न्यूरोइन्फैमेशन के इन विट्रो मॉडल में आइसोथियोसाइनेट्स की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता

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Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

प्राप्त: 10 जुलाई 2020 / स्वीकृत: 25 अक्टूबर 2020 / ऑनलाइन प्रकाशित: 16 नवंबर 2020

© लेखक (ओं) 2020

सिस्टैंच हर्बल पाउडर फंक्शन: बहुत अच्छा हैन्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव

सार

क्रूसिफेरस सब्जियों में ग्लूकोसाइनोलेट अग्रदूत के रूप में मौजूद आइसोथियोसाइनेट्स (आईटीसी) ने दिखाया है किसूजनरोधी, एंटीऑक्सिडेंट, और एंटीकार्सिनोजेनिक गतिविधियाँ। यहां, हमने आरओएस उत्पादन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (एमएमपी)-2 और -9 की अभिव्यक्ति पर तीन अलग-अलग आईटीसी के प्रभावों की तुलना की, जो विभिन्न न्यूरोलॉजिकल रोगों के महत्वपूर्ण रोगजनक कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। चूहे के एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियों को एलपीएस द्वारा सक्रिय किया गया था और साथ ही साथ एलिल आइसोथियोसाइनेट (एआईटीसी), 2- फेनथाइल आइसोथियोसाइनेट (पीईआईटीसी), और 2- सल्फोराफेन (एसएफएन) की विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया गया था। परिणामों से पता चला कि SFN और PEITC H2O2 द्वारा प्रेरित ROS उत्पादन का प्रतिकार करने में सक्षम थे। सेल कल्चर सुपरनैटेंट्स के ज़ाइमोग्राफ़िक विश्लेषण से पता चला है कि पीईआईटीसी और एसएफएन एमएमपी -9 के सबसे प्रभावी अवरोधक थे, जबकि केवल एसएफएन ने एमएमपी -2 गतिविधि को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया था। पीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि उपयोग किए गए सभी आईटीसी ने एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति दोनों को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया है। माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनसे (एमएपीके) सिग्नलिंग पाथवे पर जांच से पता चला है कि आईटीसी बाह्य-विनियमित प्रोटीन किनेज (ईआरके) गतिविधि को रोककर एमएमपी ट्रांसक्रिप्शन को संशोधित करते हैं। इस अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि आईटीसी एमएमपी की भागीदारी से जुड़े न्यूरोलॉजिकल रोगों की रोकथाम और पूरक उपचार के लिए न्यूट्रास्युटिकल एजेंट हो सकते हैं।

कीवर्डएंटीऑक्सीडेंट · सूजन-रोधी · आइसोथियोसाइनेट · मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस · न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग

परिचय

न्यूरोइन्फ्लेमेशन मस्तिष्क की चोट के लिए एक जटिल प्रतिक्रिया है जिसमें जैव रासायनिक घटनाओं का एक झरना शामिल है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) निवासी कोशिकाओं के सक्रियण के लिए अग्रणी है। एस्ट्रोसाइट्स की अचानक सक्रियता उनकी न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका से समझौता करती है, जिससे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस), नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), साइटोकिन्स, केमोकाइन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस जैसे भड़काऊ मध्यस्थों की रिहाई होती है।

(एमएमपी)।

एमएमपी तटस्थ, Zn2 प्लस-निर्भर एंडोपेप्टिडेस का एक बड़ा परिवार है, जो फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन, इलास्टिन और लेमिनिन (लैट्रोनिको और लिउज़ी 2017) जैसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के घटकों के प्रमुख लक्ष्य हैं।

टिज़ियाना लैट्रोनिको

tiziana.latronico@uniba.it

बायोसाइंसेज, बायोटेक्नोलॉजीज, और बायोफर्मासिटिक्स विभाग, बारी विश्वविद्यालय "एल्डो मोरो",

बारी, इटली

विज्ञान विभाग, बेसिलिकाटा विश्वविद्यालय, पोटेंज़ा,

इटली

सीएनएस में, एमएमपी विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे कि मोर्फोजेनेसिस, टर्नओवर, और ईसीएम की रीमॉडेलिंग, भ्रूणजनन, और घाव की मरम्मत; हालांकि, जब एमएमपी नियामक तंत्र से बचते हैं तो वे हानिकारक हो जाते हैं (रोसेनबर्ग 2009; अग्रवाल एट अल। 2008)।

इस संबंध में, यह ज्ञात है कि एमएमपी अभिव्यक्ति और गतिविधि में परिवर्तन कई तंत्रिका संबंधी विकारों में प्रमुख रोगजनक घटनाएं हैं (लैट्रोनिको और लिउज़ी 2017; मास्ट्रोइयानी और लिउज़ी 2007; ब्रिकिक एट अल। 2015)। प्रायोगिक साक्ष्यों ने सुझाव दिया है कि एमएमपी के बीच, जिलेटिनैस ए (एमएमपी -2) और बी (एमएमपी -9) विशेष रूप से न्यूरोइन्फ्लेमेशन में शामिल हैं क्योंकि उनका अपचयन रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की अखंडता से समझौता कर सकता है। यह मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रतिरक्षा परिधीय रक्त कोशिकाओं की भर्ती और घुसपैठ की ओर जाता है, जो भड़काऊ प्रक्रिया को बनाए रखता है जो प्रगतिशील न्यूरोनल हानि और बिगड़ा हुआ न्यूरोनल फ़ंक्शन (रिवेस्ट 2009) का कारण है। कई इन विट्रो और विवो अध्ययनों से पता चला है कि आरओएस उत्पादन एमएमपी के अप-विनियमन में शामिल कारकों में से एक है -9 माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) सिग्नलिंग मार्ग-निर्भर तंत्र (एचएसआईएच और) के माध्यम से मस्तिष्क कोशिकाओं में अभिव्यक्ति यांग 2013)।

इस सबूत के आधार पर, यह स्पष्ट है कि न्यूरोटॉक्सिक कारकों का डाउनरेगुलेशन, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाएं कम हो जाती हैं, मस्तिष्क रोगों की शुरुआत को रोकने या कम करने के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं।

हाल के वर्षों में, न्यूरोलॉजिकल क्षेत्र में बायोमेडिकल रुचि तेजी से प्राकृतिक यौगिकों के अनुसंधान पर केंद्रित है जो न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं से जुड़ी प्रक्रियाओं को संशोधित करने में सक्षम हैं। इस संबंध में, कई अध्ययनों से पता चला है कि पॉलीफेनोल्स, आइसोथियोसाइनेट्स (आईटीसी), और अन्य जैसे फाइटोकेमिकल यौगिकों में न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता होती है जो एमएमपी की अभिव्यक्ति को बाधित करने और आरओएस उत्पादन (डिंकोवा-कोस्तोवा और कोस्तोव) का मुकाबला करने की उनकी क्षमता से भी प्राप्त होती है। 2012; लिउज़ी एट अल। 2007, 2011)।

आइसोथियोसाइनेट्स रोगज़नक़ हमले (हड्डियों और रॉसिटर 2006) के खिलाफ रक्षा की एक प्रणाली के रूप में ब्रैसिसेकी परिवारों से संबंधित कई पौधों द्वारा उत्पादित मेटाबोलाइट्स हैं। वे एंजाइम मायरोसिनेज द्वारा ग्लूकोसाइनोलेट्स (जीएसएल) के एंजाइमैटिक डिग्रेडेशन से उत्पन्न होते हैं। ब्रोकली, ब्रसेल्स स्प्राउट्स, पत्तागोभी, शलजम, सहिजन, कोहलबी, सरसों, मूली, वॉटरक्रेस और केल जैसी आमतौर पर खपत होने वाली क्रूसिफेरस सब्जियों में आईटीसी मौजूद होते हैं। भोजन में उनकी मात्रा बहुत परिवर्तनशील है और खाद्य प्रसंस्करण और तैयारी पर निर्भर है।

हाल ही में यह दिखा रहा है कि आईटीसी में विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय प्रभाव होते हैं, जिसमें एंटीऑक्सिडेंट, जीवाणुरोधी, विरोधी भड़काऊ और कीमोप्रिवेंटिव एक्शन (ड्यूफोर एट अल। 2015; मार्ज़ोको एट अल। 2015) शामिल हैं।

आईटीसी की सुरक्षात्मक गतिविधि विषहरण, सूजन, एपोप्टोसिस और सेल चक्र विनियमन में शामिल विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों के मॉड्यूलेशन के माध्यम से की जाती है। साक्ष्य के कई टुकड़े इंगित करते हैं कि आईटीसी के एंटी-कार्सिनोजेनिक और एंटी-इंफ्लेमेटरी गुणों को मुख्य रूप से परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (Nrf2) मार्ग को सक्रिय करने की उनकी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। Nrf2 एक रेडॉक्स-संवेदनशील ट्रांसक्रिप्शनल कारक है जो इलेक्ट्रोफिलिक एजेंटों और ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति में नाभिक में बदल जाता है जहां यह एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया तत्वों (ARE) को बांधता है, डिटॉक्सिफिकेशन में शामिल साइटोप्रोटेक्टिव जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और ऑक्सीडेटिव स्थितियों के मॉड्यूलेशन में और भड़काऊ प्रक्रियाएं (हेस एट अल 2001)। इस संबंध में, यह बताया गया है कि आईटीसी चरण II डिटॉक्सिफाइंग एंजाइमों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करके और जीएसएच उत्पादन (वैग्नर एट अल 2010) के अप-विनियमन द्वारा मानव कोशिकाओं की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता को बढ़ाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, यह Nrf2 और परमाणु कारक (NF)-κB मार्ग के बीच एक क्रॉस-टॉक के अस्तित्व की सूचना दी गई है जिसके परिणामस्वरूप सूजन का मॉड्यूलेशन होता है (स्टर्म और वैगनर 2017; ली और जॉनसन 2004)। इस संबंध में, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के इन विट्रो और विवो मॉडल में विभिन्न प्रयोगों ने प्रदर्शित किया है कि आईटीसी एनएफ-κबी ट्रांसलोकेशन को काफी कम करने में सक्षम हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और एमएमपी (ली एट अल। 2015; सुबेदी एट अल। 2017) का निषेध है।

इस पत्र में, हमने तीन आईटीसी अर्थात एलिल आइसोथियोसाइनेट (एआईटीसी), 2-फेनिथाइल आइसोथियोसाइनेट (पीईआईटीसी), और 2-सल्फोराफेन (एसएफएन) के एमएमपी की रिहाई पर प्रभाव की जांच की-2 और -9 के साथ-साथ एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स द्वारा आरओएस उत्पादन पर। हमारे परिणामों ने प्रमाणित किया कि पीईआईटीसी, एसएफएन और एआईटीसी इन विट्रो में एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एमएमपी -9 और एमएमपी -2 की अभिव्यक्ति को बाधित करने और एच 2 ओ 2 से प्रेरित आरओएस उत्पादन का मुकाबला करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, हमने दिखाया कि आईटीसी एमएमपी के ओवरएक्प्रेशन को बाह्य-विनियमित प्रोटीन किनसे (ईआरके) गतिविधि के निषेध से संबंधित तंत्र के साथ नियंत्रित करते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि क्रूसिफेरस सब्जियों से भरपूर आहार से न्यूरोलॉजिकल रोगों की रोकथाम और पूरक उपचार के लिए संभावित लाभ हो सकते हैं।

सामग्री और तरीके

रसायन और अभिकर्मक

Dulbecco का संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन GIBCO (पैस्ले, स्कॉटलैंड) द्वारा प्रदान किया गया था। जिलेटिन, DNase 1, पॉली-एल-लाइसिन

(पीएलएल), ट्रिप्सिन, लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), ट्रिपैन ब्लू और 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-2।5-डिपेनहिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) ), एलिल आइसोथियोसाइनेट (AITC) [कॉड। 377,430, शुद्धता 95 प्रतिशत (एचपीएलसी)], 2-फेनिथाइल आइसोथियोसाइनेट (पीईआईटीसी) [कॉड। 253,731, शुद्धता 99 प्रतिशत )], 2-सल्फोराफेन (एसएफएन) [कॉड। S6317, शुद्धता 95 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर (HPLC)] सिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्रदान की गई थी। 2′,7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट (DCFH-DA) Calbiochem से खरीदा गया था। मानक प्रोटीन और आर -250 Coomassie Brilliant Blue बायो-रेड (हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) से थे। एंटी-ग्लिअल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (GFAP) एंटीबॉडी (RRID: AB _2294571) Serotec (ऑक्सफोर्ड, यूके) से खरीदे गए थे। बाह्य-विनियमित प्रोटीन किनेसेस (ईआरके) 1/2, और फॉस्फोराइलेटेड ईआरके 1/2 (पी-ईआरके 1/2) के खिलाफ एंटीबॉडी सांताक्रूज बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए) से थे। Hybond-P PVDF मेम्ब्रेन, एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ECL) वेस्टर्न ब्लॉटिंग एनालिसिस सिस्टम, और एंटी-माउस-HRP सेकेंडरी एंटीबॉडी GE से थे

हेल्थकेयर लाइफ साइंसेज (लिटिल शैल्फोंट, बकिंघमशायर,

युके)। MMP-2, MMP-9, और 18S rRNA के लिए विशिष्ट प्राइमर जोड़े सिग्मा जेनोसिस (कैम्ब्स, यूके) से थे। RNeasy मिनी किट और क्वांटिक्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट Qiagen (Valencia, CA, USA) से खरीदे गए थे। पीसीआर के लिए इकोनो-टाक प्लस ग्रीन 2X मास्टर मिक्स अभिकर्मकों को लुसिजेन कॉर्पोरेशन (मिडलटन, WI, यूएसए) से खरीदा गया था।

नैतिक वक्तव्य

जानवरों से जुड़े प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड में सिफारिशों के अनुसार और बारी विश्वविद्यालय, इटली की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ किए गए थे (परमिट संख्या: 23-98- ए)।

एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की तैयारी

एस्ट्रोसाइट्स {0}} दिन पुराने विस्टार चूहों (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, इटली) के नियोकोर्टिकल ऊतकों से तैयार किए गए थे। एस्ट्रोसाइट्स की तैयारी के लिए 12 पिल्ले के 6 लिटर, दोनों लिंगों में से प्रत्येक का उपयोग किया गया था। कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) के संपर्क में आने से जानवरों की इच्छामृत्यु की गई और तेजी से सड़ने से उनकी मौत हो गई। लैट्रोनिको एट अल द्वारा रिपोर्ट की गई विधि के बाद नियोकोर्टिकल ऊतकों को विच्छेदित किया गया और प्राथमिक ग्लियाल सेल संस्कृतियों के शुद्धिकरण के लिए उपयोग किया गया। (2018)। संक्षेप में, विच्छेदन के बाद, चूहे के दिमाग में मेनिन्जेस और रक्त वाहिकाओं की कमी हो गई, यांत्रिक कीमा बनाया गया और 0.25 प्रतिशत ट्रिप्सिन के साथ 0.01 प्रतिशत DNase की उपस्थिति में पच गया। सेल व्यवहार्यता के सेंट्रीफ्यूजेशन और मूल्यांकन के बाद, कोशिकाओं को डीएमईएम में 1.5 × 107 कोशिकाओं / फ्लास्क के घनत्व पर पीएलएल-लेपित फ्लास्क (75 सेमी 2) में चढ़ाया गया, 10 प्रतिशत एफबीएस, 100 आईयू एमएल −1 पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम एमएल −1 स्ट्रेप्टोमाइसिन , और 5 प्रतिशत CO2 में 37 डिग्री पर बनाए रखा। 7 दिनों के बाद, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को हटाने के लिए फ्लास्क को हिलाया गया। ट्रिप्सिनाइजेशन (0.25 प्रतिशत ट्रिप्सिन/0.02 प्रतिशत ईडीटीए) द्वारा प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स की शुद्धता का मूल्यांकन जीएफएपी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया गया था।

एलिल आइसोथियोसाइनेट, फेनिथाइल आइसोथियोसाइनेट या 2-सल्फोराफेन के साथ एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स का उपचार

कंफ्लुएंट एस्ट्रोसाइट्स, 96 वेल-प्लेट्स में बीजित, एलपीएस के 10 माइक्रोग्राम एमएल −1 से प्रेरित थे और साथ ही साथ एलिल आइसोथियोसाइनेट (एआईटीसी), 2- फेनथाइल आइसोथियोसाइनेट (पीईआईटीसी) या 2- सल्फोराफेन के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। (एसएफएन) सीरम मुक्त डीएमईएम में। सीरम-मुक्त डीएमईएम और एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एस्ट्रोसाइट्स क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, चूंकि AITC (100 µM), PEITC (67 µM), और SFN (56.4 µM) के स्टॉक समाधान DMSO में बनाए गए थे, DMSO के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र, एक ही विलायक सांद्रता में संस्कृति माध्यम में पतला विश्लेषण किए गए नमूने, यौगिक विषाक्तता का अनुमान लगाने के लिए चलाए गए थे। 37 डिग्री पर ऊष्मायन के 20 घंटे के बाद, 5 प्रतिशत CO2 सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और उपयोग होने तक -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया, जबकि सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए कोशिकाओं को एमटीटी परख के अधीन किया गया था।

एमटीटी सेल व्यवहार्यता परख

एस्ट्रोसाइट्स पर AITC, PEITC और SFN की साइटोटोक्सिसिटी का पता MTT [{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,{{5 का उपयोग करके लगाया गया था। }}डिपेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड] परख। यह परख व्यवहार्य कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सक्सेनेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा एमटीटी की कमी पर आधारित है, एक अघुलनशील नीले फॉर्मेज़ान उत्पाद के लिए जिसे स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जा सकता है। संक्षेप में, AITC, PEITC या SFN के साथ 20 घंटे के उपचार के बाद, संस्कृति माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को MTT के 0.5 mg mL−1 से लोड किया गया। 37 डिग्री पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, 5 प्रतिशत CO2 माध्यम को हटा दिया गया था और कोशिकाओं में फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को 90 प्रतिशत इथेनॉल के साथ घोल दिया गया था। क्रिस्टल के पूर्ण घुलनशीलता प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए प्लेटों को हिलाने के बाद, फॉर्मेज़ान उत्पाद की मात्रा ऑप्टिकल अवशोषण द्वारा 560 एनएम पर 690 एनएम के संदर्भ तरंग दैर्ध्य के साथ निर्धारित की गई थी। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण के प्रतिशत (CTRL) के रूप में व्यक्त किया गया था, जिसे अनुपचारित कोशिकाओं द्वारा दर्शाया गया था, जिसे 100 प्रतिशत पर सेट किया गया था। प्रत्येक यौगिक के लिए, सेल व्यवहार्यता का एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त किया गया था।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाना

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए 37 डिग्री पर 37 डिग्री पर फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम में 2′, 7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) के 10 माइक्रोन के साथ एस्ट्रोसाइट्स लोड करके किया गया था। तब DCFH-DA को कुओं से हटा दिया गया था और कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए AITC (400 μM), PEITC (10 μM) या SFN (25 μM) के साथ फिनोल रेड-फ्री DMEM में H2O2 की उपस्थिति में 100 μM की अंतिम एकाग्रता में इलाज किया गया था। . केवल DCFH-DA या H2O2 के साथ उपचारित कोशिकाओं ने क्रमशः नकारात्मक (CTRL) और सकारात्मक नियंत्रण (H2O2) का प्रतिनिधित्व किया। ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं को पीबीएस के साथ रिंस किया गया और के साथ लाइस किया गया

ट्रिस-एचसीएल 10 एमएम/NaCl 150 एमएम/ट्राइटन एक्स-100 0.5 प्रतिशत, पीएच 7.5,

फिर 10 मिनट के लिए 10,000×g, 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और उनका स्पेक्ट्रोफ्लोरिमेट्रिक विश्लेषण 485 एनएम पर उत्तेजना के तहत 525 एनएम पर किया गया था। परिणाम कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत किए गए थे और आरओएस उत्पादन को फोटोल्यूमिनेशन (पीएल) तीव्रता बनाम सकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था।

जिलेटिनिस का पता लगाना

सेल सुपरनैटेंट्स (एसएन) में जिलेटिनस गतिविधि का पता ज़िमोग्राफिक विश्लेषण द्वारा लगाया गया था जैसा कि लैट्रोनिको एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था। (2013)। संक्षेप में, एसएन की एक मात्रा, कुल प्रोटीन के लगभग 10 माइक्रोग्राम के अनुरूप, -मर्कैप्टोएथेनॉल के बिना लाम्मली नमूना बफर के 30 μl के साथ घुलनशील थी। नमूने 7.5 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जेल में चलाए गए थे जो 0.1 प्रतिशत (wt/v) जिलेटिन के साथ सहपॉलीमराइज़ किए गए थे। इलेक्ट्रोफोरेटिक रन के बाद, जैल को 2.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100/10 मिमी CaCl2 के साथ 50 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4 में दो बार रिंस किया गया और 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 में 37 डिग्री पर 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। /50 एमएम ट्रिस-एचसीएल/10 एमएम CaCl2, पीएच 7.4। जैल Coomassie शानदार नीले R -250 से सना हुआ था और मेथनॉल/एसिटिक एसिड/H2O (4:1:5 v/v) में नष्ट हो गया था। जिलेटिनस गतिविधि को जेल की नीली पृष्ठभूमि पर पाचन के एक स्पष्ट बैंड के रूप में देखा गया था और इमेज लैबटीएम सॉफ्टवेयर (बायो-रेड लेबोरेटरीज) का उपयोग करके कम्प्यूटरीकृत डेंसिटोमेट्रिक छवि विश्लेषण द्वारा इसकी मात्रा निर्धारित की गई थी। जिलेटिनस

गतिविधि को ऑप्टिकल घनत्व (OD) × mm2 के रूप में व्यक्त किया गया था, जो घटता के तहत स्कैनिंग क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो सब्सट्रेट लसीका क्षेत्र की चमक और चौड़ाई दोनों को ध्यान में रखता है। डेटा को निम्न समीकरण का उपयोग करके व्यक्त किया गया था: प्रतिशत अवरोध=[100 - (आयुध डिपो नमूना/आयुध डिपो सकारात्मक नियंत्रण) × 100]।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)

6 अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स, एलपीएस (10 माइक्रोग्राम एमएल −1) के साथ सक्रिय थे और साथ ही साथ अधिकतम गैर-विषाक्त एकाग्रता पर आईटीसी के साथ इलाज किया गया था। ऊष्मायन के 20 घंटे के बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूजेन आरनेसी मिनी किट का उपयोग करके कुल आरएनए को एस्ट्रोसाइट्स से निकाला गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्वांटिक्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके पूरक डीएनए (सीडीएनए) को आरएनए के 500 एनजी से संश्लेषित किया गया था। कुल 25 एनजी रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पादों का उपयोग विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके 591 बीपी के टुकड़े को बढ़ाने के लिए किया गया था (sense 5′-जीटीसी एसीटी सीसीजी सीटीजी सीजीसी टीटीटी टीटीटी सीजी -3 ′; एंटीसेंस 5′-जीएसी एसीए टीजीजी जीजीसी एसीसी एसीसी टीटीसी। TGA-3′) चूहे के MMP-2 अनुक्रम के लिए और विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करते हुए 541 bp टुकड़ा (sense 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; एंटी-सेंस 5′-AAG ACG AAG जीजीजी एएजी एसीजी सीएसी एटीसी 3′) चूहे के एमएमपी -9 अनुक्रम के लिए। समानांतर में, चूहे 18S rRNA (अर्थ 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA -3 ; एंटीसेंस 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA -3 ) के 308 बीपी के टुकड़े का प्रवर्धन, एक अपेक्षाकृत अपरिवर्तनीय आंतरिक संदर्भ जीन, प्रदर्शन किया गया था। . प्राइमर सेट, पहले से ही अन्य अध्ययनों में मान्य हैं (लैट्रोनिको एट अल। 2013; लिउज़ी एट अल। 2004; ग्रामेग्ना एट अल। 2011) विशेष रूप से केवल रुचि के जीन को पहचानते हैं जैसा कि पीसीआर के अपेक्षित आकार के एकल बैंड के प्रवर्धन द्वारा दर्शाया गया है। उत्पाद। पीसीआर प्रवर्धन 25 चक्रों के लिए किया गया था, जिनमें से प्रत्येक में 94 डिग्री पर विकृतीकरण, 59 डिग्री पर एनीलिंग और 72 डिग्री पर विस्तार शामिल था। प्रवर्धन के बाद, उत्पादों का विश्लेषण 1.5 प्रतिशत agarose जैल में किया गया। जैल के डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण के बाद, लक्ष्य जीन के प्रवर्धन को 18S rRNA अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और परिणाम सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में निषेध के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए थे जैसा कि जिलेटिनस परिमाणीकरण के लिए रिपोर्ट किया गया था।

पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा ईआरके 1/2 फॉस्फोराइलेशन का पता लगाना

ईआरके 1/2 का पता इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा लगाया गया था जैसा कि लैट्रोनिको एट अल में बताया गया है। (2018)। संक्षेप में, मिला हुआ प्राथमिक

एस्ट्रोसाइट्स को {{0}} अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया गया, 24 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में बनाया गया, एआईटीसी (4 0 0 माइक्रोन), पीईआईटीसी (10 माइक्रोन) के साथ 1 घंटे के लिए दिखावा किया गया। या फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम में एसएफएन (25 माइक्रोन)। एलपीएस के 10 कुरूप एमएल −1 के साथ 2 घंटे के लिए उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 2.5 मिमी Na-पाइरोफॉस्फेट, 1 मिमी -ग्लिसरोफॉस्फेट 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, 1 मिमी के साथ lysed किया गया था। फेनिलमेथाइलसल्फोनील फ्यूओराइड, 20 ug/mL aprotinin, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuoride, 1 mM Na3VO4, pH 7.5। प्रत्येक नमूने के कुल प्रोटीन के साठ कुरूप को 10 प्रतिशत एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल किया गया था और प्रोटीन को तब पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली पर प्रतिरक्षित किया गया था। 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20, 1 प्रतिशत दूध, 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन 150 एमएम NaCl, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5) के साथ 4 डिग्री पर रातोंरात अवरुद्ध होने के बाद, एक मोनोक्लोनल एंटी-पी के साथ झिल्ली को 4 डिग्री पर रातोंरात जांचा गया। ईआरके 1/2 एंटीबॉडी (1:500)। फिर झिल्ली को ट्रिस-बफर खारा में 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20 के साथ तीन बार धोया गया, 24 डिग्री पर 2- घंटे के लिए एंटी-माउस-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:20, 000) के साथ जांच की गई और पता चला संवर्धित रसायन विज्ञान के साथ। ईआरके की कुल मात्रा का आकलन करने के लिए, झिल्ली को छीन लिया गया और गैर-फॉस्फोराइलेटेड ईआरके 1/2 (1:500) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। बैंड की तीव्रता को ब्लॉट्स के डेंसिटोमेट्रिक स्कैनिंग द्वारा निर्धारित किया गया था और ईआरके 1/2 के फॉस्फोराइलेशन के स्तर को गैर-फॉस्फोराइलेटेड ईआरके 1/2 के लिए सामान्यीकृत किया गया था और सकारात्मक नियंत्रण (एलपीएस के साथ इलाज किए गए एस्ट्रोसाइट्स) की तुलना में प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। निम्नलिखित समीकरण:

प्रतिशत पर्क 1/2=(ODनमूना/ODधनात्मक नियंत्रण) × 100.

सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म 5.0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया था। डेटा को माध्य मान ± SD के रूप में व्यक्त किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण विचरण (ANOVA) के एक तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था, इसके बाद डननेट की बहु तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण किया गया था।

परिणाम

एस्ट्रोसाइट व्यवहार्यता पर आइसोथियोसाइनेट यौगिकों का प्रभाव

AITC, PEITC, या SFN की साइटोटोक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग किए गए। इस उद्देश्य के लिए, शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स को आईटीसी यौगिकों के साथ 5 और 400 µM के बीच सांद्रता में या विधि अनुभाग में वर्णित संस्कृति माध्यम में पतला DMSO के साथ 20 घंटे के लिए इलाज किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, डीएमएसओ उन सभी उपयोग किए गए सांद्रता में विषाक्त नहीं था जो परीक्षण किए गए आईटीसी समाधानों से मेल खाते हैं। जांच की गई आईटीसी में, एआईटीसी

अंजीर। 1 आइसोथियोसाइनेट यौगिकों के साथ इलाज किए गए एस्ट्रोसाइट्स की सेल व्यवहार्यता। कंफ्लुएंट प्राइमरी एस्ट्रोसाइट्स को 20 घंटे के लिए एलिल आइसोथियोसाइनेट (एआईटीसी), 2- फेनिथाइल आइसोथियोसाइनेट (पीईआईटीसी), या 2- सल्फोराफेन (एसएफएन) के साथ संकेतित सांद्रता में इलाज किया गया था, फिर एमटीटी परख के अधीन। इसके अलावा, चूंकि यह स्टॉक समाधान में डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग कर दिया गया था, डीएमएसओ के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र, आईटीसी नमूनों में मौजूद एक ही विलायक एकाग्रता (प्रतिशत) पर संस्कृति माध्यम में पतला प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त करने के लिए चलाया गया था। आईटीसी विषाक्तता का एक विश्वसनीय अनुमान। नियंत्रण (CTRL) प्रतिनिधि था-

सीरम मुक्त डीएमईएम में अनुपचारित एस्ट्रोसाइट्स से सुगंधित। रेखांकन सेल व्यवहार्यता के खुराक-प्रतिक्रिया घटता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे नियंत्रण की तुलना में सेल अस्तित्व के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। 60 प्रतिशत से ऊपर सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने वाले यौगिकों की खुराक को अधिकतम गैर-विषाक्त सांद्रता के रूप में चुना गया था। मान मतलब ± n के एसडी=3 विभिन्न सेल आबादी पर किए गए प्रयोग हैं। माइक्रो-ग्राफ विभिन्न यौगिकों के साथ उपचार के बाद एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप (50X आवर्धन) के तहत देखे गए कोशिका आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं

एस्ट्रोसाइट्स के लिए कम विषैला था। विशेष रूप से, एआईटीसी 400 माइक्रोन तक की कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं था, जबकि पीईआईटीसी और एसएफएन क्रमशः 10 और 25 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में विषाक्त थे। सूक्ष्म अवलोकन ने एमटीटी परख के परिणामों की पुष्टि की, जिसमें दिखाया गया है कि पीईआईटीसी और एसएफएन की विषाक्त सांद्रता में, एस्ट्रोसाइट्स संख्या में कम हो गए थे और जो बने रहे, उनके साइटोप्लाज्म में साइटोटोक्सिक परिवर्तन दिखाई दिए।

हाइड्रोजन पेरोक्साइड-उपचारित एस्ट्रोसाइट्स में आरओएस उत्पादन पर आईटीसी यौगिकों का सुरक्षात्मक प्रभाव

ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति आईटीसी के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स को पीईआईटीसी, एआईटीसी और एसएफएन के साथ अधिकतम गैर-विषैले एकाग्रता पर पूर्व-उपचार किया गया था, फिर एच 2 ओ 2 से प्रेरित किया गया था। H2O2 से प्रेरित इंट्रासेल्युलर ROS उत्पादन को DCFH-DA द्वारा परख लिया गया। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, H2O2 के संपर्क में आने से फ्लोरोसेंट सिग्नल में वृद्धि होती है

अंजीर। 2 आईटीसी के साथ इलाज किए गए एस्ट्रोसाइट्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन। सामग्री और विधियों अनुभाग में बताए गए अनुसार 2′,7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (DCFA) के फ्लोरोसेंट सिग्नल के परिवर्तनों को मापकर ROS की उपस्थिति को परख लिया गया। एस्ट्रोसाइट्स, 6 अच्छी तरह से प्लेटों में, DCFA के साथ 3 0 मिनट के लिए पूर्व-उपचार किया गया था, फिर 100 μM की अंतिम एकाग्रता पर H2O2 की उपस्थिति में 10 μM PEITC, 400 μM AITC, या 25 μM SFN के साथ 1 घंटे के लिए इलाज किया गया था। . अकेले DCFA (CTRL) या 100 μM H2O2 के साथ इलाज किए गए एस्ट्रोसाइट्स क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं। सेल lysates में पाया गया फ्लोरोसेंट संकेत 485 एनएम पर उत्तेजना के तहत 525 एनएम पर एक फ्लोरोमीटर द्वारा मापा गया था। सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में आरओएस उत्पादन को फोटोल्यूमिनेशन (पीएल) तीव्रता के प्रतिशत (प्रतिशत) के रूप में व्यक्त किया गया था। मान मतलब ± n के एसडी=3 विभिन्न सेल आबादी पर किए गए प्रयोग हैं। H2O2 की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी तारक द्वारा इंगित की जाती है (एकतरफा एनोवा के बाद डन-नेट का पोस्ट हॉक टेस्ट; *p <>

नियंत्रण (CTRL) की तुलना में एस्ट्रोसाइट्स। जैसा कि डीसीएफ प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी के सबूत के रूप में, आईटीसी यौगिकों के साथ एस्ट्रोसाइट्स के पूर्व-उपचार ने एच 2 ओ 2 द्वारा प्रेरित आरओएस पीढ़ी का प्रतिकार किया। परीक्षण किए गए ITCs में, केवल PEITC और SFN सकारात्मक नियंत्रण (H2O2) की तुलना में ROS उत्पादन को क्रमशः लगभग 20 और 24 प्रतिशत कम करने में सक्षम थे।

आइसोथियोसाइनेट यौगिक एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एमएमपी -2 और एमएमपी -9 के स्तर को रोकते हैं

MMP-2 और MMP-9 स्तरों पर ITC यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन LPS के साथ सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स पर किया गया था, जो जिलेटिनिस (गॉट्सचॉल और डेब 1996) की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, और साथ ही साथ AITC के साथ इलाज किया जाता है, PEITC, या SFN सांद्रता की श्रेणी में जो कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं थे। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 3a, 72 और 92 kDa के पाचन के दो स्पष्ट बैंड क्रमशः MMP-2 और MMP-9 के अनुरूप जेल पर मौजूद थे। एलपीएस के साथ एस्ट्रोसाइट्स की सक्रियता ने एमएमपी के स्तर को बढ़ा दिया -2 और एमएमपी के संश्लेषण को प्रेरित किया -9। एआईटीसी (छवि 3 बी), पीईआईटीसी (छवि 3 सी), या एसएफएन (छवि 3 डी) के साथ उपचार एक खुराक पर निर्भर निर्धारित करता है

एमएमपी-9 के स्तर में कमी, जो उपयोग किए गए यौगिक के आधार पर भिन्न होता है। विशेष रूप से, इस्तेमाल किए गए आईटीसी में, एसएफएन एमएमपी को बाधित करने में सबसे प्रभावी था -9 क्योंकि इसने 10 माइक्रोन की खुराक पर 70 प्रतिशत निषेध और 25 माइक्रोन की खुराक पर 100 प्रतिशत निषेध निर्धारित किया था। इसके अलावा, अधिकतम गैर-विषाक्त सांद्रता पर केवल एसएफएन एमएमपी -2 (छवि 2 डी) को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करने में सक्षम था।

आइसोथियोसाइनेट यौगिक एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एमएमपी -2 और एमएमपी -9 जीन अभिव्यक्ति को रोकते हैं

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अध्ययन किए गए आईटीसी यौगिक एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति को बाधित करने में सक्षम थे, आरटी-पीसीआर को आईटीसी की अधिकतम गैर-विषैले एकाग्रता के साथ इलाज किए गए एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स पर किया गया था। जैसा कि चित्र 4ए में प्रतिनिधि जैल में दिखाया गया है, व्यक्तिगत आईटीसी के साथ एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स का उपचार एमएमपी -2 और एमएमपी -9 एमआरएनए की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रतिकार करने में सक्षम था। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 4बी, परिणामों के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि, अधिकतम गैर-विषैले एकाग्रता पर, आईटीसी यौगिकों ने एमएमपी -2 और एमएमपी -9 की तुलना में एक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण निषेध निर्धारित किया है। एक सकारात्मक नियंत्रण (एलपीएस) के लिए। विशेष रूप से, पीईआईटीसी और एसएफएन एमएमपी-2 (85 प्रतिशत) और एमएमपी-9 (100 प्रतिशत) पर समान प्रतिशत निषेध करते हैं, जबकि एआईटीसी एमएमपी को बाधित करने में पीईआईटीसी और एसएफएन की तुलना में कम प्रभावी था{{17} } (65 प्रतिशत ) और एमएमपी -9 (90 प्रतिशत ) अभिव्यक्ति।

ईआरके 1/2 आईटीसी द्वारा एमएमपी अभिव्यक्ति के निषेध में शामिल है

चूंकि ईआरके 1/2 एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स (ली एट अल। 2003) में एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति के नियमन में शामिल मुख्य सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन मार्ग है, आईटीसी यौगिकों का प्रभाव बाह्य-विनियमित प्रोटीन किनेसेस (ईआरके) 1/2 की सक्रियता का परीक्षण किया गया।

जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 5 एलपीएस ने फॉस्फोराइलेटेड ईआरके 1/2 (पी-ईआरके) के स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित किया जो आईटीसी यौगिकों के साथ पूर्व-उपचार द्वारा प्रतिकार किया गया था।

बहस

यह व्यापक रूप से माना जाता है कि कई बीमारियों के खिलाफ मुख्य रक्षा रणनीति मुख्य रूप से जोखिम वाले कारकों से बचने और एक सही जीवन शैली अपनाने में होती है। इस परिकल्पना का समर्थन करने वाले कई वैज्ञानिक प्रमाण हैं कि कुछ प्राकृतिक मेटाबोलाइट्स, जो आमतौर पर विभिन्न प्रकार के फलों और सब्जियों द्वारा निर्मित होते हैं, कैंसर, तंत्रिका संबंधी रोगों और अन्य बहुक्रियात्मक रोगों जैसे रोग संबंधी घटनाओं को संशोधित करने में सक्षम हैं। इस परिदृश्य में, आइसोथियोसाइनेट्स (ITCs) ने अपने ऐंटिफंगल, जीवाणुरोधी,

अंजीर। 3 एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एमएमपी-2 और एमएमपी-9 स्तरों पर आइसोथियोसाइनेट यौगिकों का प्रभाव। एलपीएस (10 कुरूप एमएल -1) के साथ सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स से संस्कृति सुपरनैटेंट्स के विश्लेषण के एक प्रतिनिधि ज़ीमोग्राफिक जेल की सूचना दी गई है और साथ ही संकेतित सांद्रता (μM) पर एआईटीसी, पीईआईटीसी, या एसएफएन के साथ 20 घंटे के लिए इलाज किया जाता है। सीरम-मुक्त माध्यम (CTRL) और LPS- में अस्थिर और अनुपचारित एस्ट्रोसाइट्स से नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्राप्त किए गए थे।

सक्रिय कोशिकाएं (LPS), क्रमशः। हिस्टोग्राम बी-डी विभिन्न सेल आबादी पर किए गए एन {{0}} प्रयोगों के परिणामों (माध्य ± एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं, एलपीएस की तुलना में एमएमपी निषेध के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है, डेंसिटोमेट्री और जैल के कम्प्यूटरीकृत विश्लेषण को स्कैन करने के बाद गणना की जाती है। . एलपीएस की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी तारक द्वारा इंगित की जाती है (एकतरफा एनोवा के बाद डननेट का पोस्ट हॉक टेस्ट; *p < 0.05,="" **p=""><>

एंटीकार्सिनोजेनिक, एंटीमुटाजेनिक, एंटीऑक्सिडेंट, और एंटी-इंफ्लेमेटरी जैविक गुण (ड्यूफोर एट अल। 2015; मार्ज़ोको एट अल। 2015; विग एट अल।, 2009; तलाले और फाहे 2001)। आइसो-थियोसाइनेट्स ग्लूकोसाइनोलेट्स (जीएसएल) के एंजाइमैटिक डिग्रेडेशन से उत्पन्न होते हैं, जो कैपरालेस ऑर्डर के 15 वानस्पतिक परिवारों में मौजूद द्वितीयक मेटाबोलाइट्स हैं और ब्रैसिसेकी परिवार (फेहे एट अल। 2001) में बहुत प्रचुर मात्रा में हैं। GSL को ITCs, नाइट्राइट्स, थियोसाइनेट्स, एपिथियोनिट्राइल्स, SFGate, ग्लूकोज और ऑक्साज़ोलिडाइन्स (Li और Kushad 2005) जैसे विभिन्न घटकों में myrosinase (-thioglucoside glucohydrolase e; EC 3.2.3.147) द्वारा हाइड्रोलाइज़ किया जाता है। यद्यपि आईटीसी का कीमोथेराप्यूटिक क्षेत्र (ग्रंडमैन और ह्यूबर 2018) में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, न्यूरोलॉजिकल रोगों में उनकी चिकित्सीय क्षमता के बारे में कुछ जांच की गई है, इसके बावजूद एसएफएन और एआईटीसी की बीबीबी को पार करने और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में जमा होने की क्षमता का प्रदर्शन किया गया है। (क्लार्क एट अल। 2011; जज़वा एट अल। 2011; झांग 2010)। इस पेपर में, हमने तीन आईटीसी के प्रभावों की तुलना की,

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (एमएमपी) अभिव्यक्ति पर कई सामान्य रूप से उपभोग की जाने वाली क्रूसिफेरस सब्जियों में मौजूद, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के इन विट्रो मॉडल में लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के साथ सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है या एच 2 ओ 2 के साथ इलाज किया जाता है। एस्ट्रोसाइट्स, सीएनएस का सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लियाल सेल प्रकार, मस्तिष्क के होमियोस्टेसिस के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और विभिन्न तंत्रिका संबंधी रोगों (सेकानाविसीयूट और बकवाल्टर 2016; कोलंबो और फरीना 2016) की पहचान हैं। उन्हें जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का महत्वपूर्ण नियामक माना जाता है और हानिकारक अपमान, जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति उनकी प्रतिक्रिया, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और ऊतक क्षति को बढ़ा सकती है या ऊतक की मरम्मत को बढ़ावा दे सकती है। यह सर्वविदित है कि सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स एमएमपी जैसे न्यूरोटॉक्सिक कारकों का उत्पादन करते हैं जिनकी तंत्रिका संबंधी बीमारियों में न्यूरोइन्फ्लेमेशन और प्रगतिशील न्यूरोनल नुकसान को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका होती है (हसीह और यांग 2013)। इसलिए, का मॉडुलन

अंजीर। 4 एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति पर आईटीसी यौगिकों का प्रभाव। 6 अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स, एलपीएस (10 माइक्रोग्राम एमएल -1) के साथ सक्रिय किए गए थे और साथ ही साथ एआईटीसी (400 माइक्रोन), पीईआईटीसी (10 माइक्रोन) या एसएफएन (25 माइक्रोन) के साथ 20 घंटे के लिए इलाज किया गया था। आरटी-पीसीआर। एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि agarose जैल (ए) में बताए गए हैं। (बी) में हिस्टोग्राम विभिन्न सेल पर किए गए n=3 प्रयोगों के परिणामों (मतलब ± एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं

एस्ट्रोसाइट्स की सक्रियता के बाद होने वाली घटनाएं भड़काऊ प्रतिक्रिया और न्यूरोनल क्षति को कम कर सकती हैं।

इस अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि अध्ययन किए गए आईटीसी में एआईटीसी कम विषैला था क्योंकि इसका उपयोग किए गए सभी सांद्रता में सेल व्यवहार्यता में कोई कमी नहीं हुई थी। इसके विपरीत, जैसा कि अन्य लेखकों द्वारा विभिन्न ग्लियल सेल लाइनों पर देखा गया है, पीईआईटीसी और एसएफएन ने क्रमशः 10 और 25 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में सेलुलर विषाक्तता दिखाई (ली एट अल। 2015; एरेन एट अल। 2018; सु एट अल) 2015)।

वर्तमान वैज्ञानिक साहित्य में, सेल व्यवहार्यता पर आईटीसी के प्रभावों के अंतर्निहित आणविक तंत्र पर बहुत विवादास्पद डेटा हैं। इस संबंध में, अधिकांश अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि आईटीसी सेलुलर विकास-उत्प्रेरण एपोप्टोसिस, सेल चक्र गिरफ्तारी, कैंसर कोशिकाओं में आरओएस की पीढ़ी को रोकता है लेकिन सामान्य कोशिकाओं में नहीं (फोफारिया एट अल। 2 015; किन एट अल। 2018; सेस्टिली और फिमोगनारी 2015)। हमने पाया कि एसएफएन और पीईआईटीसी, लेकिन एआईटीसी नहीं, एस्ट्रोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ एक सुरक्षात्मक भूमिका है, वास्तव में अधिकतम गैर-विषैले सांद्रता में वे एच 2 ओ 2 के संपर्क से प्रेरित आरओएस उत्पादन का मुकाबला करने में सक्षम थे। सीएनएस अपनी उच्च ऑक्सीजन खपत, कमजोर एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम और ऑक्सीकरण के लिए अतिसंवेदनशील बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की उच्च सामग्री के कारण विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव की चपेट में है। माना जाता है कि आरओएस और ऑक्सीडेटिव क्षति की पीढ़ी अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), और मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) (ली एट अल) जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों के रोगजनन में शामिल है। 2015)। इसलिए, हालांकि हमारे इन विट्रो प्रयोगों में एसएफएन और पीईआईटीसी ने आरओएस उत्पादन का एक मध्यम सीमा तक प्रतिकार किया, हम मान सकते हैं कि विवो में आईटीसी के लंबे समय तक प्रशासन से आरओएस में अधिक महत्वपूर्ण कमी हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ सार्थक परिणाम हो सकते हैं। सकारात्मक नियंत्रण (एलपीएस) की तुलना में एमएमपी निषेध के प्रतिशत के रूप में व्यक्त आबादी के लिए, डेंसिटोमेट्री को स्कैन करने और जैल के कम्प्यूटरीकृत विश्लेषण के बाद गणना की जाती है। एलपीएस की तुलना में एमएमपी -2 और एमएमपी -9 अभिव्यक्ति की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी तारक (एकतरफा एनोवा के बाद डननेट के पोस्ट हॉक टेस्ट; * पी <0.01) द्वारा="" इंगित="" की="" जाती="">

मस्तिष्क रोगों की रोकथाम और मॉड्यूलेशन। सीएनएस में भड़काऊ प्रतिक्रिया के कैस्केड को ट्रिगर करने के लिए आरओएस एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है। इस संबंध में, यह सर्वविदित है कि आरओएस प्रो-इंफ्लेमेटरी ट्रांसक्रिप्शन कारकों जैसे कि न्यूक्लियर फैक्टर-κB (NF-κB) (ली एट अल। 2015; Chiurchiù et al।) के सक्रियण के माध्यम से न्यूरोइन्फ्लेमेशन में शामिल कई जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। 2016; मार्टोराना एट अल। 2019)। इस परिदृश्य में, एमएमपी द्वारा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जाती है, जिनकी अभिव्यक्ति एनएफ-κबी (यान और बॉयड 2007) के सक्रियण के माध्यम से आरओएस द्वारा विनियमित होती है।

चूंकि एमएमपी डिसरेगुलेशन कई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में योगदान देता है, इसलिए उनका निषेध एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। इस कारण से, पिछले दशक में एमएमपी को बाधित करने के लिए दवाओं और प्राकृतिक यौगिकों की क्षमता पर बढ़ती रुचि पर ध्यान केंद्रित किया गया है। कई इन विट्रो अध्ययनों ने यह प्रमाणित किया है कि सब्जियों और समुद्री जीवों में मौजूद कई दवाओं और बायोएक्टिव यौगिकों की विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट कार्रवाई एमएमपी की अभिव्यक्ति को बाधित करने की उनकी क्षमता से जुड़ी हुई है (लैट्रोनिको एट अल। 2016, 2018; डि बारी एट अल) 2015)। इस अध्ययन में, हमने दिखाया कि परीक्षण किए गए आईटीसी में एसएफएन और पीईआईटीसी एमएमपी -2 और एमएमपी -9 के स्तर और एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स में अभिव्यक्ति को बाधित करने में सबसे प्रभावी थे। अन्य विवो और इन विट्रो अध्ययनों में आईटीसी द्वारा एमएमपी के निषेध की सूचना दी गई है। विशेष रूप से, ली एट अल। (2013) ने प्रदर्शित किया कि एसएफएन प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस के इन विवो मॉडल में एमएमपी -9 अभिव्यक्ति को रोककर बीबीबी क्षति को कम करने में सक्षम है। अन्य लेखकों ने बताया कि एसएफएन चूहों में रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद एमएमपी -9 अभिव्यक्ति को देखने में सक्षम था (माओ एट अल। 2010 ए)। इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि सेल प्रवास के आईटीसी द्वारा दमन और

अंजीर। 5 एक्स्ट्रासेल्युलर सिग्नल-विनियमित किनेज 1/2 (ईआरके 1/2) आईटीसी यौगिकों द्वारा एमएमपी अभिव्यक्ति के निषेध में शामिल है। AITC (400 μM), PEITC (10 μM) या SFN (25 μM) के साथ 1 घंटे के लिए पूर्व-उपचार किए गए एस्ट्रोसाइट्स से lysates के पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण की प्रतिनिधि ऑटोरैडियोग्राफिक फिल्में, और फिर LPS (10 ug mL) के साथ 2 घंटे के लिए सक्रिय होती हैं। 13}})। अनुपचारित और अस्थिर कोशिकाएं नकारात्मक नियंत्रण (CTRL) का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) में हिस्टोग्राम C6 ग्लियोमा कोशिकाओं में pERK1 / 2 स्तरों के आक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है, जो NF-κB (ली एट अल। 2015) द्वारा मध्यस्थता MMP -9 अभिव्यक्ति के निषेध से जुड़ा था।

आणविक तंत्र जिसके द्वारा आईटीसी एमएमपी को रोकते हैं, अस्पष्ट हैं, और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों पर आईटीसी के एंटीऑक्सिडेंट और विरोधी भड़काऊ गुणों की जांच करने वाले कोई अध्ययन नहीं हैं। कई अध्ययन इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि ITCs का निरोधात्मक प्रभाव Nrf2 सिग्नलिंग मार्ग द्वारा NF-κB को अवरुद्ध करने की उनकी क्षमता का परिणाम है। इस संबंध में, एक इन विवो अध्ययन इस बात का सबूत है कि Nrf2 नॉकआउट चूहों में रीढ़ की हड्डी की NF-κB-मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया और MMP सहित NFκB-निर्भर जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए अतिसंवेदनशील थे -9 (माओ एट अल। 2010b) ) यद्यपि NF-κB और Nrf2 रास्ते परस्पर क्रिया कर सकते हैं, हमने प्रदर्शित किया कि NF-κB का नियमन आणविक तंत्रों के मॉड्यूलेशन के माध्यम से भी होता है जो Nrf2 द्वारा स्वतंत्र होते हैं। वास्तव में, हमने पाया कि एआईटीसी, पीईआईटीसी और एसएफएन ने ईआरके 1/2 की सक्रियता को रोक दिया जो सिग्नल ट्रांसडक्शन घटनाओं के कैस्केड में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो अंततः एमएमपी जीन ट्रांसक्रिप्शन को नियंत्रित करता है।

हालांकि, प्रायोगिक साक्ष्य कि अधिकतम गैर-विषैले सांद्रता पर एसएफएन ने एमएमपी -9 अभिव्यक्ति और स्तर दोनों को पूरी तरह से बाधित कर दिया, जबकि एआईटीसी और पीईआईटीसी ने एमएमपी को अधिकतम करने के लिए बाधित किया -9 अभिव्यक्ति लेकिन केवल एमएमपी को गिरा दिया {{3} } का स्तर लगभग 50 प्रतिशत तक, यह सुझाव दे सकता है कि ये यौगिक क्रिया के विभिन्न तंत्रों के साथ MMP-9 प्रतिलेखन को संशोधित करते हैं। इस संबंध में, यह बताया गया है कि एसएफएन, एनएफ-κबी के एलपीएस-प्रेरित सक्रियण के निषेध के अलावा, एलपीएस को टीएलआर4 रिसेप्टर (कू एट अल 2013) के बंधन में हस्तक्षेप करता है। टीएलआर4 पर एसएफएन का निरोधात्मक प्रभाव एलपीएस द्वारा एस्ट्रोसाइट्स की सक्रियता को रोक सकता है और इसके परिणामस्वरूप एमएमपी-9 अभिव्यक्ति का अपस्ट्रीम निषेध हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप एमएमपी-9 उत्पादन में कमी हो सकती है।

ऑटोरैडियोग्राफिक फिल्मों के डेंसिटोमेट्रिक स्कैनिंग और गैर-फॉस्फोराइलेटेड ईआरके 1/2 के सामान्यीकरण के बाद प्राप्त किया गया। डेटा प्रतिनिधित्व का अर्थ है ± n का एसडी=3 विभिन्न सेल आबादी पर किए गए प्रयोग। तारांकन सकारात्मक नियंत्रण (एलपीएस-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स) से सांख्यिकीय रूप से भिन्न मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो 1 0 0 प्रतिशत (एकतरफा एनोवा के बाद डननेट की बहु तुलना पोस्ट हॉक टेस्ट; * पी <0.01) पर="" सेट="" किया="" गया="">

निष्कर्ष

सारांश में, हमारा डेटा इंगित करता है कि आईटीसी के साथ एस्ट्रोसाइट्स का उपचार आरओएस गठन को कम करता है और एमएमपी की रिहाई को रोकता है -2 और एमएमपी -9 ग्लियाल पर आईटीसी के एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-भड़काऊ गुणों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। कोशिकाएं। इन परिणामों से पता चलता है कि तंत्रिका संबंधी रोगों की रोकथाम और पूरक उपचार के लिए, स्वस्थ खाद्य पदार्थों के उपयोग के आधार पर, न्यूरो-पोषण हस्तक्षेपों के विकास के लिए आईटीसी न्यूट्रास्युटिकल एजेंट हो सकते हैं।

CRUI-CARE समझौते के अंतर्गत Università Degli Studi di Bari Aldo Moro द्वारा प्रदान की गई ओपन एक्सेस फंडिंग।

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