इशोफ्लोरोग्लुसीन ए आइसोलेटिड फ्रॉम इशिगे ओकामुराए सप्रेस्स मेलानोजेनेसिस इनड्यूस्ड बाय -एमएसएच: इन विट्रो एंड इन वीवो पार्ट 1

अमूर्त:इशिगे ओकामुरा (आईओ) से पृथक किए गए डिफ्लोरेथोहाइड्रॉक्सीकार्मालोल (डीपीएचसी) ने यूवी-बी विकिरण के खिलाफ संभावित श्वेत प्रभाव दिखाया। हालांकि, आईओ के घटकों और उनके आणविक तंत्र -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच) के खिलाफ अभी तक जांच नहीं की गई है। इस प्रकार, इस अध्ययन का उद्देश्य इशोफ्लोरोग्लुसीन ए (आईपीए) के निरोधात्मक प्रभावों की जांच करना है, एक -एमएसएच-प्रेरित जेब्राफिश मॉडल और बी16एफ10 मेलेनोमा कोशिकाओं में विवो में मेलेनोजेनेसिस में भूरे रंग के शैवाल आईओ और इसके कच्चे अर्क (आईओई) से पृथक एक फ्लोरोटैनिन। कृत्रिम परिवेशीय। फ्लोरोटैनिन्स के आणविक डॉकिंग अध्ययन उनके निरोधात्मक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किए गए थे और मेलेनोजेनेसिस से संबंधित एक ग्लाइकोप्रोटीन टाइरोसिनेज के साथ उनके इंटरैक्शन मोड को स्पष्ट करते हैं। इसके अलावा, IPA और IOE उपचार के बाद -MSH- प्रेरित zebrafish मॉडल में रूपात्मक परिवर्तन और मेलेनिन सामग्री में कमी आई। इसके अलावा, वेस्टर्न ब्लॉटिंग ने खुलासा किया कि IPA ने -MSH-उत्तेजित B16F10 कोशिकाओं में बाह्य-संबंधित प्रोटीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया। इसलिए, इन परिणामों से पता चलता है कि IOE से अलग किए गए IPA में दवा और कॉस्मेटिक उद्योगों में उपयोग की क्षमता है।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार,धनियाएक आम जड़ी बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ, और प्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना। सिस्टैच और स्किन व्हाइटनिंग के बीच का तंत्र सिस्टैच ग्लाइकोसाइड्स के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित है।मेलेनिनमानव त्वचा में tyrosinase द्वारा उत्प्रेरित tyrosine के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता है। ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना।

1 परिचय

समुद्री शैवाल ने कार्यात्मक भोजन, सौंदर्य प्रसाधन और दवा उद्योगों से अत्यधिक ध्यान आकर्षित किया है क्योंकि वे बायोएक्टिव यौगिकों जैसे कि फ्लोरोटैनिन, फ्यूकोइडान, पॉलीसेकेराइड और प्रोटीन [1-7] का उपयोग करते हैं। पिछले एक अध्ययन के अनुसार, इशिगे ओकामुराए (आईओ) की टाइरोसिनेज गतिविधि [8] पर इसके निरोधात्मक प्रभावों के लिए जांच की गई थी। हालांकि इसके फ्लोरोटैनिन, डिफ्लोरेथोहाइड्रॉक्सीकार्मोलोल (डीपीएचसी) का इन विट्रो मॉडल [8] में यूवी-बी विकिरण से प्रेरित एंटी-मेलानोजेनेसिस गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया गया था, डीपीएचसी और मेलानोजेनेसिस-संबंधित प्रोटीन के बीच बातचीत को समझाने के लिए आगे कोई अध्ययन नहीं किया गया था। इस अध्ययन में, एक आणविक डॉकिंग अध्ययन में डीपीएचसी की तुलना में, एक उपन्यास पॉलीफेनोल यौगिक, ईशोफ्लोरोग्लुसीन ए (आईपीए) [9] का टायरोसिनेज के साथ बातचीत के लिए मूल्यांकन किया गया था।

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आणविक डॉकिंग प्रोटीन की सक्रिय साइट के भीतर छोटे अणुओं या लिगेंड के संभावित बाध्यकारी मोड की भविष्यवाणी करने के लिए एक ज्ञात त्रि-आयामी संरचना के रिसेप्टर या उनके इंटरैक्शन पैटर्न का अध्ययन करने के लिए या दवा डिजाइन [10-12] के लिए एक कुशल कम्प्यूटेशनल विधि है। पिछले अध्ययनों ने आण्विक डॉकिंग अध्ययन [13,14] द्वारा जांच के अनुसार टाइरोसिनेस एंजाइम की अंतःक्रिया साइट और ऊर्जा मूल्य की सूचना दी है। कार्यात्मक रूप से, टायरोसिनेज एक दर-सीमित एंजाइम है जो सिग्नलिंग मार्ग में अपेक्षाकृत धीमी प्रतिक्रिया दर को उत्प्रेरित करता है और मेलेनोसाइटिक कोशिकाओं [15] द्वारा विशेष रूप से संश्लेषित मेलेनोसॉम्स नामक विशेष अंगों में मेलेनिन बायोसिंथेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, सिलिको आणविक डॉकिंग सिमुलेशन के माध्यम से मॉडलिंग के रूप में टाइरोसिनेस की एंजाइमैटिक गतिविधि त्वचीय हाइपरपिग्मेंटेड विकारों को रोकने के लिए अवरोधकों की जांच करने का लक्ष्य रही है। इसके आधार पर, प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल क्षेत्रों में, कई फेनोलिक यौगिकों या धातु चेलेटिंग क्षमता वाले अवरोधकों का व्यापक रूप से टाइरोसिनेस अवरोधक [16] के रूप में अध्ययन किया गया है।

मेलेनिन मुख्य रूप से त्वचा के रंग को नियंत्रित करता है और जब त्वचा यूवी विकिरण [17] के संपर्क में आती है तो सुरक्षात्मक वर्णक के रूप में कार्य करता है। यूवी विकिरण के संपर्क में मेलेनिन संश्लेषण को प्रेरित करने के लिए त्वचीय केराटिनोसाइट्स और मेलानोसाइट्स से -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच) की रिहाई का कारण बनता है और बाद में त्वचा को सौर विकिरण के हानिकारक प्रभाव से बचाता है [18]। हालांकि, यूवी विकिरण के लंबे समय तक संपर्क -एमएसएच द्वारा महत्वपूर्ण मेलेनिन संश्लेषण को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप त्वचा की क्षति होती है जैसे झाईयां, सनस्पॉट और एपिडर्मिस पर काले धब्बे, जिससे डीएनए फोटोडैमेज और त्वचा कैंसर [19] होता है। इसके बाद, मेलेनोमा [20] में मेलेनोजेनेसिस के लिए टायरोसिनेस गतिविधि में काफी बदलाव लाने के लिए मेलानोसाइट्स में -एमएसएच के प्रशासन का व्यापक अध्ययन किया गया है।

जेब्राफिश इंसानों की तरह त्वचा के रंग में विविधता प्रदर्शित करती है। वे एक पशु मॉडल हैं जिनका उपयोग मानव त्वचा के रंग की आनुवंशिक उत्पत्ति को समझने के लिए किया जाता है, बुनियादी मॉडल जीव जीव विज्ञान को मानव आनुवंशिकी [21] से जोड़ता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफिश गैस्ट्रुला के उदर और पार्श्व क्षेत्रों पर वर्णक और लार्वा चरणों के दौरान उनकी पारदर्शिता रंजकता प्रक्रिया के सरल अवलोकन की अनुमति देती है, जिससे मेलानोसाइट विकास में दोषों के परिणामस्वरूप त्वचा कोशिका विकारों को समझने के लिए व्यवहार्य मॉडल विकसित करने का अवसर मिलता है [22- 24]।

मेलेनिन संश्लेषण कई मेलेनोजेनेसिस-संबंधित प्रोटीन की गतिविधि के माध्यम से होता है, जैसे टायरोसिनेज, माइक्रोफथाल्मिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्शन कारक (एमआईटीएफ), टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन -1 (टीआरपी -2), और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन { {6}} (ट्रप-1) [15]। इस अध्ययन में, हमने त्वचा रंजकता और मेलेनोमा के इलाज में उनके संभावित उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए विवो में -MSH- प्रेरित ज़ेब्राफिश और इन विट्रो में B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं पर tyrosinase गतिविधि और मेलेनोजेनेसिस में IPA और IO क्रूड एक्सट्रैक्ट (IOE) के निरोधात्मक प्रभाव की जांच करने का लक्ष्य रखा है। .

2. परिणाम

2.1। आणविक डॉकिंग अध्ययन

IPA, DPHC, और अर्बुटिन [25] के साथ वाणिज्यिक टायरोसिनेस एंजाइम के बंधन को अनुकरण करने के लिए एक डॉकिंग विधि की गई। मशरूम टाइरोसिनेज के साथ आईपीए, डीपीएचसी, या अर्बुटिन के बाइंडिंग मोड चित्र 1ए-सी में प्रस्तुत किए गए हैं। जैसा कि tyrosinase-IPA कॉम्प्लेक्स (चित्र 1A), tyrosinase-DPHC (चित्र 1B), और tyrosinase-arbutin (चित्र 1C) के 3D आरेख में दिखाया गया है, हालाँकि IPA, DPHC, और arbutin सक्रिय साइट पर डॉक किया गया है, tyrosinase- आईपीए कॉम्प्लेक्स ने सबसे बड़ा बाध्यकारी सतह क्षेत्र दिखाया। इसके अलावा, जैसा कि एक 2डी आरेख में दिखाया गया है, टाइरोसिनेज-डीपीएचसी या टाइरोसिनेस-अर्बुटिन की तुलना में टायरोसिनेस-आईपीए कॉम्प्लेक्स ने टाइरोसिनेज के विभिन्न अमीनो एसिड के साथ अधिक बातचीत दिखाई। सात बेंजीन के छल्ले (पहला, दूसरा, तीसरा, आठवां, नौवां, बारहवां और सोलहवां) और उनके ऑक्सीजन परमाणुओं में हिस्टिडाइन6 0, मेथियोनीन61, लाइसिन157, ग्लूटामेट158, प्रोलाइन160, प्रोलाइन201, आर्जिनाइन206 और वैलाइन218 के साथ π-π इंटरैक्शन हैं। . विशेष रूप से, 16वीं बेंजीन रिंग को हिस्टिडाइन60 और हिस्टिडाइन204 के साथ जोड़ा गया था, जो सक्रिय साइट के मुख्य अमीनो एसिड हैं। इसके अलावा, IPA में कई ऑक्सीजन परमाणुओं ने ग्लूटामेट 158, प्रोलाइन 160, एस्पार्टेट 167, मेथिओनिन 184, फेनिलएलनिन 197, एस्पेरागिन 199, ग्लूटामाइन 202, एस्पेरागिन 205 और आर्जिनिन 209 के साथ हाइड्रोजन बांड के माध्यम से बातचीत की। इसके अलावा, डॉकिंग विश्लेषण परिणामों के आधार पर, यह गणना की गई थी कि डीएस 3.0 (चित्र 1डी) के सीडीओकेईआर इंटरेक्शन एनर्जी प्रोग्राम का उपयोग करके कुल बाध्यकारी ऊर्जा और सीडीओकेईआर इंटरेक्शन ऊर्जा इस प्रकार थी: टाइरोसिनेज के साथ इंटरैक्शन एनर्जी: इसोफ्लोरोग्लुसीन ए (आईपीए): - 152.154 किलो कैलोरी/मोल, डिफ्लोरथोहाइड्रॉक्सीकार्मोलोल (DPHC): -65.5221 किलो कैलोरी/मोल और अर्बुटिन: -33.6835 किलो कैलोरी/मोल और टाइरोसिनेज के साथ बाध्यकारी ऊर्जा: इसोफ्लोरोग्लुसीन ए (आईपीए): -546.504 किलो कैलोरी/मोल, डिफ्लोरेथोहाइड्रॉक्सीकार्मोलोल (डीपीएचसी): -407.706 किलो कैलोरी /mol और arbutin: -79.0913 kcal/mol।

2.2। Zebrafish लार्वा में मेलेनिन संश्लेषण पर मेलानोजेनिक अवरोधकों के प्रभाव

इस अध्ययन का उद्देश्य यह निर्धारित करना था कि क्या आईपीए और आईओई विवो में जेब्राफिश लार्वा में मेलानोजेनेसिस को रोक सकते हैं। हमारे पिछले अध्ययन में, IPA और IOE ने zebrafish लार्वा [26] में कोई विषाक्तता नहीं दिखाई। हमने जेब्राफिश लार्वा का इलाज जेब्राफिश (0.05, 0.15, और 0.5 एनएम) और आईओई (3, 10, और 30 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ किया ) उनकी मेलेनिन सामग्री निर्धारित करने के लिए। निरोधात्मक गतिविधियों का अनुमान लगाने के लिए, हमने जेब्राफिश अर्क की कुल मेलेनिन सामग्री को मापा। ज़ेब्राफिश मेलेनिन पर फेनोटाइपिक प्रभाव कमरे के तापमान पर एक माइक्रोस्कोप के तहत उनके शरीर के रंजकता का विश्लेषण करके देखा गया था। लक्ष्य अवरोधकों (चित्र 2) की विभिन्न सांद्रता द्वारा सतह मेलेनिन को काफी कम कर दिया गया था। 3 एनएम-एमएसएच के साथ उपचार ने अनुपचारित समूह की तुलना में जेब्राफिश की मेलेनिन सामग्री में काफी वृद्धि की। IPA (0.5 nM) और IOE (30 µg/mL) की उच्चतम सांद्रता ने कुल मेलेनिन सामग्री को क्रमशः 28.56 प्रतिशत और 30.36 प्रतिशत घटा दिया, जिसने अर्बुटिन (200 µM)-उपचारित समूह के समान प्रभाव प्रस्तुत किया (चित्र 2ए, बी)।

2.3। B16F10 कोशिकाओं में मेलेनिन संश्लेषण पर IPA और IOE का प्रभाव

B16F1 0 कोशिकाओं पर IPA और IOE के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को MTT (3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,{{ 7}}डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड) परख। हमने शुरू में B16F1 0 कोशिकाओं पर IPA और IOE के साइटोटोक्सिक प्रभावों की जांच की, जिनका बिना -MSH उत्तेजना के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। आईपीए (0.15, 0.5, 1.5, और 5 एनएम) ने बी16एफ10 कोशिकाओं पर कोई महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिसिटी प्रकट नहीं की, जबकि आईओई (1, 3, 10, और 30 माइक्रोग्राम/एमएल) ने कोई साइटोटोक्सिसिटी नहीं दिखाई (चित्र 3ए, बी)। आगे के अध्ययन के लिए बिना किसी विषाक्तता वाले IPA और IOE की सांद्रता का उपयोग किया गया।

हमने जांच की कि क्या विवो में IPA या IOE उपचार से मेलेनिन निषेध का प्रभाव B16F10 कोशिकाओं में -MSH उत्तेजना के बिना प्रतिवर्ती था। नियंत्रण समूह (चित्रा 3सी, डी) की तुलना में आईपीए (5 एनएम) या आईओई (30 μg/mL) के साथ उपचार पर मेलेनिन सामग्री में काफी कमी आई थी। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि IPA और IOE ने B16F10 कोशिकाओं में -MSH उत्तेजना के बिना मेलेनिन संश्लेषण को रोक दिया, इस प्रकार इसके एंटी-मेलानोजेनेसिस प्रभाव में योगदान दिया।

2.4। -MSH-उत्तेजित B16F10 कोशिकाओं में Tyrosinase गतिविधि और मेलेनिन संश्लेषण पर IPA और IOE का प्रभाव

इसलिए, IPA (0.5, 1.5, और 5 nM) और IOE (3, 10, और 30 µg/mL) की खुराक को B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि सेलुलर टाइरोसिनेस गतिविधि और -MSH में उनकी बायोएक्टिविटी का निर्धारण किया जा सके। -मध्यस्थ मेलानोजेनेसिस।

B16F10 कोशिकाओं (चित्रा S2A-D) में उनके साइटोटॉक्सिसिटी और मेलेनिन उत्पादन के परिणामों के आधार पर -MSH और अर्बुटिन की सांद्रता निर्धारित की गई थी। उत्तरजीविता दर पर डेटा का विश्लेषण करके, आगे के प्रयोगों के लिए 1 एनएम -एमएसएच और 100 माइक्रोन आर्बुटिन का उपयोग किया गया।

सेलुलर टाइरोसिनेस गतिविधि के लिए, हालांकि आईपीए के 1.5 एनएम के निरोधात्मक प्रभाव सकारात्मक नियंत्रण में दर्शाए गए लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कम थे, एकाग्रता लगभग 10 गुना भिन्न थी, जिसमें 100 माइक्रोन (चित्रा 4ए) पर आर्बुटिन की उच्च एकाग्रता थी। IOE ने -MSH-उपचारित समूह (चित्र 4B) की तुलना में विभिन्न सांद्रता के प्रभावों के बीच मामूली उतार-चढ़ाव के साथ tyrosinase गतिविधि को कम किया। -एमएसएच-मध्यस्थता मेलानोजेनेसिस के लिए, मेलेनिन सामग्री में महत्वपूर्ण कमी 1.5 और 5 एनएम आईपीए-उपचारित समूहों (चित्रा 4सी) में देखी गई थी। इसके अलावा, 30 μg/mL IOE ने रंजकता को उस बिंदु तक रोक दिया जो रिक्त समूह (चित्र 4D) जैसा दिखता था। इन परिणामों से पता चलता है कि IPA और IOE ने टाइरोसिनेज गतिविधि को कम कर दिया है और यह निरोधात्मक प्रभाव B16F10 कोशिकाओं में सेलुलर मेलेनिन संश्लेषण को कम कर सकता है।

2.5। -MSH-उत्तेजित B16F10 कोशिकाओं में आणविक तंत्र पर IPA और IOE का प्रभाव

उनके मेलानोजेनेसिस निरोधात्मक प्रभाव के लिए जिम्मेदार तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, हमने मेलेनिन संश्लेषण (चित्रा 5) में शामिल सिग्नलिंग अणुओं के अभिव्यक्ति स्तरों पर आईपीए और आईओई के प्रभाव को निर्धारित किया। ERK (एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनेज), JNK (जून एन-टर्मिनल किनेज), और p38 माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज (MAPK) इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन कैस्केड [27,28] से संबंधित हैं। जैसा कि चित्र 5ए, बी में प्रस्तुत किया गया है, ईआरके फास्फारिलीकरण को आईपीए उपचार के साथ बढ़ाया गया था, जबकि आईपीए (1.5 और 5 एनएम) या आईओई (30 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ उपचार के बाद जेएनके का फास्फारिलीकरण थोड़ा कम हो गया था। इसके अलावा, जैसा कि चित्र 5सी में प्रस्तुत किया गया है, नियंत्रण की तुलना में लगभग 80 प्रतिशत पर -एमएसएच-उत्तेजित समूहों में पी-पी38 स्तर अत्यधिक बढ़ गए थे। इसके अलावा, IPA, IOE, या arbutin के साथ उपचार के बाद, p38 का फॉस्फोराइलेशन थोड़ा दबा हुआ था। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि आईपीए और आईओई के मेलानोजेनिक निरोधात्मक प्रभाव जेएनके और पी38 एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग से संबंधित हो सकते हैं।

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