Cistanche Tubulosa से एक नए Coumarin Glycosyltransferase CtUGT1 की आणविक क्लोनिंग और जैव रासायनिक विशेषता

अधिक जानकारी के लिए:ali.ma@wecistanche.com

ज़िपिंग जू, एट अल

सार

यूडीपी-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरस (यूजीटी) द्वितीयक मेटाबोलाइट जैवसंश्लेषण में शामिल एंजाइमों का एक महत्वपूर्ण और कार्यात्मक रूप से विविध परिवार है। Coumarin उम्मीदवार औषधीय गतिविधियों के साथ प्राकृतिक उत्पादों के सबसे आम कंकालों में से एक है। हालांकि, आज तक, पौधों से कई रिपोर्ट किए गए जीटी ने मुख्य रूप से फ्लेवोनोइड्स को चीनी स्वीकर्ता के रूप में मान्यता दी है। केवल सीमित जीटी ही Coumarins के ग्लाइकोसिलेशन को उत्प्रेरित कर सकते हैं। इस अध्ययन में, एक नए यूजीटी का क्लोन बनाया गया थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा, एक मूल्यवान पारंपरिक टॉनिक चीनी जड़ी बूटी, जो फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स, लिग्नन ग्लाइकोसाइड्स और इरिडॉइड ग्लाइकोसाइड्स जैसे विविध ग्लाइकोसाइड्स से प्रचुर मात्रा में है। अनुक्रम संरेखण और फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण से पता चला है किसीटीयूजीटी1अधिकांश रिपोर्ट किए गए फ्लेवोनोइड यूजीटी से फ़ाइलोजेनेटिक रूप से दूर है और फेनिलप्रोपेनाइड यूजीटी से सटे हुए हैं। इन विट्रो एंजाइम एसेज़ में व्यापक रूप से पाया गया कि यद्यपिसीटीयूजीटी1में बायोएक्टिव ग्लाइकोसाइड के जैवसंश्लेषण में शामिल नहीं थेसिस्टैंच ट्यूबुलोसा, यह काफी उपज में Coumarins umbelliferone 1, esculetin 2, और hymecromone 3 के ग्लूकोसिलेशन को उत्प्रेरित कर सकता है। ग्लाइकोसिलेटेड उत्पादों को संदर्भ मानकों या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ तुलना करके पहचाना गया, और परिणामों ने संकेत दिया किसीटीयूजीटी1C7- OH स्थिति में हाइड्रॉक्सिल Coumarins के ग्लूकोसिलेशन को पुनः विशिष्ट रूप से उत्प्रेरित कर सकता है। प्रमुख अवशेष जो निर्धारित करते हैंसीटीयूजीटी1होमोलॉजी मॉडलिंग और आणविक डॉकिंग विश्लेषण के आधार पर गतिविधि पर आगे चर्चा की गई। साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन परिणामों के साथ संयुक्त, यह पाया गया कि H19 ने महत्वपूर्ण उत्प्रेरण आधार के रूप में एक अपूरणीय भूमिका निभाई।सीटीयूजीटी1बायोएक्टिव Coumarin ग्लाइकोसाइड की एंजाइमी तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है।

कीवर्ड:प्लांट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरस, कौमारिन ग्लाइकोसाइड्स,सिस्टैंच ट्यूबुलोसा, गृहविज्ञान मॉडलिंग, साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन

सिस्टैंच एक्सट्रेक्ट बेनिफिट प्रोडक्ट्स के लिए क्लिक करें

परिचय

ग्लाइकोसिलेशन माध्यमिक प्राकृतिक उत्पादों के सबसे सामान्य संरचना संशोधन प्रकारों में से एक है। ग्लाइकोसिलेशन एग्लीकॉन की स्थिरता और/या घुलनशीलता को बदल सकता है, और कई संयुग्मन प्रकारों के कारण प्राकृतिक/अप्राकृतिक उत्पादों की विविधता में बहुत योगदान देता है। पौधों में, इन प्रतिक्रियाओं को आमतौर पर यूरिडीन डाइफॉस्फेट (यूडीपी) -निर्भर ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ (यूजीटी) द्वारा संचालित किया जाता था, एक प्रकार का एंजाइम जो सक्रिय न्यूक्लियोटाइड चीनी से एक ग्लाइकोसिल स्वीकर्ता अणु में मोनोसैकेराइड मोएट के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है जो एक कार्बोहाइड्रेट, ग्लाइकोसाइड, ओलिगोसेकेराइड हो सकता है। , या एक पॉलीसेकेराइड [1,2]

आज तक, यूजीटी को कूटबद्ध करने वाले कई जीनों को कई पौधों [3] से अलग किया गया है। ग्लाइकोसिलेशन मुख्य रूप से हाइड्रॉक्सिल समूहों या द्वितीयक उत्पादों की एक विस्तृत श्रृंखला के कार्बोक्सिल समूहों में हुआ, जैसे कि फ्लेवोनोइड्स [4], फेनिलप्रोपेनोइड्स [5], टेरपेनोइड्स [6], स्टेरॉयड [7], एल्कलॉइड [8], और इसी तरह। Coumarins फेनिलप्रोपेनोइड मेटाबोलाइट्स हैं जो कई पौधों की प्रजातियों में व्यापक रूप से वितरित किए जाते हैं। स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले Coumarins अक्सर ग्लाइकोकोनजुगेट्स के रूप में मौजूद होते हैं, और इन डेरिवेटिव्स में एंटीऑक्सिडेंट [9], एंटीवायरल [10,11], हेपेटोप्रोटेक्टिव [12], एंटी-इंफ्लेमेटरी [13], एंटी-कैंसर [14] सहित औषधीय गतिविधियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित होता है। ], एंटीमुटाजेनिक [15], और कोलिनेस्टरेज़ (ChE) और मोनोमाइन ऑक्सीडेज (MAO) निरोधात्मक गतिविधियाँ [14,15], आदि। हालाँकि, आज तक, सबसे अधिक रिपोर्ट की गई और व्यापक रूप से जाँच किए गए फ्लेवोनोइड्स UGT की तुलना में, केवल सीमित UGT ही थे। चीनी की मात्रा को Coumarins [16–18] में स्थानांतरित करने में सक्षम होने की सूचना दी।

विविध ग्लाइकोसाइड से भरपूर पौधे उपन्यास उत्प्रेरण गतिविधियों के साथ यूजीटी के एक आदर्श जीन पूल के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, कई यूजीटी में कई सबस्ट्रेट्स के ग्लाइकोसिलेशन को उत्प्रेरित करने के लिए काफी स्वीकर्ता संलिप्तता होने की सूचना मिली है, जिनमें से कुछ को पौधों में अलग भी नहीं किया गया था [19]। इस लेख में, एक उपन्यास ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़सीटीयूजीटी1से पहचाना गया थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा, एक पारंपरिक औषधीय जड़ी बूटी है जो विविध ग्लाइकोसाइड जैसे कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (PhGs), लिग्नन ग्लाइकोसाइड्स और इरिडॉइड ग्लाइकोसाइड्स से भरपूर है। विषम अभिव्यक्ति और कार्य लक्षण वर्णन ने प्रदर्शित किया कि यद्यपि पुनः संयोजकसीटीयूजीटी1इन ग्लाइकोसाइड्स के जैवसंश्लेषण में शामिल नहीं थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा, यह हाइड्रॉक्सिल Coumarins के ग्लूकोसिलेशन को उत्प्रेरित कर सकता है, और प्रतिक्रिया regiospecifically Coumarins umbelliferone 1, escalating 2, और hymecromone 3 की 7- OH स्थिति पर तीन औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों स्किमिंग (1a), सिचोरिन (2a) का उत्पादन करने के लिए हुई। , और 4-मिथाइलंबेलिफ़ेरिल ग्लूकोसाइड (3ए) क्रमशः काफी उपज के साथ। इसके अलावा, बेंजोफेनोन सब्सट्रेट 4,4′-डायहाइड्रॉक्सी बेंजोफेनोन (4), आइसोफ्लेवोन सब्सट्रेट जेनिस्टिन (5), और एन्थ्राक्विनोन सब्सट्रेट एलो-इमोडिन (6) भी द्वारा स्वीकार किया जा सकता है।सीटीयूजीटी1. उत्प्रेरक गुण और प्रमुख अवशेष की उत्प्रेरण क्षमता को रेखांकित करते हैंसीटीयूजीटी1होमोलॉजी मॉडलिंग, ऑटोडॉक विश्लेषण और साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन के आधार पर भी मूल्यांकन किया गया था।

2। प्रायोगिक

2.1. संयंत्र सामग्री और रसायन

सिस्टैंच ट्यूबुलोसाइस अध्ययन में प्रयुक्त हेटियन, झिंजियांग स्वायत्त क्षेत्रों में रेगिस्तानी क्षेत्रों से एकत्र किया गया था। पेकिंग विश्वविद्यालय के प्रोफेसर पेंगफेई तू ने उनकी वानस्पतिक पहचान की पुष्टि की। इस अध्ययन में परीक्षण किए गए Coumarins और अन्य सबस्ट्रेट्स को सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, यूएसए), चेंगदू पुश बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (चेंगदू, चीन) और चेंगदू बायोप्यूरिफाई फाइटोकेमिकल्स कं, लिमिटेड (चेंगदू, चीन) से खरीदा गया था। ) जब तक अन्यथा न कहा जाए। स्किमिंग (1ए) और सिचोरिन (2ए) के संदर्भ मानकों को वुहान केम फेसेस बायोकेमिकल कंपनी लिमिटेड (वुहान, चीन) से खरीदा गया था।

2.2. सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से सीटीयूजीटी1 की आणविक क्लोनिंग

का कुल आरएनएसिस्टैंच ट्यूबुलोसाएक ओमेगा प्लांट आरएनए किट (जीए, यूएसए) का उपयोग करके मांसल तने से निकाला गया था और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्राइमस्क्रिप्ट ™ आरटी अभिकर्मक किट (ताकरा, जापान) के साथ सीडीएनए को रिवर्स-ट्रांसकोड किया गया था। एक अपक्षयी प्राइमर को संरक्षित पीएसपीजी (प्लांट सेकेंडरी प्रोडक्ट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़) में एमिनोएसिड अनुक्रमों के आधार पर 3′RACE के लिए डिज़ाइन किया गया था - प्लांट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ का बॉक्स। 3′-अंत और 5′-अंत के प्रवर्धनसीटीयूजीटी1प्राइमर (टेबल S1) का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्मार्ट RACE cDNA एम्प्लीफिकेशन किट (Clontech, USA) का उपयोग करके किया गया। की पूर्ण लंबाई वाली सीडीएनएसीटीयूजीटी1निम्न स्थितियों के तहत जीन-विशिष्ट प्राइमर जोड़े (तालिका S1) के साथ KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japan) का उपयोग करके PCR द्वारा प्रवर्धित किया गया था: 2 मिनट के लिए 94 C पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण, इसके बाद विकृतीकरण के 35 चक्र 15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 55 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, 7 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार चरण के साथ। प्राप्त सभी डीएनए अंशों को एक पेसी-ब्लंट वेक्टर (ट्रांसजेन बायोटेक, चीन) में क्लोन किया गया और अनुक्रमित किया गया।

2.3. अनुक्रम संरेखण और फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण

अनुक्रम संरेखणसीटीयूजीटी1रिपोर्ट किए गए ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ (टेबल S2) के साथ DNAMAN 4 का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था। 0 सॉफ्टवेयर पैकेज (लिनन बायोसॉफ्ट, कनाडा)। एक संरक्षित डोमेन टूल (//www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi) का उपयोग करके रूपांकनों और डोमेन का विश्लेषण किया गया था। फ़ाइलोजेनेटिक ट्री का निर्माण MEGA 7.0.14 सॉफ़्टवेयर को बूटस्ट्रैप करके किया गया था, जिसमें 1000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृति [20] के साथ पड़ोसी-जुड़ने की विधि का उपयोग किया गया था। का अनुवादित प्रोटीन अनुक्रमसीटीयूजीटी1ClustalW के साथ NCBI जेनबैंक डेटाबेस (टेबल S3) में जमा ज्ञात प्लांट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ के साथ संरेखित किया गया था।

2.4. Escherichia coli . में CtUGT1 की विषम अभिव्यक्ति और प्रोटीन शुद्धि

का कोडिंग क्षेत्रसीटीयूजीटी1तालिका S1 में दिखाए गए प्राइमरों का उपयोग करके प्रतिबंध साइटों के रूप में BAMH I और Not I के साथ प्रवर्धित किया गया था। KOD-Plus-Neo DNA पोलीमरेज़ (TOYOBO, ओसाका, जापान) का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाएं की गईं। प्राप्त अनुक्रमों को पेसी-ब्लंट वेक्टर (ट्रांसजेन बायोटेक, चीन) में क्लोन करके सत्यापित किया गया था। की पुष्टि प्रवर्धन उत्पादसीटीयूजीटी1बाद में पच गया और अभिव्यक्ति वेक्टर पीईटी -28 ए (प्लस) (नोवगेन, यूएसए) में उप-क्लोन किया गया। सत्यापित निर्माण को पुनः संयोजक तनाव प्राप्त करने के लिए ई. कोलाई ट्रान्सेटा (DE3) में बदल दिया गया था। पुनः संयोजक तनाव की रातोंरात संस्कृति को लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम में टीका लगाया गया था जिसमें 5 0 ug⋅mL− 1 केनामाइसिन और 4 0 ug⋅mL− 1 क्लोरोमाइसेटिन 1: 1 {{ के अनुपात में था। 19}}0. संस्कृतियों को 37 C, 200 आरपीएम पर उगाया गया जब तक कि ओडी 600 मूल्य 0.4-0.6 तक नहीं पहुंच गया। Isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) को बाद में 0.5 mM की अंतिम सांद्रता में जोड़ा गया और कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए 18 C, 180 rpm पर उगाया गया। तब सेल छर्रों को सेंट्रीफ्यूजेशन (7600 × g, 10 मिनट, 4 C) द्वारा काटा गया था, और 3 mL / g चिल्ड लिसीज़ बफर (सप्लीमेंट्री डेटा नोट 1) में फिर से निलंबित कर दिया गया था, और बर्फ पर sonication द्वारा बाधित किया गया था। सेल मलबे को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 7600 × g, 4 C पर लगभग 30 मिनट के लिए हटा दिया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए एक पूर्व-संतुलित हिस्ट्रैप कॉलम (जीई हेल्थकेयर, उप्साला, स्वीडन) का उपयोग किया गया था। पुनः संयोजक प्रोटीन को 250 मिमी इमिडाज़ोल युक्त रेफरेंस बफर (सप्लीमेंट्री डेटा नोट 1) के 10 कॉलम संस्करणों द्वारा क्षारित किया गया था। प्रोटीन की शुद्धता का विश्लेषण 10 प्रतिशत एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था। शुद्ध किए गए प्रोटीन को 30 kDa अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूएसए) द्वारा केंद्रित किया गया था और पीडी -10 कॉलम (जीई हेल्थकेयर, उप्साला, स्वीडन) का उपयोग करके डिसेल्टिंग बफर (सप्लीमेंट्री डेटा नोट 1) के साथ डिसेल्ट किया गया था। मानक के रूप में बीएसए का उपयोग करके ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई थी।

2.5. एंजाइमी गतिविधि परख और सीटीयूजीटी 1 की सब्सट्रेट विशिष्टता

की ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि की जांच करने के लिएसीटीयूजीटी1, एंजाइम assays 0 .4 मिमी एग्लिकोन, 0.8 मिमी यूडीपी-ग्लूकोज (यूडीपीजी), और 50 कुरूप शुद्ध से बना एक प्रतिक्रिया मिश्रण (15 0 μL) में किया गया था।सीटीयूजीटी1डिसेल्टिंग बफर में प्रोटीन। सभी प्रतिक्रियाओं को 3 0 C पर 12 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया और 300 μL ठंडे मेथनॉल जोड़कर समाप्त किया गया। मिश्रण को एचपीएलसी-यूवी/ईएसआई-एमएस विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 30 मिनट के लिए 15, 000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए तीन समानांतर assays नियमित रूप से की गईं। एचपीएलसी (एगिलेंट 1260, यूएसए) एक डायोड ऐरे डिटेक्टर और एक कैपसेल पाक सी18 कॉलम (250 मिमी × 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन; शिसीडो, जापान) से 1 एमएल-मिन−1 की प्रवाह दर और कॉलम तापमान से लैस था। 30 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। मोबाइल चरण में ए (यानी, 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड जलीय घोल) और बी (यानी, एसीटोनिट्राइल) शामिल थे। ग्रेडिएंट प्रोग्राम को तालिका S4 में सूचीबद्ध किया गया था। एचआरईएसआई-एमएस डेटा एक एलसीएमएस-आईटी-टीओएफ सिस्टम पर दर्ज किया गया था, जो एक ईएसआई इंटरफेस (शिमदज़ु, क्योटो, जापान) के साथ अल्ट्रा-उच्च शुद्धता के साथ टक्कर गैस के रूप में, और एन 2 नेबुलाइजिंग गैस के रूप में फिट किया गया था। अनुकूलित ईएसआई स्रोत पैरामीटर निम्नानुसार थे: म्यान गैस प्रवाह दर, 1.5 एमएल-मिनट-1; सहायक गैस प्रवाह दर, 1.5 मिलीलीटर-मिनट-1; स्प्रे वोल्टेज, 4.5 केवी; केशिका तापमान, 200 C। पूर्ण स्कैन MS विश्लेषण के लिए स्पेक्ट्रा को 100-1500 m/z रेंज में दर्ज किया गया था।

2.6. एंजाइम गतिविधि पर प्रतिक्रिया समय, पीएच मान और तापमान के प्रभाव, और सीटीयूजीटी 1 के गतिज अध्ययन

की एंजाइम गतिविधि पर प्रतिक्रिया समय, पीएच मान और तापमान का प्रभावसीटीयूजीटी1यूडीपीजी को चीनी दाता के रूप में और 3 को चीनी स्वीकर्ता के रूप में ऊपर वर्णित प्रतिक्रिया स्थितियों में परीक्षण किया गया था। इष्टतम पीएच के निर्धारण के लिए, एंजाइम गतिविधि की तुलना 1 0 0 मिमी बफर (साइट्रिक एसिड-सोडियम साइट्रेट) में की गई थी, जिसका पीएच मान 3.0 से 6.{{ है। 14}}, 10{{20}} मिमी बफर (KH2PO4-K2HPO4) पीएच मान 6.0 से लेकर 8.{{29} }, 100 एमएम बफर (ट्रिस-एचसीएल) पीएच मान के साथ 7.0 से 9.0 तक, 100 एमएम बफर (Na2CO3-NaHCO3) पीएच मान के साथ 9.0 से 11.0 तक। इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान के लिए परख करने के लिए, प्रतिक्रियाओं को 0 से 65 C तक के विभिन्न तापमानों पर ऊष्मायन किया गया था। प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम का मूल्यांकन 0 और 24 घंटे के बीच 12 अलग-अलग समय बिंदुओं पर किया गया था। सभी प्रयोग तीन प्रतियों में प्रदर्शित किए गए थे। प्रतिक्रिया मिश्रण का विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस द्वारा किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है। के काइनेटिक अध्ययन के लिएसीटीयूजीटी1, एंजाइमैटिक assays 1 0 0 μL की अंतिम मात्रा में 100 mM KH2PO 4- K2HPO4 बफर (पीएच 8.0), 25 शुद्ध शुद्ध किए गए थेसीटीयूजीटी1, यूडीपीजी के 3 एमएम, और 3 की अलग-अलग सांद्रता (50-3000 माइक्रोन) 3. प्रतिक्रियाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए आयोजित किया गया और फिर 100 μL बर्फ-ठंडा मेथनॉल के साथ समाप्त किया गया। इन सभी प्रतिक्रियाओं को तीन प्रतियों में किया गया था, और एंजाइम गतिविधि का मूल्यांकन संबंधित ग्लूकोसिलेटेड डेरिवेटिव के परिमाणीकरण के माध्यम से किया गया था। माइकलिस-मेंटेन स्थिरांक (किमी) और वीमैक्स सहित काइनेटिक मापदंडों की गणना ग्राफपैड प्रिज्म 5 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गैर-रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा की गई थी।

2.7. सब्सट्रेट और चीनी दाता सीटीयूजीटी1 . की चयनात्मकता

की सब्सट्रेट वरीयताओं का पता लगाने के लिएसीटीयूजीटी1, दाता के रूप में यूडीपीजी का उपयोग करते हुए विभिन्न संरचनात्मक प्रकारों से संबंधित कुल 27 सबस्ट्रेट्स का परीक्षण किया गया। उनकी रासायनिक जानकारी को तालिका S5 में सूचीबद्ध किया गया था, और उनकी संरचनाओं को अंजीर में दिखाया गया था। S1 और S2। चीनी दाताओं की चयनात्मकता की जांच करने के लिएसीटीयूजीटी1, यूडीपीजी, यूडीपी के साथ सब्सट्रेट के रूप में umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5), और एलो-इमोडिन (6) का उपयोग करके assays का आयोजन किया गया था। एन एसिटाइल गैलेक्टोसामाइन, यूडीपी-गैलेक्टोज, जीडीपी-मैननोज, जीडीपी-फ्यूकोज, यूडीपी गैलेक्टुरोनिक एसिड, यूडीपी-रमनोज क्रमशः चीनी दाताओं के रूप में। सभी प्रयोग तीन प्रतियों में प्रदर्शित किए गए थे। प्रतिक्रिया मिश्रण का विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस द्वारा किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है।

2.8. CtUGT1 द्वारा 4-मिथाइलंबेलिफ़ेरिल ग्लूकोसाइड (यौगिक 3a) तैयार करना

प्रारंभिक प्रतिक्रिया मिश्रण में {0}}.034 mmol सब्सट्रेट यौगिक 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg शुद्ध किया गया था।सीटीयूजीटी150 एमएल रिएक्शन बफर में। प्रतिक्रियाओं को इष्टतम स्थितियों (100 मिमी KH2PO 4- K2HPO4 पीएच 8.0; 37 C) पर धीरे से उत्तेजित किया गया था। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला स्तंभ क्रोमैटोग्राफी द्वारा मैक्रोपोरस राल (एमसीआई जीईएल सीएचपी) के साथ 12, 000 × जी पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करने के बाद अलग किया गया था। मोबाइल चरण 100 प्रतिशत पानी से 100 प्रतिशत मेथनॉल का क्रमिक क्षालन था। प्रत्येक अंश का विश्लेषण एचपीएलसी-यूवी द्वारा किया गया था। केवल लक्षित उत्पादों वाले अंशों को कम दबाव में सूखापन के लिए वाष्पित किया गया था और 1H परमाणु चुंबकीय अनुनाद (NMR) स्पेक्ट्रोस्कोपी और 13C NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी की विशेषता थी।

2.9. CtUGT1 . के आणविक डॉकिंग और साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन

प्रोटीन मॉडलसीटीयूजीटी1SWISS-MODEL [21–25] का उपयोग करके स्थापित किया गया था। मेडिकैगो ट्रंकैटुला ग्लाइकोसिल ट्रांसफ़ेज़ UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) की क्रिस्टल संरचना को टेम्पलेट संरचना [26] के रूप में चुना गया था। स्थापित मॉडल का मूल्यांकन VERIFY-3D [27,28] द्वारा किया गया था। ऑटो-डॉक वीना का उपयोग आणविक डॉकिंग अध्ययन [29] के लिए किया गया था। यूजीटी74एफ2 [30] की क्रिस्टल संरचना, अरबिडोप्सिस थालियाना से एक ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, लिगैंड यूडीपी और सैलिसिलिक एसिड (पीडीबी आईडी 5यू6एम) के साथ कॉम्प्लेक्स में क्रमशः चीनी दाता जेब और चीनी स्वीकर्ता पॉकेट विश्लेषण के लिए नियंत्रण संरचना के रूप में इस्तेमाल किया गया था। . MGLTools (आणविक ग्राफिक्स प्रयोगशाला उपकरण) से ऑटो-डॉक-टूल्स 1.5.6 का उपयोग आणविक डॉकिंग के लिए चीनी दाता UDPG और सब्सट्रेट 1, 2 तैयार करने के लिए किया गया था। सक्रिय-स्थल गुहा के आसपास के अवशेषों की साइड चेन को लचीला बनाया गया था, और लिगेंड के घूमने योग्य बंधनों को घूमने के लिए स्वतंत्र छोड़ दिया गया था। उच्चतम (kcat/mol) आत्मीयता के साथ वीना डॉकिंग मॉडल द्वारा निर्धारित शीर्ष क्रम की मुद्रा को PyMOL 2.0 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके दृश्य विश्लेषण के अधीन किया गया था।

उत्परिवर्तजन जांच के लिए, अनुक्रम अनुकूलित जीनसीटीयूजीटी1(पूरक डेटा नोट 2) को जंगली प्रकार के रूप में संश्लेषित और परीक्षण किया गया था। साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजनसीटीयूजीटी1फास्ट म्यूटेनेसिस सिस्टम (ट्रांसजेन बायोटेक) का उपयोग करके आयोजित किया गया था। म्यूटेंट को अनुकूलित जीन के टेम्प्लेट से प्रवर्धित किया गया था जिसे तालिका S1 में दिखाए गए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके PET-28एक वेक्टर में निर्मित किया गया है। निर्मित म्यूटेंट को पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था और विषम अभिव्यक्ति के लिए ई। कोलाई (डीई 3) में परिवर्तित होने से पहले अनुक्रमण किया गया था। ऊपर वर्णित अनुसार प्रोटीन शुद्धि और एंजाइम प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन और विश्लेषण किया गया।

3) परिणाम और चर्चा

3.1. से CtUGT1 जीन की पूर्ण लंबाई वाली सीडीएनए क्लोनिंगसिस्टैंच ट्यूबुलोसा

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा(एल.) (रौकोंगरोंग) एक पारंपरिक चीनी औषधीय जड़ी बूटी है जो जैव सक्रिय प्राकृतिक ग्लाइकोसाइड की एक विस्तृत विविधता का उत्पादन करती है। इसके जीनोम में काफी संख्या में नए ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज जीन मौजूद होने चाहिए। दिलचस्प कटैलिसीस गतिविधियों के साथ उपन्यास ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की तलाश करने के लिए, 3′-RACE के लिए एक पतित प्राइमर को संरक्षित पीएसपीजी मोटिफ के आधार पर अनुमेय यूजीटी को क्लोन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा. प्राप्त 3′ अंत अनुक्रम का एनसीबीआई विस्फोट द्वारा और विश्लेषण किया गया था और 5′-रेस के लिए विशिष्ट प्राइमर प्राप्त अनुक्रम के आधार पर डिजाइन किया गया था। प्रवर्धित 5′ सीडीएनए समाप्त होता है और 3′ सीडीएनए सिरों को जोड़ा जाता है और की पूर्ण लंबाई होती हैसीटीयूजीटी1अनुक्रम, 1739 न्यूक्लियोटाइड सहित, प्राप्त किया गया था (चित्र। S3) और पूरक डेटा नोट 3 में सूचीबद्ध किया गया था। इसके बाद, एक खुला रीडिंग फ्रेम (ORF)सीटीयूजीटी1एनसीबीआई ओआरएफ फाइंडर टूल्स द्वारा पाया गया था और तालिका एस 1 में विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके आरटी-पीसीआर प्रवर्धन द्वारा 1482 बीपी कोडिंग अनुक्रम को सफलतापूर्वक क्लोन किया गया था। CtUGT1 का सीडीएनए अनुक्रम एनसीबीआई (परिग्रहण संख्या MW629113) को प्रस्तुत किया गया है।

3.2. CtUGT1 का अनुक्रम विश्लेषण और विषम अभिव्यक्ति

सीटीयूजीटी1जीन से 55.78 kDa के अनुमानित आणविक द्रव्यमान के साथ 493 अमीनो एसिड अवशेषों के एक प्रोटीन को सांकेतिक शब्दों में बदलना अपेक्षित था। एनसीबीआई विस्फोट से पता चला कि का घटा हुआ प्रोटीन अनुक्रमसीटीयूजीटी1UGT86A1-जैसे एंजाइमों के साथ उच्चतम पहचान (76.39 प्रतिशत) साझा करता है। इस तरह के एंजाइम के जैव रासायनिक कार्यों को पूरी तरह से चित्रित नहीं किया गया है। यह भविष्यवाणी की गई है कि वे अजैविक तनावों के लिए पौधे के अनुकूलन में शामिल हो सकते हैं। CtUGT1 और अन्य प्लांट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ के अमीनो एसिड अनुक्रमों का संरेखण चित्र S4 में दिखाया गया है।

पीएसपीजी मोटिफ के अत्यधिक संरक्षित 44 अवशेष सी-टर्मिनल पर पाए गएसीटीयूजीटी1. पीएसपीजी-बॉक्स के भीतर, एचसीजीडब्ल्यूएनएस का एक पेप्टाइड अनुक्रम 373वें अमीनो एसिड पर स्थित था, जो सभी ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ [31] के 95 प्रतिशत में पाया गया है। पीएसपीजी मोटिफ का अंतिम अवशेष ग्लूटामाइन था, जिसने संकेत दिया कि यह एंजाइम यूडीपीजी को अपने चीनी दाता के रूप में उपयोग करता है [32] (चित्र। एस4)। Phylogenetic पेड़ का निर्माण के अनुमानित पॉलीपेप्टाइड अनुक्रमों के आधार पर किया गया थासीटीयूजीटी1और विभिन्न प्रकार के पौधों की उत्पत्ति ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ जो विभिन्न माध्यमिक चयापचयों के जैवसंश्लेषण में शामिल थे। अब तक, पौधों से रिपोर्ट किए गए अधिकांश ग्लाइकोसिलट्रांसफेरस ने फ्लेवोनोइड्स को उनके सब्सट्रेट के रूप में मान्यता दी है, जैसे कि फ्लेवोन 7-ओ-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, फ्लेवोनोइड 3-ओ-ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज़, आइसोफ्लेवोन 7-ओ-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, और चेल्कोन ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़। Phylogenetic विश्लेषण के परिणामों से पता चला है किसीटीयूजीटी1फ्लेवोनोइड जीटी के समूह में समूहीकृत नहीं किया गया है। इसके बजाय, यह UGT74T1 और UGT74S1 (लिनम यूसिटाटिसिमम से लिग्नन ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़) और NtGT2 (निकोटियाना टैबैकम से एक Coumarin glycosyltransferase) के निकट स्थित है, जिसने संकेत दिया किसीटीयूजीटी1फेनिलप्रोपेनाइड सबस्ट्रेट्स (छवि 1) के प्रति कुछ उपन्यास कटैलिसीस गतिविधियां हो सकती हैं, विशेष रूप से माना जाता है कि केवल सीमित सदस्यों को ही इन समूहों से संबंधित कार्यात्मक रूप से पहचाना गया है।

अपनी उत्प्रेरण गतिविधि को और प्रकट करने के लिए,सीटीयूजीटी1अनुक्रम को ई. कोलाई ट्रांसेटा (DE3) कोशिकाओं में T7 लाख प्रमोटर के नियंत्रण में उनके 6- टैग फ्यूजन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया था। उसका टैग किया गया पुनः संयोजकसीटीयूजीटी1नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा एकरूपता के लिए कुशलतापूर्वक शुद्ध किया गया था। शुद्ध पुनः संयोजक CtUGT1 का आणविक भार लगभग 55 kDa (चित्र S5) था, जो कि अनुमानित आणविक द्रव्यमान के अनुरूप है।

3.3. CtUGT1 की इन विट्रो स्वीकर्ता सब्सट्रेट विशिष्टता में

की ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि का परीक्षण करने के लिएसीटीयूजीटी1, इन विट्रो एंजाइमेटिक assays में प्रदर्शन किया गया। यूडीपीजी का उपयोग चीनी दाता के रूप में किया गया था। विभिन्न चिंताओं के आधार पर चीनी स्वीकर्ता का चयन किया गया। सबसे पहले,सीटीयूजीटी1जीन से क्लोन किया गया थासिस्टैंच ट्यूबुलोसाजिनके मुख्य रासायनिक घटक PhG हैं। सत्यापित करने के लिए कि क्यासीटीयूजीटी1PhGs के जैवसंश्लेषण में शामिल है, PhGs के सामान्य एग्लिकोन्स मेंसिस्टैंच ट्यूबुलोसाजैसे कि टायरोसोल (NP1, Fig। S2) और सालिड्रोसाइड (NP2, Fig। S2) को सबसे पहले सब्सट्रेट के रूप में चुना गया था। दुर्भाग्य से, एचपीएलसी और एचआरईएसआई-एमएस विश्लेषण में कोई ग्लाइकोसिलेटेड उत्पाद नहीं मिला, जो यह दर्शाता है किसीटीयूजीटी1PhGs के जैवसंश्लेषण में शामिल नहीं हो सकते हैं।

दूसरे, अनुक्रम संरेखण और फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण परिणामों के आधार पर (चित्र 1),सीटीयूजीटी1फ़ाइलोजेनेटिक रूप से लिग्नेनॉइड और क्यूमरिन ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ से संबंधित था, जिसने सुझाव दिया किसीटीयूजीटी1संभवतः एक फेनिलप्रोपेनाइड ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ है। इस भविष्यवाणी को सत्यापित करने के लिए, तीन Coumarin सबस्ट्रेट्स 1, 2, और 3 को एक साथ एक lignanoid सब्सट्रेट magnolol NP17 के साथ क्रमशः चीनी स्वीकर्ता के रूप में परीक्षण किया गया था। गर्मी-निष्क्रिय एंजाइम (100 C, 10 मिनट) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। सब्सट्रेट के रूप में NP17 का उपयोग करते हुए प्रतिक्रियाओं के HPLC-HRESI-MS विश्लेषण में कोई उत्पाद नहीं मिला। इसके विपरीत,सीटीयूजीटी1परीक्षण किए गए Coumarin सबस्ट्रेट्स (1,2,3) के खिलाफ स्पष्ट ग्लूकोसिलेशन क्षमताओं को दिखाया। एक उदाहरण के रूप में सब्सट्रेट 1 का उपयोग करना, जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 2 ए, सब्सट्रेट 1 (19.75 मिनट) की तुलना में घटी हुई अवधारण समय (11.46 मिनट) के साथ एक नया शिखर (1 ए) द्वारा निर्मित किया गया था।सीटीयूजीटी137.78 प्रतिशत की उपज पर। इसका यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रम 1 के अनुरूप है। एचआरईएसआई-एमएस स्पेक्ट्रम ने दिखाया कि पीक 1 ए ने एम/जेड 325.1029 पर एक [एम प्लस एच] प्लस और एम/जेड 347.0710 पर एक [एम प्लस ना] प्लस (कैल्कडी। 347.0737 C15H16O8Na के लिए) प्रदर्शित किया। ) C15H16O8 के अनुमानित सूत्र के साथ, जो 1 की तुलना में 162 amu अधिक था और एक ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद (छवि 2A) के सैद्धांतिक सूत्र के अनुरूप था। इसी तरह, सब्सट्रेट 2 (14.21 मिनट, अंजीर। 2 बी) और 3 (21.92 मिनट, अंजीर। 2 सी) का ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद भी 22.03 प्रतिशत और 68.67 प्रतिशत की रूपांतरण दर के साथ 10.85 मिनट और 13.80 मिनट के प्रतिधारण समय पर पाया गया। , क्रमश। उत्पादों का आणविक द्रव्यमान ग्लूकोसिलेटेड उत्पादों के परिकलित द्रव्यमान से बिल्कुल मेल खाता है, जिसने पुष्टि की किसीटीयूजीटी1Coumarin यौगिकों 1–3 (तालिका 1) के ग्लूकोसिलेशन को उत्प्रेरित कर सकता है।

इसके बाद, यह देखते हुए कि हाल ही में रिपोर्ट किए गए अधिकांश एंजाइमों ने इन विट्रो में उत्प्रेरण संलिप्तता का प्रदर्शन किया, ताकि आगे के सब्सट्रेट स्पेक्ट्रम का पता लगाया जा सके।सीटीयूजीटी1, फ्लेवोनोइड्स, फेनोलिक यौगिकों, कूमारिन, स्टिलबिन, एन्थ्राक्विनोन, बेंजोफेनोन, नेफ़थलीन, और इरिडॉइड (अंजीर। एस 1- एस 2) सहित विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक उत्पादों से संबंधित विभिन्न यौगिकों के लिए विस्तृत एंजाइम परख आयोजित किए गए थे, यूडीपीजी का उपयोग करते हुए चीनी दाता। यह पाया गया कि बेंजोफेनोन सब्सट्रेट 4,4'-डायहाइड्रॉक्सी बेंजोफेनोन (4), आइसोफ्लेवोन सब्सट्रेट जेनिस्टिन (5), और एन्थ्राक्विनोन सब्सट्रेट एलो-इमोडिन (6) भी द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है।सीटीयूजीटी1उच्च ध्रुवता के साथ संगत ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद 4a, 5a, 6a बनाने के लिए (चित्र 3)। एचआरईएसआई-एमएस विश्लेषण से पता चला है कि उत्पादों के आयन शिखर सबस्ट्रेट्स की तुलना में सभी 162 एमयू अधिक थे, यह सुझाव देते हुए किसीटीयूजीटी1इन यौगिकों के ग्लूकोसाइलेशन को उनके संबंधित मोनो ग्लूकोसाइड उत्पाद बनाने के लिए उत्प्रेरित कर सकता है। 4, 5 और 6 की रूपांतरण दर क्रमशः 4.12 प्रतिशत, 14.14 प्रतिशत और 23.33 प्रतिशत थी (सारणी 1)।

चीनी दाता चयनात्मकतासीटीयूजीटी1भी पता लगाया गया था। UDPG के अलावा, UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galactose, GDP-mannose, GDP-fucose, UDP-galacturonic acid, और UDP rhamnose सहित छह अन्य दाताओं का परीक्षण सब्सट्रेट 1-6 को स्वीकर्ता के रूप में किया गया था। परिणामों से पता चला किसीटीयूजीटी1चीनी दाता के रूप में विशेष रूप से यूडीपीजी का चयन किया। जब अन्य सक्रिय शर्करा का परीक्षण किया गया तो कोई उत्पाद नहीं देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया)।

3.4. CtUGT1 . के जैव रासायनिक गुण और गतिज पैरामीटर

के जैव रासायनिक गुणसीटीयूजीटी1चीनी स्वीकर्ता के रूप में 3 और चीनी दाता के रूप में यूडीपीजी का उपयोग करके जांच की गई जैसा कि अंजीर में दर्शाया गया है। 4. कटैलिसीस गतिविधिसीटीयूजीटी14-6 0 C के तापमान रेंज में परीक्षण किया गया था, इष्टतम गतिविधि 37 C (चित्र 4ए) में पाई गई थी। पीएच 3.0 और 9.0 के बीच एंजाइम गतिविधि के विश्लेषण से पता चला है कि पीएच 8.0 (100 मिमी बफर KH2PO 4- K2HPO4, चित्र 4C) पर इष्टतम पीएच मान देखा गया था। ग्लूकोसिलेशन उत्पाद 3ए की उपज 1 घंटे के भीतर रैखिक रूप से बढ़ी और विकास दर 5 घंटे (छवि 4 बी) के बाद बंद हो रही थी। का स्पष्ट किमी मानसीटीयूजीटी13 के लिए 218.7 ± 7.176 μM था, और Vmax 0 था।02255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. ग्लूकोसिलेटेड उत्पादों की एंजाइमेटिक तैयारी और संरचनात्मक पहचान

एंजाइम परख परिणामों के आधार पर,सीटीयूजीटी1एक विशिष्ट ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज़ होता है जो विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक उत्पादों के ग्लूकोसिलेशन को उत्प्रेरित कर सकता है। उत्पादों की HPLC-HR-MS जानकारी को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया था। उनमें से, Coumarins सबस्ट्रेट्स ने काफी रूपांतरण दर प्रदर्शित की। Coumarins के खिलाफ एंजाइम गतिविधि का और अधिक विश्लेषण किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी तीन परीक्षण किए गए Coumarin सबस्ट्रेट्स द्वारा स्वीकार किए गएसीटीयूजीटी1C-7 स्थिति में एक हाइड्रॉक्सिल समूह है, जबकि esculetin (2) में C-6 स्थिति में एक अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल समूह है। एस्क्यूलेटिन के ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद का एचपीएलसी प्रोफाइल अंजीर में दिखाया गया है। 2. केवल एक ही उत्पाद देखा गया था, यह सुझाव देता है कि ग्लूकोसिलेशन प्रतिक्रिया regiospecifically सी -6 या सी -7 स्थिति में हुई थी। ग्लाइकोसिलेशन साइट की पुष्टि करने के लिए, उत्पाद 2a की पहचान एचपीएलसी-यूवी/एचआरईएसआई-एमएस विश्लेषण द्वारा प्रामाणिक ग्लूकोसाइड्स के साथ तुलना करके की गई थी। प्रतिक्रिया प्रणाली में प्रामाणिक ग्लूकोसाइड सिचोरिन (7- ओएच स्थिति 2 पर ग्लूकोसिलेटेड) जोड़ते समय, शिखर 2a के साथ ओवरलैप किया गया, सह-एचपीएलसी प्रोफाइल ने आगे पुष्टि की कि 2 के ग्लाइकोसिलेटेड उत्पाद द्वारा उत्प्रेरित किया गया हैसीटीयूजीटी1सिचोरिन [33] है, जिसने साबित कर दिया कि ग्लूकोसाइल की मात्रा विशेष रूप से C7-OH स्थिति पर स्थानांतरित की गई थी। उत्पाद 1a को संदर्भ मानक के साथ तुलना करके भी पहचाना गया था। यूवी-एचपीएलसी स्पेक्ट्रा ने सह-एचपीएलसी विश्लेषण (छवि 2) के साथ मिलकर खुलासा किया कि 1 ए की रासायनिक संरचना को स्किमिंग [34] के रूप में जिम्मेदार ठहराया गया था, जो सी 7- ओएच स्थिति पर 1 का ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद है।

उत्पाद 3ए को स्केल-अप प्रतिक्रिया से तैयार किया गया था और संरचनात्मक रूप से HRESI-MS, 1H NMR, और 13C NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी (अंजीर। S13, S14, और नोट 4) द्वारा विशेषता थी। 1H NMR सिग्नल में, सब्सट्रेट 3 की तुलना में, C{{10}} स्थिति में एक फेनोलिक हाइड्रॉक्सिल सिग्नल गायब हो गया, और C-7 का कार्बन सिग्नल δ1 स्थानांतरित हो गया।{{25} } पीपीएम उच्च क्षेत्र में, जबकि सी -6 और सी -8 सिग्नल 13 सी एनएमआर में निम्न क्षेत्र में स्थानांतरित हो गए। इन निष्कर्षों ने पुष्टि की कि ग्लूकोपाइरानोसिल अवशेष 3 [35] की सी -7 स्थिति में फेनोलिक हाइड्रॉक्सिल समूह से जुड़ा था। इसके अलावा, 1H NMR स्पेक्ट्रम ने δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz) पर विसंगतिपूर्ण प्रोटॉन संकेत दिखाए; चीनी घटक -D-glucopyranose होने का संकेत दिया गया था। यह परिणाम दिखायासीटीयूजीटी1एक Coumarin O-glucosyltransferase है जो 7-OH स्थिति में हाइड्रॉक्सिल Coumarin के ग्लूकोसिलेशन को उत्प्रेरित करता है।

3.6. होमोलॉजी मॉडलिंग, आणविक डॉकिंग, और साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन सीटीयूजीटी1 प्रोटीन

व्यापक एंजाइम प्रतिक्रियाओं से पता चला किसीटीयूजीटी1तीन Coumarins के ग्लूकोसिलेशन को उनके संबंधित ग्लूकोसिलेटेड उत्पाद में उत्प्रेरित कर सकता है, और ग्लूकोसिलेटेड स्थिति विशेष रूप से 7- OH स्थिति में हुई। उन प्रमुख अवशेषों की पहचान करने के लिए जो की उत्प्रेरण गतिविधियों को निर्धारित करते हैंसीटीयूजीटी1, होमोलॉजी मॉडलिंग, आणविक डॉकिंग, और साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन जांच CtUGT1 का प्रदर्शन किया गया। CtUGT1 के लिए सजातीय आणविक मॉडलिंग SWISS-MODEL [21–25] का उपयोग करके स्थापित किया गया था। मेडिकैगो ट्रंकैटुला ग्लाइकोसिल ट्रांसफ़ेज़ UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) की क्रिस्टल संरचना, जिसे 2.1 के रिज़ॉल्यूशन पर निर्धारित किया गया था, ने अधिकतम अनुक्रम होमोलॉजी और कम ई-मान के साथ उच्चतम कुल स्कोर दिखाया, जिसे टेम्पलेट संरचना [26] के रूप में चुना गया था। स्थापित मॉडल का तर्कसंगत मूल्यांकन रामचंद्रन प्लॉट (चित्र S6) में दिखाया गया था, स्थापित मॉडल में 88.5 प्रतिशत अवशेष सबसे पसंदीदा क्षेत्र में हैं। CtUGT1 के होमोलॉजी मॉडल में क्रमशः N- और C-टर्मिनल पर दो समान रॉसमैन-प्रकार के फोल्ड मोटिफ होते हैं (चित्र 5A)। एन-टर्मिनल डोमेन में सात-फंसे समानांतर चादरें हैं जो दस हेलिकॉप्टरों के आसपास हैं। सी-टर्मिनल डोमेन में छह-फंसे हुए चादरें हैं जो नौ हेलिकॉप्टरों से घिरी हुई हैं (चित्र 5ए, एस7)।

की सक्रिय जेब को और स्पष्ट करने के लिएसीटीयूजीटी1, आणविक डॉकिंग का प्रदर्शन किया गया। चूंकि UGT85H2 में केवल एपीओ फॉर्म संरचना है, यूडीपी और सैलिसिलिक एसिड दोनों के साथ एक और होमोलॉग UGT74F2 को दो लिगेंड के रूप में नियंत्रण टेम्पलेट के रूप में चुना गया था। यूडीपीजी को चीनी दाता के रूप में तैयार किया गया था। दो Coumarin सबस्ट्रेट्स 1 और 2 को क्रमशः चीनी स्वीकर्ता के रूप में तैयार किया गया था। ग्लाइकोसिल डोनर और स्वीकर्ता की बाध्यकारी साइटों की गणना की गई और उन्हें अलग-अलग डॉक किया गया जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 5. परिणामों ने संकेत दिया कि दोनों बाध्यकारी पॉकेट्स कसकर भरे हुए एन-टर्मिनस डोमेन और सी के अंतःक्रिया क्षेत्र में गहरे फांक के अंदर स्थित हैं। -टर्मिनस डोमेनसीटीयूजीटी1और स्थानिक रूप से एक दूसरे के करीब (चित्र 5ए)। का सी-टर्मिनससीटीयूजीटी1अन्य पौधों के यूजीटी में वर्णित ग्लाइकोसिल दाता के संपर्क में मुख्य रूप से शामिल है, और आसपास के अधिकांश अवशेष हाइड्रोफिलिक और अत्यधिक संरक्षित हैं। जैसे ठेठ पीएसपीजी-बॉक्स, इस आकृति में अवशेष W377, यूडीपीजी के ग्लूकोज समूह के साथ हाइड्रोजन बांड बना सकता है (चित्र 5बी); इस आकृति में N378 और S379 UDPG के डिपोस्फेट समूह (चित्र 5B) के साथ हाइड्रोजन बांड बना सकते हैं। इसके अलावा, डॉकिंग परिणामों के अनुसार, W356 और Q359 के अवशेष, सक्रिय जेब में दाता को स्थिर करने के लिए हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन के माध्यम से यूरिडीन समूह के साथ बातचीत कर सकते हैं। इन अनुमानित प्रमुख अवशेषों के कार्य को सत्यापित करने के लिए, कुल 16 साइटों का चयन किया गया और एलेनिन स्कैनिंग उत्परिवर्तजन के अधीन किया गया। ऊपर उल्लिखित सभी छह सकारात्मक सबस्ट्रेट्स का उपयोग करके इन म्यूटेंट की कटैलिसीस गतिविधियों का परीक्षण किया गया था। एचपीएलसी विश्लेषणों से पता चला है कि, जब G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, और D398 के अवशेषों को एलेनिन में उत्परिवर्तित किया गया था, तो प्रोटीन की ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि थी सभी परीक्षण किए गए सबस्ट्रेट्स की ओर पूरी तरह से खो गया। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि उपरोक्त 16 अवशेष प्रमुख अवशेष हैं जो यूडीपीजी दाता के बंधन और ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि को निर्धारित करते हैं।सीटीयूजीटी1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 प्रतिशत) जैसे V14, V132, E153, T212, और I209 (चित्र। S8)। यह अनुमान लगाया गया है कि सुगंधित वलय के आसपास के ये हाइड्रोफोबिक अवशेष बाध्यकारी जेब में सब्सट्रेट के साथ वैन डेर वाल्स इंटरैक्शन बना सकते हैं।

4। चर्चा

ग्लाइकोसिलेशन कई माध्यमिक चयापचयों के जैवसंश्लेषण मार्गों में सबसे महत्वपूर्ण संशोधन चरणों में से एक है। ग्लाइकोसिलेशन प्राकृतिक उत्पादों की पानी में घुलनशीलता में सुधार और उनकी विषाक्तता को कम करके जैव उपलब्धता में वृद्धि कर सकता है। Coumarin को बेंजीन रिंग के साथ जुड़े एक -पायरोन रिंग से निर्मित प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले फेनोलिक उप-रुखों के एक विशाल वर्ग के भीतर सबसे सरल रूप माना जाता है। दोनों प्राकृतिक और सिंथेटिक Coumarin-आधारित यौगिकों ने औषधीय रसायनज्ञों और दवा डिजाइन वैज्ञानिकों से उनके विविध औषधीय और जैविक गुणों के परिणामस्वरूप बहुत ध्यान आकर्षित किया है [36]। Coumarins के आगे ग्लाइकोसिलेटेड संशोधन इन यौगिकों की संरचनात्मक विविधता को समृद्ध करने में मदद कर सकते हैं और उनकी घुलनशीलता और जैव उपलब्धता में भी सुधार कर सकते हैं। पौधों में, ऐसी ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रिया यूडीपी-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ द्वारा उत्प्रेरित होती है। यद्यपि विभिन्न पौधों से कई यूजीटी की पहचान की गई है, आज तक, रिपोर्ट किए गए अधिकांश यूजीटी फ्लेवोनोइड्स के ग्लाइकोसिलेटेड संशोधन में शामिल थे। केवल सीमित यूजीटी को Coumarins को सब्सट्रेट के रूप में स्वीकार करने में सक्षम होने की सूचना मिली थी। इस अध्ययन में, एक नया ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ जीनसीटीयूजीटी1पारंपरिक चीनी जड़ी बूटी से क्लोन किया गया थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा. अनुक्रम संरेखण और फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण परिणामों से पता चला है किसीटीयूजीटी1अधिकांश रिपोर्ट किए गए फ्लेवोनोइड यूजीटी से फ़ाइलोजेनेटिक रूप से दूर है, और फेनिलप्रोपेनाइड यूजीटी के बहुत करीब है। व्यापक एंजाइम परखों से पता चला कि सीटीयूजीटी1 फिनाइल एथेनॉल यौगिकों के ग्लाइकोसिलेशन को उत्प्रेरित नहीं कर सका जिससे पीएचजी बनता है, जो कि पीएचजी का मुख्य रासायनिक घटक है।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा. इसके बजाय, यह Coumarins को इसके सब्सट्रेट के रूप में पहचान सकता है, और ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया का संचालन कर सकता है। उत्पादों की संरचना की व्याख्या से पता चला है कि ग्लाइकोसिलेशन साइट द्वारा उत्प्रेरित किया गया हैसीटीयूजीटी1Coumarins की C7-OH स्थिति में विशिष्ट रूप से हुआ। CtUGT1 का उपयोग करते हुए, स्किमिंग (1a), सिचोरिन (2a), और 4-मिथाइलंबेलिफ़ेरिल ग्लूकोसाइड (3a) सहित तीन Coumarin ग्लाइकोसाइड को सफलतापूर्वक एंजाइमेटिक संश्लेषित और संरचनात्मक रूप से पहचाना गया। इन तीनों यौगिकों को औषधीय रूप से सक्रिय अणुओं के रूप में सूचित किया गया था। उदाहरण के लिए, 1a को विभिन्न औषधीय गतिविधियों का अधिकारी माना गया है, जिसमें रेनोप्रोटेक्टिव गतिविधि, विरोधी भड़काऊ, कैंसर विरोधी और अमीबिक गुण [37] शामिल हैं। 2a ने कुछ ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया जैसे बैसिलस सेरेस और स्टैफिलोकोकस ऑरियस [38] के खिलाफ उच्च जीवाणुरोधी गतिविधि दिखाई। 3ए पौधों को रसायनों और विषाक्त पदार्थों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया क्षमता में सुधार करने में मदद कर सकता है [39]।

Coumarins के अलावा, व्यापक एंजाइम परख ने पाया किसीटीयूजीटी1बेंजोफेनोन सब्सट्रेट 4, आइसोफ्लेवोन सब्सट्रेट 5, और एन्थ्राक्विनोन सब्सट्रेट 6 के प्रति अवलोकन योग्य ग्लूकोसिलेशन गतिविधि भी दिखाई गई, जिसने संकेत दिया कि सीटीयूजीटी 1 में कुछ सब्सट्रेट सहिष्णुता है। फिर भी,सीटीयूजीटी1में ग्लाइकोसाइड घटकों के जैवसंश्लेषण को उत्प्रेरित नहीं कर सकासिस्टैंच ट्यूबुलोसाजैसे कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (PhGs), लिग्नेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स और इरिडॉइड ग्लाइकोसाइड्स। इसके अलावा, पिछली जांच के अनुसार, किसी भी Coumarin ग्लाइकोसाइड को से अलग नहीं किया गया थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा. तो, के विवो समारोह मेंसीटीयूजीटी1अभी और खोजे जाने की जरूरत है। Coumarin सबस्ट्रेट्स के प्रति CtUGT1 की ग्लूकोसिलेशन गतिविधि इस एंजाइम को Coumarins के एंजाइमेटिक ग्लाइकोसिलेशन संशोधन के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाती है और यह भी संकेत देती है कि प्लांट सेकेंडरी मेटाबॉलिक एंजाइम अमूल्य उत्प्रेरक गतिविधियों को कर सकते हैं जो उनके मूल कार्यों से बहुत दूर हैं।

प्रतिस्पर्धी हित की घोषणा

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

स्वीकृति

इस काम को आर्थिक रूप से बीजिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 7192112) द्वारा समर्थित किया गया था; CAST द्वारा यंग एलीट साइंटिस्ट्स प्रायोजन कार्यक्रम (अनुदान संख्या CACM- 2018- QNRC1− 02); चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 81402809); चाइना स्कॉलरशिप काउंसिल स्टेट स्कॉलरशिप फंड (ग्रांट नंबर 2019065555010) और साइंस फाउंडेशन फॉर एलीट यंग स्कॉलर्स ऑफ बीजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन (ग्रांट नंबर 2018-JYB-XJQ006)।

परिशिष्ट ए। अनुपूरक डेटा

इस लेख का पूरक डेटा https://doi पर ऑनलाइन पाया जा सकता है। संगठन/10.1016/j.fitote.2021.104995।

से: 'आणविक क्लोनिंग और एक नए Coumarin ग्लाइकोसिलेट्रांसफेरेज़ का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन'सीटीयूजीटी1सेसिस्टैंच ट्यूबुलोसा' द्वाराज़िपिंग जू, एट अल

---फिटोटेरेपिया 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

संदर्भ

[1] वाई। ली, एस। बाल्डौफ, ईके लिम, डीजे बाउल्स, अरबिडोप्सिस थालियाना के यूडीपीग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज मल्टीजीन परिवार का फाइलोजेनेटिक विश्लेषण, जे। बायोल। रसायन। 276 (2001) 4338-4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200।
[2] एलएफ मैकेंज़ी, क्यू। वांग, आरएजे वॉरेन, एसजी विदर, ग्लाइकोसिंथेस: ऑलिगोसेकेराइड संश्लेषण के लिए उत्परिवर्ती ग्लाइकोसिडेस, जे। एम। रसायन। समाज. 120 (1998) 5583-5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d।
[3] सीजे थिबोडॉक्स, सीई मेलानकॉन, एचडब्ल्यू लियू, असामान्य चीनी जैवसंश्लेषण और प्राकृतिक उत्पाद ग्लाइकोडायवर्सिफिकेशन, नेचर 446 (2007) 1008-1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814।
[4] वाई। जी, बी। ली, एम। किआओ, जे। ली, एच। जू, एल। झांग, एक्स। झांग, एडवांस ऑन इन विवो और इन विट्रो ग्लाइकोसिलेशन ऑफ फ्लेवोनोइड्स, एपीएल। माइक्रोबायल। जैव प्रौद्योगिकी। 104 (2020) 6587-6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] टी। कोएडुका, वाई। उयामा, एस। किताजिमा, टी। ओहनिशी, के। मत्सुई, आणविक क्लोनिंग और यूडीपी-ग्लूकोज के लक्षण वर्णन: पेटुनिया फूलों में वाष्पशील बेंजीनोइड / फेनिलप्रोपेनाइड ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज़, जे। प्लांट फिजियोल। 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245।
[6] एस. रहीमी, जे. किम, आई. मिजाकोविच, के.एच. जंग, जी. चोई, एससी किम, वाईजे किम, पौधों से ट्राइटरपेनॉइड-बायोसिंथेटिक यूडीपी-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, बायोटेक्नॉल। सलाह 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016।
[7] जी. सिंह, वाईवी धर, एमएच आसिफ, पी. मिश्रा, स्टेरोल ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज एंजाइम के कार्यात्मक महत्व की खोज, प्रोग। लिपिड रेस। 69 (2018) 1-10, https://doi। संगठन/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] केएफ मैक्यू, पीवी एलन, एलवी शेफर्ड, ए ब्लेक, जे। व्हिटवर्थ, एमएम मैक्री, डीआर रॉकहोल्ड, डी। स्टीवर्ट, एचवी डेविस, डब्ल्यूआर बेल्कनैप, आलू से विवो स्टेरॉइडल अल्कलॉइड ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज में प्राथमिक, फाइटोकेमिस्ट्री। 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem।
[9] जे. यू, एल. वांग, आरएल वाल्ज़ेम, ईजी मिलर, एलएम पाइक, बीएस पाटिल, साइट्रस लिमोनोइड्स, फ्लेवोनोइड्स, और कौमारिन्स की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि, जे. एग्रीक। खाद्य रसायन। 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632।
[10] एचजे चो, एसजी जियोंग, जेई पार्क, जेए हान, एचआर कांग, डी. ली, एमजे सॉन्ग, एंटीवायरल एक्टिविटी ऑफ एंजेलिसिन अगेंस्ट गैम्माहेरपेसविरस, एंटीवायर। रेस. 100 (2013) 75-83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009।
[11] जेड। जू, क्यू। चेन, वाई। झांग, सी। लिआंग, शक्तिशाली एंटी-एचआईवी गतिविधि के साथ कौमारिन-आधारित डेरिवेटिव, फिटोटेरेपिया। 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j। फिटोट.2021.104863।
[12] एटी मोसा, टीएम हेइकल, एम. बेलैबा, ईजी रावेलिसन, एच. फेरहौट, जे. बौजिला, एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि और साइपरमेथ्रिन प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और पुरुष चूहों में जिगर की क्षति, बीएमसी पूरक पर सेड्रेलोप्सिस ग्रेवी की हेपेटोप्रोटेक्टिव क्षमता। वैकल्पिक। मेड. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2।
[13] वाई. बंसल, पी. सेठी, जी. बंसल, कौमारिन: ए पोटेंशियल न्यूक्लियस फॉर एंटी-इंफ्लेमेटरी मॉलिक्यूल्स, मेड। रसायन। रेस. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6।
[14] एम. कुमार, आर. सिंगला, जे. डंडरियाल, वी. जैतक, कौमारिन डेरिवेटिव्स एज़ एंटीकैंसर एजेंट्स फॉर लंग कैंसर थेरेपी: ए रिव्यू, एंटी कैंसर एजेंट्स मेड। रसायन। 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926।
[15] ए। स्टेफनाची, एफ। लियोनेटी, एल। पिसानी, एम। कैटो, ए। कैरोटी, कौमारिन: बायोएक्टिव यौगिकों के लिए एक प्राकृतिक, विशेषाधिकार प्राप्त और बहुमुखी मचान, अणु 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/अणु23020250।
[16] टी. तागुची, एन. उबुकाता, एच. हयाशिदा, एम. यामामोटो, ओकाज़ाकी, एक ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज़ का क्लोनिंग और लक्षण वर्णन जो 7-फ़्लेवोनोल के हाइड्रॉक्सिल समूह और 3- से कूमारिन के हाइड्रॉक्सिल समूह पर प्रतिक्रिया करता है। तंबाकू कोशिकाएं, आर्क। जैव रसायन। बायोफिज़। 420 (2003) 95-102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027।
[17] एल. झोउ, टी. तियान, बी. ज़ू, एल. सोंग, एल. लियू, आर. यू, बायोसिंथेसिस ऑफ़ कौमारिन ग्लाइकोसाइड्स बाय पॉलीगोनम मल्टीफ़्लोरम, बायोसी की ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ें। जैव प्रौद्योगिकी। जैव रसायन। 76 (2012) 1008-1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347।
[18] एच. कानोह, एम. कावाउची, एम. कुरोयानागी, टी. अरिमा, मॉलिक्यूलर क्लोनिंग एंड कैरेक्टराइजेशन ऑफ कुमारिन ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज इन हेयर रूट्स ऑफ फैरबिटिस निल (इपोमिया नील), प्लांट टिश्यू कल्ट। लेट. 31 (2014) 21-28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a।
[19] जेबी हे, पी। झाओ, जेडएम हू, एस। लियू, वाई। कुआंग, एम। झांग, बी। ली, सीएच यूं, एक्स। किआओ, एम। ये, ट्रोलियस से एक विशिष्ट Cglycosyltransferase का आणविक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन चिनेंसिस, एंग्यू। रसायन। इंट. ईडी। इंजी. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505।
[20] एस. कुमार, जी. स्टीचर, के. तमुरा, MEGA7: आणविक विकासवादी आनुवंशिकी विश्लेषण संस्करण 7.0 बड़े डेटासेट के लिए, मोल। बायोल। विकास। 33 (2016) 1870-1874, https://doi। संगठन/10.1093/molbev/msw054.
[21] ए। वाटरहाउस, एम। बर्टोनी, एस। बिएनर्ट, जी। स्टडर, जी। टॉरिलो, आर। गुमिनी, एफटी हीर, टीएपी डी बीयर, सी। रेम्फर, एल। बोर्डोली, आर। लेपोर, टी। श्वेडे, स्विस-मॉडल: प्रोटीन संरचनाओं और परिसरों की होमोलॉजी मॉडलिंग, न्यूक्लिक एसिड रेस। 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427।
[22] एन. ग्यूएक्स, एमसी पिट्सच, टी. श्वेडे, स्विस-मॉडल और स्विस-पीडीबी व्यूअर के साथ स्वचालित तुलनात्मक प्रोटीन संरचना मॉडलिंग: एक ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य, वैद्युतकणसंचलन 30 (2009) एस162-एस173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] एस. बिएनर्ट, ए. वाटरहाउस, टीएपी डी बीयर, जी. टॉरिलो, जी. स्टडर, एल. बोर्डोली, टी. श्वेडे, द स्विस-मॉडल रिपोजिटरी-नई विशेषताएं और कार्यक्षमता, न्यूक्लिक एसिड रेस। 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132।
[24] जी. स्टडर, सी. रेम्पफर, एएम वाटरहाउस, जी. गुमिनी, जे. हास, टी. श्वेडे, क्यूएमईएंडइससह-दूरी की कमी मॉडल गुणवत्ता आकलन, जैव सूचना विज्ञान पर लागू होती है। 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828।
[25] एम। बर्टोनी, एफ। किफ़र, एम। बियासिनी, एल। बोर्डोली, टी। श्वेडे, होमोलोजी द्वारा बाइनरी इंटरैक्शन से परे होमो- और हेटेरो-ऑलिगोमर्स की मॉडलिंग प्रोटीन चतुर्धातुक संरचना, विज्ञान। प्रतिनिधि 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8।
[26] एल. ली, एल.वी. मोडोलो, एल.एल. एस्कैमिला-ट्रेविनो, एल. एक्नाइन, आरए डिक्सन, एक्स. वांग, मेडिकैगो ट्रंकैटुला यूजीटी85एच की क्रिस्टल संरचना2-एक बहुकार्यात्मक (आइसो) फ्लेवोनोइड के संरचनात्मक आधार में अंतर्दृष्टि ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, जे। मोल। बायोल। 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036।
[27] आर. लुथी, जेयू बॉवी, डी. ईसेनबर्ग, तीन-आयामी प्रोफाइल के साथ प्रोटीन मॉडल का आकलन, प्रकृति 356 (1992) 83-85, https://doi.org/10.1038/ 356083ए0.
[28] आरए लास्कोवस्की, मेगावाट मैकआर्थर, डीएस मॉस, जेएम थॉर्नटन, प्रोचेक: प्रोटीन संरचनाओं की स्टीरियोकेमिकल गुणवत्ता की जांच करने के लिए एक कार्यक्रम, जे। एपल। क्रिस्टलोग्र। 26 (1993) 283-291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684।
[29] ओ. ट्रॉट, एजे ओल्सन, ऑटोडॉक वीना: एक नए स्कोरिंग फ़ंक्शन, कुशल अनुकूलन और मल्टीथ्रेडिंग के साथ डॉकिंग की गति और सटीकता में सुधार, जे. कंप्यूट। रसायन। 31 (2010) 455-461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334।
[30] एएम जॉर्ज थॉम्पसन, सीवी इंकु, केई नीट, जेवी डीन, जेवाई चो, यूजीटी 74 एफ1 द्वारा सैलिसिलिक एसिड ग्लूकोज संयुग्मन में अंतर और अरबिडोप्सिस थालियाना, विज्ञान से यूजीटी 74 एफ 2। प्रतिनिधि 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629।
[31] टी. वोग्ट, पी. जोन्स, ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ इन प्लांट नेचुरल प्रोडक्ट सिंथेसिस: कैरेक्टराइजेशन ऑफ ए सुपरजीन फैमिली, ट्रेंड्स प्लांट साइंस। 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9।
[32] ए। कुबो, वाई। अराई, एस। नागाशिमा, टी। योशिकावा, एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन द्वारा प्लांट ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की चीनी दाता विशिष्टताओं का परिवर्तन, आर्क। जैव रसायन। बायोफिज़। 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. एबीबी.2004.06.021।
[33] एच. कान्हो, एस. याओया, टी. इटानी, टी. नाकाने, एन. कवाहरा, वाई. ताकासे, के. मसुदा, एम. कुरोयानागी, फेनोलिक यौगिकों का ग्लूकोसिलेशन फ़ारबिटिस नील बालों वाली जड़ों द्वारा: I. Coumarin का ग्लूकोसिलेशन और फ्लेवोन डेरिवेटिव, बायोसी। जैव प्रौद्योगिकी। जैव रसायन। 68 (2004) 2032-2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032।
[34] जे। बजरे, ईएच नीलसन, एम। बोल्स, साइक्लोडेक्सट्रिन डाइसायनोहाइड्रिन द्वारा उत्प्रेरित विषाक्त प्राकृतिक ग्लूकोसाइड का हाइड्रोलिसिस, यूर। जे संगठन रसायन। 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954।
[35] बी ज़ू, एलबी झोउ, जेडब्ल्यू लियू, आरएम यू, कैथरैन्थस रोसियस के सुसंस्कृत निलंबन कोशिकाओं द्वारा हाइड्रोक्सीकौमरिन डेरिवेटिव का बायोट्रांसफॉर्मेशन, फार्माज़ी 67 (2012) 467-471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] टी. अल-वारही, ए. सब्ट, ईबी एल्केड, डब्ल्यूएम एल्डेहना, कौमारिन-आधारित एंटीकैंसर एजेंटों की हालिया प्रगति: एक अप-टू-डेट समीक्षा, बायोर्ग। रसायन। 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163।
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, इफेक्ट्स ऑफ़ ए कामारिन डेरिवेटिव, 4-मिथाइलंबेलिफ़ेरोन, बीज अंकुरण और अरबिडोप्सिस में अंकुर स्थापना पर, जे. केम। ईकोल। 37 (2011) 880-890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3।
[38] के. जू, जेडएम फेंग, वाईएन यांग, जेएस जियांग, पीसी झांग, एट्रेक्टाइलोड्स लांसिया, फिटोटेरापिया से आठ नए यूडेसमैन- और एरेमोफिलेन-टाइप सेस्क्यूटरपेनोइड्स। 114 (2016) 115-121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017।
[39] वाई। लू, एच। वू, जे। झेंग, एक्स। हे, जेड। वू, एक्स। लू, वाई। किउ, चूहे के प्लाज्मा में यूएचपीएलसी-एमएस / एमएस द्वारा स्किमिंग का निर्धारण और फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन, जे। फार्म . बायोमेड। गुदा। 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969।