त्वचा की उम्र बढ़ने के खिलाफ एंटीऑक्सीडेंट बूस्टर के रूप में जैस्मीनम सांबैक सेल अर्क भाग 1

अमूर्त: ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पादों (एजीई) के गठन के माध्यम से त्वचा की उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। इसलिए त्वचा देखभाल बाजार में एंटीऑक्सीडेंट अवयवों की आवश्यकता होती है और पादप कोशिका संस्कृतियों से आने वाले अणुओं का उपयोग एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। इस पेपर में, जैस्मीनम साम्बैक कोशिकाओं (जैशएक्स) द्वारा प्राप्त हाइड्रोएथेनॉलिक अर्क की विशेषताओं का पता लगाया गया था। एंटीऑक्सिडेंट और एंटी-एजीई गुणों की जांच मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक और बायो-इन्फॉर्मेटिक इन विट्रो और एक्स विवो प्रयोगों के संयोजन से एक बहु-विषयक दृष्टिकोण द्वारा की गई थी। जैशेक्स में फेनोलिक एसिड डेरिवेटिव, लिग्नान और ट्राइटरपीन होते हैं और यह बहिर्जात तनाव के संपर्क में आने वाले केराटिनोसाइट्स में साइटोसोलिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को कम करने के लिए पाया गया था। इसने AGE गठन को कम करने और बाह्य मैट्रिक्स में कोलेजन प्रकार I उत्पादन को बढ़ाने की क्षमता भी दिखाई। डेटा से पता चला है कि जैशएक्स एंटीऑक्सीडेंट गुण इसके मुक्त कट्टरपंथी सफाई और धातु चेलेटिंग गतिविधियों और एनआरएफ 2/एआरई मार्ग के सक्रियण से संबंधित थे। यह एलपीएस-उत्तेजित मैक्रोफेज में एनओ स्तर में कमी से संबंधित जैशेक्स विरोधी भड़काऊ गतिविधि को अच्छी तरह से समझा सकता है। इस प्रकार, जैशएक्स को ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित त्वचा की उम्र बढ़ने के खिलाफ एक शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट बूस्टर माना जा सकता है।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ कर सकती है, मुक्त कट्टरपंथी प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोक सकती है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव डालती है।

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कीवर्ड: त्वचा की उम्र बढ़ना; प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस); उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पाद (एजीई); जैस्मीनम साम्बक हाइड्रोएथेनॉलिक अर्क (जसहेक्स); मास स्पेक्ट्रोमेट्री; चयापचय; वैश्विक प्राकृतिक उत्पाद सामाजिक आणविक नेटवर्किंग (जीएनपीएस); परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (एनआरएफ2)

1 परिचय

आनुवंशिक आंतरिक कारक और बाहरी एजेंट जैसे पराबैंगनी विकिरण, अवरक्त विकिरण, ज़ेनोबायोटिक्स और पर्यावरण प्रदूषक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन का कारण बनते हैं। वे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला, साइटोक्रोम पी450 और एनएडीपीएच ऑक्सीडेस [1] के सक्रियण से उत्पन्न होते हैं। आरओएस में मुक्त रेडिकल (सुपरऑक्साइड आयन, हाइड्रोपरॉक्सिल रेडिकल, एल्कोक्सी रेडिकल और हाइड्रॉक्सिल रेडिकल) और गैर-रेडिकल अणु (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सिंगलेट ऑक्सीजन) शामिल हैं [2]। जब एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम अभिभूत हो जाते हैं, तो आरओएस कोशिकाओं के भीतर जमा हो जाता है और तथाकथित ऑक्सीडेटिव तनाव उत्पन्न करता है जो त्वचा की उम्र बढ़ने में मुख्य योगदानकर्ता है [3]।

वास्तव में, ऑक्सीडेटिव तनाव डीएनए क्षति और लिपिड और प्रोटीन ऑक्सीकरण दोनों का कारण बनता है, साथ ही माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस (एमएपीके) मार्ग (AKT, JNK, ERK, और p38) को ट्रिगर करता है [4]। यह, बदले में, प्रतिलेखन कारकों AP-1 और NF-κB की उत्तेजना के माध्यम से प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स, विकास कारकों और चिपकने वाले अणुओं की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, एमएपीके पाथवे सक्रियण कोलेजन के स्तर को कम करके त्वचीय मैट्रिक्स परिवर्तन का कारण बनता है। यह मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) और उनके ऊतक अवरोधक टीआईएमपी की अभिव्यक्ति को संशोधित करके कोलेजन टूटने को तेज करता है और यह टीजीएफ-प्रकार II रिसेप्टर/स्मॉड सिग्नलिंग को अवरुद्ध करके नए कोलेजन के संश्लेषण को कम करता है। इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव त्वचा की स्थितियों को बदल देता है, जिससे एपिडर्मल कैल्शियम ग्रेडिएंट बाधित होता है, जो कॉर्निफाइड लिफाफे की अखंडता और कार्य के लिए आवश्यक है, वसामय ग्रंथियों के कार्य को उत्तेजित करता है और मेलानोसाइट अध: पतन को प्रेरित करता है [5]।

समानांतर में, उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पादों (एजीई) के रूप में जाने जाने वाले संशोधित बायोमोलेक्यूल्स का गठन कोशिकाओं और ऊतकों में ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ावा देता है [6]। इन उम्र बढ़ने वाले बायोमार्करों का विकास विभिन्न पर्यावरणीय कारकों जैसे सिगरेट के धुएं, उच्च स्तर के परिष्कृत और सरल कार्बोहाइड्रेट आहार, उच्च तापमान वाले पके हुए भोजन और एक गतिहीन जीवन शैली से प्रेरित होता है; AGE स्थिर और अपरिवर्तनीय उत्पाद हैं जो कम करने वाली शर्करा और प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड या लिपिड के बीच गैर-एंजाइमी प्रतिक्रिया से प्राप्त होते हैं, जिसके बाद आगे पुनर्व्यवस्था होती है [7]। दरअसल, AGE गठन का प्रारंभिक बिंदु माइलार्ड प्रतिक्रिया है जिसमें कम करने वाली शर्करा के कार्बोनिल समूह प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड या एमिनोफॉस्फोलिपिड के मुक्त अमीनो समूहों के साथ शिफ बेस बनाने के लिए विपरीत प्रतिक्रिया करते हैं। ये इमाइन्स स्वतः ही अधिक स्थिर केटामाइन में पुनर्व्यवस्थित हो जाते हैं, जिन्हें अमाडोरी उत्पाद कहा जाता है। वे प्रतिक्रियाशील डाइकारबोनिल्स (ग्लाइऑक्सल या मिथाइलग्लॉक्सल के रूप में) का उत्पादन करते हैं जो प्रोटीन के लाइसिन और आर्गिनिन कार्यात्मक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, जिससे बड़ी संख्या में AGEs उत्पन्न होते हैं [8,9]। प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने और क्रॉसलिंक बनाने की उनकी क्षमता के आधार पर उन्हें विभिन्न समूहों में वर्गीकृत किया गया है।

AGE क्रिया की मध्यस्थता AGEs (RAGEs) के लिए रिसेप्टर्स द्वारा की जाती है, जो टाइप I सेल सतह अणुओं के इम्युनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली से संबंधित ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन होते हैं, जो केराटिनोसाइट्स, फ़ाइब्रोब्लास्ट और मैक्रोफेज सहित विभिन्न सेल प्रकारों में व्यक्त होते हैं। बाइंडिंग AGEs/RAGEs मुख्य रूप से NADPH ऑक्सीडेस (NOXes) और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के सक्रियण से ROS उत्पादन को बढ़ाता है, जिससे ऑक्सीडेटिव तनाव और उपरोक्त सभी परिणामी प्रभाव होते हैं [6,8]।

इसके अलावा, बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन, विशेष रूप से कोलेजन, ग्लाइकेशन के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। दरअसल, कोलेजन से प्राप्त एजीई संरचना पेंटोसिडाइन का स्तर, युवा विषयों की तुलना में बूढ़ों में काफी अधिक है [10]। कोलेजन ग्लाइकेशन न केवल कोलेजन के यांत्रिक गुणों को बदलता है, जो कठोर और अधिक भंगुर हो जाता है [11] बल्कि बाह्य मैट्रिक्स के गुणों को भी बदलता है, जो निवासी कोशिकाओं के व्यवहार (विकास, विभेदन, गतिशीलता, जीन अभिव्यक्ति और प्रतिक्रिया) को प्रभावित करता है। साइटोकिन्स) और मैट्रिक्स-सेल इंटरैक्शन [12]।

इस परिदृश्य में, एजीई गठन और उनके संबंधित ऑक्सीडेटिव कैस्केड को कम करने के लिए कॉस्मेटिक क्षेत्र में एंटीऑक्सीडेंट अवयवों की काफी मांग है: ओलेसी परिवार से संबंधित प्रजाति जैस्मिनम सांबैक से प्राप्त अर्क, उनके एंटीऑक्सीडेंट गुणों और लोक में उनके संयुक्त उपयोग के लिए दिलचस्प हैं। त्वचा रोगों के इलाज के लिए दवा [13]। हालाँकि, पौधों के अर्क में कई नुकसान दिखाई देते हैं जैसे खराब जैव-स्थिरता, कीटनाशकों, उर्वरकों या रोगजनकों के साथ संभावित संदूषण और मौसम और पर्यावरणीय परिस्थितियों से प्रभावित उनकी गुणात्मक और मात्रात्मक संरचना की परिवर्तनशीलता। बायोएक्टिव कॉस्मेटिक अवयवों के स्रोत के रूप में पौधों का एक वैध विकल्प, पादप कोशिका संस्कृतियों द्वारा दर्शाया जाता है जो कई फायदे प्रदान करते हैं: (i) उत्पादन प्रक्रिया की उच्च स्थिरता, क्योंकि किसी कृषि भूमि की आवश्यकता नहीं है; (ii) भौगोलिक, मौसम और पौधों के प्रजनन चक्र पर निर्भरता के बिना प्राकृतिक उत्पादों की निरंतर आपूर्ति; (iii) रोगजनकों, पर्यावरण प्रदूषकों और कृषि रसायन अवशेषों द्वारा संदूषण का कोई जोखिम नहीं; (iv) मानकीकृत बढ़ती स्थितियाँ जो बायोमास और मेटाबोलाइट उपज की उच्च और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दर प्राप्त करने की अनुमति देती हैं; (v) उच्च बहुमुखी प्रतिभा, क्योंकि यौगिकों की सांद्रता को संवर्धन स्थितियों को बदलकर अनुकूलित किया जा सकता है और (vi) आसान और कम समय लेने वाले निष्कर्षण प्रोटोकॉल, आक्रामक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता को कम करते हैं [14,15]।

यहां, जैस्मिनम साम्बैक सेल कल्चर (जैशेक्स) से प्राप्त हाइड्रोएथेनॉलिक अर्क का अध्ययन किया गया। हमारे अध्ययन का उद्देश्य जैशेक्स का व्यापक रासायनिक और जैविक लक्षण वर्णन करना है, विशेष रूप से इसके एंटी-ग्लाइकेशन और एंटी-एजिंग गुणों की खोज करना। सबसे पहले, अर्क का विस्तृत संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। फिर, जैशेक्स की जैविक गतिविधि को एंटी-ऑक्सीडेंट के रूप में साबित करने के लिए इन विट्रो और एक्स विवो प्रयोग किए गए।

2। सामग्री और विधि

2.1. पादप ऊतक संवर्धन और अर्क तैयार करना

प्रमाणित अरेबियन चमेली (जैस्मिनम सांबैक) एक स्थानीय नर्सरी ("लाड्रे डि पियांटे", पिस्तोइया, टोस्काना क्षेत्र, इटली) से प्राप्त की गई थी। जैस्मिनम साम्बक की पत्तियों को 1 मिनट के लिए 7{6}} प्रतिशत इथेनॉल (सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में भिगोया गया और ट्वीन 2 के साथ पूरक वाणिज्यिक ब्लीच के 1 प्रतिशत (v/v) के साथ सतह को निष्फल किया गया। 9}} (सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) 8 मिनट के लिए, उसके बाद बाँझ आसुत जल में तीन बार कुल्ला। फिर, पत्तियों को 0.5-1.0 सेमी टुकड़ों में काटा गया और 3 प्रतिशत (w/v) सुक्रोज युक्त पूर्ण-शक्ति एमएस माध्यम [16] पर संवर्धित किया गया, 0 .2 मिलीग्राम/लीटर 2,4डी, और 8 ग्राम/लीटर फाइटो-एगर। खोजकर्ताओं को तीन महीने के लिए एक ताजा माध्यम पर मासिक उपसंस्कृति दी गई। एक बार जब पीला-हरा, भुरभुरा और तेजी से बढ़ने वाला कैलस प्राप्त हो गया, तो पौधों की कोशिकाओं को तरल एमएस माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया, 3 प्रतिशत (w/v) सुक्रोज और 0.2 mg/L 2,4D के साथ पूरक किया गया। निलंबन को एक अँधेरे जलवायु वाले कमरे में 110 बजे और 27 ◦C पर जाइरेटरी शेकर में हिलाया गया। लगभग 177 ग्राम/लीटर के तरल निलंबन संस्कृतियों तक पहुंचने तक अंधेरे में विकसित कोशिकाओं को हर हफ्ते छोटे पैमाने से बड़े पैमाने के फ्लास्क तक बढ़ाया गया। जैस्मीनम सांबैक सेल कल्चर हाइड्रो-एथेनॉलिक एक्सट्रैक्ट (जैसएचईएक्स) की तैयारी 500 ग्राम कोशिकाओं में इथेनॉल/पानी (90/10, वी/वी) के 2000 एमएल घोल को मिलाकर की गई थी। ग्रिंडोमिक्स GM300 चाकू मिल (रेत्श जीएमबीएच, हान, जर्मनी) का उपयोग करके मिश्रण को 1500 आरपीएम पर 3 मिनट और 3800 आरपीएम पर 6 मिनट के लिए समरूप बनाया गया था। प्राप्त निलंबन को प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 400 आरपीएम पर हिलाया गया। फिर सस्पेंशन को 6300 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए 4 ◦C पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया, फ़िल्टर किया गया, और फिर 25 ◦C पर सेट एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, जर्मनी) में वैक्यूम के नीचे केंद्रित किया गया। अंत में, पीएच को 10 एन NaOH के साथ 7.0 पर लाया गया और फिर एक अच्छा पाउडर प्राप्त होने तक फ्रीज में सुखाया गया।

2.2. जैशेक्स रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए यूपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण

एक द्विध्रुवीय ब्यूटेनॉल/जल निष्कर्षण हासिल किया गया। अल्टिमेट™ 3000 यूपीएलसी प्रणाली (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) से सुसज्जित क्यू-एक्सएक्टिव क्लासिक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किए गए यूपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण से पहले ब्यूटेनॉल अंश को मेथनॉल (10 मिलीग्राम/एमएल) में पिघलाया गया था। ). सभी क्रोमैटोग्राफ़िक रन पहले से ही सेकासी एट अल द्वारा बताए गए अनुसार किए गए थे। [17].

2.3. वैश्विक प्राकृतिक उत्पाद सामाजिक आणविक नेटवर्किंग विश्लेषण

मेटाबोलाइट पहचान के लिए, वैश्विक प्राकृतिक उत्पाद सामाजिक आणविक नेटवर्किंग को नियोजित किया गया था [18]। जीएनपीएस द्वारा निर्दिष्ट नहीं किए गए उन सभी एमएस और एमएसएमएस संकेतों की बुद्धिमानी से जांच की गई और तदनुसार साहित्य को सौंपा गया। जीएनपीएस स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी खोज से पहले, कच्ची फाइलों को एमएस कन्वर्टर जनरल यूजर इंटरफेस सॉफ्टवेयर द्वारा एमजेडएक्सएमएल प्रारूप में परिवर्तित किया गया था। इसे 0.025 Da की पूर्ववर्ती आयन द्रव्यमान सहनशीलता, 0.02 Da की खंडित आयन द्रव्यमान सहनशीलता, 2 की न्यूनतम मिलान चोटियाँ, और 0.7 की स्कोर सीमा का उपयोग करके किया गया था। परिणामों की मैन्युअल रूप से पुष्टि की गई।

डेटा प्री-प्रोसेसिंग Mzmin (संस्करण 2.53, सॉफ्टपीडिया, बुखारेस्ट, रोमानिया) द्वारा किया गया था [19] और एक फ़ीचर-आधारित आणविक नेटवर्किंग (FBMN) कार्य [20] किया गया था, जैसा कि Ceccacci et al द्वारा रिपोर्ट किया गया था। [17]. प्राप्त नेटवर्क फ़ाइलों को साइटोस्केप (संस्करण 3.9.1, यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस), बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) [21] में आयात किया गया था।

2.4. लिग्नांस और ट्राइटरपेन्स का मात्रात्मक विश्लेषण

गुणात्मक प्रयोगों के लिए बताई गई समान यूपीएलसी सेटिंग्स को लिग्नांस के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया था, जबकि ट्राइटरपीन के लिए, उन्हें आइसोमर्स, अर्जुनोलिक/एशियाटिक एसिड और ओलीनोलिक/उर्सोलिक एसिड के दो जोड़े को अलग करने के लिए सुधार किया गया था। जैसा कि पहले परिभाषित किया गया था, विश्लेषण क्यू-एक्सएक्टिव क्लासिक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया था। पृथक्करण एक फेनोमेनेक्स काइनेटेक्स (टॉरेंस, सीए, यूएसए) ईवीओ सी 18 300 Å (15 {{12 }} × 2.1 मिमी, कण आकार 5 µm) द्वारा किया गया था। मोबाइल चरण में ए (5 मिमी अमोनियम एसीटेट जलीय घोल, पीएच 9.00 अमोनियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा समायोजित) और बी (1{{4{53}}}}0 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल) का उपयोग शामिल था। 0-20 मिनट पर 13-28 प्रतिशत बी, 20-24 मिनट पर 28-65 प्रतिशत बी, 24-28 मिनट पर 65-75 प्रतिशत बी, 28-28.5 मिनट पर 75-95 प्रतिशत, 28.5 पर 95 प्रतिशत का क्रमिक निक्षालन -32 मिनट, 32-32.1 मिनट पर 95-13 प्रतिशत और 32.1-44 मिनट पर 13 प्रतिशत। प्रवाह दर 0.450 एमएल/मिनट थी और इंजेक्शन की मात्रा 5 μL थी। लिगनेन और ट्राइटरपीन दोनों के लिए, डेटा को सेकासी एट अल द्वारा वर्णित द्रव्यमान विधि से प्राप्त किया गया था। [17]. हमने बायोसिंथ कार्बोसिंथ से नॉर्टाचेलोजेनिन (#LCA52174), फाइटोलैब जीएमबीएच एंड कंपनी केजी से मैटैरेसिनॉल (#80497) और मैसलिनिक एसिड (#83209), सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस) से सेकोइसोलैरिसिरेसिनॉल (#60372) और अर्जुनोलिक एसिड (#SMB00119) खरीदा। , एमआई, यूएसए), एशियाटिक एसिड (#0027), ओलीनोलिक एसिड (#0041 एस) और एक्स्ट्रासिंथेस (जेने, फ्रांस) से उर्सोलिक एसिड (#0037 एस)। लिगनेन के लिए 0.05 से 25 µM की सांद्रता और ट्राइटरपेन्स के लिए 0.1 से 25/250 µM की सांद्रता पर मानकों को इंजेक्ट करके अंशांकन वक्र प्राप्त किए गए थे। मानकों के लिए पता लगाने की सीमा (एलओडी) और परिमाणीकरण की सीमा (एलओक्यू) सिग्नल-टू-शोर (एस/एन) अनुपात के आधार पर निर्धारित की गई थी।

2.5. त्वचा कोशिका संवर्धन और व्याख्याकार

एडेक्सबियो टेक्नोलॉजीज (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) से खरीदे गए अमर मानव केराटिनोसाइट्स (HaCaT) को डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम; सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में संरक्षित किया गया था, जिसे 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक किया गया था। (एफबीएस; सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) 95 प्रतिशत हवा, 5 प्रतिशत सीओ2, और 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र वातावरण में। मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफ) को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) के पूरक के साथ डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में संरक्षित किया गया था। ) 95 प्रतिशत हवा में, 5 प्रतिशत CO2, और 37 ◦C पर आर्द्र वातावरण में। सर्जरी सेंटर विला सिंजिया (नेपल्स, इटली) में स्वस्थ महिला दाताओं (उम्र 31 और 40 वर्ष) की त्वचा से प्राप्त त्वचा एक्सप्लांट्स को डीएमईएम/एफबीएस में ट्रांसवेल प्लेटों और वायु-तरल स्थितियों में एंटीबायोटिक दवाओं में संवर्धित किया गया था। 5 प्रतिशत CO2 आर्द्र हवा में 37 ◦C पर। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार, सभी दाताओं ने त्वचा के ऊतकों के उपयोग के लिए अपनी लिखित सूचित सहमति दी थी।

2.6. H2O2-तनावग्रस्त HaCaT कोशिकाओं में साइटोसोलिक ROS परख

इस प्रक्रिया के लिए, 1.8 × 104 HaCaT को अच्छी तरह से प्लेटों में बोया गया और 2 घंटे तक उगाया गया। फिर कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए जैशएक्स ({{10%).0006 प्रतिशत, 0.002 प्रतिशत, और 0.006 प्रतिशत पी/वी) की विभिन्न सांद्रता के साथ या 500 µM एस्कॉर्बिक एसिड के साथ इलाज किया गया, जिसका उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया। उसके बाद, उन्हें पीबीएस (फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन) में धोया गया और 100 µL/वेल घोल के साथ 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया, जिसमें शामिल थे: 10 mM हेप्स, 1.3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM ग्लूकोज, और 5 µM CM-H2DCFDA (5-(और-6)-क्लोरोमेथाइल-20,70 -डाइक्लोरोडीहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट, इनविट्रोजन)। 45 मिनट के बाद, एक पीबीएस वॉश किया गया और उपकरण एनविज़न (पर्किनएल्मर, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके कोशिकाओं की बेसलाइन प्रतिदीप्ति तीव्रता 535 एनएम (उत्तेजना 485 एनएम) पर मापी गई। फिर, 450 µM H2O2 जोड़कर ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित किया गया, और नमूनों की प्रतिदीप्ति को 30 मिनट के बाद मापा गया।

2.7. ग्लाइऑक्सल स्ट्रेस्ड ह्यूमन डर्मल फ़ाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफ) कोशिकाओं में उम्र का पता लगाने के लिए एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)

इस चरण के लिए, 1.5 × 1{8}}4 एचडीएफ को अच्छी तरह से प्लेटों में बोया गया और 2 दिनों तक उगाया गया। पीबीएस के साथ धोने के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस में 100 μL 4 प्रतिशत फॉर्मेल्डिहाइड के साथ 1 {{1 {{13 }}}} मिनट के लिए तय किया गया था। इसके बाद, उन्हें 1 सप्ताह के लिए 50 ◦C पर 0.5 प्रतिशत ग्लाइऑक्सल की उपस्थिति में जैशेक्स (0.0006 प्रतिशत और 0.002 प्रतिशत पी/वी) या 1 µM एमिनोगुआनिडाइन के सकारात्मक नियंत्रण के साथ इलाज किया गया। ऊष्मायन के बाद, उन्हें AGE (Abcam ab23722) के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) के लिए संसाधित किया गया था।

2.8. फाइब्रिलिन का पता लगाने के लिए मिथाइल-ग्लाइऑक्सल स्ट्रेस्ड स्किन एक्सप्लांट्स पर इम्यूनोहिस्टोफ्लोरेसेंस परख

त्वचा के एक्सप्लांट 31 और 4{2}} वर्ष के दो रोगियों से प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक त्वचा बायोप्सी से, वायु-तरल इंटरफ़ेस पर होने वाले प्रत्येक उपचार के लिए तीन पंच उत्पन्न किए गए थे। पहले दिन, घूंसे का उपचार जैशएक्स ({{4%).002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत पी/वी) या सकारात्मक नियंत्रण (1 मिमी एमिनोगुआनिडाइन) के साथ किया गया और 24 घंटे के बाद, 500 µM मिथाइल- ग्लाइऑक्सल मिलाया गया। उपचारों को कुल सात दिनों तक हर दो दिन में ताज़ा किया गया। अवधि के अंत में, पंचों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया, 4 प्रतिशत पीएफए ​​में तय किया गया, 15 प्रतिशत सुक्रोज में इनक्यूबेट किया गया, फिर 30 प्रतिशत सुक्रोज में, और क्रायो को -80 ◦C पर OCT कंपाउंड (इष्टतम कटिंग तापमान) में संग्रहित किया गया। . क्रायोस्टेट सीएम1520 लीका (लीका बायोसिस्टम्स, बफ़ेलो, आईएल, यूएसए) के साथ 5 µm का क्रायोसेक्शन प्राप्त किया गया था। क्रायोसेक्शन वाली स्लाइडों को पीबीएस में 30 मिनट के लिए हाइड्रेट किया गया और 1 घंटे के लिए "अवरुद्ध" समाधान (6 प्रतिशत बीएसए, 5 प्रतिशत सीरम, 20 मिमी एमजीसीएल 2, 0.2 प्रतिशत ट्वीन) में रखा गया। इसके बाद, उन्हें प्राथमिक एंटी-फाइब्रिलिन 1 एंटीबॉडी (एमए 5-12770, थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ इनक्यूबेट किया गया। 4 ◦C पर 16 घंटे के लिए। स्लाइडों को 30 मिनट के लिए पीबीएस से धोया गया और फिर 1 घंटे के लिए द्वितीयक खरगोश-विरोधी एलेक्सा-फ्लोर 546 एंटीबॉडी (ए11035, थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ इनक्यूबेट किया गया। नाभिक को 10 मिनट के लिए पीबीएस में डीएपीआई (40, 6-5 डायमिडीनो -2-फेनिलइंडोले) 1 ग्राम/एमएल से रंगा गया। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था और इमेजजे सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.53 ए, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, यूएसए) के साथ विश्लेषण किया गया था।

2.9. प्रोकोलेजन प्रकार I सी-पेप्टाइड (पीआईपी) सामग्री को मापने के लिए अल्फाएलआईएसए परख

इस चरण में, 8 × 1 0 3 एचडीएफ को एक अच्छी तरह से प्लेट में डाला गया और 24 घंटे के लिए जैशेक्स ({6}} के साथ इलाज किया गया। 0 006 प्रतिशत, 0.002 प्रतिशत, और 0.006 प्रतिशत पी/वी) या टीजीएफ- (2.5 एनजी/एमएल) के साथ। उपचार के बाद, कोशिकाओं को अल्फा एलआईएसए एचपीआईपी कोलेजन किट प्रदाता (एएल353एचवी, (पर्किनएल्मर, वाल्थम, एमए, यूएसए)) के निर्देशों के अनुसार संसाधित किया गया था।

2.10. Nrf2 लूसिफ़ेरेज़-आधारित प्रतिलेखन सक्रियण परख

यहां, 6 × 1 0 3 HaCaT कोशिकाओं को एक 96- वेल प्लेट में बोया गया और 16 घंटे तक उगाया गया। उसके बाद, उन्हें एआरई रिपोर्टर किट बीपीएस बायोसाइंस (सैन डिएगो, सीए, यूएसए, #60514) का उपयोग करके एनआरएफ2 ल्यूसिफेरेज-आधारित ट्रांसक्रिप्शन सक्रियण परख के अधीन किया गया। एक ट्रांसफ़ेक्शन-तैयार लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर वेक्टर (न्यूनतम प्रमोटर के अपस्ट्रीम में स्थित उत्तरदायी तत्वों के नियंत्रण में एक जुगनू ल्यूसिफ़ेरेज़ जीन युक्त) एक आंतरिक नियंत्रण (एक संवैधानिक रूप से व्यक्त रेनिला ल्यूसिफ़ेरेज़ वेक्टर) के साथ मिलकर HaCaT कोशिकाओं में क्षणिक रूप से सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था X-TREME जीन एचपी डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक (रोश, बेसिलिया, स्विट्जरलैंड, #6366244001)। 24 घंटे के लिए पारगमन के बाद, कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए अर्क (0.0006 प्रतिशत, 0.002 प्रतिशत, और 0.006 प्रतिशत पी/वी) या सकारात्मक नियंत्रण रेसवेराट्रॉल (50 µM) के साथ इलाज किया गया। उसके बाद, उन्हें डुअल-ग्लो लूसिफ़ेरेज़ परख प्रणाली (पेमरेगा, रोम, इटली #E2920) के साथ ल्यूसिफ़ेरेज़ परख के अधीन किया गया। संक्षेप में, कोशिकाओं को एक 96- वेल प्लेट रीडर (विक्टर निवो, वाल्थम, एमए, यूएसए) में ल्यूमिनेसेंस को मापने से पहले 10 मिनट के लिए जुगनू ल्यूसिफेरेज सब्सट्रेट के साथ ऊष्मायन किया गया था। जुगनू और रेनिला से चमक के अनुपात की गणना Nrf2 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को सामान्य करने और तुलना करने के लिए की गई थी।

2.11. HaCaT कोशिकाओं में SOD-1(NM_000454.5) और OH{5}}(NM_002133.3) जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण

इस प्रक्रिया के लिए, 1.5 × 105 HaCaT कोशिकाओं को प्रति कुएं में 16 घंटों के लिए 6-वेल प्लेटों में उगाया गया और अर्क (0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत) के साथ 6 घंटों के लिए इनक्यूबेट किया गया। p/v) या सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 50 µM रेस्वेराट्रोल। ऊष्मायन के अंत में, कुल आरएनए को "जेनएल्यूट™ टोटल आरएनए प्यूरिफिकेशन" किट (सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमआई, यूएसए) से) का उपयोग करके निकाला गया और 37 पर DNase I (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ इलाज किया गया। जीनोमिक डीएनए संदूषक को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए ◦सी। कुल आरएनए के 500 एनजी को एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके रेट्रो-ट्रांसक्राइब किया गया था। यूनिवर्सल की जोड़ी का उपयोग करके अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर आयोजित किए गए थे आंतरिक मानकों के रूप में प्राइमर 18S प्राइमर/प्रतियोगी (इनविट्रोजन- थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए)। पीसीआर उत्पादों को 1.5 प्रतिशत एगरोज़ जेल पर अलग किया गया था, और आईब्राइट उपकरण (इनविट्रोजन थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके देखा गया था। प्रवर्धन के लिए प्रयुक्त प्राइमरों के अनुक्रम निम्नलिखित थे: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA।

2.12. एलपीएस-उत्तेजित रॉ 264.7 में नाइट्रिक ऑक्साइड परख

RAW 264.7 म्यूरिन मैक्रोफेज में कोई सांद्रता निर्धारित नहीं की गई थी, 1.5 × 1{8}}5 कोशिकाओं/वेल की सांद्रता में 24 घंटे के लिए 96-वेल प्लेटों में बीजित किया गया था, और अर्क के साथ पूर्व-उपचार किया गया था ({{1) 0}}.0006 प्रतिशत, 0.002 प्रतिशत, और 0.006 प्रतिशत पी/वी) या 2 घंटे के लिए 10 µM टीपीसीके (सकारात्मक नियंत्रण) के साथ, 18 घंटे के लिए 2 µg/एमएल एलपीएस के साथ ऊष्मायन से पहले। नाइट्राइट में परिवर्तित NO की मात्रा की गणना ग्रीज़ अभिकर्मक (N-(1-naphthyl)एथिलीनडायमाइन और सल्फ़ानिलिक एसिड, इनविट्रोजन-थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए का घोल) को जोड़कर की गई और, 30 मिनट के बाद, मल्टीवेल-प्लेट रीडर (एनविज़न, पर्किनएल्मर, वाल्थम, एमए, यूएसए) द्वारा अवशोषण को 540 एनएम पर मापा गया था।

3। परिणाम

3.1. जैस्मीनम सांबैक सेल कल्चर हाइड्रो-एथेनॉलिक एक्सट्रैक्ट (जैशएक्स) का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

जैशएक्स का यूपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण किया गया और ग्लोबल नेचुरल प्रोडक्ट्स सोशल मॉलिक्यूलर नेटवर्किंग (जीएनपीएस) का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा का विश्लेषण किया गया, जो एक वेब-आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रणाली है जो प्राकृतिक उत्पादों (एनपी) के एनोटेशन में सहायता करती है [18] . विशेष रूप से, ऑनलाइन डीरेप्लिकेशन प्राप्त करने के लिए एक जीएनपीएस स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का प्रदर्शन किया गया था। जीएनपीएस द्वारा पहचानी नहीं गई रासायनिक प्रजातियों को साहित्य के अनुसार सौंपा गया था। जैसा कि चित्र 1 और 2 और तालिका 1 में दिखाया गया है, द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के कई वर्गों, मुख्य रूप से पॉलीफेनोल्स और टेरपेन्स से संबंधित 50 से अधिक यौगिकों की पहचान की गई थी। दरअसल, जैशेक्स अर्क में फेनोलिक एसिड डेरिवेटिव, लिग्नांस (सेकोइसोलारिसेरिनॉल, नॉरट्रैचेलोजेनिन, और मैटैरेसिनॉल), और ट्राइटरपेनोइड्स (अर्जुनोलिक एसिड, एसपारटिक एसिड, मैस्लिनिक एसिड, ओलीनोलिक एसिड और उर्सोलिक एसिड) शामिल हैं।

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