लैमिवुडिन SAMP8 चूहों में संज्ञानात्मक गिरावट में सुधार करता है: विवो फार्माकोलॉजिकल मूल्यांकन और नेटवर्क फार्माकोलॉजी में एकीकरण

अमूर्त

लैमिवुडिन (3TC) जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधक इसमें महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैंबुढ़ापा विरोधी, लेकिन उनका प्रभाव पर पड़ता हैउम्र बढ़ने के कारण होने वाली न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियाँस्पष्ट नहीं हैं, विशेषकर के कार्यों परतंत्रिका तंत्र जैसे अनुभूति. इस अध्ययन में, हमने 4 सप्ताह के लिए गैस्ट्रिक छिड़काव (100 मिलीग्राम/किग्रा) द्वारा वृद्धावस्था-त्वरित माउस प्रोन 8 (एसएएमपी8) चूहों को 3टीसी दिया। हमारे परिणामों से पता चला कि 3TC में उल्लेखनीय सुधार हुआSAMP8 चूहों की उम्र बढ़ने की स्थिति, विशेष रूप से मॉरिस वॉटर भूलभुलैया परीक्षण द्वारा मूल्यांकन की गई संज्ञानात्मक क्षमता में गिरावट। के आणविक तंत्र की और जांच करने के लिएउम्र बढ़ने की स्थिति में सुधार3TC द्वारा SAMP8 चूहों में से, चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों (यानी, हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स) का अध्ययन करने के लिए qपीसीआर और ऊतक धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया था, जबकि 3TC के संभावित लक्ष्यों की जांच के लिए नेटवर्क फार्माकोलॉजी विश्लेषण लागू किया गया था। परिणामों से पता चला कि जीन का एमआरएनए स्तर लंबे अंतराल वाले तत्व से संबंधित है -1, टाइप 1 इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया, सेनेसेंस-जुड़े स्राव फेनोटाइप, औरअल्जाइमर रोगSAMP8 चूहों के हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स में वृद्धि हुई थीबुढ़ापा, लेकिन यह प्रवृत्ति 3TC द्वारा आंशिक रूप से उलट गई थी। हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों के परिणामों से पता चला है कि 3TC ने हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की मृत्यु को कम कर दिया है, जबकि नेटवर्क फार्माकोलॉजी विश्लेषण के परिणामों ने संकेत दिया है कि 3TC एस्ट्रोजन सिग्नलिंग और PI3K/Akt और न्यूरोएक्टिव लिगैंड-रिसेप्टर इंटरेक्शन सिग्नलिंग मार्ग सहित कई मार्गों के माध्यम से अपना प्रभाव डाल सकता है। जिसे हमने इन विट्रो प्रयोगों के माध्यम से सत्यापित किया है। ये निष्कर्ष न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार में 3TC की चिकित्सीय क्षमता के प्रमाण प्रदान करते हैं।

कीवर्डउम्र बढ़ने, संज्ञानात्मक क्षमता, लैमिवुडिन, एलओंग अन्तर्विभाजक तत्व-1, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग

चीनी जड़ी-बूटियाँ सिस्टैंच प्रभाव परएंटी-एजिंग पर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधक

1|परिचय

आज तक, उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, जैसेअल्जाइमर (एडी) या पार्किंसंस रोगउम्र बढ़ने से जुड़े, वैश्विक जनसांख्यिकीय परिवर्तनों के कारण लगातार बढ़ रहे हैं। 1,2 संज्ञानात्मक गिरावट लंबे और स्वस्थ जीवन को प्राप्त करने में एक गंभीर बाधा का प्रतिनिधित्व करती है। दशकों से, ऐसी दवाओं की खोज के लिए काफी प्रयास किए गए हैं जिनका उपयोग उम्र बढ़ने के साथ संज्ञानात्मक गिरावट का इलाज करने के लिए किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, लंबे समय तक फैले हुए तत्व -1 (एल 1) ने एक संभावित उपन्यास के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। वृद्धावस्था के अध्ययन के लिए लक्ष्य।4 एल1 ~500,000 प्रतियों के साथ गैर-लंबे टर्मिनल रिपीट रेट्रोट्रांसपोज़न के सबसे प्रचुर परिवार से संबंधित है, जिसमें मानव जीनोम का ~17 प्रतिशत शामिल है। L1 जीन में दो खुले रीडिंग फ्रेम (ORF1 और ORF2) के साथ एक ऑपेरॉन शामिल होता है, जो रेट्रोट्रांसपोज़िशन के लिए आवश्यक होते हैं। 5-7 ORF1 एक प्रोटीन (ORF1p) को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधियों के साथ एनकोड करता है, जिसे न्यूक्लियोसाइड एनालॉग्स द्वारा बाधित किया जा सकता है, जैसे लैमिवुडिन (2'-3'-डीऑक्सी-3'-थियोसाइटिडाइन, 3TC).8

सक्रिय L1 क्रोमैटिन के बाहर cDNA को संश्लेषित कर सकता है और फिर इसे ORF1p द्वारा उत्प्रेरित जीनोम में पुनः सम्मिलित कर सकता है, अंततः अन्य जीनों की अभिव्यक्ति को बदल सकता है और परिणामस्वरूप जीनोमिक अस्थिरता से जुड़ी बीमारियाँ हो सकती हैं। 9,10 मेजबान आम तौर पर एक श्रृंखला के माध्यम से L1 की ट्रांसपोज़ेबल गतिविधि को रोकता है। एपिजेनेटिक संशोधन और मेजबान सीमित कारक विनियमन जैसे नियमों का।11,12 एल1 का स्थानांतरण आम तौर पर केवल रोगाणु या कैंसर कोशिकाओं में होता है, जबकि हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एल1 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र या उम्र बढ़ने वाली कोशिकाओं में भी अत्यधिक सक्रिय है, हालांकि L1 के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र अस्पष्ट हैं।13 अध्ययनों से पता चला है कि L1 के निगरानी तंत्र से संबंधित कारक (उदाहरण के लिए, TREX1, RB1 और FOXA1) कोशिका जीर्णता में निष्क्रिय हैं, जिसके परिणामस्वरूप L1 सक्रिय होता है। TREX1 एक 3' एक्सोन्यूक्लियर एसेज़ है जो विदेशी हमलावर डीएनए को ख़राब करता है और इसका नुकसान साइटोप्लाज्मिक L1 cDNA के संचय के साथ जुड़ा हुआ है। 14 RB1 को L1 तत्वों सहित दोहराए जाने वाले तत्वों से बंधने और उनके हेटरोक्रोमैटिनाइजेशन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।15 और FOXA1 है सेन्सेंट कोशिकाओं13 में अप-विनियमित और एल1 5' यूटीआर के मध्य क्षेत्र से बंधा हुआ। सक्रिय L1 टाइप-I इंटरफेरॉन (IFN-I) प्रतिक्रिया को और सक्रिय करता है, जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शनल सीडीएनए के माध्यम से सूजन को प्रेरित करता है और बुढ़ापे से जुड़े स्राव फेनोटाइप (SASP) को बनाए रखता है। इसलिए, उम्र बढ़ने के कारण होने वाली सड़न रोकने वाली सूजन में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में, एल1 को उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों के इलाज के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य माना जाता है। 3TC से उपचारित बुजुर्ग चूहों में, मांसपेशियों और अन्य ऊतकों में L1 के बाह्यकोशिकीय प्रतिलेखन को रोककर सूजन कारकों के संचय में सुधार किया जाता है।16 आज तक, तंत्रिका तंत्र के कार्यों पर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधकों के प्रभावों का अध्ययन विरल है। हाल ही में, एडी के साथ मृत रोगियों के मस्तिष्क में जीनोमिक सीडीएनए (जेनसीडीएनए) के हजारों प्रकार पाए गए हैं, जो जीनोम में विशिष्ट आरएनए स्प्लिसिंग वेरिएंट के पुन: सम्मिलन के परिणामस्वरूप हुआ है।17 इस घटना को एडी का एक महत्वपूर्ण कारण माना जाता है। जेनसीडीएनए की उत्पत्ति के कारकों में प्रतिलेखन, डीएनए विनाश, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और उम्र बढ़ना शामिल हैं।

अध्ययनों से पता चला है कि अंतर्जात रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधियों के साथ चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइनों में न्यूक्लियोसाइड रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधकों का उपयोग करके जेनसीडीएनए गठन की प्रक्रिया को अवरुद्ध कर दिया गया है। इसके अलावा, 65 वर्ष से अधिक आयु के एड्स रोगी जो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधक ले रहे हैं लंबे समय तक शायद ही AD.20 विकसित हुआ हो, इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि 3TC, एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधक के रूप में, संज्ञानात्मक हानि और उम्र बढ़ने के कारण होने वाले न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार के लिए एक संभावित दवा हो सकती है। यह दिखाया गया कि मानव उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में, बुढ़ापा-त्वरित प्रोन 8 (एसएएमपी8) चूहों में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के शुरुआती चरणों में होने वाली कई विशेषताएं प्रदर्शित होती हैं, जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि, न्यूरोइन्फ्लेमेशन और संज्ञानात्मक गिरावट.21, इसलिए, इस अध्ययन में, SAMP8 चूहों को उम्र बढ़ने के कारण होने वाली न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में चुना गया था। हमने समय से पहले बूढ़े होने वाले चूहों और उम्र बढ़ने से जुड़े आणविक मार्गों पर 3TC के संज्ञानात्मक प्रभावों पर ध्यान केंद्रित किया, जो उम्र बढ़ने के कारण न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधकों की भूमिका के लिए सबूत प्रदान करता है। हमने 3TC के लक्ष्यों की भविष्यवाणी करने, नेटवर्क बनाने और 3TC से संबंधित जैविक कार्यों और मार्गों का विश्लेषण करने के लिए नेटवर्क फार्माकोलॉजी पद्धति को लागू किया।

2|प्रायोगिक खंड 2.1 |

पशु टियांजिन यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन द्वारा प्रदान किए गए {{0}सप्ताह के नर SAMP8 और सजातीय सामान्य बुढ़ापा-त्वरित माउस-R1 (SAMR1) चूहों का उपयोग {{7}सप्ताह की अनुकूलन अवधि के बाद किया गया था। पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को शेडोंग प्रांतीय अस्पताल की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) गाइड के आधार पर प्रदर्शन किया गया था। चूहों को ऑटोक्लेव्ड पिंजरों में रखा गया और बाँझ भोजन और पानी दिया गया। चूहों के शरीर का वजन हर दिन दर्ज किया गया। इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों का एक प्रवाह चार्ट चित्र 1ए में दिया गया है। प्रयोगों के पूरा होने पर, चूहों को डायथाइल ईथर इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई।

2.2|3टीसी की तैयारी और उपचार

प्रत्येक प्रयोग के दिन औषधियाँ ताज़ा तैयार की गईं। MCE (शंघाई, चीन) से खरीदे गए 3TC को DMSO में 2 mmol/L की अंतिम सांद्रता तक घोल दिया गया। फिर स्टॉक समाधान को पीने के पानी का उपयोग करके कार्यशील सांद्रता तक पतला किया गया, जिसमें डीएमएसओ की अंतिम सांद्रता 0.1 प्रतिशत से कम थी। चूहों के तीन समूह स्थापित किए गए: एक नियंत्रण समूह जिसे वाहन समाधान (पीने के पानी) से उपचारित किया गया, एक परीक्षण समूह जिसे 3TC से उपचारित किया गया, और SAMR1 समूह जिसने वाहन प्राप्त किया जिसे उम्र बढ़ने के लिए एक अन्य नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किया गया। परीक्षण समूह को मौखिक रूप से प्रति दिन 100 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर 3टीसी प्राप्त हुआ। सभी चूहों को 4 सप्ताह तक इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन द्वारा भोजन दिया गया (चित्र 1बी)।

चित्र 1 प्रायोगिक डिज़ाइन और उम्र बढ़ने और बुढ़ापा ग्रेडिंग स्कोर के कारण सापेक्ष वजन घटाने में सुधार पर 3TC का प्रभाव। (ए) एसएएमपी8 चूहों की संज्ञानात्मक क्षमता पर 3टीसी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए औषधीय प्रयोगों का प्रवाह चार्ट। (बी) पशु प्रयोग अनुसूची की योजनाबद्ध प्रस्तुति। (सी) फार्ममैपर का उपयोग करके दवा-लक्ष्य इंटरैक्शन की भविष्यवाणी करने के लिए वैचारिक कार्यप्रवाह, बाएं से दाएं, 3टीसी की आणविक संरचना, 3टीसी का 3डी संरचनात्मक आरेख और उच्चतम सामान्यीकृत के साथ एस्ट्रोजेन रिसेप्टर के लिए 3टीसी बाइंडिंग के साथ अनुमानित फार्माकोफोर मॉडल। फिट स्कोर. (डी) चूहों के प्रत्येक समूह में शरीर के वजन का विकास पैटर्न। (ई) 3टीसी के उपचार से पहले और बाद में ग्रेडिंग स्कोर में परिवर्तन। SAMR1 प्लस वाहन: सप्ताह पुराने SAMR1 चूहों का 4 सप्ताह तक वाहन-उपचार किया गया। SAMP8 प्लस वाहन: सप्ताह पुराने SAMP8 चूहों का वाहन में 4 सप्ताह तक उपचार किया गया। SAMP8 प्लस 3TC: सप्ताह पुराने SAMP8 चूहों का 3TC से 4 सप्ताह तक उपचार किया गया। छात्र का टी-टेस्ट: *p < 0.05, **p < 0.01 और ***p < 0.001। एनएस: कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं। काले तारांकन SAMR1 प्लस वाहन समूह के साथ तुलना दर्शाते हैं। लाल तारांकन SAMP8 प्लस वाहन समूह के साथ तुलना दर्शाते हैं। नीली रेखा 44 और 48 सप्ताह की आयु में SAMP8 प्लस 3TC समूह को चिह्नित करती है।

2.3|ग्रेडिंग स्कोर प्रणाली

चूहों में बुढ़ापे की डिग्री का मूल्यांकन पहले वर्णित ग्रेडिंग स्कोर प्रणाली का उपयोग करके किया गया था। 22 प्रत्येक श्रेणी के स्कोर में पांच स्तर होते हैं, जो 0 से लेकर 4 तक होते हैं, जिसमें ग्रेड का उच्चतम स्कोर जानवर की बुढ़ापा की उच्चतम डिग्री को दर्शाता है। . प्रत्येक श्रेणी के अंकों का मूल्यांकन चार अनुभवी प्रयोगकर्ताओं द्वारा अलग-अलग किया गया था, जो उपचार की स्थितियों से अनभिज्ञ थे (पूरक तालिका एस1)।

.2.4|मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण

मॉरिस जल भूलभुलैया का अध्ययन मॉरिस के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया, जिसमें एक ओरिएंटेशन नेविगेशन प्रयोग और जांच परीक्षण शामिल थे। 23 जल भूलभुलैया एक गोलाकार पूल (120 सेमी व्यास वाला 10 सेमी व्यास के मंच से सुसज्जित) था और 25 पर पानी से भरा हुआ था। ± 1 डिग्री . चूहों को एक मिनट के भीतर पानी की सतह के नीचे मंच खोजने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। यदि चूहे को 60 सेकंड के भीतर प्लेटफ़ॉर्म नहीं मिला, तो उसे प्लेटफ़ॉर्म पर निर्देशित किया गया और 20 सेकंड तक वहीं रहने दिया गया। प्रत्येक चूहे को प्रति दिन पांच बार प्रशिक्षित किया गया और प्रत्येक को 15 मिनट के लिए एक दूसरे से अलग किया गया। प्रत्येक परीक्षण में, प्रारंभिक स्थिति छद्म यादृच्छिक क्रम में भिन्न थी। परीक्षण के छठे दिन, प्लेटफ़ॉर्म को हटा दिया गया और जानवर भूलभुलैया के चतुर्थांश के विपरीत एक बिंदु से पानी की भूलभुलैया में प्रवेश कर गया जहाँ प्रशिक्षण के दौरान प्लेटफ़ॉर्म हुआ करता था और उसे 60 सेकंड के लिए भूलभुलैया का पता लगाने की अनुमति दी गई थी। तैराकी पथ और भूलभुलैया की खोज में चूहों द्वारा बिताया गया समय वीडियो कैमरे द्वारा रिकॉर्ड किया गया और एथोविज़न एक्सटी (नोल्डस सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। प्रत्येक समूह में कम से कम आठ जानवर शामिल थे।

2.5|आरएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक पीसीआर

निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen) का उपयोग करके उपचार के बाद चूहों के हिप्पोकैम्पल और कॉर्टिकल ऊतकों से कुल RNA निकाला गया। प्रत्येक आरएनए नमूना (1 ug) को सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (तकरा) का उपयोग करके सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए उलटा ट्रांसक्रिप्ट किया गया और फिर TaKaRa Taq किट (टकारा) का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धित किया गया। प्राइमर सेट को पूरक तालिका S2 में वर्णित किया गया है।

2.6|ऊतक तैयारी

जानवरों को डायथाइल ईथर से बेहोश किया गया था, और उनके दिमाग को फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) और 4 प्रतिशत पैराफॉर्मल्डिहाइड समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के बाद एकत्र किया गया था। मस्तिष्क के ऊतकों को हटा दिया गया और उन्हें 2 दिनों से अधिक समय तक पैराफॉर्मल्डिहाइड में स्थिर रखा गया। स्थिर मस्तिष्क को हिप्पोकैम्पस ऊतक के साथ पैराफिन में 5 माइक्रोन की मोटाई में विभाजित किया गया था।

2.7|हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधलापन

हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला तरीकों का उपयोग करके मस्तिष्क आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया गया था। हिप्पोकैम्पस ऊतकों के पैराफिन वर्गों को सांद्रता की एक श्रृंखला के अल्कोहल के क्रमिक प्रभाव के साथ डीवैक्स किया गया और निर्जलित किया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एचई स्टेनिंग एच एंड ई स्टेनिंग किट (सोलरबियो) का उपयोग करके किया गया था। इथेनॉल और ज़ाइलीन में डुबोए जाने के बाद, वर्गों को राल के साथ लगाया गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (ओलंपस) के तहत देखा गया।

2.8|निस्सल धुंधलापन

हिप्पोकैम्पस ऊतकों के अनुभागों पर न्यूरोनल चोट का पता लगाने के लिए निस्सल स्टेनिंग (बियंटियन) विधि का उपयोग किया गया था। अनुभागों को 30 मिनट के लिए निस्सल दाग से इनक्यूबेट किया गया और 95 प्रतिशत इथेनॉल से धोया गया। दागदार कोशिकाओं की गिनती की गई और एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (ओलंपस) के नीचे उनकी तस्वीरें खींची गईं। कोशिकाओं को हिप्पोकैम्पस ऊतक की प्रत्येक स्लाइड में तीन बेतरतीब ढंग से चयनित गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों पर गिना गया था, जिसमें जीवित न्यूरॉन्स की संख्या / न्यूरॉन्स की कुल संख्या के रूप में परिभाषित अस्तित्व सूचकांक था।

2.9|ट्यूनेल धुंधला हो जाना

हिप्पोकैम्पस ऊतकों के अनुभागों को 15 मिनट के लिए प्रोटीनएज़ K समाधान के साथ ऊष्मायन किया गया और उसके बाद TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण (बायोटाइम) के साथ ऊष्मायन किया गया। पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, अनुभागों को परमाणु डाई डीएपीआई युक्त एक बढ़ते समाधान के साथ लगाया गया था और एक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक कन्फोकल लेजर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया था।

2.10|3TC के लक्ष्य डेटाबेस का निर्माण

3TC का लक्ष्य डेटाबेस दो डेटाबेस के आधार पर बनाया गया था। सबसे पहले, फार्ममैपर डेटाबेस (//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html) के आधार पर रिवर्स फार्माकोडायनामिक जीन मैप का उपयोग करके 3TC के संभावित लक्ष्यों की पहचान की गई थी। सभी रासायनिक घटकों को चेम्बियोड्रॉ द्वारा '.mol2' के प्रारूप में परिवर्तित किया गया और फार्ममैपर डेटाबेस (चित्र 1C) पर अपलोड किया गया। 4.{7}} से अधिक सामान्यीकृत फ़िट स्कोर वाले अणुओं को 3TC के संभावित लक्ष्य के रूप में पहचाना गया था। दूसरा, लक्ष्य या यौगिकों की जैविक गतिविधियों की क्वेरी के लिए ChEMBL डेटाबेस (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) का उपयोग किया गया था। होमो सेपियन्स से प्राप्त प्रोटीन की पुष्टि 3TC के संभावित लक्ष्य के रूप में की गई थी।

2.11|लक्ष्य प्रोटीन अंतःक्रिया विश्लेषण और नेटवर्क निर्माण

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >डुप्लिकेट को हटाने के बाद डिज़ाइन की गई सेटिंग में 0.4 का चयन किया गया।

3TC के आणविक तंत्र की व्यापक जांच करने के लिए, PPI नेटवर्क का निर्माण साइटोस्केप सॉफ़्टवेयर संस्करण 3.6 का उपयोग करके किया गया था।(http://www.cytoscape.org/)। नोड्स का डिग्री विश्लेषण सेंटिस्केप 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape) के साथ नेटवर्क में हब जीन को निकटता केंद्रीयता मूल्य, बीचता केंद्रीयता मूल्य और डिग्री केंद्रीयता मूल्य के साथ {{6 पर सेट किया गया था) के साथ किया गया था। }}.2, 450 और 50, क्रमशः।

2.12|3TC के लिए सिग्नलिंग मार्ग को समृद्ध और स्क्रीनिंग करना

DAVID जैव सूचना विज्ञान डेटाबेस (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp) के आधार पर जैविक कार्य एनोटेशन के लिए संभावित लक्ष्यों के जैविक प्रक्रियाओं, सेलुलर घटकों और आणविक कार्यों के साथ जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण किया गया था। ऑनलाइन केईजीजी स्वचालित एनोटेशन सर्वर (//www.genome.jp/ kegg/) का उपयोग करके जीन और जीनोम (केईजीजी) डेटाबेस के क्योटो विश्वकोश के आधार पर केईजीजी चयापचय मार्गों को एनोटेट किया गया था।

2.13|अनुमानित लक्ष्यों के लिए 3TC का बंधन

कंपाउंड 3TC की एसडीएफ संरचना फ़ाइलें पबकेम वेबसाइट (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) द्वारा प्राप्त की गईं। SDF फ़ाइल को OpenBabel2.3.2 सॉफ़्टवेयर द्वारा PDB फ़ाइल में बदल दिया गया था, और रिसेप्टर प्रोटीन ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) और EGFR (PDBID:6S9C) प्रोटीन डेटा बैंक डेटाबेस (www.wwpdb) से प्राप्त किए गए थे। .org). PYMOL2.3.4 सॉफ़्टवेयर का उपयोग रिसेप्टर प्रोटीन से पानी और लिगेंड को हटाने के लिए किया गया था। डॉकिंग अध्ययन ऑटोडॉक वीना (1.1.2) का उपयोग करके किया गया था, जो स्क्रिप्स द्वारा विकसित एक ओपन-सोर्स आणविक डॉकिंग सॉफ्टवेयर है। टूल सॉफ़्टवेयर का उपयोग चार रिसेप्टर प्रोटीन को संशोधित करने के लिए किया गया था, और ग्रिड प्रोग्राम के तहत ग्रिड बॉक्स कमांड का उपयोग प्रत्येक रिसेप्टर प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए ग्रिड विकल्प टूल को खोलने के लिए किया गया था। जाली की दूरी 1 पर सेट की गई थी, और पॉकेट के केंद्र को बाइंडिंग साइट के केंद्र के रूप में सेट किया गया था।

2.14|कोशिका संवर्धन एवं उपचार

माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल सेल लाइन्स HT22 को शंघाई सेल बायोटेक्नोलॉजी कंपनी से खरीदा गया था। HT22 कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM में संवर्धित किया गया। प्रयोगात्मक उपचार से 1 दिन पहले कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेटों में डाला गया। जैसा कि पहले बताया गया है, कोशिकाओं की वृद्धावस्था सिग्मा-एल्ड्रिच से खरीदे गए फॉर्मेल्डिहाइड (एफए) से प्रेरित थी। 24 एचटी22 कोशिकाओं को तीन समूहों में विभाजित किया गया था, जिसमें एफए समूह को 24 घंटे के लिए 30 µmol/L FA से उपचारित किया गया था, FA/3TC समूह को 30 µmol/L FA और 50 µmol/L 3TC दोनों के साथ उपचारित किया गया, और नियंत्रण समूह को FA या 3TC के बिना संवर्धित किया गया।

2.15|इम्यूनोफ्लोरेसेंस और माइक्रोस्कोपी

माध्यम को हटा दिया गया, और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2 प्रतिशत पैराफॉर्मल्डिहाइड समाधान का उपयोग करके ठीक किया गया। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग पहले वर्णित अनुसार किया गया था।25 इस अध्ययन में उपयोग किए गए एंटीबॉडी में एलेक्सा फ्लोर 594 सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:1000; इनविट्रोजन) के साथ एंटी लाइन -1 ओआरएफ1पी एंटीबॉडी (1:1000; सिग्मा-एल्ड्रिच) शामिल थे। . नाभिक को लेबल करने के लिए कोशिकाओं को 1 मिनट के लिए डीएपीआई (1: 500 कमजोर पड़ने; थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ ऊष्मायन किया गया था। एंटी-फ्लोरेसेंस शमन माउंटिंग एजेंट जोड़ने के बाद, कोशिकाओं को एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप (निकॉन) का उपयोग करके देखा गया। 2.16|वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

EGFR, p-AKT1 (सक्रिय Akt1: S473 पर फॉस्फोराइलेटेड) और ADRB2 की अभिव्यक्तियाँ वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा मापी गईं। विभिन्न उपचारों के बाद कोशिकाओं से कुल प्रोटीन एकत्र किया गया। जैसा कि पहले बताया गया था, वेस्टर्न ब्लॉट किया गया था।26 इस अध्ययन में उपयोग किए गए एंटीबॉडी में एक एंटी-ईजीएफआर एंटीबॉडी (1:500; सिग्मा-एल्ड्रिच), एक एंटी-पीएकेटी1 एंटीबॉडी (1:1000; सिग्मा-एल्ड्रिच) शामिल थे। और एक एंटी-ADRB2 एंटीबॉडी (1:200; सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ खरगोश-विरोधी सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:1,000; इनविट्रोजन)। धोने के बाद, धब्बों को ईसीएल वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन सिस्टम (एमर्सहम, आयल्सबरी, यूके) के साथ विकसित किया गया।

2.17|डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

प्रत्येक प्रयोग को कम से कम तीन बार दोहराया गया और समान परिणाम दिखाने वाले परीक्षणों के साथ वैध माना गया। परिणाम माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किए गए। महत्वपूर्ण अंतर किसी भी छात्र के टी-टेस्ट द्वारा पी <{1}}.05 के साथ निर्धारित किया गया था।

जायदा के लिये पूछो:

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