मिल्क एक्सोसोम-व्युत्पन्न माइक्रोआरएनए-2478 एक्ट-जीएसके3 पाथवे के माध्यम से मेलानोजेनेसिस को दबाता है

संपर्क करना:joanna.jia@wecistanche.com/ व्हाट्सएप: 008618081934791

इन-सीन बे और संग हूं किम

सार:एक्सोसोम डोनर्टो प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से अणुओं को स्थानांतरित करके अंतरकोशिकीय संचार में भाग लेते हैं। एक्सोसोम शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों में पाए जाते हैं, जिनमें रक्त, मूत्र, मस्तिष्कमेरु द्रव और दूध शामिल हैं। दूध एक्सोसोम में कई अंतर्जात माइक्रोआरएनए अणु होते हैं। माइक्रोआरएनए छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं और जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। दूध एक्सोसोम के विशिष्ट जैविक कार्यों को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। इस अध्ययन में, हमने के प्रभावों की जांच कीमिल्केक्सोसोममेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स में मेलेनिन उत्पादन पर। हमने पाया किदूध एक्सोसोम में कमीमेलेनिन सामग्री, टायरोसिनेस गतिविधि, और मेलेनोजेनेसिस-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति इनमेलानोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स। एक्सोसोम में गोजातीय-विशिष्ट miR-2478 मेलेनिन उत्पादन को रोकता है। हमने पाया कि Rap1a मेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स में miR-2478 का प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन है। MiR -2478 ओवरएक्प्रेशन ने रैप1ए एक्सप्रेशन को कम कर दिया, जिसके कारण मेलेनिन उत्पादन और मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति में कमी आई। रैप1ए अभिव्यक्ति का निषेध कम हुआमेलानोजेनेसिसAkt-GSK3 सिग्नल पाथवे के माध्यम से। ये परिणाम के नियामक के रूप में मिल्केक्सोसोम से प्राप्त miR-2478 की भूमिका का समर्थन करते हैंमेलानोजेनेसिसरैप1ए के प्रत्यक्ष लक्ष्यीकरण के माध्यम से। इन परिणामों से पता चलता है कि दूध एक्सोसोम बेहतर बनाने के लिए उपयोगी कॉस्मेटिक सामग्री हो सकते हैंसफेद.

कीवर्ड: मेलानोजेनेसिस;दूध एक्सोसोम; एमआईआर-2478; रैप1ए

हर्बा सिस्टेनचेसएक मेलेनिन अवरोधक घटक है

1 परिचय

Cosmeceutical कॉस्मेटिक और फ़ार्मास्यूटिकल को मिलाने वाला एक मिश्रित शब्द है और ऐसे सौंदर्य प्रसाधनों को संदर्भित करता है जिनमें कार्यात्मक तत्व होते हैं जिनका चिकित्सीय प्रभाव होता है [1]। अतीत में, त्वचाविज्ञान प्रक्रियाओं के माध्यम से त्वचा में सुधार किया गया था, लेकिन हाल ही में, सौंदर्य प्रसाधनों के माध्यम से इन प्रभावों को प्राप्त करने की उपभोक्ताओं की इच्छा के कारण कॉस्मीस्यूटिकल्स में रुचि बढ़ गई है। कॉस्मेटिक उद्योग ने हाल के वर्षों में उपन्यास कॉस्मेटिक सामग्री के उपयोग में एक बढ़ी हुई रुचि दिखाई है [ 2]. कार्यात्मक सौंदर्य प्रसाधनों में ऐसे उत्पाद शामिल हैं जो त्वचा पर मेलेनिन के जमाव को रोककर त्वचा को गोरा करने में मदद करते हैं।

मेलेनिन, एक महत्वपूर्ण तत्व जो त्वचा और बालों के रंग को निर्धारित करता है, त्वचा को पराबैंगनी किरणों से बचाता है [3]। हालांकि, मेलेनिन के अत्यधिक गठन से असमान त्वचा की टोन होती है, जैसे, धब्बे और झाइयां [4]। माइक्रोफथाल्मिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF) मेलानोसाइट विकास का एक प्रमुख नियामक है। Tyrosinase (TYR) मेलेनिन संश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण एंजाइम है। मेलेनिन संश्लेषण प्रक्रिया MITF के माध्यम से TYR सक्रियण से प्रेरित है, जो मेलेनिन संश्लेषण प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण में शामिल एक महत्वपूर्ण एंजाइम है और मेलेनिन बनाने के लिए सब्सट्रेट के रूप में tyrosine या DOPA के L-रूप का उपयोग करता है [5]।

माइक्रोआरएनए (एमआईआर) लघु गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन अभिव्यक्ति [6] को नियंत्रित करके कई जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। अध्ययनों ने माइक्रोआरएनए द्वारा मेलेनिन जैवसंश्लेषण के नियंत्रण को भी उजागर किया है। उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि miR-143-5p Tak1 जीन को लक्षित करता है और MITF अभिव्यक्ति को कम करता है, जिससे मेलेनिनसिंथेसिस [7] बाधित होता है। MiR-125b, का एक नकारात्मक नियामक हैमेलानोजेनेसिस, वर्णक जीन SH3BP4 [8] को विनियमित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, और miR -675 केराटिनोसाइट्स से स्रावित एक्सोसोम में रोकता हैमेलानोजेनेसिसMITF [9] को लक्षित करके।

एक्सोसोम 30-200 एनएम के आकार की झिल्ली से बंधे हुए पुटिका होते हैं और इनमें डीएनए, आरएनए और पेप्टाइड्स [10] होते हैं। एक्सोसोम के आंतरिक घटक जैविक तरल पदार्थों में एंजाइमों द्वारा अवक्रमित किए बिना आसन्न या दूरस्थ कोशिकाओं को सुरक्षित रूप से सूचना प्रसारित कर सकते हैं, इस प्रकार विभिन्न कोशिकाओं के आसपास के सूक्ष्म वातावरण को प्रभावित करते हैं [11]।दूध एक्सोसोमदूध-व्युत्पन्न बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं हैं जो मानव पाचन प्रक्रियाओं में स्थिर होती हैं [12]। गोजातीय दूध से निकाले गए एक्सोसोम में न केवल कैसिइन और लैक्टोग्लोबुलिन जैसे कई प्रोटीन होते हैं, बल्कि माइक्रोआरएनए भी होते हैं, जो कार्गो के रूप में कार्य करते हैं [13-15]। गोजातीय दूध में प्रतिरक्षा संबंधी माइक्रोआरएनए जैसे miR-15b, miR-27b, miR-34a, और miR-10 होते हैं। ये माइक्रोआरएनए विशेष रूप से कोलोस्ट्रम [16] में प्रचुर मात्रा में होते हैं।

कुछ अध्ययनों से पता चला है कि दूध के घटक अवरोध करते हैंमेलानोजेनेसिसमेलानोसाइट्स में; उदाहरण के लिए, दूध में प्रोटीन जैसे -लैक्टोग्लोबुलिन और -कैसिइन मेलानोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं [17,18]। लैक्टोबैसिलस हेल्वेटिकस एनएस8-किण्वित दूध का सुपरनैटेंट त्वचा में यूवी क्षति और हाइपरपिग्मेंटेशन को रोकने के लिए पाया गया है [19]। हालांकि, अभी तक इस बारे में कोई रिपोर्ट नहीं है कि गोजातीय दूध में मौजूद माइक्रोआरएनए त्वचा में शामिल होते हैं या नहींसफेद, हालांकि 79 माइक्रोआरएनए मौजूद हैंदूध एक्सोसोम[13]। इसलिए, इस अध्ययन में, हमने जांच की कि क्या माइक्रोआरएनए युक्त दूध एक्सोसोम माउस और मानव मेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स में मेलेनिन संश्लेषण को रोकते हैं।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. कोश पालन

माउस मेलेनोमा B16F10 कोशिकाओं को Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA) में सुसंस्कृत किया गया था। मानव मेलेनोमा MNT -1 कोशिकाओं को न्यूनतम आवश्यक माध्यम (MEM, Hyclone) में विकसित किया गया था। सभी मीडिया को 10 प्रतिशत भ्रूणबोविन सीरम (FBS, Hyclone, USA) और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक किया गया था। नॉर्मलह्यूमन एपिडर्मल मेलानोसाइट्स (एनएचईएम, प्रोमोसेल, हीडलबर्ग, जर्मनी) को 5 या 6 मार्ग पर एक मेलानोसाइट विकास माध्यम (प्रोमोसेल) में बनाए रखा गया था। इन कोशिकाओं को 5 प्रतिशत CO2 युक्त आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।

2.2. एक्सोसोम शुद्धिकरण

वाणिज्यिक दूध (1 एमएल) को 1 0 मिनट के लिए 2 000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, फिर सतह पर तैरनेवाला 10 मिनट के लिए 1 0, 000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। दूध सतह पर तैरनेवाला a0.45 µm फिल्टर और फिर एक 0.2 µm फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया था। परिणामी समाधान (300 µ एल) को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) और एक्सोक्विक एक्सोसोम वर्षा समाधान (सिस्टम्स बायोसाइंसेज, पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए) के 300 µ एल के साथ मिलाया गया और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। मिश्रण को एक एक्सोसोम गोली प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए 10,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, जो कि पीबीएस में अगला था। एक्सोसोम का आकार वितरण Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, France) पर निर्धारित किया गया था। एक्सोसोम को आगे के उपयोग के लिए −80 C पर संग्रहीत किया गया था।

2.3. क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

ताजा एक्सोसोम निलंबन का एक 3 μL विभाज्य एक चमक-निर्वहन, छिद्रित कार्बन-लेपित ग्रिड (2/2-3 सी सी-फ्लैट; प्रोटोचिप्स, मॉरिसविले, एनसी, यूएसए) के लिए adsorbed किया गया था, जिसे बाद में 3 एस के लिए ब्लॉट किया गया था। 4 C और एक विट्रोबोट मार्क IV (थर्मो फिशर साइंटिफिक, लाफायेट, सीओ, यूएसए) का उपयोग करके प्लंज-फ्रोजन। ग्रिड को तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया गया था, फिर Gatan 626 क्रायो नमूना धारक (Gatan, Pleasanton, CA, USA) में स्थानांतरित कर दिया गया। नमूने एक क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FEI Tecnai F20 TEM, FEI, Hillsboro, OR, USA) में 29, 000 × के नाममात्र आवर्धन के लिए एक मानक क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (s-FEG) से सुसज्जित थे। 200 kV के त्वरित वोल्टेज पर K2Summit कैमरा (Gatan)।

2.4. सेल व्यवहार्यता परख (WST परख)

मेलानोमा कोशिकाओं (B16F10, MNT -1) और मानव मेलानोसाइट्स (NHEM) को 4 × 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 96- अच्छी तरह से प्लेटों में बोया गया और इसके साथ इलाज किया गया।दूध एक्सोसोम(20 और 50 माइक्रोग्राम/एमएल) या प्रत्येक प्रयोग के लिए एक माइक्रोआरएनए मिमिक (आरएनए डबल-स्ट्रैंड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स)। संकेतित समय बिंदुओं पर, सेल व्यवहार्यता को निर्माता के निर्देशों के अनुसार संवर्धित सेल व्यवहार्यता परख किट EZ-CyTox (डेइल लैब सर्विस, सियोल, कोरिया) का उपयोग करके मापा गया था। एक Vmax माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आणविक उपकरण, सैन जोस, सीए, यूएसए) पर अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया था।

2.5. मेलेनिन सामग्री मापन

मेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स का इलाज के साथ किया गया थादूध एक्सोसोम(20 और 50 µ g/एमएल) 48 घंटे के लिए । बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, कोशिकाओं को 2500 × g for10 मिनट पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सेल छर्रों को 90 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 एन NaOH में 10 प्रतिशत डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड से युक्त किया गया था। कुल मेलेनिन सामग्री को Vmax माइक्रोप्लेटस्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आणविक उपकरण) पर 405 एनएम पर मापा गया था।

2.6. टायरोसिनेस गतिविधि परख

मेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स के साथ ऊष्मायन किया गया थादूध एक्सोसोम48 घंटे के लिए। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और पीबीएस के साथ ट्राइटन एक्स -100 और 0 .1 एमएमफेनिलमेथेनसल्फोनील फ्लोराइड युक्त lysed। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और एक 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया। 0.1 एमएल-3,4-डायहाइड्रोक्सीफेनिलएलनिन के अतिरिक्त के बाद, नमूने 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किए गए थे। टायरोसिनेस गतिविधि को माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आणविक उपकरण) का उपयोग करके 475 एनएम पर अवशोषण के आधार पर मापा गया था।

हर्बा सिस्टेनचेस

2.7. मानव त्वचा के ऊतक

मेलानोसाइट्स (मेलानोडर्म, एमईएल-300बी) युक्त एपिडर्मल समकक्ष मैटटेक (एशलैंड, एमए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे और उन्हें ईपीआई -100-एनएमएम-113-माध्यम में बनाए रखा गया था।दूध एक्सोसोम1, 3, 7, 9 और 12 दिनों में मेलानोडर्म ऊतकों पर लागू किए गए थे। पीबीएस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। 3, 7, 9, 12 और 14 दिनों में ऊतकों की तस्वीरें ली गईं। एल मान (एडोब फोटोशॉपसीसी 2015) में परिवर्तनों की तुलना करके रंजकता को मापा गया। मानव त्वचा के ऊतकों में मेलेनिन सामग्री को 14 दिन पर सॉल्वेबलमेलेनिन परख द्वारा मापा गया था। संक्षेप में, मेलानोडर्म के ऊतकों को सॉल्वेबल (पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके घुलनशील किया गया था और रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। नमूनों को भंवर में डाला गया और फिर 5 मिनट के लिए 16,500 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला 96-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित किया गया और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा 490 एनएम पर पढ़ा गया।

3। परिणाम

3.1. दूध से पृथक एक्सोसोम की विशेषता

गायों के दूध से निकाले गए एक्सोसोम की विशेषताओं की जांच करने के लिए, हमने सबसे पहले एक्सोसोम के आकार को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा मापा। परिणामस्वरूप, दूध से निकाले गए एक्सोसोम का व्यास 80-190 एनएम (चित्र 1क) पाया गया। के लियेमिल्कएक्सोसोमशुद्धिकरण, एक्सोक्विक-दूध सतह पर तैरनेवाला मिश्रण दूध एक्सोसोम गोली प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। CD9, TSG101, और HSP70 की एक्सोसोमल मार्कर के रूप में अभिव्यक्ति छर्रों में पाई गई थी, लेकिन ये प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला (चित्रा 1 ए) में मौजूद नहीं थे। इसके अलावा, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) द्वारा एक्सोसोम के गोलाकार आकारिकी और आकार की पुष्टि की गई थी। 1बी)। एक्सोसोम का व्यास 200 एनएम तक गोल आकार का पाया गया। इसके बाद, हमने जांच की कि क्या दूध से निकाले गए एक्सोसोम कोशिकाओं द्वारा ग्रहण किए गए हैं। माउस B16F10 कोशिकाओं को के साथ जोड़ा गया थादूध एक्सोसोमथीलिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई PKH26 के साथ लेबल किया गया। परिणामस्वरूप, हमने देखा कि लेबल किए गए एक्सोसोम कोशिकाओं के अंदर मौजूद थे (चित्र S1)।

3.2. B16F10 कोशिकाओं में दूध एक्सोसोम द्वारा दबा हुआ टायरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन उत्पादन

अगला, हमने सेल व्यवहार्यता पर निकाले गए एक्सोसोम के प्रभाव की जांच की। जैसा कि चित्र 2ए में दर्शाया गया है, हमने खुलासा किया कि एक्सोसोम एकाग्रता की परवाह किए बिना, सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

संभावित त्वचा कोशिका की जांच के लिए-सफेदका प्रभावदूध एक्सोसोम, कोशिकाओं को दूध एक्सोसोम के साथ इलाज किया गया था। हमने पाया कि 20 या 50 माइक्रोग्राम/एमएल की सांद्रता में मिल्कएक्सोसोम के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में टायरोसिनेस गतिविधि क्रमशः 43 प्रतिशत और 59 प्रतिशत कम हो गई (चित्र 2ख)। क्योंकि टायरोसिनेस एंजाइम गतिविधि में कमी मेलेनिन जैवसंश्लेषण को रोक सकती है, मेलेनिन सामग्री को दूध एक्सोसोम के साथ उपचार के बाद मापा गया था। हमने उजागर कोशिकाओं में मेलेनिन संश्लेषण के निषेध को नोट कियादूध एक्सोसोम(20 या 50 µ g/mL) 45 प्रतिशत और 55 प्रतिशत, क्रमशः (चित्र 2c)। इसके अलावा, MITF mRNA की अभिव्यक्ति में कमी आई क्योंकि दूध एक्सोसोम की सांद्रता में वृद्धि हुई। MITF mRNA के स्तर में 20 µ g/mL एक्सोसोम के साथ उपचारित कोशिकाओं में 59 प्रतिशत और 50 µ g/mL एक्सोसोम के साथ उपचारित कोशिकाओं में 84 प्रतिशत की कमी आई, क्रमशः (चित्र 2डी)। एक्सोसोम (चित्रा 2डी) की इन सांद्रता के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में टायरोसिनेस (टीवाईआर) एमआरएनए अभिव्यक्ति भी 49 प्रतिशत और 76 प्रतिशत तक कम हो गई। दूध की सांद्रता के रूप में MITF और tyrosinase प्रोटीन का स्तर भी कम हो गयाएक्सोसोमवृद्धि हुई (चित्र 2ई)। ये परिणाम बताते हैं कि दूध के एक्सोसोम मेलानोजेनेसिस को रोकते हैं माउस B16F10 कोशिकाओं में।

3.3. मिल्क एक्सोसोम से बोवाइन-विशिष्ट miR-2478 मेलानोजेनेसिस को दबा देता है

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या miR-2478 से प्राप्त किया गया हैदूध एक्सोसोमसीधे मेलानोजेनेसिस को प्रभावित करते हैं, miR-2478 अवरोधक को मिल्केक्सोसोम (50 माइक्रोग्राम/एमएल) के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। मिल्क एक्सोसोम की उपस्थिति में, B16F10 कोशिकाओं को थीमीआर -2478 अवरोधक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, उस नियंत्रण (चित्रा 4 ए) की तुलना में काफी अधिक टाइरोसिनेस गतिविधि दिखाई गई। नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 4बी) की तुलना में एमआईआर -2478 अवरोधक-उपचार कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री भी अधिक थी। MITF mRNA अभिव्यक्ति -2 थी। 5- miR 2478 अवरोधक-उपचारित कोशिकाओं में नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में अधिक गुना अधिक था, और TYR mRNA अभिव्यक्ति थी - 2- जब miR -2478 को बाधित किया गया था तब गुना अधिक था (चित्र 4C) ) MITF और TYR प्रोटीन का स्तर भी के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में बरामद हुआदूध एक्सोसोमइन कोशिकाओं को miR-2478 अवरोधक (चित्र 4D) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करने के बाद। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि miR -2478 दूध एक्सोसोम से प्राप्त सीधे माउस मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनोजेनेसिस को दबा देता है।

3.4. मिल्क एक्सोसोम्स एक्ट-जीएसके3 पाथवे के माध्यम से मेलानोजेनेसिस को दबाते हैं

इसके बाद, हमने जांच की कि कैसेदूध एक्सोसोमविनियमितमेलानोजेनेसिसमेलेनोमा कोशिकाओं में प्रासंगिक प्रभावित मार्ग की पहचान करने के लिए। हालांकि यह ज्ञात नहीं है कि रैप1ए मेलानोजेनेसिस को सीधे नियंत्रित करता है या नहीं, यह बताया गया है कि रैप1ए एक्ट फास्फारिलीकरण कैंसर कोशिकाओं को रोकता है [20]। इस जानकारी के आधार पर, हमने जांच की कि क्या रैप 1 ए को बढ़ावा देने के लिए एक्ट पाथवे को संशोधित करता है।

Akt से सम्बंधितमेलानोजेनेसिसपाथवे, सक्रिय अक्ट Ser9 पर Gsk3 के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करता है और इस प्रकार इसे निष्क्रिय करता है; यह परिवर्तन MITF की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को रोकता है और टायरोसिनेस [21,22] को कम करता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने Rap1a siRNA से उपचारित कोशिकाओं में Akt और GSK3 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया। इन कोशिकाओं में, अक् ट फास्फारिलीकरण की सक्रियता बढ़ गई और pGSK3 की मात्रा भी बढ़ गई (चित्र 7क)। GSK3 को 20 या 50 µg/mL से उपचारित कोशिकाओं में एकाग्रता-निर्भर तरीके से Akt के सक्रियण द्वारा निष्क्रिय किया गया था।दूध एक्सोसोम(चित्र 7ख)। miR-2478मिमिक से उपचारित कोशिकाओं में प्रोटीन Akt और GSK3 का स्तर उपरोक्त परिणामों (चित्र 7C) के अनुरूप था। इसके बाद, हमने परीक्षण किया कि क्या दूध एक्सोसोम से miR -2478 Akt-GSK3 मार्ग को प्रभावित करता है। मिल्क एक्सोसोम की उपस्थिति में, थेमीआर -2478 इनहिबिटर (चित्र 7डी) से उपचारित कोशिकाओं में प्रोटीन एक्ट और जीएसके3 का फास्फोराइलेशन कम था। इसके अलावा, AKT अवरोध करनेवाला GSK690693 के साथ उपचार से जुड़े जीनों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुईमेलानोजेनेसिसदूध एक्सोसोम-उपचारित कोशिकाओं में। (चित्र 7ई)। इन निष्कर्षों का मतलब है कि miR-2478 inदूध एक्सोसोमRap1a को डाउनरेगुलेट करता है और Akt-GSK3 पाथवे के माध्यम से मेलानोजेनेसिस को दबाता है।

सिस्टैंच हर्बाएंटी-ऑक्सीडेशन के लिए त्वचा पर सफेदी का प्रभाव

3.8. मिल्क एक्सोसोम मानव मेलेनोमा कोशिकाओं, मेलानोसाइट्स और मेलानोडर्म ऊतक में मेलानोजेनेसिस को रोकते हैं

मान लें किदूध एक्सोसोमसंकोचीमेलानोजेनेसिसमाउस कोशिकाओं में, हमने अगली बार यह निर्धारित किया कि क्या मानव कोशिकाओं में दूध के एक्सोसोम समान रूप से प्रभावी थे। सबसे पहले, MNT-1 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं और NHEM मानव मेलानोसाइट्स की व्यवहार्यता की जांच 20 या 50 ug/mL दूध एक्सोसोम के साथ ऊष्मायन के बाद की गई थी। जैसा कि चित्र 8क में प्रस्तुत किया गया है, व्यवहार्यता में कोई अंतर नहीं था। एमएनटी -1 कोशिकाओं में टायरोसिनेस गतिविधि को क्रमशः 43 प्रतिशत और 85 प्रतिशत द्वारा बाधित किया गया था, जो 20 कुरूप/एमएल या 50 कुरूप/एमएल दूध के एक्सोसोम (चित्र 8बी) के संपर्क में थे। NHEM को भी क्रमशः 34 प्रतिशत और 66 प्रतिशत कम किया गया था, 20 कुरूप/एमएल या 50 कुरूप/एमएल दूध के एक्सोसोम (चित्र 8बी) के साथ उपचार के माध्यम से। इसके अलावा, मेलेनिन सामग्री को MNT -1 कोशिकाओं और NHEM में दूध एक्सोसोम के संपर्क में मापा गया। परिणामस्वरूप, MNT-1 कोशिकाओं में मेलेनिन संश्लेषण 20 कुग/एमएल या 50 कुरूप/एमएल के संपर्क में आता है।दूध एक्सोसोमक्रमशः 37 प्रतिशत और 58 प्रतिशत द्वारा बाधित किया गया था, और एनएचईएम कोशिकाओं में, दूध एक्सोसोम उपचार ने मेलेनिन संश्लेषण को क्रमशः 36 प्रतिशत और 62 प्रतिशत तक बाधित किया (चित्र 8सी)। इसके अलावा, त्वचा को हल्का करने वाला प्रभावदूध एक्सोसोममानव त्वचा के ऊतकों का उपयोग करके और पुष्टि की गई थी। मानव ऊतकों में दूध एक्सोसोम के साथ उपचार के बाद, रिश्तेदारसफेद प्रभाव 3, 9, 12, और 14 दिनों में देखे गए थे। नतीजतन, हमने पाया कि दूध के एक्सोसोम-उजागर ऊतकों में त्वचा का रंग नियंत्रण ऊतकों (चित्रा 8डी) की तुलना में उज्जवल दिखाई देता है। रंजकता की डिग्री की गणना एल मान के रूप में की गई थी, जो चमक का प्रतिनिधित्व करने वाला मान है। नियंत्रण त्वचा के ऊतकों (चित्रा 8डी) की तुलना में दूध एक्सोसोम-उपचारित त्वचा के ऊतकों में रंजकता अधिक धीरे-धीरे आगे बढ़ी। प्रायोगिक समूह ने के साथ व्यवहार कियादूध एक्सोसोमनियंत्रण समूह (चित्रा 8ई) की तुलना में एक छोटे मेलेनिन कण आकार और मेलेनिन वर्णक की कम मात्रा को दिखाया। दूध के एक्सोसोम के 14 दिनों के बाद मेलेनिन सामग्री को मापने के परिणामस्वरूप मानव ऊतकों में मेलेनिन संश्लेषण बाधित होता है (चित्र 8F)। इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि मिल्केक्सोसोम बाधित करते हैंमेलानोजेनेसिसमानव कोशिकाओं और ऊतकों में।

4। चर्चा

एक्सोसोम विनियमन पर अध्ययनमेलानोजेनेसिसने बताया है कि केराटिनोसाइट्स से प्राप्त एक्सोसोम का सफेदी प्रभाव पड़ता है। मेलानोसाइट्स और आसपास के केराटिनोसाइट्स त्वचा के एपिडर्मिस [23,24] में मेलेनिन इकाइयों को बनाने के लिए कार्यात्मक रूप से जुड़े हुए हैं। केराटिनोसाइट-व्युत्पन्न घुलनशील कारक पड़ोसी मेलानोसाइट्स के मेलेनोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं। सामान्य केराटिनोसाइट्स से स्रावित एक्सोसोम्स की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैंमेलानोजेनेसिस-संबंधित प्रोटीन [23-25]। इसके अलावा, ए मेंसफेदकोशिकाओं से निकाले गए एक्सोसोम का उपयोग करते हुए अध्ययन, यह हाल ही में बताया गया था कि मानव वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्टेम / स्ट्रोमल कोशिकाओं से निकाले गए एक्सोसोम ने माउसमेलेनोमा कोशिकाओं [26] में त्वचा को चमकदार बनाने की क्षमता दिखाई। एक रिपोर्ट यह भी थी कि पौधों से निकाले गए एक्सोसोम का सफेदी प्रभाव पड़ता है। डी। मॉर्बिफेरा पौधे के पत्तों और तनों से निकाले गए बाह्य पुटिकाओं ने माउस मेलेनोमा कोशिकाओं और स्वस्थ मानव त्वचा [27] पर एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव प्रदर्शित किया। हमारे अध्ययन में, दूध से व्युत्पन्न एक्सोसोम के श्वेत प्रभाव की जांच की गई।

रक्त प्लाज्मा या संस्कृति द्रव से निकाले गए एक्सोसोम की तुलना में, दूध से प्राप्त एक्सोसोम में न केवल बड़ी मात्रा में एक्सोसोम होने के फायदे होते हैं, जिसे प्रति यूनिट मात्रा में निकाला जा सकता है, बल्कि कम कीमत [26,27] भी होती है। इसलियेदूध एक्सोसोमकोशिका झिल्ली के समान रासायनिक संरचना होती है, वे कम इम्युनोजेनेसिटी और साइटोटोक्सिसिटी का प्रदर्शन करते हैं और उच्च जैव-रासायनिकता [28,29] होती है। हाल ही में, जब दूध एक्सोसोम को डीएसएस (डेक्सट्रान सल्फेट सोडियम नमक) से प्रेरित कोलाइटिस मॉडल चूहों को खिलाया गया, तो नियंत्रण समूह की तुलना में प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स आईएल -6 और टीएनएफ की अभिव्यक्ति कम हो गई, जिससे सूजन कम हो गई और नेक्रोटाइज़िंग एंटरटाइटिस में सुधार हुआ [30, 31]. इसके अलावा, ऑस्टियोपोरोसिस रोग के माउस मॉडल में दूध के एक्सोसोम के अंतर्ग्रहण ने हड्डियों के घनत्व को बढ़ाकर और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स [32,33] को कम करके गठिया में सुधार किया। अब तक, दूध के एक्सोसोम के प्रभावों को प्रतिरक्षात्मक घटनाओं पर केंद्रित किया गया है जो प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स को कम करते हैं, और हड्डी के विकास पर, जैसे कि आंत्रशोथ का उन्मूलन और ऑस्टियोपोरोसिस में सुधार। इस अध्ययन में, लेने की विधि के अलावादूध एक्सोसोम, यह पुष्टि की गई थी कि जब त्वचा पर लगाया जाता है, तो यह त्वचा में प्रभावी होता हैसफेद. यह इंगित करता है कि भविष्य में दूध एक्सोसोम का उपयोग करके शारीरिक गतिविधि को बढ़ाकर विभिन्न रोगों के उपचार के लिए इसे लागू किया जा सकता है।

हालांकि इस अध्ययन ने सुझाव दिया किदूध एक्सोसोमरोकनामेलानोजेनेसिस, यह पहले से ही ज्ञात है कि मट्ठा प्रोटीन जैसे कैसिइन, -लैक्टोग्लोबुलिन, और -लैक्टलबुमिन का सफेद प्रभाव पड़ता है। -लैक्टोग्लोबुलिन मानव मेलानोसाइट्स [18] में टायरोसिनेस गतिविधि को कम करता है, और के-केसीन माउस बी 16 मेलेनोमा कोशिकाओं [17] में मेलेनोजेनेसिस को रोकता है। दिलचस्प बात यह है कि इनमें से कई घटक दूध के एक्सोसोम में भी मौजूद होते हैं। दूध एक्सोसोम के प्रोटिओमेरेसल्ट के अनुसार, कैसिइन, -लैक्टोग्लोबुलिन, और -लैक्टलबुमिन को एक्सोसोम [15,34,35] में वितरित किया जाता है। मिल्क एक्सोसोम में माइक्रोआरएनए के साथ-साथ प्रोटीन भी होते हैं। इज़ुमी और उनके सहयोगियों द्वारा दूध एक्सोसोम का उपयोग करते हुए miRNA माइक्रोएरे के परिणामस्वरूप, miR-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b, और miR{{16 }} दूध एक्सोसोम [13] में अत्यधिक वितरित किए गए थे। इस अध्ययन में, miR-2478 के अपवाद के साथ, इन microRNAs में से, miR-1777b, miR-1777a,let-7b, और miR-1224 ने दिखाया नियंत्रण समूह (चित्रा S2) से टायरोसिनेस गतिविधि में कोई अंतर नहीं है। miR-2478 सबसे प्रचुर मात्रा में थादूध एक्सोसोमऔर टायरोसिनेस गतिविधि में कमी आई है। हालांकि, वाइटनिंग से संबंधित MITF और TYR जीन की अभिव्यक्ति से उपचारित कोशिकाओं में अधिक कम हो गईदूध एक्सोसोमmiR से उपचारित कोशिकाओं की तुलना में -2478अकेले मिमिक्री करें। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मिल्केक्सोसोम में माइक्रोआरएनए सहित कई घटक इसमें शामिल हैंसफेदगतिविधि।

दूध एक्सोसोम में अधिकांश माइक्रोआरएनए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को बाधित करके जैविक कार्य करते हैं। इस अध्ययन में, miR-2478 ने Rap1a को लक्ष्य जीन के रूप में लक्षित करके मेलेनिन संश्लेषण को भी बाधित किया। यद्यपि वे दूध-व्युत्पन्न माइक्रोआरएनए नहीं थे, माइक्रोआरएनए जो कि श्वेत-संबंधी जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं, पहले ही सूचित किए जा चुके हैं। जब मानव miR-27a-3p मिमिक को माउसमेलानोसाइट्स पर लागू किया गया था, तो इसने Wnt3a अभिव्यक्ति को बाधित कर दिया और इस तरह मेलेनिन संश्लेषण को बाधित कर दिया [36], और एक्टोपिक miR-218 ने MITF अभिव्यक्ति को कम करके TYR गतिविधि को रोक दिया। murine मेलेनोमा मेलानोसाइट्स [37] में। miR-203 प्रचार करता हैमेलानोजेनेसिसमेलेनोमा [38] में Kif5b को लक्षित करके CREB1/MITF/Rab27apathway के माध्यम से। दूध एक्सोसोम में 79 माइक्रोआरएनए होते हैं

माइक्रोआरएनए इनदूध एक्सोसोमगायों से प्राप्त [13]। इसलिए, दूध एक्सोसोम की शारीरिक गतिविधि पर और शोध की आवश्यकता है।

5। निष्कर्ष

हमारे निष्कर्ष बताते हैं किदूध एक्सोसोमएंटी-मेलेनोजेनिक एजेंटों के लिए उम्मीदवार हैं जो मेलेनिन-संबंधित जीन (चित्रा 10) की अभिव्यक्ति को रोककर रंजकता को कम करते हैं। मेलेनोमा कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स में, दूध एक्सोसोम ने नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में टीवाईआर अवरोध और मेलेनिन सामग्री में कमी दिखाई। इसके अलावा, इन प्रभावों की मध्यस्थता miR-2478 द्वारा . से की गई थीदूध एक्सोसोम. इसलिए, दूध एक्सोसोम कार्यात्मक के विकास के लिए उपयोगी हो सकते हैंसफेदकम साइटोटोक्सिसिटी वाले सौंदर्य प्रसाधन।

सिस्टैंचेएंटी-ऑक्सीडेशन के लिए त्वचा पर सफेदी का प्रभाव