ऑलिव लीफ एक्सट्रैक्ट (OLE) बिगड़ा हुआ वैसोप्रेसिन-प्रेरित एक्वापोरिन-2 कैल्शियम-सेंसिंग रिसेप्टर के सक्रियण के माध्यम से तस्करी

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वासोप्रेसिन (एवीपी) में पानी की पारगम्यता बढ़ जाती हैगुर्देएक्वापोरिन -2 (AQP2) तस्करी के नियमन के माध्यम से डक्ट एकत्रित करना। उच्च रक्तचाप और अनुचित एंटीडाययूरेटिक हार्मोन स्राव (SIADH) सहित कई विकार, जल होमियोस्टेसिस में असामान्यताओं से जुड़े हैं। यह दिखाया गया है कि कुछ फाइटोकंपाउंड मानव स्वास्थ्य के लिए फायदेमंद होते हैं। यहां, इन विट्रो और विवो मॉडल का उपयोग करके जैतून का पत्ता निकालने (ओएलई) के प्रभावों का मूल्यांकन किया गया है। कन्फोकल अध्ययनों से पता चला है कि OLE वैसोप्रेसिन-प्रेरित AQP2 को MCD4 कोशिकाओं और चूहे में प्लाज्मा झिल्ली में स्थानांतरित होने से रोकता है।गुर्दे. OLE के साथ इनक्यूबेशन आसमाटिक जल पारगम्यता गुणांक (Pf) की AVP-निर्भर वृद्धि को कम करता है। OLE के संभावित प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का मूल्यांकन किया गया था। OLE कैल्शियम सेंसिंग रिसेप्टर (CaSR) की सक्रियता के माध्यम से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम को बढ़ाता है। NPS2143 , एक चयनात्मक CaSR अवरोधक, AVP-निर्भर जल पारगम्यता पर OLE के निरोधात्मक प्रभाव को समाप्त कर देता है। विवो प्रयोगों में पता चला है कि OLE के साथ उपचार से CaSR mRNA की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और AQP2- miRNA को लक्षित -137 की वृद्धि से समानान्तर AQP2 mRNA कम हो जाता है। साथ में, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ओएलई सीएएसआर की उत्तेजना के माध्यम से वैसोप्रेसिन क्रिया का विरोध करता है, यह दर्शाता है कि यह अर्क असामान्य सीएएसआर सिग्नलिंग और गुर्दे के पानी के पुनर्वसन को प्रभावित करने वाले विकारों को कम करने के लिए फायदेमंद हो सकता है।

जैतून के पेड़ के पत्तों का व्यापक रूप से कई बीमारियों के इलाज के लिए पारंपरिक उपचार के रूप में उपयोग किया जाता है, खासकर भूमध्यसागरीय देशों में। आम तौर पर मानव आहार में पत्तियों का सेवन अर्क या पाउडर के रूप में अर्क या हर्बल चाय तैयार करने के लिए किया जाता है। रासायनिक लक्षण वर्णन विश्लेषण से पता चला है कि जैतून के पेड़ के पत्तों में कई बायोएक्टिव यौगिक होते हैं जो चयापचय सिंड्रोम, डिस्लिपिडेमिया और उच्च रक्तचाप जैसी कुछ रुग्णताओं में लाभकारी प्रभाव डाल सकते हैं। आवश्यक उच्च रक्तचाप वाले रोगियों में, ओएलई ने रक्तचाप में कमी की और ग्लाइसेमिया और कैल्सीमिया को थोड़ा कम किया। ओलेयूरोपिन, हाइड्रॉक्सीटायरोसोल और टायरोसोल जैसे कई पॉलीफेनोल हरे जैतून के पत्ते के अर्क (ओएलई) 5 में समृद्ध पाए गए हैं, और वे ऑक्सीडेटिव तनाव की विशेषता वाली कुछ बीमारियों की रोकथाम में शामिल होने के लिए जाने जाते हैं। इसलिए, पिछले कुछ वर्षों में, अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में वैज्ञानिकों के बीच जैतून के पत्ते के अर्क के संभावित लाभकारी प्रभावों की जांच में रुचि बढ़ रही है। ओआईई ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम गतिकी को बदलकर, संभवतः टी- को लक्षित करके घातक मेसोथेलियोमा कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण एंटीप्रोलिफेरेटिव प्रभाव प्रदर्शित किया। Ca2 प्लस चैनल टाइप करें। दिलचस्प बात यह है कि ओएलई को संवहनी समारोह के सुधार से संबंधित अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों (एसएचआर) में आनुवंशिक उच्च रक्तचाप पर एंटीहाइपरटेंसिव प्रभाव डालने के लिए पाया गया था। बढ़े हुए रक्तचाप के रोगजनन में अत्यधिक जल पुनर्अवशोषण एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उच्च रक्तचाप से ग्रस्त रोगियों में, जैतून के पत्ते के अर्क के साथ इलाज किया गया, रक्तचाप में कमी के साथ जुड़े कई भड़काऊ कारकों में उल्लेखनीय कमी पाई गई। इसके अलावा, अत्यधिक जल प्रतिधारण कई विकारों की विशेषता है जैसे कि लीवर सिरोसिस, हृदय की विफलता और अनुचित एंटीडाययूरेटिक हार्मोन स्राव (SIADH)। शरीर के पानी के होमियोस्टेसिस को एंटीडाययूरेटिक हार्मोन वैसोप्रेसिन (एवीपी) द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है जो निर्जलित स्थिति के तहत जारी किया जाता है। AVP अपने कॉग्नेट V2R रिसेप्टर को के आधारभूत झिल्ली पर स्थानीयकृत बांधता हैगुर्देप्रमुख कोशिकाएं इस प्रकार सीएमपी सिग्नल मार्ग को सक्रिय करती हैं जिसके परिणामस्वरूप एक्वापोरिन का स्थानान्तरण होता है -2 (एक्यूपी 2) एक इंट्रासेल्युलर पूल से एपिकल प्लाज्मा झिल्ली में जहां पानी का पुन: अवशोषण होता है। आणविक स्तर पर, कई कारक गुर्दे के पानी के संतुलन को नियंत्रित कर सकते हैं, ल्यूमिनल कैल्शियम का एक ऊंचा स्तर कैल्शियम-सेंसिंग रिसेप्टर (CaSR) 1,12 के सक्रियण के माध्यम से अल्पकालिक वैसोप्रेसिन-आश्रित AOP2 तस्करी को कम करता है। दूसरी ओर, मानव मूत्र से पृथक, सशर्त रूप से अमर वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में सीएएसआर सक्रियण, साइटोसोलिक कैल्शियम में उल्लेखनीय वृद्धि को प्रेरित करता है और एडिनाइलेट cvclase3 के प्रत्यक्ष उत्प्रेरक फोरस्किन (एफके) द्वारा प्राप्त सीएमपी में वृद्धि को काफी कम करता है। , वृक्क संग्रह वाहिनी MCD4 कोशिकाओं में, जल चैनल AOP2 को स्पष्ट रूप से व्यक्त करते हुए, CaSR की उत्तेजना ने सेरीन 256 पर AQP2 फॉस्फोराइलेशन में cAMP-निर्भर वृद्धि को देखा, जो वैसोप्रेसिन द्वारा सक्रिय सिग्नल ट्रांसडक्शन कैस्केड में एक महत्वपूर्ण घटना है और अंततः पानी की पारगम्यता में वृद्धि हुई है। ,15 इसके अलावा, मेंगुर्दाआंतरिक मज्जा माउस किडनी से स्लाइस, कैल्सीमेटिक एनपीएस-आर568 के साथ सीएएसआर की सक्रियता ने AQP में उल्लेखनीय वृद्धि की 2- miRNA को लक्षित करना -137, CaSR सिग्नल पाथवे और AQP के बीच एक तंग परस्पर क्रिया की पुष्टि करता है। {4}}आश्रित जल पारगम्यताl.17.वर्तमान अध्ययन में, स्थानीय कोराटीना कल्टीवेर से प्राप्त जैतून के पत्तों के अर्क के प्रभावों का मूल्यांकन वृक्क संग्रह वाहिनी में वैसोप्रेसिन-प्रेरित AQP2 फ़ंक्शन पर किया गया था। उपचारित चूहों को अर्क के साथ इंजेक्ट किया जाता है। हम सबूत देते हैं कि ओएलई उपचार गुर्दे की कोशिकाओं में वैसोप्रेसिन प्रतिक्रिया का प्रतिकार करता है, जो इसके मूत्रवर्धक प्रभाव की व्याख्या कर सकता है। दिलचस्प बात यह है कि यह प्रभाव सीएएसआर के ओएलई-प्रेरित सक्रियण से संबंधित प्रतीत होता है, एक रिसेप्टर जिसे वैसोप्रेसिन रिसेप्टर 2 के साथ एक नकारात्मक परस्पर क्रिया के लिए जाना जाता है।

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परिणाम

MCD4 कोशिकाओं में वैसोप्रेसिन-प्रेरित AQP2 फ़ंक्शन पर OLE का प्रभाव। वैसोप्रेसिन पर निर्भर AQP2 फ़ंक्शन पर OLE की संभावित भागीदारी की जांच करने के लिए,गुर्देडक्ट MCD4 कोशिकाओं को इकट्ठा करना, वैसोप्रेसिन रिसेप्टर 2 (V2R) और मानव AQP2 को स्पष्ट रूप से व्यक्त करते हुए, एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया था। कॉन-फोकल स्टडीज (छवि 1 ए) से पता चला है कि, डीडीएवीपी उपचारित कोशिकाओं की तुलना में, जिसमें एक्यूपी 2 को एपिकल प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीयकृत किया जाता है, ओएलई के साथ उपचार ने डीडीएवीपी के साथ उत्तेजना से प्रेरित एओपी 2 के झिल्ली स्थानीयकरण को रोका। इन अवलोकनों के अनुरूप, OLE उपचार ने dDAVP- प्रेरित अस्थायी आसमाटिक प्रतिक्रिया (Fig.1B में 1 / t के रूप में दर्शाया गया है) (OLE / dDAVP =88 .70 ± 1. 86 प्रतिशत) को प्रभावित किया। n=292 सेल बनाम dDAVP=206.8±5.49 प्रतिशत,n=186 सेल;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

OLE के इंजेक्शन वाले चूहों के गुर्दे में OLE का प्रभाव।

ओएलई के कार्यों की और जांच करने के लिए, विवो अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है। विशेष रूप से, चूहों को तीन दिनों के लिए दिन में एक बार OLE (250 mg/kg/दिन) का इंजेक्शन लगाया गया है। वैकल्पिक रूप से, चूहों को OLE के साथ 3 दिनों के लिए और dDAVP के साथ 3 0 मिनट के लिए सह-उपचार किया गया। सीएएसआर एमआरएनए का मूल्यांकन जो चूहों के वृक्क संग्रह वाहिनी से अलग किया गया था और वास्तविक समय पीसीआर (छवि 6) के लिए संसाधित किया गया था, ने ओएलई (ओएलई =1 .87 ± 0.29, एन {{ में सीएएसआर एमआरएनए में उल्लेखनीय वृद्धि का खुलासा किया। 10}} चूहों बनाम CTR=1.02 ±0.17, n=5 चूहों; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">गुर्दा, पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण, और मुखर अध्ययन किए गए (चित्र। 9)। OLE / dDAVP इंजेक्शन वाले चूहों में, सेरीन 256 पर AQP2 का फॉस्फोराइलेशन dDAVP उपचारित जानवरों (OLE / dDAVP =0) के गुर्दे के ऊतकों की तुलना में काफी कम हो गया था। 77 ± 0.16, एन =5 चूहों बनाम डीडीएवीपी =2 .16 ± 0 .25, एन =5 चूहों; पी<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

बहस

कैल्शियम एक महत्वपूर्ण इंट्रासेल्युलर संदेशवाहक है जो कोशिकीय कार्यों की अधिकता को नियंत्रित करता है। असामान्य कैल्शियम संकेतन से हृदय की विफलता, कैंसर और उच्च रक्तचाप सहित कई बीमारियां हो सकती हैं। अभिव्यक्ति का विशिष्ट नियंत्रण और कई इंट्रासेल्युलर कैल्शियम संकेतों को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन की गतिविधि कई विकारों का सामना करने में सफल साबित हुई है और इसलिए दवा विकास के लिए आकर्षक है। यह अध्ययन वैसोप्रेसिन-प्रेरित AQP2 तस्करी और अभिव्यक्ति को ठीक करने में शामिल सीएएसआर की उत्तेजना के माध्यम से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम सिग्नलिंग को संशोधित करने की क्षमता दिखाते हुए ओएलई की कार्रवाई के तंत्र में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। शारीरिक स्थितियों के तहत, AQP2 शरीर के पानी के होमोस्टैसिस को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इंट्रासेल्युलर मशीनरी का उत्तेजना, जिसके कारण एपिकल प्लाज्मा झिल्ली पर AQP2 का स्थानीयकरण होता है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य जल प्रतिधारण और परिणामी हाइपोनेट्रेमिया होता है, जैसा कि अनुचित एंटीडाययूरेटिक हार्मोन (SIADH) स्राव, यकृत सिरोसिस और कंजेस्टिव हार्ट फेल्योर के सिंड्रोम में होता है। एक माउस में SIADH का मॉडल, पॉलीसिस्टिक किडनी रोग 1 अगुणता से जुड़ा, जंगली प्रकार के चूहों के एकत्रित नलिकाओं में मापा स्तर की तुलना में बेसल इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर काफी कम हो गया था। कम इंट्रासेल्युलर कैल्शियम ने प्रोटीन फॉस्फेटस PP2A सहित कुछ एंजाइमों की गतिविधि को कम कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप सेरीन 2561 पर AOP2 फॉस्फोराइलेशन का अपचयन हुआ। इसके विपरीत। कैल्सीमेटिक एनपीएस-आर568 के साथ सीएएसआर की सक्रियता ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि की और पीकेडी 1 की कमी वाली कोशिकाओं में सीएमपी स्तर को कम कर दिया। महत्वपूर्ण रूप से, साइटोसोलिक कैल्शियम कैल्शियम-इनहिबिटेबल एडिनिलेटेड साइक्लेज3 को डाउनरेगुलेट कर सकता है, जिससे सीएमपी के इंट्रासेल्युलर स्तर को ठीक किया जा सकता है। cyclase4। इस अध्ययन में, ओएलई के साथ उपचार ने सीएएमपी और एओपी 2-pS256 की वैसोप्रेसिन-निर्भर वृद्धि को रोका, संभवतः इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि के लिए माध्यमिक। ध्यान दें, पारगम्य 8-Br-cAMP का उपयोग करके cAMP के बाहरी स्रोत के संपर्क में आने से V2R मार्ग पर OLE के निरोधात्मक प्रभाव का काफी विरोध हुआ।

साइटोसोलिक कैल्शियम का एक ऊंचा स्तर कोशिका मृत्यु और एपोप्टोसिस का कारण बन सकता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में 250 एनएम से 600 से अधिक की निरंतर वृद्धि ने न्यूरोनल उत्तरजीविता को बढ़ावा दिया4.एमसीडी4 कोशिकाओं में, 0.1 मिलीग्राम / एमएल पर ओएलई के साथ उपचार प्रदर्शित नहीं होता है एक साइटोटोक्सिक प्रभाव। इस सांद्रता पर, OLE (0.1 mg/ml) ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्तर को थोड़ा बढ़ा दिया। कैल्शियम इमेजिंग से पता चला है कि ओएलई के साथ तीव्र उत्तेजना ने सीएएसआर की सक्रियता के माध्यम से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की क्षणिक वृद्धि का कारण बना दिया है, जिसे तब समाप्त कर दिया गया है जब कोशिकाओं को चयनात्मक सीएएसआर प्रतिपक्षी एनपीएस2143 के साथ प्रीइनक्यूबेट किया गया था, वृक्क समीपस्थ ट्यूब्यूल कोशिकाओं में, आई-ऑर्निथिन के साथ सीएएसआर के एलोस्टेरिक सक्रियण। आरओएस उत्पादन को कम कर दिया जिससे माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव कम हो गया जिससे सेल एपोप्टोसिस 356 हो गया। इसके अलावा, हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि सीएएसआर के गेन-ऑफ-फंक्शन वेरिएंट की अभिव्यक्ति ने AQP237 के ROS रिलीज़ और S-glutathionylation को कम कर दिया। OLE के साथ इनक्यूबेशन ने MCD4 कोशिकाओं में अपनी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता दिखाते हुए ROS पीढ़ी को कम कर दिया। फिर भी, फिलहाल यह स्पष्ट नहीं है कि OLE AOP को प्रभावित करता है या नहीं 2-S-glutathionylation। कई अध्ययनों से पता चला है कि ओएलई या ओलेयूरोपिन, जो ओएलई का मुख्य घटक है, कोशिका मृत्यु को रोककर सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकता है, हालांकि, ओएलई प्राप्त करने वाले चूहों में खुराक पर निर्भर प्रभावों का वर्णन किया गया है। 250 और 500 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर लाभकारी प्रतिक्रियाएं प्राप्त की गईं। इसके विपरीत, उच्च सांद्रता पर, ओएलई के साथ उपचार के हानिकारक प्रभाव हो सकते हैं, संभवतः कई फाइटोकंपाउंड्स के प्रो-ऑक्सीडेंट कार्यों के कारण। इस अध्ययन में, चूहों को ओएलई के साथ 250 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर तीन दिनों के लिए इंजेक्शन दिया गया था, जो सीएएसआर के अपग्रेडेशन को दर्शाता है। सीएएसआर का अभिव्यक्ति स्तर कुछ यौगिकों द्वारा बढ़ाया जाता है जो रिसेप्टर के एलोस्टेरिक सक्रियक के रूप में कार्य करते हैं। कैल्सीमिमेटिक्स, वास्तव में, मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में सीएएसआर के जैवसंश्लेषण को बढ़ाकर संवहनी कैल्सीफिकेशन को कम करता है। इस प्रतियोगिता में, इस संभावना से इंकार नहीं किया जा सकता है कि ओएलई में कुछ यौगिक सीएएसआर के एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर के रूप में कार्य कर सकते हैं। दूसरी ओर, वैसोप्रेसिन के साथ उत्तेजना से IL -6 रिलीज हो सकता है जो CaSR42 के अभिव्यक्ति स्तर को बढ़ाने में योगदान कर सकता है।

गुर्दे में, CaSR संकेतन की उत्तेजना संभवतः miR-137 पीढ़ी के माध्यम से AQP2 अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन के साथ जुड़ी हुई है।miRNAs निर्णायक पोस्टट्रांसक्रिप्शनल न्यूनाधिक हैं। AQP2 अभिव्यक्ति को लक्षित करने वाले कई वैसोप्रेसिन-आश्रित miRNAs का भी वर्णन किया गया है। MiR-32 और miR-137 के साथ अभिकर्मक ने mpkCCDc14 कोशिकाओं में AOP2 के अभिव्यक्ति स्तर को काफी कम कर दिया। दिलचस्प बात यह है कि ओएलई भड़काऊ संकेतों को कम कर सकता है और कई miRNAs के अभिव्यक्ति स्तर को संशोधित करके सुरक्षात्मक प्रभाव डाल सकता है। विशेष रूप से, ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म कोशिकाओं में, OLE ने miR-13745 सहित विभिन्न miRNA की अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, जो कि डाउनरेगुलेशन में शामिल है। Akt/mTOR सिग्नलिंग पाथवे 46. ध्यान दें, oleuropein के साथ उपचार कैल्शियम-प्रेरित CAMK और AMPK के सक्रियण के माध्यम से Akt/mTOR सिग्नलिंग को रोकता है। NPS-R568 के साथ CaSR का सक्रियण AMPK को सक्रिय करता है और मानव समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में mTOR गतिविधि को कम करता है। इन निष्कर्षों के अनुरूप, OLE के साथ ऊष्मायन साइटोसोलिक कैल्शियम को बढ़ाता है, PKA गतिविधि को कम करता है, और 3D-सेल संस्कृति मॉडल में पुटी के आकार को कम करता है। साथ में इन निष्कर्षों से पता चलता है कि OLE CaSR सिग्नलिंग के डाउनरेगुलेशन से संबंधित इंट्रासेल्युलर कैल्शियम डायनेमिक्स के अपचयन द्वारा विशेषता विकारों के इलाज में उपयोगी हो सकता है।

जैतून की पत्ती के अर्क में कई बायोएक्टिव घटक होते हैं, जिनमें पॉलीफेनोल्स, फाइबर और खनिज शामिल हैं। फिलहाल, यह स्पष्ट नहीं है कि ओएलई में फाइटोकंपाउंड का एक यौगिक या सहक्रियात्मक संयोजन इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने में फायदेमंद हो सकता है। इस अध्ययन में उपयोग किए गए अर्क को एक संभावित खाद्य योज्य के रूप में लागू किया गया है और इसलिए अर्क के शारीरिक प्रभाव को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि हाइड्रोक्सीटायरसोल सहित कई फिनोल गुर्दे द्वारा फ़िल्टर किए जा सकते हैं और मूत्र में बरामद हो सकते हैं। आगे के अध्ययन विशिष्ट घटकों की प्रभावकारिता प्रदान करेंगे जो सीएएसआर के माध्यम से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम सिग्नल-आईएनजी को सक्रिय रूप से विनियमित कर सकते हैं। निष्कर्ष निकालने के लिए, यह अध्ययन इस बात का प्रमाण प्रदान करता है कि OLE को एक उपन्यास संभावित सहायक माना जा सकता है जो CaSR अभिव्यक्ति में कमी के साथ-साथ गुर्दे के पानी की पारगम्यता को प्रभावित करने और प्रभावित करने वाले विकारों को कम करने के लिए उपयोगी है।

सामग्री और तरीके

रसायन और एंटीबॉडी।सभी रसायन और एंटीबायोटिक्स मर्क (मर्क केजीए, डार्मस्टैड, जर्मनी) से खरीदे गए थे। Calcein-AM, Fura-2-AM, सेल कल्चर मीडिया, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और सुपर सिग्नल वेस्ट पिको केमिलुमिनसेंट सबस्ट्रेट्स थर्मो फिशर साइंटिफिक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA, यूएसए) से खरीदे गए थे। एक्वापोरिन{ {2}}(AQP2) को मानव AQP2 के अंतिम 15 C-टर्मिनल अमीनो एसिड के अनुरूप सिंथेटिक पेप्टाइड के खिलाफ उठाए गए विशिष्ट एंटीबॉडी (C-tail Ab) का उपयोग करके पता लगाया गया था! AQP2-pS256 एंटीबॉडी प्रो पीटर डीन द्वारा उपहार में दिए गए थे। माध्यमिक बकरी विरोधी खरगोश हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-युग्मित एंटीबॉडी मर्क (मर्क केजीए, डार्मस्टैड, जर्मनी) से प्राप्त किए गए थे। एलेक्सा -488 से जुड़ा एक द्वितीयक बकरी-विरोधी खरगोश एंटीबॉडी थर्मो फिशर साइंटिफिक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) से खरीदा गया था।

फेनोलिक्स-समृद्ध अर्क उत्पादन और रासायनिक लक्षण वर्णन।जैसा कि रैनिरी एट अल में बताया गया है, जैतून के पत्तों से एक फेनोलिक-समृद्ध अर्क का उत्पादन किया गया था। 35। एक ब्लेंडर (वारिंग-कमर्शियल, टॉरिंगटन, सीटी, यूएसए) के साथ मिलिंग के बाद, ddH2O पानी जोड़ा गया (अनुपात 1/20, w/y) और फिर तीन बार अल्ट्रासाउंड (CEIA, Viciomaggio, इटली) के अधीन किया गया। हर बार 35 ± 5 डिग्री पर 30 मिनट के लिए। अंत में, अर्क को फिल्टर पेपर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया, lyophilized, और -20 डिग्री C पर संग्रहीत किया गया। प्राप्त अर्क को 0.45 माइक्रोन (मर्क KGaA, डार्मस्टैड, जर्मनी) के नायलॉन फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया और रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया गया। डिफोंजो एट अल के अनुसार कुल फिनोल सामग्री, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि और एकल फेनोलिक यौगिकों की पहचान की गई। ओएलई ने 195 मिलीग्राम के बराबर फोलिन-सियोकाल्टु द्वारा निर्धारित पॉलीफेनोल्स की एक सामग्री दिखाई। गैलिक एसिड समकक्ष (जीएई) और एक एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि, एबीटीएस द्वारा निर्धारित (2,2'-एज़िनो-बीआईएस (3-एथिलबेनज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड डायमोनियम नमक）, 750 μmol TE （Trolox समकक्ष) के लिए लेखांकन। .

सेल संस्कृति और उपचार।माउस कॉर्टिकल कलेक्टिंग डक्ट MCD4 सेल्स, मानव AQP2 और काइमेरिक V2R-Rluc को स्पष्ट रूप से व्यक्त करते हुए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को Dalbec-cos संशोधित ईगल के माध्यम के 1:1 मिश्रण में विकसित किया गया था और F -12 को 5 प्रतिशत (y/y) भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक किया गया था। 1 प्रतिशत (y/y) L-glutamine और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 μM डेक्सामेथासोन, 4 0 0 ug/ml G418 (AQP2 प्रतिरोध के लिए) और 1 ug/ml पौरोमाइसिन (V2R-Rluc प्रतिरोध के लिए) , 5 प्रतिशत सीओ आर्द्र वातावरण में, 37 डिग्री पर। MCD4 कोशिकाओं को बेसल स्थिति (CTR) के तहत छोड़ दिया गया था या लंबे समय तक OLE के साथ 0.1 mg / ml O / N, dDAVP को 100 nM पर 30 मिनट के लिए, या OLE और dDAVP या NPS2143 के साथ l μM O / N पर सह-उपचार किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए 500 μM पर 8-Br-cAMP से अवगत कराया गया, ओएलई के साथ 5 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल और एनपीएस2143 पर 15 मिनट के लिए 10 μM पर अल्पकालिक प्रयोग किए गए। अलग-अलग मार्ग से कोशिकाओं का उपयोग करके स्वतंत्र समय 3-5 प्रयोग किए गए।

पशु मॉडल और उपचार।प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और संचालन के लिए डेनिश राष्ट्रीय दिशानिर्देशों और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रकाशित दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रक्रियाओं को पूरा किया गया था, प्रोटोकॉल को क्लिनिकल मेडिसिन संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था। आर्फस विश्वविद्यालय, डेनमार्क के न्याय मंत्रालय द्वारा जारी प्रायोगिक जानवरों के उपयोग के लिए लाइसेंस के अनुसार (अनुमोदन संख्या 2015-15-0201-00658)। वयस्क नर विस्टार चूहों पर 200-225 ग्राम के शुरुआती वजन के साथ अध्ययन किया गया। जानवरों को एक मानक कृंतक आहार (अल्ट्रोमिन, लेज, जर्मनी) पर रखा गया था और उन्हें नल के पानी की मुफ्त पहुंच थी। प्रयोगों के दौरान, चूहों को दो प्रति पिंजरे के समूहों में रखा गया था, जिसमें 12:12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र, 21 ± 2 डिग्री सेल्सियस का तापमान और 55 ± 2 प्रतिशत की आर्द्रता थी। 200 उल खारा / जानवर में 1 एनजी डीडीएवीपी (सिग्मा-एल्ड्रिच, ग्लोस्ट्रुप, डेनमार्क) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ पांच चूहों का इलाज किया गया था, और पांच वाहन-उपचार वाले चूहों को नियंत्रण के रूप में परोसा गया था। 30 मिनट के बाद, चूहों को मार दिया गया, और गुर्दे को नीचे वर्णित अनुसार संसाधित किया गया।

सेल और IMCD lysates।कोशिकाओं को {0}} मिमी व्यंजन पर उगाया गया और 22 0 मिमी मैनिटोल, 7 0 मिमी सुक्रोज, {{1 0}} युक्त बफर में फिर से जोड़ा गया। 5 एम ईजीटीए पीएच 8.0,0.5 एम ईडीटीए पीएच 8.0,1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4 प्रोटीज की उपस्थिति में (1 मिमी पीएमएसएफ, 2 मिलीग्राम / एमएल ल्यूपेप्टिन, और 2 मिलीग्राम / एमएल पेप्सटिन ए) और फॉस्फेटेस (10 मिमी NaF और 1 मिमी सोडियम ऑर्थोवनाडेट) अवरोधक। वैकल्पिक एलवी, लगभग 0.5 मिमी के गुर्दा वर्गों को 1i8 मिमी NaCl, 16 मिमी हेप्स, 17 मिमी Na-Hepes, 14 मिमी ग्लूकोज, 3.2 मिमी KCl, 2.5 मिमी CaCl2,1.8 मिमी MgSO4 युक्त बफर में 10 मिनट के लिए तैयार और संतुलित किया गया था। 1.8 मिमी KH2PO4 (pH7.4)। गुर्दे के पैपिला को प्रोटीज (1 मिमी PMSF, 2 mg / mlleupeptin, और 2mg / mlpepstatin A) और फॉस्फेटेस (10 मिमी NaF और 1 मिमी सोडियम) की उपस्थिति में एक ही बफर में कैंची से कीमा बनाया गया था। orthovanadate) अवरोधक। सोनिका-टियन (5 एस के लिए 60 kHz) के बाद, lysates को 12, 000 × g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और इम्युनोब्लॉटिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था।

संनाभि माइक्रोस्कोपी।पहले वर्णित के रूप में कन्फोकल अध्ययन किए गए थे। संक्षेप में, कोशिकाओं को सेल कल्चर पीईटी इन्सर्ट पर उगाया गया और ऊपर वर्णित के अनुसार व्यवहार किया गया। वैकल्पिक रूप से, नियंत्रण से प्राप्त गुर्दा वर्गों, OLE, dDAVP, और OLE को dDAVP उपचारित चूहों के साथ पहले वर्णित के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के अधीन किया गया था। छवियों को एक मुखर लेजर-स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप Leica TCS SP2 (Leica माइक्रोसिस्टम्स, हीरब्रग, स्विट्जरलैंड) के साथ प्राप्त किया गया था। जेल वैद्युतकणसंचलन और इम्युनोब्लॉटिंग। प्रोटीन को 12 प्रतिशत दाग-मुक्त पॉलीक्रिलामाइड जैल (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक।, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) पर अलग किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित =5, 52 की शर्तों को कम करने के तहत किया गया था। संक्षेप में, प्रोटीन बैंड को इमोबिलोन-पी मेम्ब्रेन (मर्क केजीए, डार्मस्टैड, जर्मनी) पर स्थानांतरित किया गया और एंटी-एक्यूपी2 (प्री-सी-टेल एब) और एंटी-एक्यूपी 2- pS256 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोब्लॉट किया गया। केमिडॉक सिस्टम (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक।, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) के साथ सुपर सिग्नल वेस्ट पिको केमिलुमिनसेंट सबस्ट्रेट्स का उपयोग करके इम्यूनोएक्टिव सिग्नल प्राप्त किए गए थे। दाग-मुक्त तकनीक (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक।) का उपयोग करके कुल प्रोटीन के लिए बैंड को सामान्य किया गया था। हरक्यूलिस, सीए, यूएसए)। इमेजलैब (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक।, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके डेंसिटोमेट्री विश्लेषण किया गया था और ग्राफपैड प्रिज्म (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

जल पारगम्यता परख।आसमाटिक जल पारगम्यता को पहले वर्णित रूप में मापा गया था। संक्षेप में, MCD4 कोशिकाओं को 40-mm ग्लास कवरस्लिप्स पर उगाया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को 10 μM झिल्ली-पारगम्य Calcein-AM के साथ 45 मिनट के लिए 37 डिग्री, 5 प्रतिशत CO, DMEM/F-12 में लोड किया गया था। Coverslips एक छिड़काव कक्ष (FCS2 क्लोज्ड चैंबर सिस्टम, BIOPTECHS, बटलर, यूएसए) में लगाए गए थे। एकल-कोशिका प्रतिदीप्ति माप के लिए सुसज्जित एक उल्टे TE 2000- S माइक्रोस्कोप (Nikon ग्रहण माइक्रोस्कोप, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके माप किए गए थे। और इमेजिंग विश्लेषण। Calcein-AM- लोडेड नमूने 490 एनएम पर उत्साहित थे। प्रतिदीप्ति माप, निम्नलिखित आइसोस्मोटिक (140 मिमी NaCl.5 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl..1 मिमी CaCl।, 10 मिमी हेप्स सल्फोनिक एसिड, 5 मिमी ग्लूकोज, पीएच 7.4) या हाइपरोस्मोटिक (135 मिमी मन्निटोल के साथ जोड़ा गया आइसोस्मोटिक समाधान) समाधान . मेटाफ्लोर सॉफ्टवेयर (आणविक उपकरण, एमडीएस एनालिटिकल टेक्नोलॉजीज, टोरंटो, कनाडा) का उपयोग करके किए गए थे। आइसो- और हाइपरोस्मोटिक समाधानों के साथ कोशिकाओं को सुगंधित करने के बाद समय पाठ्यक्रम प्रतिदीप्ति डेटा दर्ज किया गया था। सेल संकोचन के समय पाठ्यक्रम को समय स्थिरांक (Ki, 1/r, sec के रूप में व्यक्त किया गया) के रूप में मापा गया था, पानी की पारगम्यता से संबंधित एक पैरामीटर, ग्राफपैड प्रिज्म (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो) का उपयोग करके विश्लेषण किए गए एक घातीय फ़ंक्शन के साथ फिटिंग डेटा द्वारा प्राप्त किया गया था। , सीए, यूएसए)।

प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण माप।इंट्रासेल्युलर सीएमपी परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) तकनीक लागू की गई थी। FRET प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग H96 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जिसमें EPAC1 का cAMP-बाइंडिंग सर्वसम्मति मूल भाव था, जो सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP) और cp173Venus-Venus के बीच एम्बेडेड था जैसा कि पहले दिखाया गया था 32.33.54। H96 जांच को कूटने वाला प्लाज्मिड डॉ. के. जालिंक। ईसीएफपी-और/या ईवाईएफपी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का विज़ुअलाइज़ेशन और एफआरईटी का पता लगाना एक उल्टे टीई 2000-एस माइक्रोस्कोप (निकॉन एक्लिप्स माइक्रोस्कोप, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक छवि को ठीक किया गया और विश्लेषण किया गया जैसा कि पहले दिखाया गया था।

इंट्रासेल्युलर कैल्शियम माप। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम माप पहले दिखाए गए अनुसार किया गया था। संक्षेप में, MCD4 कोशिकाओं को DMEM/F -12 में 37 डिग्री पर 15 मिनट के लिए 4 μM Fura -2 AM से लोड किया गया था। 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl 1 मिमी MgCl, 10 मिमी HEPES, 5 मिमी ग्लूकोज, 1.8 मिमी CaCl, पीएच 7.4 युक्त प्रयोग के दौरान रिंगर के समाधान का उपयोग कोशिकाओं को सुगंधित करने के लिए किया गया था। प्रतिदीप्ति माप में, अतिभारित कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप एक छिड़काव कक्ष (FCS2 बंद चैंबर सिस्टम। BIOPTECHS। बटलर, यूएसए) में लगाए गए थे। एक उल्टे टीई 2000- एस माइक्रोस्कोप (निकॉन एक्लिप्स माइक्रोस्कोप, टोक्यो। जापान) का उपयोग करके माप किए गए थे, 340 और 380 एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात को प्लॉट किया गया था और प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के रूप में गणना की गई थी। विशेष रूप से, OLE（1 mg/ml） या NPS2143 μ10 μM） के साथ उत्तेजना की तुलना उसी सेल प्रकार में की गई थी, जो कैल्शियम-मध्यस्थता वाले एगोनिस्ट ATP（100 μM） की अधिकतम खुराक के साथ उत्तेजना के बाद प्राप्त हुई थी, जिसका उपयोग एक के रूप में किया गया था। आंतरिक नियंत्रण (100 प्रतिशत)।

इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्तर को स्थिर-अवस्था में मापा गया और Grynkiewicz57 द्वारा वर्णित के रूप में कैलिब्रेट किया गया। OLE और NPS2143 का उपयोग क्रमशः 0.1 mg/ml और l uM पर दीर्घावधि में किया गया था, और प्रत्येक नमूने को 1 mM EGTA（Rm की उपस्थिति में 5 μM आयनोमाइसिन के अतिरिक्त अंशांकित किया गया था। इसके बाद 5 5 मिमी CaCl, (RMA) में μM आयनोमाइसिन।

नियंत्रण और उपचारित चूहों में AQP2 और CaSR mRNA का रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण।नियंत्रण से अलग किए गए आंतरिक मज्जा संग्रह वाहिनी (IMCD) में mRNA की सापेक्ष अभिव्यक्ति को मापने के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रयोग किए गए थे और चूहे के गुर्दे की पैपिला का इलाज किया गया था। लगभग 0.5 मिमी के गुर्दे के स्लाइस बनाए गए और 118 मिमी NaCl, 16 मिमी HEPES, 17 मिमी Na-Hepes, 14 मिमी ग्लूकोज, 3.2 मिमी KCl, 2.5 मिमी CaCl2,1.8 युक्त बफर में 10 मिनट के लिए संतुलित किया गया। मिमी MgSO4, और 1.8 मिमी KH2PO4 (पीएच 7.4)। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत गुर्दे के पैपिला को अलग किया गया था। नियंत्रण और उपचारित चूहों के नमूनों को सीधे ट्राईज़ोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) में एक कैंची से कीमा बनाया गया था। सुपरस्क्रिप्टविलो मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) का उपयोग करके कुल आरएनए के 2.5 कुओं पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया था। यूएसए), निर्माता के सुझावों के अनुसार (10 मिनट के लिए 25 सी; 60 मिनट के लिए 42 सी; 5 मिनट के लिए 85 सी)। स्टेपऑन रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) में सीएएसआर, एओपी 2 और जीएपीडीएच एसेज़ (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के साथ टैगमैन फास्ट एडवांस्ड मास्टर मिक्स का उपयोग करके रीयल-टाइम पीसीआर प्रवर्धन किया गया था। ), निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में थर्मल साइकिल चालन की स्थिति निर्धारित करना (20 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 40 चक्र वैकल्पिक रूप से 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 एस और 60 डिग्री सेल्सियस 20 एस के लिए)। परिणाम 2- के रूप में व्यक्त किए गए थे। ACt=(Ct target-Ct GAPDH) के साथ मान (सापेक्ष मात्रा का ठहराव) का इलाज किया गया- (Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

नियंत्रण और उपचारित चूहों में miRNA-137 मूल्यांकन।miRNA {0}} नियंत्रण में सामग्री और उपचारित चूहे के आंतरिक मज्जा संग्रह वाहिनी का मूल्यांकन टैगमैन उन्नत miRNA assays (has-miR -137; परख आईडी; 477904 mir; थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) का उपयोग करके किया गया था। .US.A), जिसने मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके परिपक्व miRNA की अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट अधिसूचना को सक्षम किया। 118 मिमी NaCl, 16 मिमी HEPES, 17 मिमी Na-Hepes, 14 मिमी ग्लूकोज, 3.2 मिमी KCl, 2.5 मिमी CaCl2,1.8 मिमी MgSO4 और 1.8 मिमी युक्त बफर में लगभग 0.5 मिमी के गुर्दे के स्लाइस बनाए गए और 10 मिनट के लिए संतुलित किया गया। KH2PO4 (pH7.4)। गुर्दे के पैपिला को एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अलग किया गया था। कुल आरएनए निकालने के लिए नियंत्रण और उपचारित चूहों के नमूनों को सीधे ट्राईज़ोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) में कैंची से काट दिया गया। टाकमैन एडवांस्ड miRNA सीडीएनए सिंथेसिस किट कैटलॉग n²∶A25576; थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए-का उपयोग सीडीएनए संश्लेषण प्राप्त करने के लिए किया गया था, निर्माता (पॉली (ए) टेलिंग रिएक्शन; लिगेशन रिएक्शन; रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन; एमआईआर-एएमपी रिएक्शन) द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार। 59- फॉस्फोर के साथ सिंथेटिक आरएनए (UUAUUGCUUAAGAAUAACCGCUAG) थर्मो फिशर साइंटिफिक द्वारा संश्लेषित किया गया था और miRNA नमूना मूल्यों को प्रक्षेपित करने और miR-137 सामग्री का एक सटीक मूल्यांकन (नैनोग्राम में) प्राप्त करने के लिए एक अंशांकन वक्र का प्रदर्शन करता था। नमूने16, ग्राफपैड प्रिज्म (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके।

सांख्यिकीय विश्लेषण।सभी मूल्यों को माध्य के रूप में सूचित किया जाता है ± SEM सांख्यिकीय विश्लेषण एकतरफा एनोवा द्वारा किया गया था, जिसके बाद न्यूमैन-केल्स एकाधिक तुलना परीक्षण * पी के साथ किया गया था<0.05 considered="" statistically="" different="">

बयान, नैतिक अनुमोदन, और भाग लेने के लिए सहमति।प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और संचालन के लिए डेनिश राष्ट्रीय दिशानिर्देशों और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रकाशित दिशानिर्देशों के अनुसार पशु अध्ययन किए गए थे। डेनमार्क के न्याय मंत्रालय (अनुमोदन संख्या 2015-15-0201-00658) द्वारा जारी प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए लाइसेंस के अनुसार, आर्फस विश्वविद्यालय के क्लिनिकल मेडिसिन संस्थान की पशु देखभाल नैतिकता समिति ने अध्ययन प्रोटोकॉल को मंजूरी दी। लेखक पुष्टि करते हैं कि सभी तरीके प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किए गए थे। इसके अलावा, लेखक पुष्टि करते हैं कि अध्ययन आगमन दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था।

संदर्भ

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