सामान्य और सिस्टिक किडनी में नेफ्रॉन की त्रि-आयामी वास्तुकला

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थॉमस ब्लैंक1,2,7, निकोलस गौडिन3,7, मोहम्मद ज़ैदान1,4,7, मरियम गारफ़ा ट्रैरे3, फ्रैंक बिएनाइम1,5, लिसा ट्यूरिन्स्की1, सर्ज गारबे1, क्लेमेंट गुयेन1, मार्टीन बर्टिन1, गेरार्ड फ्राइडलैंडर1,6, फैबियोला Terzi1,8 और मार्को पोंटोग्लियो1,8

किडनी के लिए अच्छा है सिस्टैन्च

कीवर्ड: सिस्टिक किडनी रोग; गुर्दा; नेफ्रॉन; नेफ्रोनोफ्थिसिस;ऊतक समाशोधन

गुर्दा कार्य महत्वपूर्ण रूप से नेफ्रॉन की जटिल त्रि-आयामी संरचना पर निर्भर है। उनके आकार के किसी भी विकृति के कारण हो सकता हैगुर्दा रोग. पारंपरिक ऊतकीय विधियाँ त्रि-आयामी ऊतक पुनर्निर्माण के लिए प्रमुख सीमाएँ प्रस्तुत करती हैं। यहां, हमने शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत एकल नेफ्रॉन के पुनर्निर्माण के लिए ऊतक समाशोधन, मल्टी-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और डिजिटल ट्रेसिंग को संयुक्त किया। के समूहनेफ्रॉनउनके कार्य के अनुसार स्थान, आकार और आकार में भिन्नता की पहचान की गई। दिलचस्प बात यह है कि नेफ्रॉन विमानों में झूठ बोलते हैं। जब इस तकनीक को के मॉडल पर लागू किया गया थासिस्टिक किडनी रोगसिस्ट केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में विकसित होते पाए गए। उसी खंड के साथ, सिस्ट सामान्य गैर-फैलाए गए नलिकाओं के भीतर सन्निहित होते हैं। इसके अलावा, सिस्ट के आकार नेफ्रॉन खंड के अनुसार भिन्न होते हैं। इस प्रकार, हमारे निष्कर्ष एकल नेफ्रॉन स्तर पर गुर्दे की जटिल संरचना की कल्पना करने के लिए एक मूल्यवान रणनीति प्रदान करते हैं और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि सिस्टोजेनेसिस जैसी रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक आधार प्रदान करते हैं।

अनुवाद संबंधी वक्तव्य

समाशोधन विधियां यह समझने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करती हैं कि कैसे रूपात्मक परिवर्तन रोग संबंधी परिणामों को जन्म देते हैं। गुर्दा महत्वपूर्ण अंग हैं जो पानी, मेटाबोलाइट और इलेक्ट्रोलाइट हैंडलिंग के माध्यम से शरीर के होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं, जो नेफ्रॉन की जटिल 3-आयामी संरचना पर महत्वपूर्ण रूप से निर्भर हैं। जब इस संरचनात्मक संगठन को बदल दिया जाता है, तो गुर्दे की पैथोफिज़ियोलॉजी सामने आती है। वर्तमान अध्ययन में, हमने ऑप्टिकल समाशोधन पर आधारित एक शक्तिशाली विधि विकसित की है,

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी, और शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत एकल-नेफ्रॉन स्तर पर गुर्दे का अध्ययन करने के लिए डिजिटल ट्रेसिंग। विशेष रूप से, हम एकल नेफ्रॉन के पैमाने पर एक पॉलीसिस्टिक गुर्दा का पहला 3-आयामी पुनर्निर्माण प्रदान करते हैं। इस पद्धति को कई रोग संबंधी संदर्भों पर लागू किया जा सकता है, जिससे हम गुर्दे के खराब होने की जटिल प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप, अधिक लक्षित चिकित्सीय रणनीति विकसित कर सकते हैं।

गुर्दा अपनी जटिल 3-आयामी (3D) नेफ्रॉन संरचना के माध्यम से शरीर के होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। जब इस संरचनात्मक संगठन को बदल दिया जाता है, तो गुर्दे की पैथोफिज़ियोलॉजी सामने आती है।क्रोनिक किडनी रोगगुर्दे के घावों के विकास की विशेषता है। दिलचस्प बात यह है कि पैथोलॉजिस्ट ने क्रोनिक किडनी रोगों के दौरान घावों के वितरण में व्यापक विविधता की सूचना दी है। 1,2 क्या यह इस तथ्य को दर्शाता है कि विशिष्ट नेफ्रॉन खंड अलग-अलग क्षतिग्रस्त हो सकते हैं, या वैकल्पिक रूप से, कि कुछ नेफ्रॉन में पूरी तरह से घायल होने की अलग-अलग संवेदनशीलता होती है। , अज्ञात है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, रोग संबंधी संदर्भों में नेफ्रॉन के 3डी आकार का पुनर्निर्माण करना अनिवार्य है।

हमारे ज्ञान के लिए,नेफ्रॉनकेवल सीरियल 2डी सेक्शन का उपयोग करके पूरी तरह से पुनर्निर्माण किया गया है। 3-5 हालांकि मानक हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, 3 डी पुनर्निर्माण श्रमसाध्य और प्राप्त करना कठिन होता है। यह मुख्य रूप से यांत्रिक विकृतियों के कारण होता है, जो टुकड़ा करने की प्रक्रिया का एक अपरिहार्य प्रभाव है। इसके अलावा, 2डी छवियों से 3डी पुनर्निर्माण पूरे माउंटेड ऊतकों में 3डी संरचनाओं की प्रत्यक्ष इमेजिंग की अनुमति नहीं देता है।

मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी ने मोटे वर्गों में रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाने की हमारी क्षमता में सुधार किया है। हालांकि, प्रकाश के प्रकीर्णन के कारण एक महत्वपूर्ण सीमा उथली सुलभ गहराई है। अपवर्तक सूचकांक अंतर को कम करके, समाशोधन एजेंटों ने छवि की गहराई की क्षमता में नाटकीय रूप से सुधार किया है। इस तथ्य के बावजूद कि पहली बार समाशोधन एजेंट एक सदी पहले पेश किया गया था, हाल ही में कई समाशोधन प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं, ज्यादातर मस्तिष्क के लिए .9–17 हाल के अध्ययनों ने अन्य ठोस अंगों, जैसे कि यकृत, अग्न्याशय, या गुर्दे की इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया है।18–26

गुर्दे की बीमारी के लिए सिस्टैंच

पॉलीसिस्टिक किडनी रोग, एक आनुवंशिक रूप से विषम विकार जिसमें कई सिलिअरी जीन में उत्परिवर्तन शामिल है, सबसे आम वंशानुगत किडनी रोग है। 27,28 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग को सिस्ट के विकास की विशेषता है जो कि गुर्दे के पूर्ण विनाश का कारण बनता है। 28 माइक्रोडिसेक्शन अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि अल्सर कर सकते हैं ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक के रूप में या तो नेफ्रॉन सेगमेंट के "आउट पुशिंग" के रूप में विकसित होता हैगुर्दे की बीमारी; एकत्रित नलिकाओं (सीडी) के एक्टेटिक विस्तार के रूप में, ऑटोसोमल रिसेसिव पॉलीसिस्टिक के रूप मेंगुर्दे की बीमारी; या विशेष रूप से मेडुलरी नलिकाओं में, जैसा कि नेफ्रोनोफिथिसिस (एनपीएचपी) में होता है। 27,29 हालांकि, 3डी में सिस्ट कैसे विकसित होते हैं और एक दूसरे के साथ व्यवस्थित होते हैं और सामान्य पड़ोसी नलिकाएं अभी भी अज्ञात हैं।

यहां, हमने ऑप्टिकल समाशोधन को मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी के साथ कैसे जोड़ा है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए संयुक्त किया हैनेफ्रॉनशारीरिक स्थितियों में आकार और व्यवस्थित होते हैं और रोग के दौरान उन्हें कैसे संशोधित किया जाता है, जैसे कि सिस्टोजेनेसिस। हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि 3 प्रकार के नेफ्रॉन होते हैं और ये पोत नेफ्रॉन के स्थानिक संगठन को प्रभावित कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हमने देखा कि नेफ्रॉन विशिष्ट विमानों में झूठ बोलते हैं। अप्रत्याशित रूप से, जब हमने इस तकनीक को जेके चूहों पर लागू किया, तो हमने देखा कि सिस्ट केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में विकसित होते हैं, जिसमें फ्यूसीफॉर्म सिस्ट सामान्य नलिकाओं के साथ परस्पर जुड़े होते हैं।

परिणाम

प्रयोगिक व्यवस्था

संपूर्ण के आकार का अध्ययन करने के लिएनेफ्रॉनउनके पर्यावरण के संबंध में, हमने ऑप्टिकल क्लियरिंग और मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी (सप्लीमेंट्री फिगर S1A) पर आधारित एक तकनीक को अपनाया। विभिन्न ऑप्टिकल समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना करके, हमने निर्धारित किया कि गुर्दे के लिए, बेंज़िल अल्कोहल / बेंज़िल बेंजोएट (BABB) प्रभावकारिता (पूरक चित्रा S1B और C और पूरक तालिका S1) के मामले में सबसे उपयुक्त था।

3डी पुनर्निर्माण और डिजिटल ट्रेसिंग के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात वाली उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की आवश्यकता होती है। हमने देखा कि देशी फ्लुफ्लोरेसेंस द्वारा प्रदान किया गया ऑप्टिकल सिग्नल गुर्दे के वर्गों पर एक समान नहीं था। विशेष रूप से, मज्जा से छवियों को कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (सप्लीमेंट्री फिगर S2) के साथ खराब रूप से विपरीत किया गया था। सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करने के लिए, हमने आवधिक एसिड-शिफ (सप्लीमेंट्री फिगर S1D) के साथ वर्गों को दाग दिया, क्योंकि हमने अनुभवजन्य रूप से नोट किया कि इस धुंधलापन ने 2-फोटॉन फ्लुफ्लोरेसेंस के दौरान पतले वर्गों में उच्च विपरीतता को जन्म दिया। हालांकि, संकेत मोटी आवधिक एसिड-शिफ-सना हुआ किडनी वर्गों (पूरक चित्रा S1E) में एक समान नहीं था। इसलिए, हमने फ्लुफ्लोरोक्रोम-युग्मित लेक्टिन के साथ गुर्दे के वर्गों को दाग दिया: मूंगफली एग्लूटीनिन और गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन, जो ग्लोमेरुली और नलिकाओं को दाग देते हैं, और ग्रिफ़ोनिया सिंपिसिफोलिया एग्लूटीनिन, जो रक्त वाहिकाओं को चिह्नित करते हैं। 30 उल्लेखनीय रूप से, इन लेक्टिन के संयोजन के साथ, सिग्नल-टू- पृष्ठभूमि अनुपात नाटकीय रूप से समग्र रूप से बढ़ा थागुर्दा खंड, xy प्लेन और z अक्ष (सप्लीमेंट्री फिगर S1E और सप्लीमेंट्री मूवी S1) दोनों में महत्वपूर्ण सुधार के साथ।

3डी नेफ्रॉन खंड विज़ुअलाइज़ेशन

पूरे नेफ्रॉन के आकार की कल्पना करने के लिए, हमने उनके रास्तों का पता लगाया, जो ग्लोमेरुलस के मूत्र ध्रुव से शुरू होते हैं और सीडी जंक्शन (सप्लीमेंट्री मूवी S2) पर समाप्त होते हैं। इस तथ्य के बावजूद कि विश्व स्तर पर उपयोग किए जाने वाले व्याख्यान सभी नेफ्रॉन खंडों को बांधते हैं, हमने देखा कि जब ध्यान से निरीक्षण किया गया था, तो इन व्याख्यानों को एक विशिष्ट पैटर्न द्वारा चित्रित किया गया था जिस तरह से उन्होंने विभिन्न नेफ्रॉन खंडों में बेसल या ल्यूमिनल झिल्ली को दाग दिया था। दूसरे शब्दों में, हमने विभिन्न नेफ्रॉन खंडों की पहचान करने के लिए लेक्टिन स्टेनिंग के रूढ़िवादी पैटर्न का लाभ उठाया। इस तरह, हम आसानी से 6 संस्थाओं की पहचान कर सकते हैं: समीपस्थ नलिका (पीटी), हेनले लूप (एचएल) का पतला अंग (टीएल), एचएल का मोटा आरोही अंग (टीएएल), डिस्टल कन्फ्यूज्ड ट्यूब्यूल (डीसीटी), कनेक्टिंग ट्यूबल (सीएनटी) ), और सीडी। पीटी और टीएल के बीच संक्रमण को विशिष्ट पीटी ब्रश बॉर्डर सिग्नल के अचानक नुकसान और लुमेन की चौड़ाई में कमी की विशेषता थी, जो टीएल (चित्रा 1 ए) में लगभग अनुपस्थित था। इसके विपरीत, टीएल और टीएएल के बीच संक्रमण को बाहरी ट्यूबलर व्यास और अपेक्षाकृत स्थिर लुमेन चौड़ाई (चित्रा 1 बी) में उल्लेखनीय वृद्धि की विशेषता थी। सभी मेंनेफ्रॉन, टीएएल से डीसीटी में संक्रमण ग्लोमेरुलस के संवहनी ध्रुव पर व्यवस्थित रूप से पाया गया था। इस संक्रमण को बाहरी ट्यूबलर व्यास के अचानक बढ़ने की विशेषता थी जो मुख्य रूप से लुमेन व्यास (चित्रा 1 सी) में महत्वपूर्ण वृद्धि के कारण था। DCT और CNT के बीच संक्रमण को ट्यूबलर व्यास और लुमेन (चित्र 1d) दोनों में कमी की विशेषता थी। अंत में, CNT और कॉर्टिकल सीडी के बीच संबंध को ट्यूबलर व्यास और लुमेन (चित्र 1e) दोनों में अचानक वृद्धि की विशेषता थी। इन रूपात्मक संक्रमणों की मात्रा का ठहराव सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (चित्र 1f), और इसकी प्रासंगिकता को विशिष्ट ट्यूबलर मार्कर (सप्लीमेंट्री फिगर्स S3-S5 और सप्लीमेंट्री मूवी S3-S5) के साथ धुंधला करके सत्यापित किया गया था।

पीटी का आकार और आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है

मोटी का धुंधलापनगुर्दा खंडहमें संपूर्ण पीटी खंडों के स्थानिक विकास के निर्देशांक का पता लगाने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि उनका आकार अत्यंत परिवर्तनशील था और प्रांतस्था में उनके ग्लोमेरुली की स्थिति से निर्धारित होता था। विश्व स्तर पर, हमने 3 पैटर्न की पहचान की। फिफर्स्ट कोर ने सबसे सतही नेफ्रॉन (एसएन) (चित्रा 2 ए; पूरक मूवी एस 6) का जवाब दिया, जिसने कॉर्टेक्स के सबसे बाहरी हिस्से पर कब्जा कर लिया (गुर्दे के कैप्सूल के करीब सबसे बाहरी 30 प्रतिशत)। उनके जटिल भागों ने अपने स्वयं के ग्लोमेरुलस के चारों ओर केवल 6 से 7 संकल्पों के साथ कॉम्पैक्ट संरचनाएं बनाईं, जो बहुत छोटी और कसकर भरी हुई जगहों पर कब्जा कर लेती हैं। इन एसएन का कनवल्शन लंबे और सीधे पार्स रेक्टा में समाप्त होता है जो मज्जा में उतरता है। इस स्पेक्ट्रम के विपरीत छोर पर, हमने का दूसरा पैटर्न देखानेफ्रॉनकॉर्टेक्स के सबसे गहरे हिस्से (40 प्रतिशत अधिक आंतरिक गहराई) में स्थित है, मज्जा के बगल में (जुक्टैमेडुलरी नेफ्रॉन [JNs]) (चित्र 2a; अनुपूरक चित्र S6 और अनुपूरक मूवी S6)। उनके पीटी को एक प्रारंभिक शॉर्ट लूप की विशेषता थी जो व्यवस्थित रूप से पैपिला की ओर उतरता था और फिर यू वृक्क कैप्सूल की ओर चढ़ता था। एसएन के विपरीत, जेएन समीपस्थ घुमावदार नलिकाओं को बड़े कॉइल की विशेषता थी जो अपने स्वयं के ग्लोमेरुलस के आसपास विकसित हुए और जुक्समेडुलरी कॉर्टेक्स में बड़े, शिथिल पैक वाले डोमेन पर कब्जा कर लिया। जेएन के पीटी के जटिल हिस्से में बड़े डोमेन बनाने वाले 10 से 15 कनवल्शन थे। अंत में, तीसरे पैटर्न में कोर्टेक्स के मध्य भाग में स्थित नेफ्रॉन (मध्य नेफ्रॉन [एमएन]) (चित्र 2a; अनुपूरक मूवी S6) शामिल थे। दिलचस्प बात यह है कि इन नलिकाओं का एक आकार और स्थानिक अभिविन्यास था जो एसएन और जेएन के बीच एक संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता था। वास्तव में, उनमें कॉइल के साथ 8 से 9 कन्वोल्यूशन होते थे जो एसएन से बड़े थे, लेकिन जेएन से छोटे थे। इसके अलावा, एमएन के पास जेएन की तुलना में लंबा पार्स रेक्टा था। दिलचस्प बात यह है कि पीटी के आकार की वैश्विक तुलना से पता चला है कि एसएन और एमएन का एक सजातीय पैटर्न था जबकि जेएन बेहद विषम थे (पूरक चित्रा एस 6)। इसके अलावा, कई नेफ्रॉन के स्थानिक पुनर्निर्माण से पता चला है कि पीटी कभी भी आपस में नहीं मिलते (सप्लीमेंट्री मूवी S6), यह दर्शाता है कि प्रत्येक नेफ्रॉन प्रांतस्था में अपने स्वयं के व्यक्तिगत स्थान पर कब्जा कर लेता है।

मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण ने एसएन और जेएन के आकार और आकार में बड़े अंतर की पुष्टि की, एमएन के लिए एक मध्यवर्ती पहलू के साथ। जेएन का पीटी एसएन के पीटी से 2-गुना लंबा था (चित्र 2बी); हालांकि, जेएन (चित्रा 2 सी) की तुलना में एसएन में सीधापन अधिक था, इस अवलोकन के अनुरूप कि जेएन नलिकाएं बहुत अधिक यातनापूर्ण थीं (चित्रा 2 ए; पूरक चित्रा एस 6)।

चित्र 1|नेफ्रॉन खंडों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रूपात्मक मानदंड। (ए-ई) नियंत्रण चूहों में नेफ्रॉन के विभिन्न खंडों की आकृति विज्ञान। नेफ्रॉन को ग्लोमेरुलस के मूत्र ध्रुव से एकत्रित वाहिनी (समीपस्थ नलिका [पीटी]: फ़िरोज़ा; हेनले लूप के पतले अंग [टीएल] में खोजा गया था: हल्का भूरा; हेनले लूप का मोटा आरोही अंग [टीएएल]: गहरा भूरा; डिस्टल कनवल्यूटेड ट्यूब्यूल [डीसीटी]: गुलाबी; कनेक्टिंग ट्यूब्यूल [सीएनटी]: पीला; कॉर्टिकल कलेक्टिंग डक्ट [सीसीडी]: ऑरेंज)। तीर विभिन्न नेफ्रॉन खंडों के व्यास को इंगित करते हैं। (जारी)

चित्र 1|(जारी) (च) विभिन्न नेफ्रॉन खंडों के बाहरी ट्यूबलर व्यास का परिमाणीकरण। डेटा को माध्य SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। Tukey-Kramer परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: **P < 0.01,="" ***p=""><>

चित्र 3|त्रि-आयामी (3D) नेफ्रॉन पुनर्निर्माण से 3 विभिन्न प्रकार के नेफ्रॉन का पता चलता है। (ए) नियंत्रण चूहों में सतही प्रांतस्था (नीला), मध्य प्रांतस्था (हरा), और juxtamedullary क्षेत्र (लाल) में नलिका एकत्र करने के लिए ग्लोमेरुली से पूरे नेफ्रॉन (बाएं पैनल) की प्रतिनिधि 3डी छवियां। 3 विभिन्न प्रकार के नेफ्रॉन के लिए नेफ्रॉन विभाजन (दाएं पैनल)। बार 150 मिमी। (बी) 3 प्रकार के नेफ्रॉन के लिए हेनले लूप के 2 अंगों के बीच अंतर का परिमाणीकरण। (सी) (जारी) के लिए नेफ्रॉन की लंबाई का परिमाणीकरण

चित्र 3|(जारी) 3 प्रकार के नेफ्रॉन। (डी) नेफ्रॉन के प्रकार के अनुसार नेफ्रॉन के विभिन्न खंडों की लंबाई का परिमाणीकरण। डेटा को माध्य -SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। Tukey-Kramer परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: juxtamedullary nephron (JN) बनाम सतही नेफ्रॉन (SN): ###P < 0.001;="" जेएन="" बनाम="" मध्य="" नेफ्रॉन="" (एमएन):="" *="" पी="">< 0.05,="" **="" पी=""><0.01, ***="" पी=""><0.001। सीएनटी,="" कनेक्टिंग="" ट्यूबल;="" डीसीटी,="" दूरस्थ="" घुमावदार="" नलिका;="" पीटी,="" समीपस्थ="" नलिका;="" टीएएल,="" हेनले="" लूप="" का="" मोटा="" आरोही="" अंग;="" टीएल,="" हेनले="" लूप="" का="" पतला="">

ग्लोमेरुलर आकार गहराई के साथ बदलता रहता है

हमने तब ग्लोमेरुली की गहराई और व्यास का विश्लेषण 3 क्षेत्रों में से प्रत्येक से बेतरतीब ढंग से किया था। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि ग्लोमेरुली क्रमशः जेएन और एसएन में गुर्दे के कैप्सूल से औसतन 783 और 355 मिमी स्थित थे। जैसा कि पहले बताया गया था, हमने देखा कि ग्लोमेरुली का आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है। विशेष रूप से, जेएन का ग्लोमेरुलर आयतन एसएन और एमएन (चित्रा 2डी) की तुलना में 3 गुना अधिक था।

3डी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण

फिर हमने पीटी से सीएनटी तक पूरे नेफ्रॉन के स्थानिक विकास का पता लगाया। उनके 3डी पुनर्निर्माण के वैश्विक दृष्टिकोण ने पुष्टि की कि नेफ्रॉन का आकार एसएन, एमएन और जेएन (चित्रा 3 ए; पूरक मूवी एस 7) के बीच भिन्न था। यह अंतर मुख्य रूप से पीटी की संरचना के कारण था। इसके अलावा, हमने देखा कि HL का एक अलग 3D स्थानिक संगठन था। विशेष रूप से, टीएल और टीएएल एसएन और एमएन (चित्रा 3 बी) की तुलना में जेएन में अधिक दूर से अलग हो गए थे। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों से पता चला कि जेएन विश्व स्तर पर 2-एसएन (चित्रा 3सी) से अधिक लंबे थे। बढ़ी हुई लंबाई को टीएएल और डीसीटी को छोड़कर, सभी खंडों में आनुपातिक रूप से वितरित किया गया था, जो सभी नेफ्रॉन प्रकारों (चित्रा 3 डी) में समान पूर्ण लंबाई वाले थे। इसने सुझाव दिया कि नेफ्रॉन बढ़ाव आश्चर्यजनक रूप से समरूप रूप से प्रतिरूपित प्रक्रिया है।

धनुषाकार वाहिकाओं ने जुक्सटेमेडुलरी पीटी कनवल्शन को प्रभावित किया

का अधिक व्यापक परिप्रेक्ष्य प्राप्त करने के लिएगुर्दे की संरचना, हमने ग्रिफ़ोनिया सिंपिसिफोलिया एग्लूटीनिन धुंधला का लाभ उठाया, जिसने हमें कॉर्टिकल रेडिएट वाहिकाओं (चित्रा 4 ए; अनुपूरक मूवी एस 8) में चाप वाहिकाओं और उनकी शाखाओं का पता लगाने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि नेफ्रॉन और वाहिकाओं के सहवर्ती 3डी पुनर्निर्माण से पता चला है कि चापाकल वाहिकाएं आस-पास के नलिकाओं के साथ एक आश्चर्यजनक समानांतर स्थानिक संगठन में होती हैं। विशेष रूप से, हमने देखा कि विशिष्ट JNs (विवश JNs) द्वारा अनुसरण किया जाने वाला मार्ग पास के पोत (चित्र 4b; अनुपूरक मूवी S9) के मार्ग का अनुसरण करता है। उल्लेखनीय रूप से, यह पूर्वाग्रह (केवल जेएन नेफ्रॉन के सबसेट में देखा गया) पीटी (पूरक चित्रा एस 6) के आकार में बड़ी विविधता के लिए जिम्मेदार है। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों से पता चला है कि "विवश" पीटी "गैर-विवश" वाले (चित्रा 4 सी और डी) की तुलना में काफी लंबे और अधिक यातनापूर्ण (कम सीधे) थे। यह ध्यान देने योग्य है कि एसएन और एमएन दोनों के जटिल हिस्से चापाकल जहाजों के ऊपर स्थित थे और विवश नहीं थे।

नलिकाएं विमानों में झूठ बोलती हैं

दिलचस्प बात यह है कि नेफ्रॉन के 3डी आकार के निरीक्षण से संकेत मिलता है कि वे विमानों में झूठ बोलते हैं (चित्र 5ए; अनुपूरक मूवी एस10)। इस पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करने और इस रचना के संभावित सांख्यिकीय पूर्वाग्रह का आकलन करने के लिए, हमने नलिकाओं की सामान्य प्रवृत्ति को उनके छोरों द्वारा परिभाषित विमान से बाहर मोड़ने के लिए मापा। हमारे मापों से पता चला है कि लगातार मापा कोणों के एक ही सेट और लगातार बिंदुओं (चित्रा 5 बी) के बीच लंबाई के साथ उत्पन्न यादृच्छिक चलने के एक नकली मॉडल की तुलना में, नलिकाएं एक विमान (चित्रा 5 सी) से एक छोटे विचलन के साथ विकसित होती हैं। इसने संकेत दिया कि नलिकाएं एक विमान के साथ अपने पथ को प्रतिबंधित करने की प्रवृत्ति रखती हैं। देखे गए अंतर अत्यधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे (पी <>

सिस्टैंच किडनी के कार्य में सुधार कर सकता है

3डी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण पुटी विकास के लिए एक विशिष्ट पैटर्न का खुलासा करता है

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या हमारा प्रोटोकॉल अव्यवस्थित पैथोलॉजिकल ऊतकों में नेफ्रॉन का पता लगाने की अनुमति देता है, हमने jck चूहों में सिस्ट के आकार और स्थानिक वितरण की विशेषता बताई, जो एनपीएचपी और सिस्टिक रोग का व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। 31-33 3डी छवियों ने दिखाया कि इसके बावजूद प्रमुख सिस्ट की उपस्थिति के बारे में, नेफ्रॉन का सामान्य 3डी कोर्स नियंत्रण चूहों (सप्लीमेंट्री मूवी S11) से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था। इसी तरह, रूपमितीय विश्लेषण ने पुष्टि की कि नेफ्रॉन की वैश्विक लंबाई, ग्लोमेरुलर मात्रा और प्रत्येक की लंबाईनेफ्रॉनखंड नियंत्रण चूहों (पूरक चित्रा S7) के साथ तुलनीय थे। ध्यान दें, पुटी के विकास के कारण, हम एचएल में टीएल को टीएएल से अलग करने में असमर्थ थे। सभी नेफ्रॉन ने फ्यूसीफॉर्म सिस्ट (सप्लीमेंट्री मूवीज़ S11 और S12) विकसित किए। सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक यह अवलोकन था कि एक ही साथ कई स्थानों पर फ्यूसीफॉर्म सिस्टिक फैलाव हुआनेफ्रॉनखंड (पूरक फिल्में S12 और S13)। आश्चर्यजनक रूप से, हमने देखा कि पीटी और एचएल अवरोही अंगों (चित्रा 6 ए; पूरक मूवी एस 12) में अल्सर कभी विकसित नहीं हुए। इसके विपरीत, वे मुख्य रूप से एचएल आरोही अंगों, डीसीटी, सीएनटी, और सीडी के ऊपरी भाग में, सीएनटी (चित्रा 6 ए; पूरक मूवी एस 12) के साथ निरंतरता में पाए गए थे। विशेष रूप से, हमने देखा कि डीसीटी, साथ ही सीएनटी खंडों में, उनके संबंधित अधिक दूरस्थ भागों (चित्रा 6 बी) में अल्सर विकसित होने की एक अजीबोगरीब संभावना थी। 3डी पुनर्निर्माण छवियों के मात्रात्मक रूपमितीय विश्लेषण से पता चला है कि कुल पुटी मात्रा प्रतिनेफ्रॉनCNT (चित्र 7a) में विशेष रूप से उच्च था। इसके अलावा, हमने देखा कि एचएल और डीसीटी में सिस्ट एन लार्जमेंट एसएन और एमएन (चित्रा 7 ए; सप्लीमेंट्री मूवी एस 12) की तुलना में जेएन में अधिक थे। इसके अलावा, अन्य प्रकार के नेफ्रॉन (चित्रा 7 बी) की तुलना में जेएन में पुटी की घटना काफी अधिक थी। हमने यह भी देखा कि औसत ग्लोमेरुलर इंटरडिस्टेंस (निकटतम 5 ग्लोमेरुली पर गणना) विशेष रूप से अधिक सतही प्रांतस्था (पूरक चित्रा S8) में सिस्टिक चूहों में विशेष रूप से वृद्धि हुई है।

कई सिस्टों के 3डी पुनर्निर्माण से पता चला कि वे आकार और आयतन में अत्यंत परिवर्तनशील थे (चित्र 6c; अनुपूरक फिल्में S11 और S13)। एचएल आरोही अंग में, अल्सर में एक छोटे व्यास के साथ एक फ्यूसीफॉर्म आकार होता था। डीसीटी में, सिस्ट का आकार गोलाकार और बड़ा होता था और वे नॉनडिलेटेड नलिकाओं के बीच परस्पर जुड़े होते थे। दिलचस्प बात यह है कि डीसीटी और सीएनटी के बीच संक्रमण को व्यवस्थित रूप से एक सामान्य नॉनडिलेटेड संरचना की विशेषता थी। इसके विपरीत, सीएनटी में, हमने व्यवस्थित रूप से सीडी के संपर्क में एक सन्निहित पतला सिस्टिक संरचना का अवलोकन किया। दिलचस्प बात यह है कि सीडी में, यह संरचना उत्तरोत्तर एक सामान्य नलिका के आकार में सिकुड़ जाती है। अधिक दूर से, सीडी के सन्निहित हिस्से में कोई और सिस्ट नहीं पाया जा सकता है। एक और सुसंगत विशेषता एचएल आरोही अंग में अल्सर का अजीबोगरीब स्थानिक संगठन था। वास्तव में, हालांकि एसएन में अल्सर गहरे और लूप के करीब थे, वे जेएन (चित्रा 6 सी) में डीसीटी के अधिक सतही और करीब थे। फिर से, अल्सर ने MNs (चित्र 6c) में एक मध्यवर्ती स्थिति पर कब्जा कर लिया।

चित्र 5|नेफ्रॉन नलिकाएं एक चपटी संरचना के रूप में विकसित होती हैं। (ए) नेफ्रॉन समीपस्थ नलिका का एक विशिष्ट पथ। यह पथ इसकी समतल में लेटने की प्रवृत्ति को दर्शाता है। पथ के विकास की योजना को बेहतर ढंग से देखा जा सकता है जब ठीक से घुमाया जाता है और पर्यवेक्षक के दृष्टिकोण के साथ गठबंधन किया जाता है (उसी ट्यूबलर खंड के दाहिने हाथ का प्रतिनिधित्व देखें, जो बाईं ओर, एक अलग पर दर्शाया गया है कोण)। (बी) 4 खंडों से बना एक ट्यूबलर पथ का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (उदाहरण के रूप में दिखाए गए ट्यूबलर पथ को परिभाषित करने वाले 5 बिंदुओं के बीच)। जिस डिग्री तक पथ "उनके विमान से बाहर" जाते हैं, उन्हें यहां "बीटा" के रूप में इंगित कोण द्वारा दर्शाया जा सकता है। (जारी)

चित्र 5|(जारी) इस कोण को समतल के सापेक्ष खंड p3-p4 के बीच मापा जाता है (तुरंत पूर्ववर्ती बिंदुओं p3, p2, और p1 द्वारा परिभाषित) और योजना में एक गहरे भूरे रंग के आयत द्वारा दर्शाया जाता है। बीटा कोणों की गणना तब एक ट्यूबलर पथ में बिंदुओं के सेट के साथ पुनरावर्ती रूप से गणना की गई थी। इन बीटा कोणों के पूर्वाग्रह की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, हमने प्रत्येक ट्यूबलर पथ के लगातार अल्फा कोणों के एक ही सेट (सभी लगातार खंडों के बीच मापा) का उपयोग करके एक यादृच्छिक चलने (मोंटे कार्लो सिमुलेशन [एमसी]) का अनुकरण किया। अल्फा कोणों और यादृच्छिक बीटा कोणों के एक समान सेट के साथ यह यादृच्छिक चलने वाला पथ उत्पन्न हुआ। (सी) बीटा कोणों के वैश्विक वितरण के वायलिन प्लॉट और समीपस्थ नलिका (पीटी) में एमसी के परिणाम, हेनले लूप के पतले अंग (टीएल), हेनले लूप के मोटे आरोही अंग (टीएएल), डिस्टल कन्फ्यूज्ड ट्यूब्यूल ( डीसीटी), और संयोजी नलिका (सीएनटी)। एमसी, पी <>

बहस

पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तरीके नेफ्रॉन के वैश्विक आकार को प्रभावित करने वाले रोग परिवर्तनों का पता लगाने की उनकी क्षमता में सीमित हैं। यहां, हम ऊतक समाशोधन पर आधारित एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जिसमें सामान्य और रोग स्थितियों के तहत अभूतपूर्व स्थानिक विवरण के साथ गुर्दे की वास्तुकला पर महत्वपूर्ण प्रश्नों को संबोधित करने की क्षमता है। हमारे परिणामों ने 3 प्रकार के नेफ्रॉन के अस्तित्व की पुष्टि की, जो उनकी कार्यात्मक विशिष्टताओं के अनुरूप उनके स्थान, आकार और आकार में भिन्न होते हैं। इसके अलावा, हमने दिखाया कि नेफ्रॉन विमानों में झूठ बोलते हैं और पोत के स्थानिक संगठन के अनुकूल होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि जब हमने इस तकनीक को के मॉडल पर लागू कियासिस्टिक किडनी रोगहमने देखा कि सिस्ट सभी में विकसित होते हैं

नेफ्रॉन, लेकिन केवल विशिष्ट खंडों में। दिलचस्प बात यह है कि हमने दिखाया कि पुटी का आकार नेफ्रॉन खंड के अनुसार बदलता रहता है, और यह कि उसी नेफ्रॉन के साथ, सिस्ट सामान्य नॉनडिलेटेड नलिकाओं के साथ जुड़ते हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम नेफ्रॉन और वाहिकाओं की स्थानिक व्यवस्था का पहला 3डी लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं और महत्वपूर्ण रूप से एक रोग प्रक्रिया को समझने के लिए आधार प्रदान करते हैं, जैसे कि सिस्टोजेनेसिस।

उच्च स्तर के ऑटोफ्लोरेसेंस और सेल घनत्व के कारण किडनी ऑप्टिकल क्लियरिंग चुनौतीपूर्ण है। विभिन्न समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना करके, हमने BABB में सबसे गहरे हिस्से में स्थित संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और पुनर्निर्माण को लागू करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक की पहचान की।गुर्दा, यानी मज्जा। इसके अलावा, BABB तेज़ और स्केलेबल है और, एक बार साफ़ हो जाने के बाद, नमूने छवि अधिग्रहण से पहले महीनों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस तकनीक का एक अन्य मुख्य लाभ इसकी कम लागत है। समाशोधन एजेंटों के परिणामस्वरूप संरचनाओं का सिकुड़ना या विस्तार हो सकता है। 9–17 हालांकि, क्योंकि गुर्दे के आकार के ये संशोधन आइसोट्रोपिक हैं, सापेक्ष माप प्रभावित होने या उनकी व्याख्या को पूर्वाग्रहित करने की उम्मीद नहीं है। सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक संरचनाओं की व्याख्या है जो अत्यधिक समय लेने वाली है। फिर भी, गहन शिक्षण पर आधारित तकनीकों की संख्या बढ़ रही है, जिन्हें इस सीमा को तेजी से पार करना चाहिए।

शास्त्रीय तकनीकों द्वारा प्राप्त परिणामों के अनुरूप, हमारे अध्ययन से पता चला है कि नेफ्रॉन अपनी स्थिति के अनुसार आकार और लंबाई में भिन्न होते हैं। विशेष रूप से, हमने देखा कि जेएन में अधिक विकसित जटिल पीटी और बड़े ग्लोमेरुली हैं और एसएन की तुलना में 2 गुना अधिक लंबे हैं। बढ़ी हुई लंबाई एक सामंजस्यपूर्ण प्रक्रिया का परिणाम है क्योंकि लंबा होना नेफ्रॉन के सभी खंडों को आनुपातिक रूप से प्रभावित करता है। हमने यह भी देखा कि जेएन का एचएल बड़ा है। कुल मिलाकर, ये आंकड़े स्पष्ट रूप से दिखाते हैं कि एसएन और जेएन की माइक्रोएनाटॉमी महत्वपूर्ण रूप से भिन्न है और एमएन मध्यवर्ती विशेषताएं प्रदर्शित करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि शारीरिक अध्ययनों से पता चला है कि नेफ्रॉन भी कार्यात्मक रूप से भिन्न होते हैं। 2 इन अंतरों को रेखांकित करने वाली मॉर्फोजेनेटिक घटनाएं अभी तक ज्ञात नहीं हैं। इस प्रकार यह अनुमान लगाना आकर्षक है कि जेएन की विशेष संरचना उनके कार्यों की विशिष्टता के लिए जिम्मेदार हो सकती है।

दिलचस्प बात यह है कि पहली बार नेफ्रॉन और उनके आसपास के जहाजों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए प्रदान करके, हमने आर्क्यूट जहाजों और नेफ्रॉन के एक उपसमूह के बीच एक स्थानिक बाधा की खोज की। इस प्रकार, यह सोचना संभव है कि जहाज रास्ता तय कर सकते हैंनेफ्रॉनविकास के दौरान लंबा हो जाता है। 34,35 कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन के साथ संयुक्त नेफ्रॉन के 3 डी आकार के निरीक्षण से यह भी पता चला है कि नेफ्रॉन कभी आपस में नहीं मिलते हैं और प्रत्येक नेफ्रॉन एक विमान में झूठ बोलते हैं। इस अवलोकन के कार्यात्मक महत्व को स्पष्ट किया जाना बाकी है।

सिस्ट विकास के दौरानपॉलीसिस्टिक किडनी रोगअभी भी एक पेचीदा प्रक्रिया है। एनपीएचपी, सिस्ट के विकास की विशेषता वाली एक रोग संबंधी स्थिति, बच्चों और किशोरों में सबसे आम आनुवंशिक रोग है, जिसके कारण अंतिम चरण में गुर्दे की बीमारी होती है। अब तक बीस एनपीएचपी जीनों की पहचान की जा चुकी है। उनमें से, एनईके8 माइटोसिस ए-संबंधित किनेज परिवार में कभी नहीं के सदस्य को एन्कोड करता है, जो सिलिया फ़ंक्शन और सेल चक्र प्रगति में भूमिका निभाता है। 37 Nek8 को मूल रूप से उत्परिवर्तित जीन के रूप में चित्रित किया गया था। jck चूहों।32 विशेष रूप से, एक ही प्रोटीन डोमेन में एक उत्परिवर्तन को मनुष्यों में NPHP9 की ओर ले जाने के लिए दिखाया गया है। 38 2डी अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि सिस्ट का विकास पॉलीसिस्टिक किडनी रोग के विभिन्न रूपों में नाटकीय रूप से भिन्न होता है। 27,29 विशेष रूप से , एनपीएचपी में, सिस्ट विशेष रूप से सीडी और डीसीटी से प्राप्त हुए प्रतीत होते हैं। हालांकि सूचनात्मक, ये इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन इस संभावना के खिलाफ तर्क नहीं दे सकते हैं कि विशिष्ट ट्यूबलर मार्करों का नुकसान इस अवलोकन के लिए कृत्रिम रूप से खाता है। इस प्रकार, हमारा 3डी अध्ययन पहला स्पष्ट प्रमाण प्रदान करता है कि पुटी विकास एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंड शामिल हो सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हालांकि NIMA (नेवर इन माइटोसिस जीन A) -रिलेटेड किनसे 8 (NEK8) को सभी नेफ्रॉन सेगमेंट के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया जाता है, सिलिया में इसकी अभिव्यक्ति डीसीटी और सीडी तक ही सीमित है। क्योंकि केवल इन खंडों में सिस्ट विकसित होने का खतरा होता है, 31 हम यह मान सकते हैं कि NEK8 सिलिअरी फंक्शन का विघटन पुटी के गठन के लिए महत्वपूर्ण घटना है। दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी देखा है कि फ्यूसीफॉर्म सिस्ट सामान्य नॉनडिलेटेड नलिकाओं के साथ निरंतरता में होते हैं। तथ्य यह है कि एक पुनरावर्ती जर्मलाइन म्यूटेशन केवल कोशिकाओं के एक सबसेट में एक पैथोलॉजिकल फेनोटाइप की ओर जाता है, यह बताता है कि एक दूसरी घटना इन कोशिकाओं में पुटी के विकास को ट्रिगर कर सकती है, जैसा कि ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक के लिए सुझाव दिया गया है।गुर्दे की बीमारी.40,41

हमने यह भी देखा कि एसएन की तुलना में जेएन में सिस्ट इज़ाफ़ा अधिक प्रमुख है, कम से कम पीटी और सीएनटी के बीच स्थित सिस्ट को देखते हुए। लगातार, यह बताया गया है कि ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस के संदर्भ में, एसएन की तुलना में जेएन में ग्लोमेरुलर घाव अधिक बार पाए जाते हैं। 1,21,42 क्या बढ़े हुए एकल के कारण अधिक काम करना हैनेफ्रॉनजेएन के बिगड़ने की बढ़ती संवेदनशीलता के लिए ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर और परिवहन / एंजाइमेटिक गतिविधियां एक दिलचस्प परिकल्पना है जो आगे की जांच के योग्य है।

संक्षेप में, हम 3डी में गुर्दे की छवि के लिए पर्याप्त आणविक विशिष्टता और संकल्प के साथ एक नई तकनीक का वर्णन करते हैं जो विशिष्ट रूप से लेबल किए गए आंतरिक संरचनाओं (नेफ्रॉन, वाहिकाओं और अल्सर) के स्थानिक और मात्रात्मक वितरण को सीधे रिकॉर्ड करते हैं। प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की सुविधा, गति और क्षमता को देखते हुए, हम अनुमान लगाते हैं कि यह तकनीक गुर्दे की पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाएगी।

चित्र 6|त्रि-आयामी (3डी) नेफ्रॉन पुनर्निर्माण से पता चलता है कि सिस्ट केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में विकसित होते हैं। (ए) जेके चूहों में सतही प्रांतस्था (नीला), मध्य प्रांतस्था (हरा), और juxtamedullary क्षेत्र (लाल) में नलिका एकत्र करने के लिए ग्लोमेरुली से पूरे नेफ्रॉन (बाएं पैनल) के पुटी मात्रा प्रतिपादन के साथ प्रतिनिधि 3डी छवियां। 3 विभिन्न प्रकार के नेफ्रॉन के लिए नेफ्रॉन विभाजन (दाएं पैनल)। बार 150 मिमी। (बी) जेके चूहों में विभिन्न नेफ्रॉन खंडों में सिस्ट विकसित होने की संभावना। (जारी)

चित्र 6|(जारी) क्षैतिज अक्ष 50 डिब्बे (समीपस्थ नलिका [पीटी], फ़िरोज़ा; हेनले लूप [एचएल], सफ़ेद; डिस्टल कनवल्यूटेड ट्यूब्यूल [डीसीटी], गुलाबी; कनेक्टिंग ट्यूब्यूल [सीएनटी], पीला) के अनुरूप नेफ्रॉन की एक सामान्यीकृत लंबाई है। . (सी) सतही (ऊपरी पैनल), मध्य में एचएल (बाएं पैनल), डीसीटी (मध्य पैनल), और सीएनटी और कॉर्टिकल एकत्रित नलिकाओं (सीसीडी) (दाएं पैनल) के आरोही अंग के सिस्ट वॉल्यूम प्रतिपादन के साथ प्रतिनिधि 3 डी सिस्ट पुनर्निर्माण छवियां, मध्य (मध्य पैनल), और juxtamedullary (निचले पैनल) नेफ्रॉन jck चूहों में। बार 50 मिमी।

विधि

जानवरों

सभी पशु प्रक्रियाओं को "सर्विसेज वेटेरिनारेस डे ला प्रीफेक्चर डी पुलिस डे पेरिस" और यूनिवर्सिटी पेरिस डेसकार्टेस की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। दो महीने पुराने FVB/N चूहों (n=20) का उपयोग गुर्दे की सफाई के लिए प्रायोगिक स्थिति को स्थापित करने के लिए किया गया था। अध्ययन तब 2-सप्ताह पुराने जेके नर चूहों (एन 4) और नियंत्रण लिटमेट्स (एन ¼ 3) में किया गया था।

गुर्दे के ऊतकों की तैयारी

मारने से पहले, चूहों को इंट्राकार्डियक कैथीटेराइजेशन के माध्यम से, 25 मिलीलीटर हेपरिनिज्ड खारा (1000 आईयू / एल) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के 75 मिलीलीटर के साथ सुगंधित किया गया था। प्रयोग xylazine (Rompun 2 प्रतिशत, बायर, लीवरकुसेन, जर्मनी, शरीर के वजन का 6 mg/g) और ketamine (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, France, 120 mg/g of body weight) संज्ञाहरण के तहत किए गए।

अध्ययन को समाशोधन के लिए, गुर्दे को 4 घंटे के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक कर दिया गया था और 4 प्रतिशत agarose में एम्बेडेड किया गया था और 1.5- वृक्क हिलम के आसपास के मिमी-मोटी वर्गों को काटा गया और 4 सी पर पीबीएस में संग्रहीत किया गया था।गुर्दा खंडपहले दाग लगे और फिर साफ हो गए।

पतले वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन के लिए,गुर्देरातोंरात 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में फिक्स किया गया और पैराफिन-एम्बेडेड और 4- मिमी वर्गों को काट दिया गया।

धुंधला हो जाना

आवधिक एसिड-शिफ धुंधला हो जाना। 1.5-मिमी किडनी वर्गों को समाशोधन से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शुद्ध या 1:100 पीबीएस-पतला आवधिक एसिड-शिफ में ऊष्मायन किया गया था।

पतली पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। पैराफिन-एम्बेडेड किडनी के चार-माइक्रोमीटर वर्गों को एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए गर्म किया गया था और ट्यूबल्स (रोडामाइन मूंगफली एग्लूटीनिन [आरएल -1072-5] और रोडामाइन गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन [आरएल {{{{{{}} 6}}], वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंगम, सीए, 1:200 पर पतला) और सेगमेंट-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी अलग-अलग ट्यूबलर सेगमेंट (बायोटिनिलेटेड लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन [बी -1325], वेक्टर लेबोरेटरीज, 1 पर पतला: को चित्रित करने के लिए: 100; माउस विरोधी Calbindin D28K [D-4], सांता क्रूज़, हीडलबर्ग, जर्मनी, 1:200 पर पतला; बकरी विरोधी AQP2 [C-17], सांता क्रूज़, 1:200 पर पतला) . अगले दिन, वर्गों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया (एलेक्सा फ्लोर 488 संयुग्म [एस 32354], इंविट्रोजन; एंटीगोएट एलेक्सा फ्लोर 488 [ए -11055], इंविट्रोजन; एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 488 [ए -21202], इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए; सभी 1:500 पर पतला) 40, 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल के साथ रंगने से पहले। सभी छवियों को निकॉन एक्लिप्स E800 माइक्रोस्कोप (चैंपिग्नी सुर मार्ने, फ्रांस) के साथ अधिग्रहित किया गया था और फिजी सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.50) का उपयोग करके तैयार किया गया था।

मोटे वर्गों पर लेक्टिन धुंधला हो जाना। 1.5-मिमी-मोटी किडनी वर्गों को टेक्सास रेड या फ्लुफ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट युग्मित व्याख्यान में 1 महीने के लिए 4 सी पर ऊष्मायन किया गया था: मूंगफली एग्लूटीनिन (आरएल -1072-5) और गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन (आरएल {{6} }), 0.1 प्रतिशत पीबीएस एज़ाइड और 0.1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स में 1:100 पर पतला। समाशोधन से पहले पीबीएस के साथ 2 सप्ताह के लिए हर दिन वर्गों को धोया जाता था।

ऑप्टिकल समाशोधन

स्केल क्लियरिंग के लिए, 1.5-मिमी किडनी वर्गों को स्केलए2 (4 एम यूरिया, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100, 10 प्रतिशत ग्लिसरॉल) या स्केलबी4 में इनक्यूबेट किया गया था। (8 एम यूरिया, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100) 2 सप्ताह के लिए, 1 वर्ष तक, 4 डिग्री सेल्सियस पर।

BABB समाशोधन के लिए, 1.5-mm गुर्दा वर्गों को कमरे के तापमान पर इथेनॉल के अनुक्रमिक रिन्स में निर्जलित किया गया था। नमूनों को तब BABB (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) में 1: 2 के अनुपात में कम से कम 2 दिनों के लिए 4 C पर ऊष्मायन किया गया था।

दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण

माई ताई एचपी टाइटेनियम-नीलम लेजर (स्पेक्ट्रा-भौतिकी, सांता क्लारा, सीए) (सप्लीमेंट्री फिगर S1A) से लैस एक उल्टे मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोप (LaVision BioTec) पर जलीय जेल के साथ ऊतकों की नकल की गई थी। 8 प्रतिशत शक्ति पर उत्तेजना तरंगदैर्घ्य 815 एनएम था। हमने 20 जल विसर्जन उद्देश्य (XLUMPLFL20XW, ओलिंप [टोक्यो, जापान]; संख्यात्मक एपर्चर, 0.95; कार्य दूरी, 2.0 मिमी) का उपयोग किया। फ्लफ्लोरेसेंस अधिग्रहण के लिए, हमने एक बैंडपास फिल्टर 593/40 एनएम के साथ 80 प्रतिशत पर एक गैर-अवरोही डिटेक्टर का उपयोग किया।

सबसे प्रासंगिक केंद्रीय क्षेत्रों के चयन का मार्गदर्शन करने के लिए सबसे पहले चरण में उप-इष्टतम अधिग्रहण मापदंडों (400 मिमी 400 मिमी और 1011 1011 पिक्सल, 10 प्रतिशत ओवरलैप और 2 पर एक लाइन औसत के साथ) का उपयोग करके मध्य z स्टैक पर 2डी मोज़ेक छवि अधिग्रहण शामिल था। (पूरक चित्रा S9A)। एक बार ब्याज के xy ग्रिड और z फ़ील्ड्स को परिभाषित करने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए मापदंडों को समायोजित किया गया। इस तरह के दृष्टिकोण ने रुचि के क्षेत्र को घटाकर 5 12 फ़ीफ़ील्ड प्रति z स्टैक कर दिया। फिर, हमने 850 z स्टैक/ऑप्टिकल स्लाइस (1-मिमी स्टेप साइज) का अधिग्रहण किया, जो कि मध्य भाग में वृक्क हिलम के आसपास है।गुर्दा खंड.

छवि सिलाई, प्रसंस्करण, और अनुरेखण

प्रत्येक स्टैक को प्रीबिस्क एट अल।, 43 द्वारा विकसित विधि के अनुसार टाइल किया गया था, जो फिजी सॉफ्टवेयर के "ग्रिड/कलेक्शन स्टिचिंग" प्लगइन (http:// fifiji.sc/Fiji) का उपयोग करके छवियों के एक बड़े संग्रह की सिलाई की अनुमति देता है। . चूंकि हमने सिलाई के बाद 2 आसन्न छवियों के बीच एक महत्वपूर्ण बदलाव देखा, इसलिए हमने पायथन में एक कस्टम-मिलान कार्यक्रम लिखा। यह प्रोग्राम इमेज शिफ्ट की भरपाई करता है, जिससे हम इमेज को सही ढंग से संरेखित कर सकते हैं (सप्लीमेंट्री फिगर S9B)। इमारिस संस्करण 8.4.2 (बिटप्लेन, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके सिले-सुधारित छवियों का विश्लेषण किया गया था। इमारिस के फिफिलामेंट ट्रेसर पैकेज मैनुअल मोड का उपयोग करके नलिकाओं और जहाजों का पता लगाया गया था और एक इमरिस एक्सटेंशन से जुड़ गया था जिसे हमने MATLAB के साथ विकसित किया था (//www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_शामिल हों{{12 }} फिलामेंट_Tool.zip?dl¼0) (सप्लीमेंट्री फिगर S9C)। इमारिस के सतह पैकेज के मैनुअल मोड का उपयोग करके ग्लोमेरुली और सिस्ट को 3डी पुनर्निर्माण किया गया था। इमरिस के स्पॉट पैकेज के मैनुअल मोड का उपयोग करके 3डी ग्लोमेरुली स्थानिक संगठन प्रदर्शित किया गया था।

मोर्फोमेट्री

इमारिस के फिलामेंट ट्रेसर पैकेज का उपयोग करके ट्यूबलर खंड की लंबाई, नेफ्रॉन की लंबाई और सीधापन निर्धारित किया गया था। इमरिस सॉफ्टवेयर के अनुसार, सीधापन 2 बिंदुओं के बीच की दूरी और नेफ्रॉन खंड पथ की लंबाई के बीच के अनुपात के रूप में निर्धारित किया गया था। इकतीस पीटी और 12 पूरे नेफ्रॉन का पुनर्निर्माण किया गया और 3 जंगली प्रकार के चूहों में मापा गया, जबकि 37 पीटी और 17 पूरे नेफ्रॉन का पुनर्निर्माण किया गया और 4 जेके चूहों में मापा गया। पुटी और

इमारिस के "सतह पैकेज" का उपयोग करके ग्लोमेरुलर वॉल्यूम निर्धारित किए गए थे। इकतीस और 34 ग्लोमेरुली को क्रमशः जंगली-प्रकार और जेके चूहों में मापा गया। कुल चौहत्तर अल्सर को मापा गया।

ट्यूबलर घुमावों के "विमान के बाहर" कोण ("बीटा" के रूप में इंगित) को विमान (लगातार 3 बिंदुओं द्वारा परिभाषित) और अंतरिक्ष में अगले लगातार चौथे बिंदु (चित्रा 5 बी) के साथ दिशा के बीच मापा गया था। देखे गए पूर्वाग्रह के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए, हमने बीटा कोणों के वितरण को बीटा कोणों (मोंटे कार्लो सिमुलेशन) के यादृच्छिक रोटेशन के साथ संरचनाओं में सिम्युलेटेड किया जो समान सेगमेंट द्वारा अल्फा कोणों के समान सेट के साथ बनाए गए थे।

साथ में एक सिस्टिक घाव विकसित होने की संभावना की गणना के लिएनेफ्रॉनखंडों में, हमने अंतरिक्ष में बिंदुओं के एक सेट द्वारा प्रत्येक नेफ्रॉन का प्रतिनिधित्व किया। प्रत्येक बिंदु को पुटी बनाम सामान्य संरचना और खंड के प्रकार की उपस्थिति के संबंध में व्याख्या की गई थी। प्रत्येक मानकीकृत लंबाई (50 डिब्बे पर सेट) पर संभाव्यता की गणना सिस्टिक एनोटेशन के साथ अंकों की संख्या और बिन में अंकों की कुल संख्या के बीच के अनुपात के रूप में की गई थी।

औसत ग्लोमेरुलर इंटरडिस्टेंस की गणना के लिए, हमने प्रत्येक ग्लोमेरुलस के लिए निकटतम 5 ग्लोमेरुली पर गणना की गई औसत ग्लोमेरुलर इंटरडिस्टेंस पर विचार किया।

डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

डेटा को माध्य SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रायोगिक समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन विचरण के विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था, जब महत्वपूर्ण (P <{0}}.05), tukey-kramer="" परीक्षण="" द्वारा।="" जब="" केवल="" 2="" समूहों="" की="" तुलना="" की="" गई,="" तो="" मान-व्हिटनी="" परीक्षण="" का="" उपयोग="" किया="" गया।="" ग्राफ="" प्रिज्म="" सॉफ्टवेयर="" (सैन="" डिएगो,="" सीए,="" संस्करण="" 9.0.0)="" का="" उपयोग="" करके="" सांख्यिकीय="" विश्लेषण="" किए="" गए="">

खुलासा

सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की।

आभार

हम तकनीकी सहायता के लिए लेबरटोएयर एक्सपेरिमेंटेशन एनिमेल एट ट्रांसजेनिस (एलईएटी), हिस्टोलॉजी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म ऑफ स्ट्रक्चर फेडेरेटिव डी रेचेर्चे नेकर को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पियरे इस्नार्ड, मैरी-क्लेयर गब्लर और निकोलस कुपरवासर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इंस्टिट्यूट नेशनल डे ला सैंटे एट डे ला रेकेर्चे मेडिकल, यूनिवर्सिटी पेरिस डेसकार्टेस, असिस्टेंस पब्लिक - होपिटॉक्स डी पेरिस, एजेंस नेशनेल डे ला रेचेर्चे, व्हूमी लेबरटोएरे डी'एक्सीलेंस हू एम आई, रोश फार्मा रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट (बेसल) द्वारा समर्थित किया गया था। , स्विट्ज़रलैंड), और इंस्टिट्यूट रोश डी रेकेर्चे एट डी मेडेसीन ट्रांसलेशननेल (पेरिस, फ्रांस)।

लेखक का योगदान

टीबी, एनजी, और एमजेड ने प्रयोगों को डिजाइन और निष्पादित किया और डेटा का विश्लेषण किया। FB, LT, MGT, और SG ने भी कुछ प्रयोग किए और डेटा का विश्लेषण किया। एमबी और सीएन ने माउस प्रयोग किए। टीबी और एमजेड ने भी पांडुलिपि लिखने में योगदान दिया। GF ने पांडुलिपि को संशोधित किया। एफटी और एमपी ने वैचारिक ढांचा प्रदान किया और अध्ययन को डिजाइन किया, परियोजना की देखरेख की और पेपर लिखा।

किडनी को टोनिफाई कर सकता है सिस्टैंच

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

चित्रा S1। प्रायोगिक सेटअप, प्राप्ति प्रक्रिया, और छवि संसाधन।

चित्रा S2। xy और z संकल्पों में ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल की सीमाएं।

चित्रा S3। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड किडनी सेक्शन पर पीटी और टीएल के बीच संक्रमण की द्वि-आयामी छवि।

चित्रा S4। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड किडनी सेक्शन पर टीएएल और डीसीटी के बीच संक्रमण की द्वि-आयामी छवि।

चित्रा S5। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड किडनी सेक्शन पर डीसीटी और सीएनटी के बीच संक्रमण की द्वि-आयामी छवि।

चित्रा S6। त्रि-आयामी पुनर्निर्माण से समीपस्थ नलिकाओं के 3 अलग-अलग आकार का पता चलता है।

चित्रा S7। त्रि-आयामी पुनर्निर्माण से पता चलता है कि नेफ्रॉन की लंबाई और विभाजन सिस्ट से प्रभावित नहीं होते हैं।

चित्रा S8। नियंत्रण और सिस्टिक किडनी में ग्लोमेरुली का घनत्व।

चित्र S9. अधिग्रहण प्रक्रिया और पोस्टट्रीटमेंट इमेज प्रोसेसिंग।

तालिका S1। समाशोधन विधियों की तुलना। अनुपूरक फ़ाइल (फिल्में)

मूवी S1. लेक्टिन धुंधलापन स्पष्ट रूप से रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करता है।

मूवी S2. एक नलिका के पथ का अनुरेखण।

मूवी S3. समीपस्थ नलिका और हेनले लूप के पतले अंग के बीच के जंक्शन को दिखाते हुए एक साफ गुर्दे का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण।

मूवी S4. हेनले लूप के मोटे आरोही अंग और बाहर की घुमावदार नलिका के बीच के जंक्शन को दिखाते हुए एक साफ गुर्दे का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण।

मूवी S5. एक साफ गुर्दे का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण, बाहर की घुमावदार नलिका और जोड़ने वाली नलिका के बीच के जंक्शन को दर्शाता है।

मूवी S6. समीपस्थ नलिकाओं का आकार और आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है।

मूवी S7. नियंत्रण चूहों में त्रि-आयामी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण।

मूवी S8. एक धनुषाकार पोत से एक कॉर्टिकल विकीर्ण पोत तक एक पोत के पथ का अनुरेखण।

मूवी S9. धनुषाकार वाहिकाएं जक्सटेमेडुलरी समीपस्थ नलिकाओं के आकार का मॉडल बनाती हैं।

मूवी S10. नेफ्रॉन एक विमान में झूठ बोलते हैं।

मूवी S11. त्रि-आयामी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण पुटी के विकास के लिए एक विशिष्ट पैटर्न को दर्शाता है।

मूवी S12. त्रि-आयामी नेफ्रॉन विभाजन से पता चलता है कि विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में सिस्ट विकसित होते हैं।

मूवी S13. पॉलीसिस्टिक किडनी में नेफ्रॉन और वाहिकाओं की स्थानिक व्यवस्था और अंतर्संबंध

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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