएडीएच, अधिकांश एमटीटी कमी के लिए जिम्मेदार है। यह संपूर्ण कोशिकाओं [9] का उपयोग करके अध्ययनों द्वारा समर्थित था। इसलिए एमटीटी की कमी मेटाबोलिक रूप से सक्रिय कोशिकाओं से जुड़ी होती है और न केवल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के साथ मिलती है, बल्कि साइटोप्लाज्म और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के साथ एंडोसोम / लाइसोसोम कम्पार्टमेंट और प्लाज्मा झिल्ली [10] भी शामिल है। एमटीटी अणु पर शुद्ध धनात्मक आवेश प्लाज्मा झिल्ली क्षमता के माध्यम से इसके सेलुलर उत्थान के लिए प्राथमिक कारक है।

विशेष रूप से, एमटीटी परख कभी-कभी उस वास्तविक प्रभाव को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है जो एक परीक्षण किए गए यौगिक का विशिष्ट कोशिकाओं पर होता है। हालांकि, रासायनिक संरचना या समूह जो एमटीटी परख में परस्पर विरोधी परिणाम पैदा कर सकते हैं, उनकी पहचान नहीं की गई है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एमटीटी परख (-) - एपिगैलोकैटेचिन -3- गैलेट, ग्रीन टी में सबसे प्रचुर मात्रा में पॉलीफेनोल [11] के एंटी-प्रोलिफ़ेरेटिव प्रभाव को कम करके आंका जा सकता है। ट्यूमर केमोसेंसिटिविटी का पता लगाने के लिए एमटीटी परख का उपयोग करने वाले अध्ययनों में, कैंसर विरोधी कीमोथेराप्यूटिक एजेंट, जैसे कि एपिरूबिसिन, पैक्लिटैक्सेल, डोकेटेक्सेल, और इमैटिनिब मेसाइलेट (ग्लीवेक) ने सेल व्यवहार्यता में वृद्धि दिखाई [12,13]। इसके अलावा, कई अध्ययनों ने बताया है कि कुछ पौधों के अर्क और रेडॉक्स-सक्रिय पॉलीफेनोल्स एमटीटी परख में हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि वे कोशिकाओं की अनुपस्थिति में एमटीटी टेट्राजोलियम नमक को सीधे कम करते हैं [14]।

माइक्रोप्लेट रीडर में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण से पहले एमटीटी फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को घोलने की आवश्यकता और प्रतिक्रिया की अंतर्निहित समापन बिंदु प्रकृति कुछ अनुप्रयोगों के लिए एमटीटी परख के उपयोग को सीमित करती है। इससे टेट्राजोलियम एनालॉग्स का विकास हुआ जिसमें फिनाइल मोएट को नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सल्फोनेट समूहों से सजाया गया था, जैसे कि 2,3-बीआईएस-(2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो- 5- सल्फोफेनिल) -2एच-टेट्राजोलियम-5-कार्बोक्सामाइड (एक्सटीटी), एक नकारात्मक चार्ज वाला आंतरिक नमक [15] और 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल) -5-(3-कार्बोक्सीमेथॉक्सीफेनिल)-2-(4-सल्फोफेनिल)-2एच-टेट्राजोलियम (एमटीएस), एक कमजोर अम्लीय आंतरिक नमक जो एमटीटी से निकटता से संबंधित है [16] . इन संशोधनों के परिणामस्वरूप संस्कृति मध्यम-घुलनशील फॉर्मेज़ान उत्पादों का उत्पादन हुआ, जो परिमाणीकरण से पहले एक घुलनशीलता कदम की आवश्यकता को समाप्त कर देता है। इसके अनुरूप, जैसे-जैसे इन अणुओं पर बढ़े हुए ऋणात्मक आवेश ने कोशिका झिल्लियों के पार जाने की उनकी क्षमता को कम कर दिया [17], मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता (IEA), जैसे 1-मेथॉक्सी-5-मिथाइल फेनाज़िनियम मिथाइल सल्फेट ({{25) }}मेथॉक्सी पीएमएस) को टेट्राजोल डाई में कमी की सुविधा के लिए या कमी की दर को बढ़ाने के लिए आवश्यक थे।

हाल ही में, पानी में घुलनशील टेट्राजोलियम लवण की एक नई पीढ़ी विकसित की गई है, जिसका WST-1 प्रोटोटाइप [18] है। WST-1, एक नकारात्मक रूप से आवेशित डिसल्फ़ोनेटेड आंतरिक नमक जिसमें आयोडीन अवशेष होता है, 1-मेथॉक्सी PMS, इसकी अनिवार्य IEA की उपस्थिति में XTT और MTS की तुलना में अधिक स्थिर है। इसने WST-1/1-मेथॉक्सी PMS को एक सुविधाजनक एकल अभिकर्मक सेल प्रसार किट के रूप में विपणन करने के लिए प्रेरित किया। WST श्रृंखला में कई अन्य टेट्राजोलियम लवण विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे उपयोगी शायद WST-8 [19] है। ऐसा प्रतीत होता है कि WST-8 में WST-1 के समान सेलुलर कमी गुण हैं और इसे CCK-8 परख के रूप में स्वतंत्र रूप से विपणन किया जा रहा है। WST-8 सेल अभेद्य है और इसलिए इसे बाह्य रूप से कम किया जाता है, इंट्रासेल्युलर NADH से WST-8 तक इलेक्ट्रॉन परिवहन के माध्यम से 1-मेथॉक्सी PMS द्वारा मध्यस्थता वाले प्लाज्मा झिल्ली में। यद्यपि MTT और WST दोनों -8/1-मेथॉक्सी PMS कमी इंट्रासेल्युलर NADH द्वारा संचालित हैं, NADH का स्रोत इन दो विधियों के भीतर भिन्न प्रतीत होता है। WST-8/1-मेथॉक्सी PMS में कमी मैलेट/एस्पार्टेट शटल पर अधिक निर्भर है जो माइटोकॉन्ड्रियल ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड चक्र-एनएडीएच को एक्स्ट्रामिटोकॉन्ड्रियल स्पेस [20] से जोड़ता है।

प्रारंभिक प्रयोगों में, हमने पुष्टि की कि यौगिक 1, 2, 3, और 4 सीधे एमटीटी टेट्राजोलियम नमक (नहीं दिखाया गया) को कम नहीं कर सकते हैं। वर्तमान अध्ययन में, एमटीटी या सीसीके -8 समाधान जोड़ने से पहले फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ माइक्रोप्लेट्स को सावधानीपूर्वक धोकर अभिकर्मक के साथ यौगिकों के प्रत्यक्ष प्रभाव को समाप्त कर दिया गया था, जैसा कि निर्माता के प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया था। फिर भी, दो विधियों का उपयोग करके प्राप्त परिणाम अभी भी विरोधाभासी थे (चित्र 2)। जैसा कि अपेक्षित था, यौगिकों 1, 2, और 3 के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन ने नियंत्रण समूह (चित्रा 3) की तुलना में टेट्राजोलियम नमक की कमी को बैंगनी फॉर्मेज़ान में बढ़ा दिया, यह सुझाव देते हुए कि एक विशिष्ट यौगिक की उपस्थिति में केवल टेट्राजोलियम नमक की कमी एमटीटी परख में हस्तक्षेप करने के लिए यौगिक की क्षमता का न्याय करने के लिए पर्याप्त नहीं है।

यह निर्धारित करने के लिए कि यौगिक 1, 2, 3, और 4 EA.hy926 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकते हैं, सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन और फॉस्फेटिडिलसेरिन बाहरीकरण का मूल्यांकन किया गया था। सीसीके -8 परख के साथ देखी गई सेलुलर व्यवहार्यता में लगातार कमी के साथ, एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई का उपयोग करके होचस्ट धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के परिणामों ने सुझाव दिया कि यौगिक 1, 2, और 3 उपचार के बाद देखा गया विकास अवरोध था कारण, कम से कम भाग में, EA.hy926 सेल एपोप्टोसिस के कारण। हमारे परिणामों ने इस विचार का भी समर्थन किया कि दोनों यौगिकों 1 और 2 में मौजूद कैफॉयल समूह एमटीटी परख के साथ प्राप्त विरोधाभासी परिणामों के लिए जिम्मेदार था।

हमारे निष्कर्षों के समान, रॉटलरिन, एक शक्तिशाली बड़े चालन पोटेशियम चैनल ओपनर, ने इन विट्रो में एमटीटी के प्रति प्रतिक्रियाशीलता प्रदर्शित नहीं की। हालांकि, इसने कोशिकाओं के अंदर फॉर्मेज़ान क्रिस्टल के गठन को दृढ़ता से बढ़ाया, एक परिणाम जो एनएफ-κबी के रोटलरिन निषेध और डीएनए में [3 एच] -थाइमिडीन निगमन [21] के विश्लेषण द्वारा देखे गए सेल प्रसार के साथ स्पष्ट संघर्ष में था। जिस तंत्र द्वारा रॉटलरिन ने एमटीटी में कमी को बढ़ाया, उसे इसके माइटोकॉन्ड्रियल अनप्लगिंग प्रभाव [22] के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। रोटलरिन में एक सिनामॉयल एसिड प्रतिस्थापन समूह होता है। सिनामॉयल एसिड की तुलना में, यौगिक 3 में दो अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल अवशेष होते हैं, जो C-3 और C-4 पर स्थित होते हैं। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि वह तंत्र जिसके द्वारा यौगिक 1 और 2 एमटीटी परख में परस्पर विरोधी परिणाम देते हैं, उनके माइटोकॉन्ड्रियल अनप्लगिंग प्रभावों से भी जुड़ा हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, यौगिकों 1, 2, और एक रासायनिक अयुग्मक, जैसे कि ट्राइफ्लोरोकार्बोनिलसाइनाइड फेनिलहाइड्राजोन (FCCP) के बीच तुलनात्मक अध्ययन की आवश्यकता है।

प्रायोगिक अनुभाग

अभिकर्मक और रसायन

यौगिक 3 (कैफिक एसिड-पाउडर, शुद्धता=98.6 प्रतिशत) चेंगदू पुश बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (चेंगदू, चीन) से खरीदा गया था। यौगिक 4 (3,4-डायहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल-तेल, शुद्धता=98.5 प्रतिशत) चेंगदू मस्ट बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (चेंगदू, चीन) से प्राप्त किया गया था। एमटीटी और डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। CCK -8 परख Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan) से खरीदी गई थी। Hoechst 33342 और एनेक्सिन V-FITC / PI एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (हैमेन, चीन) से खरीदे गए थे।

संयंत्र के लिए सामग्री

C. ट्यूबुलोसा के तने युतियन प्रान्त, झिंजियांग उइगुर स्वायत्त क्षेत्र, चीन से एकत्र किए गए थे। वाउचर के नमूने हाई एल्टीट्यूड मेडिसिन, थर्ड मिलिट्री मेडिकल यूनिवर्सिटी (चोंगकिंग, चीन) की प्रमुख प्रयोगशाला में जमा किए गए थे और चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (चेंगदू, चीन) से यी झांग द्वारा प्रमाणित किए गए थे।

संयंत्र सामग्री का निष्कर्षण और अलगाव

हवा में सुखाए गए सी. ट्यूबुलोसा (0.6 किग्रा) के तने का पाउडर बनाया गया और 70 डिग्री पर 2 घंटे के लिए 50 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निकाला गया। कम दबाव में विलायक को हटाने के बाद, इथेनॉलिक अर्क (212.5 ग्राम) को पानी (2 एल) में भंग और निलंबित कर दिया गया और एन-ब्यूटानॉल (2 एल × 3) के साथ निकाला गया। एन-ब्यूटेनोलिक अर्क (110 ग्राम) को एक पॉलियामाइड कॉलम पर क्रोमैटोग्राफ किया गया था और इथेनॉल / पानी (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) के साथ पांच अंशों (ए-ई) का उत्पादन किया गया था। . अंश बी (65 ग्राम) को एक ओडीएस कॉलम पर विभाजित किया गया था; इथेनॉल के साथ क्षालन: पानी (1:9) पृथक यौगिक 1 (3 ग्राम)। भिन्न D (10.5 g) को ODS स्तंभ पर विभाजित किया गया था; इथेनॉल/पानी (1:4) के साथ क्षालन अलग यौगिक 2 (1 ग्राम)।

NMR स्पेक्ट्रा को आंतरिक मानक के रूप में Tetramethylsilane (TMS) के साथ CD3OD में ब्रूकर एवेंस 600 स्पेक्ट्रोमीटर पर दर्ज किया गया था। मास स्पेक्ट्रा को बायोटीओएफ-क्यू मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया था।

कोश पालन

EA.hy926 सेल लाइनों को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (मानस, वीए, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। कोशिकाओं को RPMI 1640 माध्यम में संवर्धित किया गया, 10 प्रतिशत (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1 प्रतिशत (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एक आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 के साथ पूरक किया गया।

सेल व्यवहार्यता

सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन MTT और CCK {0}} assays का उपयोग करके किया गया था। यौगिक 1 और 2, और उनके एग्लीकोन्स, कैफिक एसिड (3) और 3, 4-डायहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (4) को डीएमएसओ में अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता <0.1 प्रतिशत="" (वी="" वी)="" संस्कृति="" मीडिया="" में="" भंग="" कर="" दिया="" गया="">

EA.hy926 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों पर 4 × 103 कोशिकाओं / कुएं पर रखा गया था। 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 6.25-50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ इलाज किया गया था। संस्कृति माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से दो बार धोया गया। स्टॉक एमटीटी समाधान (5 मिलीग्राम · एमएल −1 ) के एलिकोट्स (10 μL) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया जिसमें 100 μL माध्यम था और 4 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, माध्यम को हटा दिया गया था और फॉर्मेज़न क्रिस्टल को घोलने के लिए प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ के 150 μL विभाज्य जोड़े गए थे। माइक्रोप्लेट रीडर (बायो-टेक सिनर्जी एचटी, वीनोस्की, वीटी, यूएसए) का उपयोग करके अवशोषण को 490 एनएम पर मापा गया था। सेल व्यवहार्यता को एमटीटी कमी के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था, जो नियंत्रण कोशिकाओं के अवशोषण के लिए 100 प्रतिशत मूल्य प्रदान करता है। सभी प्रयोग तीन बार किए गए और माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किए गए।

सीसीके -8 परख साहित्य के बाद मामूली संशोधनों के साथ किया गया था [23]। विशेष रूप से, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 6.25-50 μM यौगिकों 1, 2, 3, या 4 के साथ इलाज किया गया था और 10 μL CCK -8 समाधान और संस्कृति मीडिया के 100 μL को जोड़ने से पहले दो बार पीबीएस से धोया गया था। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री पर माइक्रोप्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण कोशिकाओं (100 प्रतिशत) के सापेक्ष व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। सभी प्रयोग तीन बार किए गए और माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किए गए।

Hoechst 33342 स्टेनिंग द्वारा एपोप्टोसिस का आकलन

Hoechst 33342 धुंधला द्वारा एपोप्टोटिक रूपात्मक परिवर्तन देखे गए। संक्षेप में, EA.hy926 कोशिकाओं को 48-अच्छी तरह से प्लेटों (2 × 104 कोशिकाओं / कुएं) पर रखा गया था और 37 डिग्री पर 48 घंटे के लिए 50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ इलाज किया गया था, दो बार पीबीएस के साथ धोया गया था। और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4 प्रतिशत (v/v) पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया। पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए Hoechst 33342 (10 ug·mL−1) के साथ दाग दिया गया और दो बार पीबीएस के साथ धोया गया। Hoechst- सना हुआ नाभिक एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (ओलिंप, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके कल्पना की गई थी।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस विश्लेषण

एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई डबल-स्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा लगाया गया था। संक्षेप में, 48 घंटे के लिए 50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ उपचार के बाद, कोशिकाओं को काटा गया और पीबीएस में 1 × 105 कोशिकाओं · एमएल−1 पर पुन: स्थापित किया गया। 25 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500 × g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एनेक्सिन V-FITC बाइंडिंग बफर के 195 μL और एनेक्सिन V-FITC के 5 μL जोड़े गए। कोमल भंवर-मिश्रण के बाद, मिश्रण को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। 25 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500 × g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, FITC-संयुग्मित एनेक्सिन V बाइंडिंग बफर के 190 μL और 10 μL PI जोड़े गए। कोमल भंवर-मिश्रण के बाद, 30 मिनट के भीतर FACSCalibur फ्लो साइटोमीटर (बेक्टन डिकिंसन, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रयोगात्मक डेटा को ± एसडी के रूप में व्यक्त किया गया था। प्रयोगात्मक नमूनों और संबंधित नियंत्रण के बीच अंतर के महत्व का आकलन SPSS सॉफ्टवेयर (संस्करण 11.5) का उपयोग करके विचरण (ANOVA) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया था। सांख्यिकीय महत्व p < 0.05="" पर="" निर्धारित="" किया="" गया="">

निष्कर्ष

हमारे परिणाम बताते हैं कि एमटीटी परख में देखी गई व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अधिक आकलन कुछ यौगिकों की साइटोटोक्सिसिटी को मुखौटा कर सकता है। इसलिए, ड्रग स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं के दौरान, हम भ्रामक परिणाम उत्पन्न करने से बचने के लिए सेल व्यवहार्यता (जैसे CCK-8 और 3 H-TdR assays) में विशिष्ट यौगिक के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।