क्लोथो की कमी आईएफएन की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को तेज करती है- / गुर्दे में आरआईजी-आई के अपग्रेडेशन के माध्यम से

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सार हाइपोक्सिया अंतिम चरण की प्रगति का एक सामान्य मार्ग हैगुर्दे की बीमारी.रेटिनोइक एसिड-इंड्यूसिबल जीन I (RIG-I) एक RNA हेलीकॉप्टर को एनकोड करता है जो SARS-CoV2 सहित वायरस को पहचानता है, जो वायरल संक्रमण के प्रसार को रोकने के लिए इंटरफेरॉन (IFN) -a / के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। हाल ही में, RIG-l सक्रियण हाइपोक्सिक परिस्थितियों में पाया गया था, और klotho की कमी को माउस दिमाग में RIG-I की सक्रियता को तेज करने के लिए दिखाया गया था। हालांकि, गुर्दे की सूजन में इन कार्यों की भूमिका मायावी बनी हुई है। यहाँ, इन विट्रो अध्ययन के लिए, सामान्य चूहे में RIG-I और IFN-a/ की अभिव्यक्ति की जांच की गई थीगुर्दा(NRK)-52E कोशिकाएं हाइपोक्सिक स्थितियों (1 प्रतिशत O2) के तहत इनक्यूबेट की जाती हैं। इसके बाद, RIG-I या तले हुए siRNA को लक्षित करने वाले siRNA को हाइपोक्सिक परिस्थितियों में RIG-I और IFN-a/ß की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए NRK52E कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। हमने 33human . में RIG-I और IFN-a/ के अभिव्यक्ति स्तरों की भी जांच कीगुर्दाबायोप्सी नमूनों में एलजीए नेफ्रोपैथी का निदान किया गया। विवो अध्ययन के लिए, हमने जंगली प्रकार के चूहों (डब्ल्यूटी चूहों) और क्लोथो-नॉकआउट चूहों (केआईटी / चूहों) में 10 मिनट के लिए गुर्दे की धमनी को बंद करके वृक्क हाइपोक्सिया को प्रेरित किया। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत ऊष्मायन ने NRK52E कोशिकाओं में RIG-lI और IFN-a / की अभिव्यक्ति में वृद्धि की। RIG-I को लक्षित करने वाले siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट NRK52E कोशिकाओं में उनके अपगमन को रोक दिया गया था। IgA नेफ्रोपैथी के रोगियों में, गुर्दे की बायोप्सी नमूनों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन से पता चला है कि RIG-Iwas की अभिव्यक्ति IFN-a / (r =0.57, P के साथ सहसंबद्ध है।<0.001, and="" r=""><0.001, respectively).="" the="" expression="" levels="" of="" rig-i="" and="" ifn-a/β="" were="" upregulated="" in="">गुर्देहाइपोक्सिक डब्ल्यूटी चूहों की और हाइपोक्सिक चूहों में आगे की वृद्धि देखी गई। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि हाइपोक्सिया IFN-a / की अभिव्यक्ति को RIG-I के अपग्रेडेशन के माध्यम से प्रेरित करता है और क्लोथो की कमी इस हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को तेज करती हैगुर्दे।

कीवर्ड:गुर्दे की बीमारी; गुर्दे की कोशिकाएं; गुर्दे का प्रतिस्थापन; गुर्दे की क्षति; गुर्दा

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार होगा

परिचयदीर्घकालिकगुर्दे की बीमारी(सीकेडी) ने 2017 [1] में विश्व स्तर पर 697.5 मिलियन लोगों को प्रभावित किया, इसलिए इसे एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता के रूप में मान्यता प्राप्त है। सीकेडी की प्रगति को धीमा करने के लिए, रेनिन-एंजियोटेंसिन-एल्डोस्टेरोन सिस्टम (आरएएएस) मार्ग के अवरोधकों का उपयोग नैदानिक ​​​​सेटिंग [2,3] में किया जाता है। हालांकि, उनके लाभकारी प्रभाव सीमित हैं और कई रोगियों को अंततः वृक्क प्रतिस्थापन चिकित्सा [4] की आवश्यकता होती है। पैथोलॉजिकल रूप से, पुरानी सूजन और बीचवाला फाइब्रोसिस, प्राथमिक बीमारी [5] की परवाह किए बिना, सीकेडी की सामान्य विशेषताएं हैं। हालांकि ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (टीजीएफ) - 1 इंटरस्टीशियल फाइब्रोसिस के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [6-8], पिछले अध्ययनों से पता चला है कि टीजीएफ के उत्पादन के लिए भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ जिम्मेदार है {{12} } [9]। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सूजन अंतरालीय फाइब्रोसिस की अपस्ट्रीम घटना है, और यह सूजन सीकेडी के लिए एक उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्य है।

हाइपोक्सिया एक ऐसी स्थिति है जिसमें अपर्याप्त ऑक्सीजन इसे ऊतकों में बनाती है। हाइपोक्सिया के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया के रूप में, हाइपोक्सिया-प्रेरक कारक (एचआईएफ) ऊतक क्षति को रोकने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [10-12]। हालांकि, गंभीर हाइपोक्सिया से तीव्र संवहनी रोग होते हैं, जैसे स्ट्रोक [13], एनजाइना पेक्टोरिस [14], और परिधीय धमनी रोग [15]। हाल ही में, यह बताया गया है कि क्रोनिक हाइपोक्सिया, जैसे स्लीप एपनिया, भी विभिन्न रोगों के विकास में योगदान देता है [16]। विषय मेंगुर्दा, हाइपोक्सिया कथित तौर पर सीकेडी चरण की प्रगति के साथ तेज होता है और वर्तमान में इसे सामान्य पैथोफिज़ियोलॉजी माना जाता है जो अंत-चरण की ओर जाता हैगुर्दे की बीमारी[17]। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, सूजन को एक अपस्ट्रीम घटना के रूप में माना जाता है, इसलिए जिस तंत्र द्वारा हाइपोक्सिया सूजन को प्रेरित करता है उसे आणविक स्तर पर स्पष्ट किया जाना चाहिए। सूजन की विशेषता दर्द, गर्मी, लालिमा, सूजन और कार्य की हानि है [18]। हालांकि, यह मूल रूप से कोशिका की चोट के प्रारंभिक कारण को खत्म करने और नेक्रोटिक कोशिकाओं और क्षतिग्रस्त ऊतक को साफ करने के लिए कार्य करता है। किसी भी मामले में, सूजन एक विशिष्ट प्रतिक्रिया नहीं है, और जन्मजात प्रतिरक्षा को मुख्य रूप से इंटरफेरॉन (IFN)- / [19] के उत्पादन के माध्यम से सूजन की प्रारंभिक प्रक्रिया में भाग लेने के लिए माना जाता है। जन्मजात प्रतिरक्षा में शामिल कारकों में, एक रेटिनोइक एसिड-इंड्यूसीबल जीन I (RIG-I) वायरल संक्रमणों के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार है [20. विशेष रूप से, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि हाइपोक्सिया मस्तिष्क और यकृत में RIG-I अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप IFN- / [21,22] का उत्पादन होता है। हालाँकि, IFN- / B की RIG-I-मध्यस्थता अभिव्यक्ति में हाइपोक्सिया की भूमिकागुर्दापकड़ में नहीं आता।

क्लोथो को पहली बार एक एंटी-एजिंग प्रोटीन [23] के रूप में रिपोर्ट किया गया था। वास्तव में, क्लोथो-कमी वाले चूहे मानव उम्र बढ़ने के समान फेनोटाइप्स के साथ एक छोटा जीवनकाल प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, क्लोथो ट्रांसजेनिक चूहे एक विस्तारित जीवनकाल दिखाते हैं [24]। रेनोप्रोटेक्टिव प्रभावों के संदर्भ में, क्लोथो की कमी को गुर्दे की बीमारियों के प्रायोगिक मॉडल में गुर्दे की क्षति को तेज करने के लिए पाया गया है, जबकि क्लोथो ओवरएक्प्रेशन या क्लोथो प्रोटीन का प्रशासन इसे [25] संशोधित करता है। क्लोथो प्रोटीन तीन रूपों में मौजूद है: झिल्ली, स्रावित और इंट्रासेल्युलर कोटो। इनमें से, इंट्रासेल्युलर क्लोथो को सूजन के साथ-साथ आरआईजी-आई अभिव्यक्ति को दबाने के लिए सूचित किया जाता है [26], इस संभावना को बढ़ाते हुए कि क्लोथो की कमी आरआईजी-आई और आईएफएन- / के हाइपोक्सिया-प्रेरित अपचयन को बढ़ा देती है।गुर्दे।इन निष्कर्षों ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं की एक सेल लाइन में हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत RIG-I और IFN- / की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और क्लोथो-नॉकआउट चूहों (KI -7) में उनका हाइपोक्सिया-प्रेरित अपचयन तेज हो गया था। चूहे)। इस अध्ययन में, हम दिखाते हैं कि हाइपोक्सिया सामान्य चूहे में RIG-I के साथ-साथ IFN-a/ को भी अपग्रेड करता हैगुर्दाकोशिकाओं (NRK-52E) और माउस किडनी। हम यह भी दिखाते हैं कि RIG-I IFN-c/B के हाइपो-ऑक्सिया-प्रेरित अपग्रेडेशन के लिए जिम्मेदार है। वास्तविक मानव मेंगुर्दाIgA नेफ्रोपैथी के निदान वाले रोगियों के नमूने, RIG-I अभिव्यक्ति IFN- / के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध पाए गए। अंत में, KI-/- चूहों में RIG-I और IFN- / के हाइपोक्सिया-प्रेरित अपग्रेड को तेज किया गया। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि क्लोथो की कमी IFN- की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को तेज करती है / RIG-I के अपग्रेडेशन के माध्यम सेगुर्दे।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की खराबी में सुधार होगा

सामग्री और तरीके पशुनर C57BL/6J जंगली-प्रकार (WT) चूहों (8 सप्ताह की आयु और वजन 20-25 ग्राम) चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं जापान (योकोहामा, जापान) से प्राप्त किए गए थे। नर चूहों (आयु 6 सप्ताह और लगभग 15 ग्राम वजन) को CLEA जापान, इंक। से खरीदा गया था। चूहों को हिरोशिमा विश्वविद्यालय (हिरोशिमा, जापान) के प्रयोगशाला पशु विज्ञान संस्थान में रखा गया था, जैसा कि पहले बताया गया था [27]। सभी प्रयोगों द्वारा अनुमोदित किया गया था हिरोशिमा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (परमिट संख्या: ए 19-158 और 2019-156) और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया। WT और KI-'चूहों को एक नियंत्रण समूह या एक हाइपोक्सिया समूह (प्रत्येक समूह में n=5) में विभाजित किया गया था। हाइपोक्सिक स्थितियों को सामान्य संज्ञाहरण (0.3 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडाइन, 4 मिलीग्राम/किलो मिडाज़ोलम, और 5 मिलीग्राम/किलो ब्यूटोरफेनॉल) [28] के तहत 1 0 मिनट के लिए बाएं गुर्दे की धमनी की क्लैंपिंग द्वारा प्रेरित किया गया था। नियंत्रण समूह में चूहों ने एक दिखावा ऑपरेशन किया जो धमनी बंधन की कमी को छोड़कर हाइपोक्सिया समूह में चूहों के समान प्रक्रिया थी। हाइपोक्सिया के 10 मिनट के बाद, चूहों को कार्डियक पंचर द्वारा इच्छामृत्यु दिया गया और उनकेगुर्देकटाई की गई। हाइपोक्सिया कागुर्दाएरिथ्रोपोइटिन अभिव्यक्ति (S1 अंजीर) के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि की गई थी।

कोश पालनसामान्य चूहागुर्दा(NRK)-52E सेल अमेरिकन टाइप कल्चर Col. lection (Manassas, VA, USA) से खरीदे गए थे। NRK-52E सेल RPMI में सुसंस्कृत थे-164010 प्रतिशत भ्रूण वाले माध्यम में गोजातीय सीरम (FBS) (निचिरेई बायोसाइंस, टोक्यो, जापान) और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमी-सिन (नैकलाई टेस्क, क्योटो, जापान)। इन cllls को 10cm कल्चर डिश में डाला गया था। उपसंगम में बढ़ने के बाद, कोशिकाओं को 30,60,90, और 120 मिनट के लिए 1 प्रतिशत O2Modular इनक्यूबेटर चैंबर (MIC 101; Billups-Rothenberg, San Diego, CA, USA) में इनक्यूबेट किया गया था, पूरे सेल lysates को तैयार और अधीन किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए। NRK के हाइपोक्सिया -52 E कोशिकाओं की पुष्टि HIF -1 अभिव्यक्ति (S2 अंजीर) के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा की गई थी।

RIG-I siRNA का अभिकर्मकNRK52E कोशिकाओं को 20 nM siRNA के साथ RIG-I (RSS311418: थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA, यूएसए) या नकारात्मक नियंत्रण siRNA (4390843; एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वॉलथम, MA, यूएसए) को लक्षित करके लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 ट्रांसफ़ेक्शन रिएजेंट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। , निर्माता के निर्देशों के अनुसार। 43-45 घंटे के बाद, इनमें से कुछ कोशिकाओं को RIG-I का मूल्यांकन करने के लिए 30 मिनट के लिए हाइपोक्सिक स्थितियों (1 प्रतिशत O ) के तहत ऊष्मायन किया गया था। अन्य कोशिकाओं को एक नए माध्यम में बदल दिया गया। 24 घंटे के बाद, इन कोशिकाओं को IFN-a / .Whole-cell lysates के दमन की पुष्टि करने के लिए 60 और 120 मिनट के लिए हाइपोक्सिक कैन-डिशन्स (1 प्रतिशत O2) के तहत इनक्यूबेट किया गया था और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन किया गया था।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणनमूना संग्रह और पश्चिमी सोख्ता पहले वर्णित विधियों के अनुसार किया गया था [29]। रैबिट मोनोक्लोनल एंटी-आरआईजी-आई एंटीबॉडी (#3743S; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-आईएफएन - 11 एंटीबॉडी (बीएस -7023 आर; बायोस एंटी-बॉडीज, वोबर्न, MA, USA), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-IFN- एंटीबॉडी (GTX37658; GeneTex, Irvine, CA, USA), खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-RIG-I एंटीबॉडी (=700366; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-IFN- 2 एंटीबॉडी (ab193055; Abcam, कैम्ब्रिज, यूके), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-IFN- एंटीबॉडी (PA5-20390; Invitrogen), रैट मोनोक्लोनल एंटी-ह्यूमन क्लोथो एंटीबॉडी (KO603; ट्रांसजेनिक, फुकुओका) , जापान), माउस मोनोक्लोनल एंटी - -एक्टिन एंटीबॉडी (A5316; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), और माउस मोनोक्लोनल एंटी - -ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (T9026; सिग्मा-एल्ड्रिच) का इस्तेमाल किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी (डको, ग्लोस्ट्रुप, डेनमार्क) और बकरी विरोधी माउस इम्युनोग्लोबुलिन जी (डको) को माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सिग्नल का पता लगाने के लिए सुपरसिग्नल वेस्ट ड्यूरा और पिको सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का इस्तेमाल किया गया। प्रत्येक बैंड की तीव्रता को ImageJ सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.47y; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) द्वारा मापा गया था और या तो -एक्टिन या -ट्यूबुलिन के स्तर तक सामान्यीकृत किया गया था।

किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टांचे

माउस किडनी ऊतक का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषणइम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला पहले वर्णित विधियों [27] के अनुसार किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में, निम्नलिखित उत्पादों को लागू किया गया था: खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-आरआईजी-आई एंटीबॉडी (# 700366; इंविट्रोजन), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-आईएफएन - 2 एंटीबॉडी (ab193055; एबकैम), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-आईएफएन- एंटीबॉडी ( पीए 5-20390; इंविट्रोजन), और चूहे मोनोक्लोनल मानव-विरोधी क्लोथो एंटीबॉडी (KO603; ट्रांसजेनिक)। आरआईजी-आई-, आईएफएन-ए / -, और क्लोथो-पॉजिटिव क्षेत्रों को 20 बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों के औसत के रूप में निर्धारित किया गया था। इमेज जे सॉफ्टवेयर।

नैदानिक ​​​​नमूना संग्रह और नैतिकता विवरणअगस्त 2014 और नवंबर 2016 के बीच हिरोशिमा विश्वविद्यालय अस्पताल में गुर्दे की बायोप्सी द्वारा गुर्दे के नमूने प्राप्त किए गए थे, जिन्हें 33 रोगियों में आईजीए नेफ्रोपैथी का निदान किया गया था। यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा में सन्निहित सिद्धांतों का पालन करता है और हिरोशिमा विश्वविद्यालय (ई -1718) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, एक वेबसाइट पर ऑप्ट-आउट के रूप में सूचित सहमति प्राप्त की गई थी (httns:/inzounaika हिरोशिमा-uaciplresearchl opt out.html)।

मानव गुर्दे के ऊतकों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषणपहले वर्णित विधियों [27] के अनुसार प्रतिरक्षण किया गया था। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: खरगोश मोनोडोनल एंटी-आरआईजी-आई एंटीबॉडी (# 700366; इंविट्रोजन), माउस मोनोक्लोनल एंटी-आईएफएन-एंटीबॉडी (एससी -373757; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, TX, यूएसए), और खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-आईएफएन-एंटीबॉडी (पीए 5-20390; इंविट्रोजन), आरआईजी-आई-और आईएफएन-ए / -पॉजिटिव क्षेत्रों को इमेज] सॉफ्टवेयर के साथ पांच बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों के औसत के रूप में निर्धारित किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषणपरिणाम माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। सहसंबंधों की गणना अविभाज्य प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी, कई तुलनाओं के लिए, हमने विचरण (ANOVA) के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया, जिसके बाद छात्र के बोनफेरोनी सुधार के साथ t -est का उपयोग किया गया। छात्र के t -est द्वारा दो समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण किया गया। P<0.05 was="" considered="" as="" statistically="">

परिणाम:हाइपोक्सिया रीनल एपिथेलियल सेल की एक चूहे की कोशिका रेखा में RIG-I और IFN-a / को अपग्रेड करता हैइन विट्रो में RIG-I और IFN- a / की अभिव्यक्ति पर हाइपोक्सिया के प्रभाव की पहचान करने के लिए, हमने NRK में इन प्रोटीनों के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया -52 हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत सुसंस्कृत ई कोशिकाओं। RIG-I का प्रोटीन स्तर 30 मिनट पर पहुंच गया और फिर धीरे-धीरे NRK में कम हो गया -52 हाइपोक्सिक उत्तेजना के तहत E कोशिकाएं Fig 1A）.IFN- / ß का स्तर बढ़ गया और NRK में क्रमशः 120 और 60 मिनट तक पहुंच गया। -52हाइपोक्सिक उत्तेजना वाली ई कोशिकाएं (ईआईजी 1बैंड1सी)। RIG-I की दस्तक हाइपोक्सिया के साथ NRK52E कोशिकाओं में IFN-a / की अभिव्यक्ति को कम करती है यह आकलन करने के लिए कि क्या RIG-I IFN- की अभिव्यक्ति में भाग लेता है- / हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, हमने NRK में उनकी अभिव्यक्ति की जांच की-52ई कोशिकाओं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया RIG-I siRNA या ऋणात्मक

सीआरएनए को नियंत्रित करें। सबसे पहले, हमने NRK-52E कोशिकाओं में RIG- siRNA के नॉकडाउन प्रभाव की पुष्टि की। RIG-I के लिए पश्चिमी सोख्ता से पता चला है कि RIG-I siRNA ने NRK -52 E कोशिकाओं में या तो हाइपोक्सिक उत्तेजना (Eig 2A) के साथ या बिना RIG-I अभिव्यक्ति को डाउनग्रेड किया। हमने अगली बार RIG के हाइपोक्सिया-प्रेरित अपचयन की भूमिका की जांच की। -I NRK में IFN- / B की अभिव्यक्ति में -52 RIG-I siRNA या नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने वाले E कक्ष। RIG-siRNA ने NRK-52Ecells (Eig2Band2C) में IFN- / की अभिव्यक्ति को दबा दिया।

RIG-I IgA नेफ्रोपैथी के मानव गुर्दे के नमूनों में IFN- / के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ संबंध रखता हैहमने जांच की कि क्या IgA नेफ्रोपैथी (n =33) के रोगियों से प्राप्त गुर्दे की बायोप्सी नमूनों में IFN-a / से जुड़े RIG-Iis का अभिव्यक्ति स्तर। इन रोगियों की विस्तृत नैदानिक ​​विशेषताओं को S1 तालिका में दिखाया गया है। RIG-I और IFN- के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना- / ग्लोमेरुली और वृक्क नलिकाओं (चित्र 3A) में उनकी अभिव्यक्ति का पता चला, और दिखाया कि RIG-I IFN-o / (r =0.57, P के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है।<0.001, and="" r=""><0.001, respectively)(eig="">

हाइपोक्सिया WT और K1-/ चूहों . में क्लोथो के अभिव्यक्ति स्तर को नहीं बदलता हैविवो में क्लोथो अभिव्यक्ति पर हाइपोक्सिक उत्तेजना के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने हाइपोक्सिक उत्तेजना के 10 मिनट के साथ या बिना WT और K- / चूहों में इसकी अभिव्यक्ति की जांच की। पश्चिमी सोख्ता और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन से पता चला है कि क्लोथो अभिव्यक्ति हाइपोक्सिया के साथ और बिना डब्ल्यूटी चूहों के बीच भिन्न नहीं थी और हाइपोक्सिक उत्तेजना (ईआईजी 4 ए और 4 बी) की उपस्थिति या अनुपस्थिति की परवाह किए बिना केआईटी / चूहों में क्लोथो अभिव्यक्ति नहीं देखी गई थी। डब्ल्यूटी चूहों में, क्लोथो ट्यूबलर कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रोटीन का दाग लगा था (चित्र 4बी)।K~ चूहों में हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत RIG-I अभिव्यक्ति तेज होती है।इंट्रासेल्युलर क्लोथो कथित तौर पर आरआईजी-आई-मध्यस्थता सूजन को दबाने की क्षमता प्रदान करता है, इसलिए हमने हाइपोक्सिक में आरआईजी-आई के अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण की जांच की।गुर्देWT और Kl - / - चूहों की। पश्चिमी सोख्ता से पता चला है कि हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ WT चूहों में RIG-I अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और यह Kl - / - चूहों (चित्र 5A) में तेज हो गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने दिखाया कि Kl - / - चूहों में RIG-I-पॉजिटिव क्षेत्र में वृद्धि हुई, जो पश्चिमी सोख्ता (चित्र 5B) से प्राप्त परिणामों के समान था।

IFN- को KI--चूहों . में हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत अपग्रेड किया जाता हैwvo की अभिव्यक्ति पर हाइपोक्सिया के प्रभावों की पहचान करने के लिए, हमने हाइपोक्सिक WT और KI-चूहों में इसके अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण की जांच की। पश्चिमी सोख्ता से पता चला है कि हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ डब्ल्यूटी चूहों में आईएफएन- अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और इसे चूहों (छवि 6 ए) में और अधिक अपग्रेड किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने से यह भी पता चला है कि IFN - - सकारात्मक क्षेत्र मुख्य रूप से ट्यूबलर कोशिकाओं में देखा गया था, और IFN- का अभिव्यक्ति स्तर पश्चिमी सोख्ता (चित्र 6B) के समान ही था।

IFN- K1T-/चूहों में हाइपोक्सिक स्थितियों में बढ़ जाता हैIFN-c के अलावा, हमने IFN-Bin हाइपोक्सिक WT और चूहों के अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण की जांच की। पश्चिमी सोख्ता के परिणामों से, हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ WT चूहों में IFN- अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि KIT / चूहों (चित्र 7A) में और वृद्धि देखी गई। IFN - - सकारात्मक क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने पर, IFN- का अभिव्यक्ति स्तर KI - / - चूहों में WT चूहों (चित्र 7B) की तुलना में बढ़ गया।

हाइपोक्सिक उत्तेजना की उपस्थिति की परवाह किए बिना Kl - / - चूहों में देखा गया। हमने दिखाया कि वृक्क हाइपोक्सिया ने RIG-I और IFN- / की अभिव्यक्ति में वृद्धि की और उनकी अभिव्यक्ति Kl - / - चूहों में और तेज हो गई। इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि क्लोथो की कमी ने RIG-I की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को तेज कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप IFN- / का अपचयन हुआ। हमने पहचाना कि हाइपोक्सिया ने इन विट्रो और विवो अध्ययनों में आरआईजी-आई और आईएफएन- / की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। हाइपोक्सिक स्थितियों के अनुकूल होने के लिए, HIF को स्थिर किया जाता है और प्रतिलेखन कारक [30] के रूप में कार्य करता है। पिछले अध्ययन में, यह बताया गया था कि RIG-I HIF-inducible अणुओं में शामिल है। हालाँकि, हम यह नहीं पहचान सके कि RIG-I HIF का डाउनस्ट्रीम इफ़ेक्टर है। वायरस के संक्रमण के अलावा, हाइपोक्सिक स्थितियों [31] के तहत RIG-I की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। हालांकि पिछले अध्ययनों ने बताया कि हाइपोक्सिया गुर्दे में ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरीसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, भड़काऊ कोशिकाओं और पूर्वज कोशिकाओं को प्रभावित करता है [32,33], हम दिखाते हैं कि आरआईजी-आई का अपगमन मुख्य रूप से चूहों में ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में देखा गया था। हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ-साथ IgA नेफ्रोपैथी वाले रोगियों में। क्योंकि वृक्क नलिकाओं को ट्रांसयूरेथ्रल रोगजनकों [34] के प्रवेश स्थल के रूप में माना जाता है, RIG-I हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया न केवल सूक्ष्मजीवों द्वारा सक्रिय होती है, बल्कि क्षतिग्रस्त, घायल, या तनावग्रस्त कोशिकाओं [35] से अलार्म संकेतों द्वारा भी सक्रिय होती है। इस अध्ययन में, हमने दिखाया कि RIG-I की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति ने IFN- / के उत्पादन में वृक्क नलिकाओं की एक चूहे की कोशिका रेखा में भाग लिया। प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि RIG-I अभिव्यक्ति हाइपोक्सिक तनाव के साथ-साथ वायरस संक्रमण के जवाब में साइटोसोल की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में कार्य करती है। पिछले अध्ययनों में बताया गया है कि प्राथमिक बीमारी की परवाह किए बिना सीकेडी के विकास के दौरान हाइपोक्सिया बढ़ जाता है और हाइपोक्सिया गुर्दे की क्षति [17] की प्रगति में योगदान देता है। रक्त ऑक्सीजन स्तर पर निर्भर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग करते हुए एक नैदानिक ​​​​अध्ययन में, गुर्दे की हाइपोक्सिया न केवल सीकेडी की प्रगति के दौरान तेज हुई, बल्कि इस तरह की प्रगति की भी भविष्यवाणी की [36]। इस प्रकार, हाइपोक्सिया को वर्तमान में अंतिम चरण की प्रगति का सामान्य मार्ग माना जाता हैगुर्दे की बीमारी, इसलिए सीकेडी प्रगति को दबाने के लिए हाइपोक्सिया-प्रेरित सूजन एक चिकित्सीय लक्ष्य होना चाहिए।

हमने दिखाया कि हाइपोक्सिया IFN- / के उत्पादन को प्रेरित करता है, जिन्हें टाइप 1 इंटरफेरॉन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। टाइप 1 इंटरफेरॉन मूल रूप से वायरल प्रतिकृति [37] को बाधित करने और हाइपोक्सिया-प्रेरित इम्यूनोसप्रेशन [21,22] का विरोध करने के लिए कार्य करता है। हालांकि, अब तक किए गए अध्ययनों से पता चला है कि टाइप 1 इंटरफेरॉन प्राकृतिक हत्यारे कोशिकाओं के सक्रियण की ओर ले जाते हैं, न केवल वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को हटाने में बल्कि ऊतक क्षति [38] में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वास्तव में, पिछले अध्ययनों ने बताया कि RIG-I विभिन्न अंगों में सूजन में योगदान देता है, जैसे कि फेफड़े [39],गुर्दा[40], और तंत्रिका तंत्र [21]। इस अध्ययन में, हमने यह भी दिखाया कि RIG-I का हाइपोक्सिया-प्रेरित अपग्रेड IFN- / के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, टाइप 1 इंटरफेरॉन हाइपोक्सिया की स्थिति में संक्रमण से बचाने के लिए कार्य कर सकते हैं, लेकिन वे असंक्रमित परिस्थितियों में हानिकारक होंगे। इसके अलावा, एक पिछले अध्ययन ने बताया कि, टाइप 1 इंटरफेरॉन के अलावा, RIG-I विभिन्न साइटोकिन्स के उत्पादन में शामिल है, जैसे कि IL-1, IL- 6, और TNF- [41]। क्योंकि ये साइटोकिन्स ऊतक क्षति का कारण बनते हैं, RIG-I का हाइपोक्सिया-प्रेरित अपचयन CKD की प्रगति में भाग ले सकता है। हमने दिखाया कि क्लोथो की कमी हाइपोक्सिया-प्रेरित RIG-I अभिव्यक्ति को बढ़ाती है, जो IFN- / के अपग्रेडेशन के साथ है। क्लोथो की अभिव्यक्ति कथित तौर पर उम्र बढ़ने और सीकेडी की प्रगति के साथ कम हो जाती है [42,43]। इसलिए, हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत बुजुर्ग और सीकेडी रोगियों में आरआईजी-आई अभिव्यक्ति को अधिक अपग्रेड किया जा सकता है, जिससे आईएफएन- / का उत्पादन हो सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, क्लोथो तीन रूपों में मौजूद है- झिल्ली, स्रावित और इंट्रासेल्युलर क्लोथो-बाद में भड़काऊ साइटोकिन्स [26] के आरआईजी-आई-मध्यस्थता उत्पादन को दबाने के लिए जिम्मेदार है। स्थानीयकरण के संदर्भ में, हमने दिखाया कि क्लोथो अभिव्यक्ति मुख्य रूप से वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में होती है, इस बात के प्रमाण के साथ कि RIG-I अभिव्यक्ति मुख्य रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में तेज होती है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि क्लोथो अभिव्यक्ति का कम स्तर हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत टाइप 1 इंटरफेरॉन के आरआईजी-आई-मध्यस्थता उत्पादन को बढ़ाने में योगदान देता है।

सिस्टैन्च से किडनी/गुर्दे के दर्द में सुधार होगा

सारांश में, हमने दिखाया कि हाइपोक्सिक उत्तेजना-प्रेरित RIG-I और IFN- / माउस किडनी में और वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं की एक चूहा कोशिका रेखा, और यह कि RIG-I IFN- / इन विट्रो प्रयोगों के हाइपोक्सिया प्रेरित अपचयन में शामिल था। IgA नेफ्रोपैथी वाले रोगियों के वृक्क बायोप्सी नमूनों में, RIG-I अभिव्यक्ति IFN- / के अपग्रेडेशन के साथ सहसंबद्ध है। अंत में, RIG-I की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति क्लोथो-नॉकआउट चूहों में तेज हो गई थी, साथ ही IFN- / के अपग्रेडेशन के साथ। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत टाइप 1 इंटरफेरॉन की आरआईजी-आई-मध्यस्थता अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, और क्लोथो डाउनरे ग्यूलेशन की स्थिति में और अधिक अपग्रेडेशन देखा गया। नैदानिक ​​अध्ययनों के अनुसार, हाइपोक्सिया उन्नत सीकेडी चरण [36] के साथ तेज हो जाता है और सीकेडी [36] की दीर्घकालिक प्रगति की भविष्यवाणी करता है। इसके अतिरिक्त, गुर्दे के कार्य में गिरावट के साथ क्लोथो की अभिव्यक्ति कम हो जाती है, और क्लोथो की अभिव्यक्ति में कमी गुर्दे की क्षति [44] से जुड़ी होती है। इस अध्ययन में, हम दिखाते हैं कि क्लोथो की कमी गुर्दे में RIG-I के अपग्रेडेशन के माध्यम से IFN- / की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को तेज करती है और RIG-I की अभिव्यक्ति IgA नेफ्रोपैथी के वास्तविक रोगियों में IFN- / के साथ जुड़ी हुई है। इन निष्कर्षों को एक साथ लेते हुए, सीकेडी की प्रगति के दौरान हाइपोक्सिया और क्लोथो की कमी दोनों को बढ़ावा दिया जाता है, और इसलिए सीकेडी रोगियों में जन्मजात प्रतिरक्षा की सक्रियता बढ़ जाती है।