भाग 1: इचिनाकोसाइड चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनलों में वोल्टेज-निर्भर सीए 2 प्लस एंट्री और प्रोटीन किनेज सी को दबाकर ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

चेंग वेई लू 1,2, त्ज़ू यू लिन 1,2, शु कुई हुआंग 1 और सु जेन वांग 3,*

सार:

ग्लूटामेटेरिक प्रणाली न्यूरोप्रोटेक्टेंट उपचारों के प्रभावों में शामिल हो सकती है।इचिनाकोसाइड, औषधीय चीनी जड़ी बूटी से निकाला गया एक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइडहर्बा सिस्टांचे, न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है। इस अध्ययन ने के प्रभावों की जांच कीइचिनाकोसाइडचूहे सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनलों (सिनेप्टोसोम) में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर। इचिनाकोसाइड ने Ca2 प्लस-निर्भर को बाधित किया, लेकिन Ca2 प्लस-निर्भर नहीं, 4-एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज। इचिनाकोसाइड ने साइटोप्लाज्मिक मुक्त Ca2 प्लस एकाग्रता में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित वृद्धि को भी कम कर दिया, लेकिन सिनैप्टोसोमल झिल्ली क्षमता को नहीं बदला। 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के निरोधात्मक प्रभाव को ओ-कोनोटॉक्सिन MVIIC द्वारा रोका गया था, जो Cav2.2 (N-टाइप) और Cav2.1 (P/Q-type) चैनलों का एक व्यापक-स्पेक्ट्रम अवरोधक है। , लेकिन इंट्रासेल्युलर Ca2 प्लस रिलीज-इनहिबिटर्स डैंट्रोलिन और 7-क्लोरो-5-(2-क्लोरोफेनिल)-1,5-dihydro-4 के प्रति असंवेदनशील था। ,1-बेंजोडायजेपाइन-2(3H)-एक (CGP37157)। इसके अलावा, इचिनाकोसाइड ने प्रोटीन किनेज सी के एमिनोपाइरीडीन-प्रेरित फास्फोराइलेशन को कम कर दिया, और प्रोटीन किनेज सी अवरोधकों ने ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के प्रभाव को समाप्त कर दिया। इन परिणामों के अनुसार, हम सुझाव देते हैं कि विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड का निरोधात्मक प्रभाव कम वोल्टेज पर निर्भर सीए 2 प्लस प्रविष्टि और बाद में प्रोटीन किनसे सी गतिविधि के दमन से जुड़ा है।

कीवर्ड:इचिनाकोसाइड; ग्लूटामेट रिलीज; सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनल; वोल्टेज पर निर्भर Ca2 प्लस चैनल; प्रोटीन किनेज सी

1 परिचय

इचिनाकोसाइडमें मौजूद एक प्रमुख फेनिलएथेनॉयड ग्लाइकोसाइड हैहर्बासिस्टांचे, एक प्रसिद्ध पारंपरिक चीनी दवा है जो विस्मृति, नपुंसकता और पुरानी कब्ज के इलाज के लिए प्रयोग की जाती है [1]।इचिनाकोसाइडएंटीऑक्सीडेशन, एंटी-इन-अमेशन, एंटीकैंसर, हेपेटोप्रोटेक्शन और इम्यून मॉड्यूलेशन जैसी विभिन्न जैव-सक्रियताएं रखता है [2-4]। विशेष रूप से, इचिनाकोसाइड में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव होते हैं; उदाहरण के लिए, यह प्राथमिक चूहे कॉर्टिकल न्यूरॉन्स, मानव न्यूरोब्लास्टोमा SH-SY5Y कोशिकाओं और फियोक्रोमोसाइटोमा (PC12) कोशिकाओं [5–8] में ऑक्सीडेटिव तनाव- या न्यूरोटॉक्सिन-प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी से रक्षा कर सकता है। इसके अलावा, इचिनाकोसाइड मस्तिष्क क्षति को कम करता है और पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, और मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा [9-12] के पशु मॉडल में संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करता है। हालाँकि, वह तंत्र जिसके माध्यम सेइचिनाकोसाइडन्यूरोप्रोटेक्शन को प्रेरित करता है पूरी तरह से समझा नहीं गया है।

न्यूरोप्रोटेक्शन विषाक्त अपमान पर न्यूरोनल संरचना और कार्य को संरक्षित करने की एक जटिल प्रक्रिया है। ग्लूटामेट एक्साइटोटॉक्सिसिटी में कमी को मस्तिष्क के न्यूरोप्रोटेक्शन में शामिल एक संभावित तंत्र माना जाता है। ग्लूटामेट, एक उत्तेजक अमीनो एसिड न्यूरोट्रांसमीटर, मस्तिष्क के कई कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [13]। हालांकि, उच्च ग्लूटामेट सांद्रता के तहत ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अधिकता इंट्रासेल्युलर सीए 2 प्लस अधिभार, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन और न्यूरोनल मौत [14,15] का कारण बनती है। यह रोग प्रक्रिया मस्तिष्क के इस्किमिया, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, मिर्गी, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग [16,17] सहित कई मस्तिष्क विकारों में शामिल है। इसलिए, पैथोफिज़ियोलॉजिकल ग्लूटामेटेरिक ट्रांसमिशन को अवरुद्ध करने वाले अवरोधकों को संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव ड्रग्स माना जाता है। इनमें से उल्लेखनीय उदाहरण ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी हैं [18,19]; हालांकि, कम प्रभावशीलता और अवांछित, या यहां तक ​​कि साइटोटोक्सिक साइड इफेक्ट [20,21] के कारण इन दवाओं के नैदानिक ​​परीक्षण विफल हो गए हैं। प्रत्यक्ष ग्लूटामेट रिसेप्टर नाकाबंदी के अलावा, ग्लूटामेट रिलीज अवरोधन न्यूरोप्रोटेक्शन के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है। कई न्यूरोप्रोटेक्टेंट्स (जैसे, मेमेंटाइन और रिलुज़ोल) चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में ग्लूटामेट रिलीज को कम कर सकते हैं [22-24]।

एक्साइटोटॉक्सिसिटी में ग्लूटामेट की भूमिका और इचिनाकोसाइड के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रो-ले को ध्यान में रखते हुए, वर्तमान अध्ययन ने ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के प्रभाव की जांच करने के लिए चूहे सेरेब्रल कॉर्टेक्स से शुद्ध किए गए पृथक तंत्रिका टर्मिनलों (सिनैप्टोसम) का उपयोग किया और आगे संभावित तंत्र का पता लगाया। पृथक तंत्रिका टर्मिनल तैयारी किसी भी पोस्टसिनेप्टिक प्रभाव [25] की अनुपस्थिति में दवाओं द्वारा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के प्रीसानेप्टिक विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। इस मॉडल का उपयोग करके, हमने ग्लूटामेट रिलीज, झिल्ली क्षमता, प्रीसानेप्टिक सीए 2 प्लस इन-यूक्स, और प्रोटीन किनसे सी गतिविधि पर इचिनाकोसाइड के प्रभाव का मूल्यांकन किया। साहित्य की हमारी समीक्षा के अनुसार, यह उस तंत्र का दस्तावेजीकरण करने वाली पहली रिपोर्ट है जिसके माध्यम से इचिनाकोसाइड प्रीसानेप्टिक स्तर पर अंतर्जात ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है।

2. परिणाम

2.1. इचिनाकोसाइडवेसिकुलर एक्सोसाइटोसिस को कम करके रैट सेरेब्रोकोर्टिकल नर्व टर्मिनलों से 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

चित्रा 1 पुरी-एड चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल सिनैप्टोसोम से 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के एकाग्रता-निर्भर प्रभाव को दिखाता है। सिनैप्टोसोम में 1 मिमी CaCl2, 1 मिमी 4-aminopyridine के साथ ऊष्मायन 7.4 ± {{1 {{2 0}}}} .1 एनएमओएल / मिलीग्राम / 5 मिनट की ग्लूटामेट रिलीज पैदा करता है, जो कम हो गया था 1, 5, 10, 30, और 50 यूएम इचिनाकोसाइड से 6.5 ± 0.2, 5.8 ± 0.3, 4.8 ± 0.2,

4.1 ± 0.1, या 2.3 ± 0.4 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट, क्रमशः (एफ(5,24)=67.1, पी=0। 000)। एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से प्राप्त 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध के लिए IC50 मान 24 uM था। इसके अलावा, ग्लूटामेट रिलीज 1 एमएम 4- एमिनोपाइरीडीन द्वारा एक बाह्य सीए 2 प्लस -फ्री सॉल्यूशन में 300 यूएम एथिलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (-एमिनोइथाइल ईथर) -एन, एन, एन /, एन / -टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए) से उत्पन्न होता है। था 2.1 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट (एफ(2,12)=310.65, पी=0।000),

और 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज का यह सीए2 प्लस-स्वतंत्र घटक 20 यूएम इचिनाकोसाइड (1.8 ± 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; पी {{1 से अप्रभावित था। 0}}.58; चित्र 1)। सिनैप्टोसोम में 0.1 uM bafilomycin A1, एक वेसिकुलर ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर [26], 4-aminopyridine-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को काफी कम कर दिया गया था (2.2 ± 0.2 nmol/mg/ 5 मिनट; एफ (2,12)=249.518, पी=0।000)। बा-लोमाइसिन A1, 20 की उपस्थिति में uM इचिनाकोसाइड ग्लूटामेट (2.1 ± 0.2 nmol/mg/5 min; p=0.94; चित्र 1) की रिहाई को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करने में विफल रहा। इसके विपरीत, 10 uM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, एक ग्लूटामेट रीपटेक इनहिबिटर) [27], 4-अमीनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज को बढ़ाकर 11.8 ± 0.4 nmol/mg/5 min ( टी(8)=-11.31, पी=0.000)। यहां तक ​​कि डीएल-टीबीओए की उपस्थिति में भी, 20 यूएम इचिनाकोसाइड ने 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया (7.7 ± 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; एफ(2,12)=87.23, पी=0.000; चित्र 1)।

2.2 इचिनाकोसाइड साइटोसोलिक Ca2 प्लस एकाग्रता को कम करता है लेकिन सिनैप्टोसोमल झिल्ली क्षमता को नहीं बदलता है

1 मिमी 4-एमिनोपाइरीडीन की वजह से सिनैप्टोसोम विध्रुवण Ca2 प्लस सांद्रता (p=0.000; तालिका 1) में वृद्धि हुई। 20 uM इचिनाकोसाइड के अनुप्रयोग ने बेसल Ca2 प्लस सांद्रता (t(8)=0.06, p=0.95) को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया, लेकिन अमीनोपाइरीडीन-प्रेरित वृद्धि को उल्लेखनीय रूप से कम कर दिया Ca2 प्लस सांद्रता (t(10)=6.16, p=0.000)। इसके अलावा, 1 एमएम 4-एमिनोपाइरीडीन 3',3',3'-डिप्रोपाइलथियाडाइकारबोसायनिन आयोडाइड [DiSC3(5)] uorescence (p=0.000) में बढ़ गया। 20 uM इचिनाकोसाइड के जुड़ने से रेस्टिंग मेम्ब्रेन पोटेंशिअल (t(8)=0.976, p=0.36) में कोई बदलाव नहीं आया या DiSC3 में एमिनोपाइरीडीन-मध्यस्थता वृद्धि में उल्लेखनीय रूप से बदलाव नहीं आया। (5) प्रतिदीप्ति (टी(8)=-0.014, पी=0.99; तालिका 1)।

2.3 सीएवी2.2 (एन-टाइप) और सीएवी2.1 (पी/क्यू-टाइप) चैनलों के माध्यम से कम सीए2 प्लस इनॉक्स को एचिनाकोसाइड द्वारा 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज के निषेध के साथ जोड़ा जा सकता है

चित्र 2 से पता चलता है कि 2 uM o-conotoxin MVIIC, एक N- और P/Q-टाइप Ca2 प्लस चैनल ब्लॉकर, 7.4 ± {{10}} से 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को कम करता है। 2 से 2.0 ± 0.1 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट (टी(9)=25.35, पी=0.000)। ओ-कोनोटॉक्सिन एमवीआईआईसी की उपस्थिति में, 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर 20 यूएम इचिनाकोसाइड का प्रभाव निरर्थक था (1.8 2± प्लस 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; टी(8)=1.06,पी=0.32)। डेंट्रोलीन (10 यूएम), एंडोप्लाज्मिक से इंट्रासेल्युलर सीए रिलीज का अवरोधक

रेटिकुलम [28], कम 4-एमिनोपाइरीडीन से उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज (5.6 ± 0.3 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; एफ(2,14) {{10}}। 95, पृष्ठ=0.000)। हालांकि, डैंट्रोलिन की उपस्थिति में, 20 यूएम इचिनाकोसाइड अभी भी ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से रोक सकता है (3.3 ± 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; पी=0। 000)। 100 यूएम 7-क्लोरो-5-(2-क्लोरोफेनी)-1,5-डायहाइड्रो-4,1-बेंजोथियाजेपिन का उपयोग करके इसी तरह के परिणाम देखे गए। -2(3H)-one (CGP37157), माइटोकॉन्ड्रियल Na प्लस /Ca2 प्लस एक्सचेंज का एक झिल्ली-पारगम्य अवरोधक। पांच जांच किए गए सिनैप्टोसोमल तैयारियों में, 20 यूएम इचिनाकोसाइड ने 100 यूएम सीजीपी37157 के साथ मिलकर 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को 48.3 प्रतिशत ± 5.2 प्रतिशत (एफ (2,13) ​​= 136.79, पी {{ 49}}। 000), अकेले इचिनाकोसाइड द्वारा निषेध के समान (46.2 प्रतिशत ± 2.3 प्रतिशत; पी=0.89; चित्रा 2)।

2.4 इचिनाकोसाइडप्रोटीन किनेज सी के माध्यम से सिग्नलिंग द्वारा 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, 10 uM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) मेनिमाइड (GF109203X), एक सामान्य प्रोटीन काइनेज सी अवरोधक [29], कम 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज (F(2,13) ​​= 19.46, p=0।{{17 }}). GF109203X-उपचारित सिनैप्टोसोम में, 20 uM इचिनाकोसाइड ने 4-अमीनोपाइरीडीन से उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज़ को केवल 5.5 प्रतिशत ± 1.8 प्रतिशत (p=0.89) से कम कर दिया, अकेले इचिनाकोसाइड से कम (42.4 प्रतिशत ± 2.3) प्रतिशत; पी=0।000)। इसी तरह के परिणाम 5,6,7, 13-टेट्राहाइड्रो-13-मिथाइल-5-ऑक्सो-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 के साथ प्राप्त किए गए थे। ,4-c]कार्बाज़ोल-12-प्रोपेननिट्राइल (Go6976), Ca2 प्लस-निर्भर प्रोटीन किनसे सी आइसोफॉर्म (, I, II, y) [29] के लिए एक चयनात्मक। 3 uM Go6976 की उपस्थिति में, 20 uM इचिनाकोसाइड ने ग्लूटामेट रिलीज़ को 11.9 प्रतिशत ± 2.9 प्रतिशत (p=0.59) कम कर दिया, जो कि अकेले इचिनाकोसाइड की तुलना में एक महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है (42.4 प्रतिशत 2.3 प्रतिशत; p {{ 65}}.000; चित्र 3)। इसके विपरीत, 3 uM रॉटलरिन, एक Ca2 प्लस-स्वतंत्र प्रोटीन काइनेज C6 अवरोधक [30], ने 4- aminopyridine (1 mM)-विकसित ग्लूटामेट रिलीज़ (p=0.45) को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित नहीं किया। फिर भी, रॉटलरिन की उपस्थिति में, 20 यूएम इचिनाकोसाइड ने प्रभावी रूप से 37.1 प्रतिशत ± 5.6 प्रतिशत रिलीज (एफ (2,13) ​​= 19.72, पी=0 के औसत अवरोध का कारण बना। {{88 }}), अकेले इचिनाकोसाइड के समान (p=0.41; चित्र 3)। इसके अलावा, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज अवरोधक 2-(2-एमिनो-3-मेथोक्सीफेनिल)-4H-1-बेंजोपायरन-4-एक) (PD98059 ) (50 uM) और प्रोटीन काइनेज A अवरोधक N-[2-(p-bromocinnamylamino)एथिल]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 uM) कम 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज (पी=0.000)। पीडी98059 या एच89 की उपस्थिति में भी, 20 यूएम इचिनाकोसाइड ने रिलीज को प्रभावी ढंग से कम कर दिया (एफ(2,13) ​​= 52.3, पी=0।000; चित्र 3)।

चित्र 4 से पता चलता है कि 1 मिमी 4-एमिनोपाइरीडीन ने सिनैप्टोसोम (t(4)=-6.871, p=0.002) में प्रोटीन काइनेज सी के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया। जब सिनैप्टोसोम को 4-एमिनोपाइरीडीन जोड़ने से पहले 10 मिनट के लिए 20 यूएम इचिनाकोसाइड के साथ दिखाया गया था, 4-एमिनोपाइरीडीन प्रेरित प्रोटीन काइनेज सी के फॉस्फोराइलेशन में काफी कमी आई (एफ(2,6)=29.202 , पी=0.001)।

2.5 ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध में गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड टाइप ए (जीएबीएए) रिसेप्टर शामिल नहीं है

चित्रा 5 में, एसआर95531 (जीएबीएए रिसेप्टर का एक विरोधी) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के प्रभाव की तुलना की गई थी। इसके अलावा, 100 uM SR95531 ने 4- aminopyridine (1 mM) से उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज़ को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित नहीं किया। SR95531-उपचारित सिनैप्टोसोम में, 20 uM इचिनाकोसाइड के अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज़ (F(2,12)=42.63, p 4- पर 43 प्रतिशत अवरोधन हुआ। {18}}। 000), जो अकेले इचिनाकोसाइड द्वारा उत्पादित निषेध से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था (40 प्रतिशत; पी=0।000)। इसी तरह का परिणाम एक अन्य GABAA रिसेप्टर प्रतिपक्षी, bicuculline (50 uM) के साथ प्राप्त किया गया था। बाइक्यूकुललाइन और इचिनाकोसाइड की उपस्थिति में मापी गई रिहाई अकेले बाइक्यूकुललाइन (पी=0। 000) की उपस्थिति में प्राप्त की गई तुलना से काफी अलग थी।

3. चर्चा

इस अध्ययन में,इचिनाकोसाइड, Herba . में एक सक्रिय यौगिकसिस्टांचे, चूहे सेरेब्रल कॉर्टेक्स तंत्रिका टर्मिनलों में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को रोक दिया। के लिए संभावित अंतर्निहित तंत्रइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज के मध्यस्थता निषेध की आगे जांच की गई है और यहां चर्चा की गई है।

3.1 ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध के अंतर्निहित तंत्र

4-aminopyridine द्वारा उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज में दो घटक शामिल हैं: एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक Ca2 प्लस-निर्भर घटक, जो ग्लूटामेट युक्त सिनैप्टिक पुटिकाओं के एक्सोसाइटोसिस के माध्यम से उत्पन्न होता है; और एक Ca2 प्लस-स्वतंत्र घटक, जो लंबे समय तक विध्रुवण से उत्पन्न होता है, जिससे ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर की झिल्ली संभावित-मध्यस्थ शिफ्ट बाहरी दिशा की ओर स्थिर होती है, इस प्रकार साइटोसोलिक ग्लूटामेट efflux [31] को प्रभावित करती है। यहाँ, हमने देखा कि इचिनाकोसाइड ने Ca2 प्लस-मुक्त माध्यम (Ca2 प्लस-स्वतंत्र रिलीज) की उपस्थिति में अमीनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से बाधित नहीं किया। इसके अलावा, मनाया गया इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को bafilomycin A1 (जो सिनैप्टिक वेसिकल्स की ग्लूटामेट सामग्री को कम करता है) द्वारा प्रभावी ढंग से रोका गया था, लेकिन डीएल-टीबीओए द्वारा नहीं (जो गैर-चयनात्मक रूप से सभी उत्तेजक अमीनो एसिड को रोकता है। ट्रांसपोर्टर उपप्रकार)। इन परिणामों से पता चलता है कि इचिनाकोसाइड ग्लूटामेट रिलीज के Ca2 प्लस-निर्भर एक्सोसाइटोसिस को प्रभावित करता है, बिना तंत्रिका टर्मिनल प्लाज्मा झिल्ली ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर के उत्क्रमण के माध्यम से ग्लूटामेट के Ca2 प्लस-निर्भर साइटोसोलिक efflux को प्रभावित किए बिना। सिनैप्टिक टर्मिनलों में, ना प्लस चैनल अवरोध या के प्लस चैनल सक्रियण झिल्ली उत्तेजना को स्थिर करता है और परिणामस्वरूप विकसित सीए 2 प्लस प्रविष्टि और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज [32,33] को कम करता है। इसलिए, इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज अवरोध अंतर्निहित संभावित तंत्र में सिनैप्टोसोमल उत्तेजना में कमी शामिल है। हालांकि, यह संभावना दो टिप्पणियों के आधार पर अस्थिर है: (1) 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित झिल्ली संभावित विध्रुवण, जिसे झिल्ली संभावित संवेदनशील डाई DiSC3(5) से मापा जाता है, इचिनाकोसाइड के अतिरिक्त द्वारा अप्रभावित था; और (2) इचिनाकोसाइड ने 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित Ca2 प्लस-स्वतंत्र ग्लूटामेट रिलीज को प्रभावित नहीं किया, रिलीज का एक घटक जो केवल झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है [31]। यदि प्रभाव सिनैप्टोसोमल उत्तेजना दमन के कारण नहीं होता है, तो यह सीएवी 2.2 (एन-टाइप) और सीएवी 2.1 (पी / क्यू-टाइप) सीए 2 प्लस चैनलों की गतिविधि में कमी के माध्यम से प्रकट हो सकता है जो ग्लूटामेट एक्सोसाइटोसिस के साथ मिलकर बनता है। तंत्रिका टर्मिनल [34-36]। फरा -2 का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि इचिनाकोसाइड Ca2 प्लस सांद्रता में 4-अमीनोपाइरीडीन-विकसित वृद्धि को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, हमारे डेटा से पता चलता है कि 4- एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड का निरोधात्मक प्रभाव सीएवी 2.2 (एन-टाइप) और सीएवी 2 के अवरोधक के संपर्क में आने के बाद 42.4 प्रतिशत 2.3 प्रतिशत से घटकर 12.1 प्रतिशत 3.9 प्रतिशत हो गया। .1 (पी/क्यू-टाइप) सीए2 प्लस चैनल। इसके अलावा, हमने देखा कि इचिनाकोसाइड ने इंट्रासेल्युलर सीए 2 प्लस रिलीज इनहिबिटर की उपस्थिति में अमीनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करना जारी रखा। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सीएवी 2.2 (एन-टाइप) और सीएवी 2.1 (पी / क्यू-टाइप) सीए 2 प्लस चैनल गतिविधि का एक साथ दमन इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज अवरोध अंतर्निहित संभावित तंत्र है। हालांकि, सीएवी2.2 (एन-टाइप) और सीएवी2.1 (पी/क्यू-टाइप) सीए2 प्लस चैनल गतिविधि का संयुक्त सक्रियण इचिनाकोसाइड की क्रिया को पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं कर सका। इसलिए, अन्य अज्ञात प्रकार के Ca2 प्लस चैनल या अन्य प्रीसानेप्टिक मार्ग अवरोध में शामिल हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, GABAA रिसेप्टर्स प्रीसानेप्टिक स्तर पर मौजूद हैं, और उनके सक्रियण को Ca2 प्लस इन-ऑक्स और ग्लूटामेट रिलीज [37] को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। वर्तमान अध्ययन में, GABAA रिसेप्टर विरोधी SR95531 और bicuculline ने ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध को अवरुद्ध नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि GABAA रिसेप्टर्स वोल्टेज-निर्भर Ca2 प्लस चैनल गतिविधि में कमी और ग्लूटामेट रिलीज के बाद के निषेध में शामिल नहीं हैं। वोल्टेज पर निर्भर Ca2 प्लस चैनलों के माध्यम से Ca2 प्लस प्रवेश, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज, प्रोटीन किनेज सी, और प्रोटीन किनेज ए सहित तंत्रिका टर्मिनलों में ग्लूटामेट रिलीज से जुड़े कई प्रोटीन किनेसेस को सक्रिय करता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्रोटीन किनेज सी अवरोधक प्रभावी ढंग से इचिनाकोसाइड का विरोध करते हैं ग्लूटामेट रिलीज का मध्यस्थता निषेध; फिर भी, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे अवरोधक PD98059 या प्रोटीन किनेज A अवरोधक H89 अप्रभावी था। इसके अलावा, ग्लूटामेट रिलीज को रोकने के लिए प्रभावी एकाग्रता पर इचिनाकोसाइड के साथ प्रीट्रीटमेंट के बाद प्रोटीन कीनेज सी के एमिनोपाइरीडीन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन सिनैप्टोसोम में कम हो गया। इसलिए, इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज निषेध के सिग्नलिंग मार्ग में प्रोटीन किनेज सी शामिल हो सकता है। प्रोटीन किनेज सी एक महत्वपूर्ण इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग सिस्टम है जो प्रीसानेप्टिक स्तर पर मौजूद है और न्यूरोट्रांसमीटर एक्सोसाइटोसिस में महत्वपूर्ण भूमिका है। उदाहरण के लिए, सिनैप्टिक वेसिकल ट्रैफिकिंग या भर्ती और एक्सोसाइटोसिस में शामिल कई सिनैप्टिक प्रोटीन, जैसे कि मिरिस्टॉयलेटेड एलेनिन-समृद्ध सी किनेज सब्सट्रेट, प्रोटीन किनसे सी [38,39] द्वारा फॉस्फोराइलेट किया जाता है। इस फॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया को विध्रुवण-उत्तेजित Ca2 प्लस प्रविष्टि द्वारा बढ़ाया जा सकता है, जो ग्लूटामेट रिलीज [40] की सुविधा प्रदान करता है। इसलिए, हम यथोचित रूप से अनुमान लगा सकते हैं कि सीए 2 प्लस प्रविष्टि पर इचिनाकोसाइड का निरोधात्मक प्रभाव यहां देखा गया है जो प्रोटीन किनसे सी गतिविधि को कम कर सकता है और परिणामस्वरूप ग्लूटामेट रिलीज हो सकता है।

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