सिस्टैंच ग्लाइसाइड Rg1 SAMP8 चूहों में NOX4/NLRP3 इन्फ्लेमसोम को रोककर उम्र बढ़ने से प्रेरित लिवर फाइब्रोसिस में सुधार करता है

अमूर्त।उम्र बढ़नेअक्सर साथ होता हैयकृत चोटऔरफाइब्रोसिस, अंततः गिरावट का कारण बनाजिगर का कार्य. हालाँकि, का तंत्रउम्र बढ़ने से प्रेरित जिगर की चोटऔरफाइब्रोसिसजहां तक हमारी जानकारी है, यह अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं जा सका है और वर्तमान में लीवर की उम्र बढ़ने के लिए कोई प्रभावी उपचार विकल्प उपलब्ध नहीं हैं। बताया गया है कि सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड आरजी1 (आरजी1) अपने शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी गतिविधि के कारण शक्तिशाली एंटी-एजिंग प्रभाव डालता है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य आरजी1 के सुरक्षात्मक प्रभाव और कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र की जांच करना हैउम्र बढ़ने से प्रेरित जिगर की चोटऔरफाइब्रोसिसमेंबुढ़ापा-त्वरितमाउस प्रोन 8 (एसएएमपी8) चूहों का 9 सप्ताह तक इलाज किया गया।

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हिस्टोपैथोलॉजिकल परिणामों से पता चला कि हेपेटोसाइट्स की व्यवस्था अव्यवस्थित थी, अधिकांश कोशिकाओं में रिक्तिका जैसा अध:पतन हुआ, और कोलेजन IV और TGF‑ 1 अभिव्यक्ति स्तर, जो कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से पता लगाया गया था, SAMP8 समूह में भी काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। Rg1 उपचार में उल्लेखनीय सुधार हुआउम्र बढ़ने से प्रेरित जिगर की चोट और फाइब्रोसिस, और कोलेजन IV और TGF‑ के अभिव्यक्ति स्तर को महत्वपूर्ण रूप से कम कर दिया 1. इसके अलावा, डायहाइड्रो एथिलीन स्टेनिंग और वेस्टर्न ब्लॉटिंग परिणामों से पता चला कि आरजी1 उपचार ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और आईएल‑1 के स्तर को काफी कम कर दिया है। , और NADPH ऑक्सीडेज 4 (NOX4), p47phox, p22phox, फॉस्फोराइलेटेड‑NF‑ के अभिव्यक्ति स्तर को कम कर दिया।κबी, कैस्पेज़-1, एपोप्टोसिस-एसोसिएटेड स्पेक-लाइक प्रोटीन जिसमें सी-टर्मिनल कैस्पेज़ रिक्रूटमेंट डोमेन और एनएलआर परिवार पाइरिन डोमेन जिसमें 3 (एनएलआरपी3) इन्फ्लेमसोम होता है, जो बुजुर्ग एसएएमपी8 चूहों के यकृत ऊतकों में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन के निष्कर्षों से पता चलता है कि Rg1 क्षीण हो सकता हैउम्र बढ़ने से प्रेरित जिगर की चोट और फाइब्रोसिसNOX4-मध्यस्थता वाले ROS ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और NLRP3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण को रोककर।

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परिचय

The number of individuals >दुनिया भर में 65 साल पुराने लोगों की संख्या 2010 में 524 मिलियन से बढ़कर 2050 तक ~1.5 बिलियन होने का अनुमान है (1)। बुजुर्ग व्यक्ति विशेष रूप से विकास के प्रति संवेदनशील होते हैंपुराने रोगों, शामिलयकृत फाइब्रोसिस(2).

लिवर फाइब्रोसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जो बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स, मुख्य रूप से फाइब्रिलर कोलेजन (3) के निरंतर जमाव और पुनर्वसन से जुड़ी होती है, जो अक्सर वास्तुशिल्प विकृति और शिथिलता में पहला कदम होता है जो लिवर के सामान्य कामकाज को रोकता है (4)। यदि इलाज नहीं किया जाता है, तो लिवर फाइब्रोसिस उन्नत लिवर सिरोसिस और हेपेटोमा (4) का कारण बन सकता है। एकत्रित साक्ष्यों से पता चला है कि उम्र के साथ लिवर फाइब्रोसिस और हेपेटाइटिस की संवेदनशीलता काफी बढ़ जाती है (5)। इस प्रकार, उम्र बढ़ने से संबंधित लिवर फाइब्रोसिस को रोकने के लिए नई रणनीतियां प्रदान करने के लिए लिवर की उम्र बढ़ने और संबंधित अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करना अत्यधिक महत्वपूर्ण है।7

उम्र बढ़ने का रोगजनन जटिल है। पिछले लगभग 40 वर्षों से, ऑक्सीडेटिव तनाव को उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों (6‑8) में एक योगदान कारक के रूप में तेजी से पहचाना जा रहा है। ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन और एंटीऑक्सीडेंट प्रणाली की सफाई क्षमता (9,10) के बीच असंतुलन से प्रेरित होता है। यह बताया गया है कि आरओएस के अत्यधिक उत्पादन से प्रोटीन, लिपिड और डीएनए को नुकसान हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अल्जाइमर रोग, मधुमेह, हृदय विफलता, क्रोनिक थकान सिंड्रोम और कैंसर (11) जैसे विभिन्न प्रकार के रोग हो सकते हैं। NADPH ऑक्सीडेज (NOX) ROS के प्रमुख स्रोतों में से एक है, और NOX प्रोटीन का परिवार झिल्ली सबयूनिट (NOX1‑5), p22phox और p67phox, p47phox और साइटोप्लाज्मिक सबयूनिट से बना है।

आरएसी1 (12,13). यह ध्यान देने योग्य है कि NOX4 एक संवैधानिक रूप से सक्रिय एंजाइम है और इसे लीवर में व्यापक रूप से व्यक्त किया गया है, विशेष रूप से हेपेटोसाइट्स, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं और फ़ाइब्रोब्लास्ट्स (14) के भीतर। बढ़ते सबूतों से संकेत मिलता है कि NOX4-व्युत्पन्न ROS के कारण होने वाला ऑक्सीडेटिव तनाव लिवर फाइब्रोसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है (15)।

क्रोनिक सूजन एक और महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो उम्र बढ़ने के दौरान सूजन पैदा करने वाले मध्यस्थों की निम्न-श्रेणी की वृद्धि के परिणामस्वरूप होती है (16)। सूजन उम्र से संबंधित कई विकृतियों का एक सामान्य लक्षण है, जैसे कमजोरी और हृदय रोग (17), जो ऊतक शिथिलता (18) की प्रगति में योगदान करते हैं। यह बताया गया है कि उम्र से संबंधित यकृत की चोट (19) में सूजन ने भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इन्फ्लेमसोम्स, जो बड़े साइटोप्लाज्मिक मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं, एनएलआर परिवार पाइरिन डोमेन युक्त (एनएलआरपी), एक साइटोप्लाज्मिक पैटर्न से युक्त होते हैं

कैस्पेज़-1 और एपोप्टोसिस-संबंधित स्पेक-जैसे प्रोटीन की पहचान रिसेप्टर जिसमें सी-टर्मिनल कैस्पेज़ भर्ती डोमेन (एएससी) होता है। पिछले अध्ययनों के निष्कर्षों के अनुसार, एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम, एक प्रकार का इन्फ्लेमसोम जो कि लीवर सहित कई ऊतकों में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त होता है, को लीवर फाइब्रोसिस के विकास और लीवर की चोट और उम्र से संबंधित लीवर रोग की प्रगति में शामिल पाया गया था ( 20‑22). जब एटीपी और कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल, साथ ही बैक्टीरियल, वायरल और फंगल रोगजनकों (23,24) जैसे विविध उत्तेजक पदार्थों द्वारा सक्रिय किया जाता है, तो एनएलआरपी3 इनफ्लेमसोम आईएल‑1 जैसे प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की एक श्रृंखला की परिपक्वता को बढ़ावा देकर सूजन पर प्रतिक्रिया करता है। और आईएल‑18 (25)। इसके अलावा, यह बताया गया है कि अत्यधिक आरओएस संचय ने उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान यकृत में एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमसोम को सक्रिय कर दिया, जिससे अंततः उम्र बढ़ने से संबंधित यकृत रोग (26) हो गया।

सेनेसेंस-एक्सीलेरेटेड माउस इज़ प्रोन 8 (एसएएमपी8) पूरी तरह से आनुवंशिक उत्पत्ति का त्वरित उम्र बढ़ने का एक मॉडल है, जिसे किसी भी प्रयोगात्मक हेरफेर (27) के अधीन नहीं किया गया है। पिछले अध्ययनों में बताया गया है कि SAMP8 चूहों ने व्यापक यकृत अध: पतन प्रदर्शित किया, जिसमें यकृत स्टीटोसिस, सूजन कोशिकाओं द्वारा विशेषता हेपेटोसाइट बैलूनिंग, फोकल नेक्रोसिस और सूजन, और फाइब्रोसिस (28,29) शामिल हैं। इन अवलोकनों में, लिवर फाइब्रोसिस सबसे आम और महत्वपूर्ण रोग परिवर्तन (5) था। इसके अतिरिक्त, SAMP8 चूहों में असामान्य लिवर फ़ंक्शन परीक्षण परिणाम भी होते हैं, जैसे एलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज़ (एएलटी) और एस्पार्टेट एमिनोट्रांस्फरेज़ (एएसटी) स्तर (30) में महत्वपूर्ण वृद्धि। हालाँकि, लीवर की उम्र बढ़ने और उम्र बढ़ने से संबंधित लीवर की चोट और फाइब्रोसिस में देरी के लिए अभी भी कोई प्रभावी तरीके और दवाएं नहीं हैं।

Ginseng has been used for >2,000 वर्ष और कई लाभकारी प्रभाव प्रदर्शित करता है, जैसे कि लीवर के स्वास्थ्य में सुधार और उम्र बढ़ने में देरी (31)। सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड आरजी1 (आरजी1) जिनसेंग (32) में सक्रिय तत्वों में से एक है। यह बताया गया है कि Rg1 ने ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित न्यूरोनल एपोप्टोसिस (33) को रोककर न्यूरोनल क्षति पर सुरक्षात्मक प्रभाव डाला है। इसके अलावा, Rg1 में सुधार पाया गया

डायबिटिक चूहों में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस को रोककर डायबिटिक कार्डियोमायोपैथी (34)। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि आरजी1 एनओएक्स4/2 (35,36) को रोककर उम्र बढ़ने से संबंधित गुर्दे की चोटों और न्यूरोनल बुढ़ापे से बचा सकता है। हालाँकि, हमारी सर्वोत्तम जानकारी के अनुसार, यह अज्ञात है कि क्या Rg1 उम्र बढ़ने से संबंधित यकृत की चोट और फाइब्रोसिस से बचाता है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य यह जांच करना है कि क्या Rg1 उपचार उम्र बढ़ने के दौरान लीवर में ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम करने के लिए NOX4/NLRP3 सिग्नलिंग को रोककर उम्र बढ़ने से संबंधित लीवर की क्षति और फाइब्रोसिस में सुधार करता है।

सामग्री और तरीके

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 प्रतिशत ; चेंग्दू डेसाइट बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड) 9 सप्ताह के लिए दिन में एक बार। SAMP8 और SAMR1 समूहों को 9 सप्ताह तक आसुत जल से उपचारित किया गया। 9 सप्ताह के उपचार के बाद, प्रत्येक समूह में छह चूहों की ग्रीवा अव्यवस्था के कारण बलि दी गई। पश्चिमी सोख्ता प्रयोगों में बाद में उपयोग के लिए लीवर को काटा गया और -80˚C पर संग्रहीत किया गया, या रखा गया

हिस्टोलॉजिकल परीक्षण के लिए कमरे के तापमान पर 24-48 घंटों के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मल्डिहाइड में। प्रायोगिक प्रक्रियाओं को अनहुई मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु आचार समिति (अनुमोदन संख्या एलएलएससी20160183; हेफ़ेई, चीन) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों (37) के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

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आरओएस का पता लगाना। चूहों के विभिन्न समूहों में शेष तीन चूहों के जिगर में आरओएस उत्पादन के स्तर का पता डायहाइड्रो एथिलीन (डीएचई) धुंधलापन का उपयोग करके लगाया गया। संक्षेप में, चूहों के प्रत्येक समूह में पूंछ नस के माध्यम से 100 µM DHE (0.1 मिली/10 ग्राम; बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) इंजेक्ट किया गया था (n=3)। 30 मिनट के बाद, जानवरों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से बलि चढ़ाया गया और लिवर को हटा दिया गया और 2 घंटे के लिए -20˚C पर एक ऑप्टिकल कटिंग तापमान यौगिक (सकुरा फिनटेक यूएसए, इंक.) में एम्बेड किया गया। बाद में जमे हुए माइक्रो‑ का उपयोग करके यकृत के ऊतकों को 10‑µm वर्गों में काटा गया।

टोम (Leica CM3050; Leica माइक्रोसिस्टम्स GmbH) -20˚C पर। अनुभागों को पीबीएस से धोया गया और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिलीग्राम / एल होचस्ट 33258 समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीएए) के साथ ऊष्मायन किया गया। फिर, अनुभागों को एक एंटी-फ्लोरेसेंस शमन एजेंट (बियोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ सील कर दिया गया और एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप (ओलंपस IX72; ओलंपस कॉर्पोरेशन; आवर्धन, x400) का उपयोग करके देखा गया। इमेज प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक.) का उपयोग आरओएस उत्पादन को इंगित करने के लिए प्रत्येक अनुभाग में तीन यादृच्छिक रूप से चयनित दृश्य क्षेत्रों से लाल प्रतिदीप्ति के औसत घनत्व का पता लगाने के लिए किया गया था।

यकृत ऊतक की पैथोलॉजिकल जांच।

एच एंड ई, पीरियोडिक एसिड-शिफ (पीएएस), और मैसन की ट्राइक्रोम स्टेनिंग तकनीकों का उपयोग करके यकृत में रूपात्मक परिवर्तनों की जांच की गई। ऊतकों में रोग संबंधी परिवर्तनों को देखने के लिए एच एंड ई स्टेनिंग सबसे आम तरीका है (38)। संक्षेप में, लीवर के नमूनों को 24-48 घंटों के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में निर्जलित और पैराफिन-एम्बेडेड किया गया, फिर 5‑µm मोटे वर्गों में काटा गया। लिवर अनुभाग (एन =4) को जाइलीन में डीपैराफिनाइज़ किया गया और वर्गीकृत अल्कोहल श्रृंखला (निर्जल इथेनॉल, 85 प्रतिशत इथेनॉल, 75 प्रतिशत इथेनॉल) में पुनर्जलीकृत किया गया, फिर 3 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन और 30 सेकंड के लिए ईओसिन के साथ दाग दिया गया। ये सभी चरण कमरे के तापमान पर किए गए। अनुभागों को तटस्थ राल से सील कर दिया गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (ओलंपस IX72; ओलंपस कॉर्पोरेशन; आवर्धन, x200) का उपयोग करके देखा गया।

पीएएस स्टेनिंग का उपयोग अक्सर यकृत की चोट का मूल्यांकन करने के लिए अम्लीय ग्लाइकोप्रोटीन के संचय का पता लगाने के लिए किया जाता है (39)। पीएएस स्टेनिंग के लिए, एच एंड ई स्टेनिंग के लिए वर्णित विधि के अनुसार, ऊतक वर्गों (एन =4) को डीपराफिनाइज़ किया गया और पुनर्जलीकरण किया गया। फिर, अनुभागों को 10 मिनट के लिए शिफ़ समाधान (बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड) से रंगा गया, इसके बाद 3 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन से रंगा गया। ये सभी चरण कमरे के तापमान पर आयोजित किए गए।

लिवर ऊतक (40) में कोलेजन जमाव का आकलन करने के लिए मैसन का ट्राइक्रोम स्टेनिंग एक महत्वपूर्ण तरीका है। मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के लिए, एच एंड ई स्टेनिंग के लिए वर्णित विधि के अनुसार, अनुभागों (एन =4) को डीपराफिनाइज़ किया गया और पुनर्जलीकरण किया गया। फिर, अनुभागों को हेमेटोक्सिलिन से रंगा गया, एसिड इथेनॉल के साथ विभेदित किया गया, और मैसन के नीले घोल (बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड) में रंगा गया, इसके बाद 8 मिनट के लिए फुकसिन के साथ धुंधला किया गया। फिर कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड से धोया गया और 5 मिनट के लिए एनिलिन ब्लू से रंगा गया। ये सभी चरण कमरे के तापमान पर किए गए। पीएएस- और मैसन की ट्राइक्रोम-सना हुआ कोशिकाओं को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (ओलंपस IX71; आवर्धन, x400) का उपयोग करके देखा गया था। पीएएस धुंधलापन के सकारात्मक क्षेत्र बैंगनी और मैसन के ट्राइक्रोम दाग वाले कोलेजन नीले दिखाई दिए। लीवर में पीएएस और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के परिणामों का तीन बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों में विश्लेषण किया गया था

इमेज‑प्रो प्लस सॉफ़्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक.) का उपयोग करके प्रत्येक अनुभाग में देखें। लीवर फाइब्रोसिस की डिग्री का आकलन करने के लिए पीएएस और मैसन के सकारात्मक क्षेत्रों की औसत घनत्व की गणना की गई थी।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला हो जाना।

एच एंड ई स्टेनिंग के लिए वर्णित विधि के अनुसार, पैराफिन-एम्बेडेड अनुभाग (एन =4) को डीपराफिनाइज़ किया गया और पुनर्जलीकरण किया गया। फिर, एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए माइक्रोवेव ओवन में 7 मिनट के लिए उबलते सोडियम साइट्रेट बफर में डुबोए जाने से पहले अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए अनुभागों को 37˚C पर 10 मिनट के लिए 3 प्रतिशत H2O2 के साथ ऊष्मायन किया गया था। बाद में गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए अनुभागों को 30 मिनट के लिए 37˚C पर 10 प्रतिशत बकरी सीरम (बिल्ली संख्या C0265; बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ ऊष्मायन किया गया। फिर अनुभागों को रात भर 4˚C पर निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया: रैबिट पॉलीक्लोनल एंटी-कोलेजन IV (1:100; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नं. BS1072), रैबिट पॉलीक्लोनल एंटी-एनएलआरपी3 (1:100; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नं. BS90949) और रैबिट पॉलीक्लोनल एंटी‑TGF‑ 1 (1:100; Abcam; कैट नं. ab92486)।

प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, अनुभागों को 30 मिनट के लिए 37˚C तक दोबारा गर्म किया गया और पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया। फिर, अनुभागों को 1 घंटे के लिए 37˚C पर एक बहुलक-युग्मित भेड़ विरोधी-खरगोश आईजीजी पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500; एफिनिटी बायोसाइंसेज; बिल्ली नं। S0001) के साथ ऊष्मायन किया गया, फिर पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया। कोशिकाओं को बाद में 30 सेकंड के लिए भूरे रंग का धुंधलापन पैदा करने के लिए डीएबी के साथ ऊष्मायन किया गया, फिर कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन के साथ दाग दिया गया और तटस्थ राल के साथ सील कर दिया गया। दागदार कोशिकाओं को एक माइक्रोस्कोप (ओलंपस IX71; आवर्धन, x400) के नीचे देखा गया।

इमेज‑प्रो प्लस सॉफ़्टवेयर का उपयोग लिवर ऊतक के प्रत्येक अनुभाग से दृश्य के तीन यादृच्छिक क्षेत्रों में कोलेजन IV, TGF‑1 और NLRP3 के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।

पश्चिमी सोख्ता।

कुल प्रोटीन को RIPA लिसीस बफर (कैट नंबर P0013B; बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) और एक स्वचालित नमूना रैपिड ग्राइंडिंग मशीन (जिंक्सिंग इंडस्ट्रियल डेवलपमेंट कंपनी लिमिटेड) का उपयोग करके लीवर ऊतकों (n {{0 }}) से निकाला गया था। .) 65 हर्ट्ज़ पर 4˚C पर 60 सेकंड के लिए। बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई और प्रोटीन (20 माइक्रोग्राम) को 8-15 प्रतिशत एसडीएस/पेज के माध्यम से अलग किया गया। अलग किए गए प्रोटीन को बाद में पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोरसिग्मा) में स्थानांतरित किया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस-0.05 प्रतिशत ट्वीन-20 (टीबीएसटी) बफर में 5 प्रतिशत स्किम्ड दूध के साथ अवरुद्ध किया गया। इसके बाद झिल्लियों को रात भर 4˚C पर निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया: एंटी‑एनएलआरपी3 (1:1,000; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नं. बीएस90949), एंटी‑एएससी (1:1) ,000; BIOSS; कैट नं. bs‑67412‑R), एंटी‑कास्पेज़‑1(1:1,000; Abcam; कैट नं. ab1872), एंटी‑IL‑1 (1:500; एबकैम;कैट नं. एबी9722), एंटी‑एनओएक्स4 (1:1,{35}}; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नं. बीएस60435), एंटी‑पी47फॉक्स (1:1,{ {40}}; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नं. बीएस4852), एंटी‑पी22फॉक्स (1:1,000; बायोवर्ल्ड बायोटेक्नोलॉजी, इंक.; कैट नंबर बीएस60290), एंटी‑एनएफ‑κबी p65 (1:1,000; वुहान सर्विस टेक्नोलॉजी कं., लिमिटेड;

बिल्ली। नहीं। GB11142), एंटी-फॉस्फोराइलेटेड (p)‑NF‑κB p65 (1:1,000; वुहान सर्विस टेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड; cat.no.GB11142‑1) और एंटी-GAPDH (1:5) ,000; एफिनिटी बायोसाइंसेज; बिल्ली नं. एएफ7021)।

प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, झिल्लियों को टीबीएसटी से तीन बार (हर बार 10 मिनट) धोया गया और एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1:10, 000; एफ़िनिटी बायोसाइंसेज; बिल्ली नं। एस) के साथ ऊष्मायन किया गया। 0001) और बकरी एंटी-माउस आईजीजी (1:10,000 एफिनिटी बायोसाइंसेज; बिल्ली नं। एस0002) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी। प्रोटीन बैंड की कल्पना एक ईसीएल किट (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक.) और एक बायोशाइन केमी इमेजिंग सिस्टम (क्यू4600 मिनी; शंघाई बायोशाइन टेक्नोलॉजी) का उपयोग करके की गई थी। प्रत्येक बैंड के ऑप्टिकल घनत्व को ImageJ 1.53a सॉफ़्टवेयर (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) का उपयोग करके अर्ध-मात्राबद्ध किया गया और GAPDH अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण।

सभी डेटा को 3 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक या उसके बराबर के औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म 8. 0 सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक.) का उपयोग किया गया था। समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए टुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट के बाद वन-वे एनोवा का प्रदर्शन किया गया। पी< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

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परिणाम

Rg1 उपचार SAMP8 चूहों के यकृत में यकृत हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों को सुधारता है। H&E स्टेनिंग के परिणामों से पता चला कि SAMR1 नियंत्रण समूह में, की सीमाएँहेपेटोसाइट्स के साइटोप्लाज्म और नाभिक स्पष्ट थे।हेपेटोसाइट्स को केंद्रीय शिरा से लेकर डोरियों में व्यवस्थित किया गया थाआस-पास का क्षेत्र, और वसा की बूंदें रिक्तिकाएँ अवसर थींसहयोगी ने देखा. SAMR1 समूह की तुलना में, कोशिकाएँSAMP8 समूह के नाभिक स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं थेअनुपस्थित थे या गहरे दाग वाले थे और एक तरफ दब गए थे(काले तीर). हेपेटोसाइट्स की व्यवस्था असामान्य थीऔर अव्यवस्थित और अधिकांश कोशिकाएँ रिक्तिका जैसी दिखाई दीं

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चित्र 1. SAMP8 चूहों में यकृत में हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों पर Rg1 उपचार का प्रभाव। (ए) यकृत का एच एंड ई धुंधलापन (स्केल बार, 100µm; आवर्धन, x200)। काले तीर संकेत करते हैं कि SAMP8 समूह की कोशिकाएं स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं थीं, नाभिक अनुपस्थित थे या गहरे दागदार थे और एक तरफ निचोड़े हुए थे। (बी) यकृत का पीएएस धुंधलापन (स्केल बार, 50 µm; आवर्धन, x400)। (सी) सकारात्मक पीएएस धुंधला क्षेत्र (एसएएमआर1 समूह के लिए सामान्यीकृत)। डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; एन=4. **पी<0.01 vs. SAMR1; ##P<0.01 vs. SAMP8. SAMP8, senescence‑accelerated mouse prone 8; SAMR1, senescence‑accelerated resistant mouse 1; PAS, periodic acid‑Schiff; Rg1, Cistanche Glycoside Rg1.

SAMP8 समूह में अध:पतन। हालाँकि, टेम्पोल (50 मिलीग्राम/किग्रा), एपोसिनिन (50 मिलीग्राम/किग्रा) और आरजी1 (5 और 10 मिलीग्राम/किग्रा) उपचार समूहों ने एसएएमपी8 समूह (चित्र 1ए) की तुलना में लीवर हिस्टो-पैथोलॉजी में उल्लेखनीय सुधार दिखाया। पीएएस धुंधला परिणामों ने यह भी संकेत दिया कि एसएएमआर 1 समूह में कोशिकाओं के भीतर सकारात्मक क्षेत्रों के एक समान वितरण के साथ, हेपेटोसाइट्स हल्के से दागदार थे। SAMR1 समूह की तुलना में, SAMP8 समूह में हेपेटोसाइट्स में सकारात्मक बैंगनी धुंधलापन का संचय काफी बढ़ गया था, जो बुजुर्ग चूहों में महत्वपूर्ण हेपेटोसाइट चोट की उपस्थिति का सुझाव देता है (छवि 1 बी और सी)। एसएएमपी8 समूह की तुलना में, टेम्पोल, एपोसिनिन और आरजी1 (5 और 10 मिलीग्राम/किग्रा) उपचार समूहों (चित्र 1बी और सी) में सकारात्मक धुंधलापन का संचय काफी कम हो गया था। इन परिणामों से पता चला कि Rg1 चूहों में उम्र बढ़ने के कारण होने वाली लीवर की चोट को काफी हद तक ठीक कर सकता है। Rg1 उपचार SAMP8 चूहों में लीवर फाइब्रोसिस को कम करता है। को

पता लगाएं कि क्या आरजी1 उम्र बढ़ने से संबंधित लिवर फाइब्रोसिस को कम करता है, मेसन के धुंधलापन का उपयोग करके लिवर के ऊतकों में कोलेजन जमाव को मापा गया था। परिणामों से पता चला कि SAMR1 समूह (चित्र 2A और B) की तुलना में SAMP8 समूह के यकृत ऊतकों में नीले सकारात्मक क्षेत्रों में काफी वृद्धि हुई थी। हालाँकि, SAMP8 मॉडल समूह की तुलना में, टेम्पोल, एपोसिनिन और Rg1 (5 और 10 mg/kg) उपचार समूहों (चित्र 2A और B) में कोलेजन जमाव का स्तर काफी कम हो गया था। इसके अलावा, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग का उपयोग करके यकृत के ऊतकों में कोलेजन IV और TGF-1 के अभिव्यक्ति स्तर को मापा गया।

कोलेजन IV स्टेनिंग के परिणामों से पता चला कि SAMR1 समूह (चित्र 3 ए और सी) में यकृत ऊतकों में कोलेजन IV निम्न स्तर पर व्यक्त किया गया था। हालाँकि, SAMR1 समूह के साथ तुलना में,

SAMP8 समूह (चित्र 3ए और सी) में कोलेजन IV के अभिव्यक्ति स्तर को काफी हद तक नियंत्रित किया गया था। इसके विपरीत, SAMP8 समूह की तुलना में, टेम्पोल, एपोसिनिन और Rg1 (5 और 10 mg/kg) के साथ उपचार से कोलेजन IV जमाव में काफी कमी आई, विशेष रूप से Rg1 (10 mg/kg) समूह में (चित्र 3A और C)। इसके अलावा, कोलेजन IV के समान TGF‑ 1 की अभिव्यक्ति भी SAMP8 समूह में SAMR1 समूह की तुलना में काफी बढ़ गई थी, और टेम्पोल, एपोसिनिन और Rg1 (5 और 10 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ उपचार के बाद काफी कम हो गई थी, विशेष रूप से आरजी1 (10 मिलीग्राम/किग्रा) समूह (चित्र 3बी और डी)। इन परिणामों से पता चला कि उम्र बढ़ने से लीवर टिशू फाइब्रोसिस हो सकता है, और टेम्पोल, एपोसिनिन और आरजी1 उपचार से उम्र बढ़ने के दौरान लीवर टिशू फाइब्रोसिस में काफी सुधार हो सकता है।

Rg1 उपचार SAMP8 चूहों के लीवर में ROS उत्पादन और NOX4 अभिव्यक्ति को कम करता है। हेपेटिक फाइब्रोसिस (41) के विकास में आरओएस एक महत्वपूर्ण कारक है। वर्तमान अध्ययन में, लीवर के ऊतकों में आरओएस उत्पादन के स्तर का पता लगाने के लिए एक आरओएस जांच, डीएचई का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि SAMR1 समूह के यकृत ऊतकों में ROS उत्पादन का स्तर कम था। हालाँकि, SAMR1 समूह की तुलना में, SAMP8 समूह (चित्र 4A और B) में ROS उत्पादन का स्तर काफी बढ़ गया था, जबकि SAMP8 समूह की तुलना में, टेम्पोल, एपोसिनिन और Rg1 (5 और 10 मिलीग्राम/किग्रा) उपचार में काफी वृद्धि हुई थी। यकृत ऊतकों में आरओएस उत्पादन के स्तर को कम कर दिया (चित्र 4ए और बी)। उम्र बढ़ने के दौरान आरओएस संचय पर NOX4 के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, NOX4-संबंधित प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण किया गया। परिणामों से पता चला कि, SAMR1 समूह की तुलना में, लीवर ऊतकों में NOX4, p22phox और p47phox के अभिव्यक्ति स्तर SAMP8 समूह (छवि 5A-D) में काफी हद तक विनियमित थे।

हालाँकि, SAMP8 समूह की तुलना में, टेम्पोल, एपोसिनिन और Rg1 (5 और 10 mg/kg) उपचार ने उम्र बढ़ने के दौरान यकृत के ऊतकों में NOX4, p22phox और p47phox के अभिव्यक्ति स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 5A‑D)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि Rg1 उपचार चूहों में उम्र बढ़ने के दौरान NOX4 को रोककर लीवर के ऊतकों में ROS-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट को ठीक कर सकता है।

सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड Rg1 SAMP8 चूहों में NOX4/NLRP3 इन्फ्लेमसोम को रोककर उम्र बढ़ने से प्रेरित लिवर फाइब्रोसिस में सुधार करता है Ⅱ

लैमिवुडिन SAMP8 चूहों में संज्ञानात्मक गिरावट में सुधार करता है: विवो फार्माकोलॉजिकल मूल्यांकन और नेटवर्क फार्माकोलॉजी में एकीकरण