रेडिकल स्कैवेंजिंग और एंटी-एजिंग गुणों के लिए एनएमआर-आधारित मेटाबोलॉमिक्स प्रोफाइलिंग भाग 2

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2.5. प्रमुख घटक विश्लेषण द्वारा जड़ी बूटी के अर्क का वर्गीकरण

बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण (एमवीडीए) का उपयोग करके परीक्षण की गई जड़ी-बूटियों की पत्तियों के बीच मेटाबोलाइट भिन्नता का विश्लेषण किया गया था। प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए), एक पैटर्न रिकग्निशन मेथड, एक अनपर्यवेक्षित एमवीडीए है जो नमूनों के बीच जुड़ाव की एक प्रमुख समझ प्रदान करता है। पीसीए स्कोर भूखंडों ने जड़ी-बूटियों को समूहों में अलग करना दिखाया, जबकि लोडिंग भूखंडों ने मेटाबोलाइट्स को उजागर किया जो अलगाव प्रदान करते हैं [85, 86]। पीसीए मॉडल ने अच्छी फिटनेस (R2X=0.997) और उच्च पूर्वानुमेयता (Q2=0.993) प्रदर्शित की, जहां R2X(cum) और Q2(cum) के बीच अंतर 0 से कम था। .3, इस प्रकार यह दर्शाता है कि प्रत्येक जड़ी-बूटियों का अर्क समान रूप से और समान रूप से देखे गए समूह अलगाव में योगदान देता है। यह अवलोकन व्हीलॉक एट अल के अनुरूप था। [87]।

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प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस स्कोर प्लॉट ने प्रदर्शित किया कि चयनित जड़ी-बूटियों को बिना किसी उल्लेखनीय आउटलेयर के दो समूहों में विभाजित किया गया था जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है। प्रिंसिपल कंपोनेंट (पीसी) 1 ने सबसे बड़ी नमूना भिन्नता प्रदर्शित की, उसके बाद पीसी 2। PC1 और PC2 ने विचरण के प्रतिशत में क्रमशः 29.7 प्रतिशत और 24.9 प्रतिशत का योगदान दिया। इसलिए, इन पीसी द्वारा लगभग 54.6 प्रतिशत के कुल विचरण का वर्णन किया गया था। लोडिंग कॉलम प्लॉट के परिणामों से पता चला कि जड़ी-बूटियों को PC1 (V.negundo और C.longa) के सकारात्मक पक्ष और PC1 के नकारात्मक पक्ष (P. माइनस, P. इंडिका, O.javanica और) में अलग करने के लिए जिम्मेदार मेटाबोलाइट्स हैं। सी. कॉडेटस)(चित्रा 4बी)।

PC1 के लोडिंग कॉलम प्लॉट के डेटा से पता चला कि फेनोलिक यौगिक, मुख्य रूप से फ्लेवोनोइड समूह और फेनोलिक एसिड, चयनित जड़ी-बूटियों के पृथक्करण के लिए जिम्मेदार थे। क्वेरसेटिन (1), क्वेरसेटिन-3-ओ-रमनोसाइड (2), क्वेरसेटिन-3-ओ-ग्लूकोसाइड (3), क्वेरसेटिन-3-ओ-ग्लुकुरोनाइड (4), क्वेरसेटिन-3- ओ-अरेबिनोफ्यूरानोसाइड (5), रुटिन (6), एमविरिकेटिन डेरिवेटिव (7), कैटेचिन (8), एपिकटेचिन (9), आइसोरहैमनेटिन (10), एस्ट्रैगैलिन (11), क्लोरोजेनिक एसिड (12), गैलिक एसिड (13), क्यूमरिक एसिड (14), एस्कॉर्बिक एसिड (15), फॉर्मिक एसिड (21), फ्यूमरिक एसिड (22), 3-मिथाइलक्सैन्थिन (26) और एपिजेनिन (28) सामग्री ज्यादातर पी। माइनस, पी। इंडिका में अधिक थी। , C. caudatus और O.javanica क्योंकि वे भूखंड के नकारात्मक पक्ष में स्थित थे। इसके विपरीत, वी.नेगुंडो और सी.लोंगा को उनके अर्क में सेरोटोनिन (27) और डी-लिमोनेन (29) की उपस्थिति के कारण अन्य जड़ी-बूटियों से अलग किया गया था।

2.6. आंशिक कम से कम वर्ग विश्लेषण (पीएलएस) का उपयोग कर बायोएक्टीओटीज और मेटाबोलाइट्स के बीच सहसंबंध

पर्यवेक्षित एमवीडीए पद्धति के रूप में पर्यवेक्षित एमवीडीए पद्धति के रूप में, पीएलएस, पर्यवेक्षित एमवीडीए पद्धति के रूप में, मापा गया बायोएक्टीविटी और मेटाबोलाइट्स के बीच संबंध को समझने के लिए, स्वतंत्र चर डेटा (मेटाबोलाइट्स के एनएमआर रासायनिक बदलाव) को आश्रित चर के डेटा से सहसंबंधित करने के लिए लागू किया गया था, जो कि DPPH, ABTS और ORAC assays के साथ-साथ एंटी-इलास्टेज और एंटी-कोलेजनेज गतिविधियों का निषेध था। इस पद्धति को लागू किया गया था क्योंकि पीएलएस के पास परीक्षण किए गए बायोएक्टीविटी को मेटाबोलाइट्स के साथ जोड़ने के लिए एक बड़ी उपलब्धि है, इस प्रकार भविष्यवाणी के लिए एक मॉडल प्रदान कर सकता है [88]। पीएलएस विश्लेषण के माध्यम से, नमूनों में मेटाबोलाइट्स के साथ कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों और एंटी-एजिंग गुणों जैसे जैव-सक्रियताओं के बीच संबंध स्थापित किया जा सकता है। इसलिए, बायोएक्टिव मार्कर के रूप में जिम्मेदार मेटाबोलाइट्स का सुझाव दिया जा सकता है।

बीप्लॉट पीएलएस विश्लेषण के परिणामस्वरूप स्कोर और लोडिंग प्लॉट का मिश्रण है, जैसा कि मेडियानी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया है। [80]। कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि (चित्रा 5ए) और एंटी-एजिंग गुणों (चित्रा 5बी) के लिए आंशिक रूप से कम-वर्ग द्विप्लॉट ने दिखाया कि सभी नमूने उल्लेखनीय आउटलेर्स के बिना अच्छी तरह से अलग और क्लस्टर किए गए थे। PC1 ने V. negundo, O.jaoanica, और C.longa से P. माइनस, C.caudatus, और P. indica की पत्तियों को अलग किया। कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों और बाइप्लॉट्स के एंटी-एजिंग गुणों के आधार पर, मॉडल ने क्रमशः {{10}}.988 और 0.966 के अच्छे फिटनेस (R'Y) मान प्रस्तुत किए। इस बीच, कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों और एंटी-एजिंग गुणों की भविष्यवाणी (Q4) क्रमशः 0.984 और 0.951 थी।

जैसा कि कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों (चित्रा 5ए) के पीएलएस बाइप्लॉट से दिखाया गया है, बायोएक्टीविटीज (डीपीपीएच, एबीटीएस, और ओआरएकेसे) को बायप्लॉट के सकारात्मक पक्ष की ओर निर्देशित किया गया था, जो कि सबसे सक्रिय क्षेत्र था और पी.मिनस, पी के सबसे करीब था। इंडिका और सी.कॉडैटस। इसके विपरीत, V. negundo, O.javanica, और C. longa को बायप्लॉट के नकारात्मक पक्षों की ओर निर्देशित किया गया था, जिन्हें सबसे कम सक्रिय क्षेत्र माना जाता था और DPPH, ABTS और ORAC assays से आगे थे, और एक नकारात्मक सहसंबंध दिखाया। जैव गतिविधियों के साथ। इस स्थिति में, P. mimus, P. indica, और C.caudatus कम से कम सक्रिय जड़ी-बूटियों से अलग हो गए हैं, यह दर्शाता है कि इन जड़ी-बूटियों ने एक मजबूत कट्टरपंथी-स्कैवेंजिंग प्रभाव प्रदर्शित किया है, जिससे यह पता चलता है कि इन जड़ी-बूटियों के अर्क में फेनोलिक के उच्च स्तर हो सकते हैं। यौगिक। तीन सबसे सक्रिय जड़ी बूटियों में, पी. माइनस को डीपीपीएच और एबीटीएस परख के साथ अधिक मजबूती से सहसंबद्ध पाया गया, इसके बाद ओआरएसी परख की गई।

यह खोज कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों के इन विट्रो परिणामों के अनुरूप थी जो कि प्रदर्शन किए गए थे। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि पी. माइनस ने अन्य जड़ी-बूटियों की तुलना में एक शक्तिशाली मुक्त कण मैला ढोने का प्रभाव प्रदर्शित किया। इस प्रकार परिणामों से पता चला कि पी. माइनस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति उन्मूलन के लिए सबसे सक्रिय जड़ी बूटी है। पी. माइनस की कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की पहचान क्वेरसेटिन, क्वेरसेटिन-3-ओ-रम्नोसाइड, कैटेचिन, आइसोरामनेटिन, एस्ट्रैगैलिन और एपिजेनिन के रूप में की गई थी।ओटेफ्लेवोनॉयडये सभी मेटाबोलाइट्स P. माइनस और DPPHand ABTS रेडिकल स्कैवेंजिंग एसेज़ के करीब स्थित थे। मेडियानी एट अल द्वारा पिछला अध्ययन। [80] यह भी पता चला कि पौधों के एक फ्रीज-सूखे नमूने में अधिक मात्रा में -ग्लूकोज, -ग्लूकोज, कैटेचिन और क्लोरोजेनिक एसिड दिखाया गया था, जिसने जड़ी-बूटी की शक्तिशाली डीपीपीएच कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता में योगदान दिया हो सकता है। हालांकि, पी.मिनस के उच्च कट्टरपंथी मैला ढोने वाले प्रभाव का भी अर्क में अज्ञात मेटाबोलाइट्स द्वारा योगदान दिया जा सकता है।

इसी तरह के निष्कर्ष एंटी-एजिंग गुणों के लिए भी पाए गए। चित्रा 5बी एंटी-एजिंग गुणों के पीएलएस से प्राप्त बाइप्लॉट को प्रस्तुत करता है। बायोएक्टिविटीज (एंटी-इलास्टेज और एंटी-कोलेजनेज गतिविधियां) को बायप्लॉट के सकारात्मक पक्ष पर पेश किया गया था, जो कि सबसे सक्रिय क्षेत्र था और पी.मिनस, पी। इंडिका और सी.कॉडैटस के करीब था। इसके विपरीत, V.negundo, O.javanica, और C.longa को बायप्लॉट के नकारात्मक पक्ष की ओर निर्देशित किया गया था, जिसे सबसे कम सक्रिय क्षेत्र माना जाता था और यह इलास्टेज और एंटी-कोलेजनेस गतिविधियों से और दूर था। इसने बायोएक्टीविटी के लिए एक नकारात्मक या कमजोर सहसंबंध दिखाया। इस स्थिति में, P.mimus, P.indica, और C. caudatus को कम से कम सक्रिय जड़ी-बूटियों से अलग किया गया था, यह दर्शाता है कि इन जड़ी-बूटियों के अर्क ने अधिक इलास्टेज और कोलेजनेज़ अवरोध प्रदर्शित किया। तीन सबसे सक्रिय जड़ी-बूटियों में, पी. माइनस का फिर से अन्य जड़ी-बूटियों की तुलना में इन एंटी-एजिंग गुणों के साथ एक मजबूत संबंध पाया गया।

यह खोज एंटी-एजिंग गुणों के इन विट्रो परिणामों के अनुरूप थी जो पहले किए गए थे। परिणामों से पता चला कि पी.मिनस इलास्टेज और कोलेजनेज एंजाइमों को रोकने के लिए सबसे सक्रिय जड़ी बूटी थी। पी. माइनस के एंटी-एजिंग गुणों में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की पहचान क्वेरसेटिन, क्वेरसेटिन-3-ओ-रमनोसाइड, मायरिकेटिन डेरिवेटिव, कैटेचिन, इसोरहैमनेटिन, एस्ट्रैगैलिन और एपिजेनिन के रूप में की गई थी। अन्य मेटाबोलाइट्स जैसे -ग्लूकोज, -ग्लूकोज, फ्यूमरिक एसिड और फैटी एसिड भी बायोएक्टीविटी के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। ये सभी मेटाबोलाइट्स पी. माइनस और एंटी-इलास्टेज और एंटी-कोलेजनेज गतिविधियों के करीब स्थित थे।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

इन चयनित जड़ी-बूटियों का भेदभाव विशेष रूप से उच्च कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि के नमूनों के अनुरूप था। माइनस, पी.इंडिया और सी.कॉडैटस, जिन्हें माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, विशेष रूप से फ्लेवोनोइड्स की उच्च सांद्रता के कारण दूसरों से भेदभाव किए जाने की उम्मीद थी, इन फेनोलिक यौगिकों की उपस्थिति को भी अधिक इलास्टेज और कोलेजनेज निरोधात्मक गतिविधियों में योगदान करने के लिए माना जाता है। ये जड़ी-बूटियाँ [67-79,89-92].

विभिन्न अध्ययनों [66,72,75,79,92-101] द्वारा मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता और एंटी-एजिंग गतिविधि की ओर पौधों के अर्क के बायोएक्टिव यौगिकों के योगदान का दस्तावेजीकरण किया गया है। इसके अलावा, मेटाबोलाइट्स जैसे फ्लेवोनोइड्स (क्वेरसेटिन, केम्पफेरोल, मायरिकेटिन, एपिक्टिन, और कैटेचिन) और अन्य फिनोल जैसे रेस्वेराट्रोल और प्रोसायनिडिन बी 2, इलास्टेज और कोलेजनेज़ [69-71, 79] को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करने के लिए सिद्ध हुए हैं।

वर्तमान अध्ययन में, प्रोजेक्शन (वीआईपी) मूल्यों में परिवर्तनशील महत्व के लिए मेटाबोलाइट संकेतों की पहचान की गई और सबसे महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स प्राप्त करने के लिए समीक्षा की गई जो कि परीक्षण किए गए बायोएक्टीविटी के साथ सहसंबद्ध थे। यह यहां प्रस्तुत परिणामों की अखंडता को बढ़ाने के लिए किया गया था, जिसमें पहचाने गए मेटाबोलाइट्स की भेदभावपूर्ण क्षमता की जांच की गई थी।प्यूरिटन विटामिन सीGenerally, the metabolites signal with VIP>{0}}.5 को भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण माना गया [102]। इस अध्ययन में, कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों और एंटी-एजिंग गुणों में योगदान करने वाले सभी मेटाबोलाइट्स को महत्वपूर्ण भेदभावपूर्ण मेटाबोलाइट्स के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है क्योंकि उनके वीआईपी मान 1.0 (तालिका 2) से ऊपर थे। फिट की अच्छाई की तुलना में कई मॉडलों के साथ मूल मॉडल की वैधता (R2) और भविष्य कहनेवाला (Q2) क्षमताओं की पुष्टि करने के लिए, दो PLSbiplots मॉडल को 100 यादृच्छिक क्रमपरिवर्तन का उपयोग करके मान्य किया गया था। R2 ने स्पष्ट किया कि मॉडल फिटनेस महत्वपूर्ण थी और मॉडल में Y चर के ग्रेड की व्याख्या की, जबकि Q2 ने एरिक्सन एट अल द्वारा रिपोर्ट की गई मॉडल के समान भविष्य कहनेवाला गुणवत्ता की पेशकश की। [103]।

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8)। परिणामों से पता चला कि सभी Y-अक्ष R . के अंतःक्षेपण करते हैं< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>सिस्टैंचR2 और Q2 अवरोधन मान क्रमशः 0.0367-0.0872 और-0.444 से-0.492 की सीमा में थे, यह सुझाव देते हुए कि दोनों PLS मॉडल मान्य थे। और ओवरफिट नहीं दिखाया। इसलिए, इन दो पीएलएस मॉडल को अच्छे प्रदर्शन मॉडल के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और इन निष्कर्षों ने मॉडल की विश्वसनीयता में वृद्धि की है।

2.7. माध्यमिक चयापचयों की सापेक्ष मात्रा का ठहराव

चयनित जड़ी-बूटियों से पहचाने गए कुछ द्वितीयक चयापचयों की सापेक्ष मात्रा का ठहराव चित्र 6 में दिखाया गया है। ये मेटाबोलाइट्स सबसे अधिक सक्रिय जड़ी-बूटियों जैसे कि पी। माइनस में अधिक पाए गए, जो बाइप्लॉट के सकारात्मक पक्ष पर स्थित थे, और परीक्षण की गई लगभग सभी जैव गतिविधियों के करीब थे।सिस्टैंच क्या है?इन परिणामों से पता चला कि द्वितीयक मेटाबोलाइट्स विशेष रूप से यौगिकों के फ्लेवोनोइड समूह से हैं जो पी। माइनस में उच्च मात्रा में मौजूद हैं, ने इस जड़ी बूटी के मुक्त कट्टरपंथी उन्मूलन और एंटी-एजिंग गुणों में योगदान दिया हो सकता है?

फ्लेवोनोइड की विभिन्न संरचनाओं की तुलना करते समय, जो उनकी प्रभावशीलता में योगदान दे सकते थे, यह नोट किया गया था कि बी-रिंग में हाइड्रॉक्सिलेशन पैटर्न उम्र बढ़ने वाले एंजाइम गतिविधि पर मेटाबोलाइट्स के निषेध प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण कारकों में से एक हो सकता है। [80] . सिम एट अल। [104] यह भी पता चला कि प्रोटीन और एमआरएनए दोनों स्तरों पर, इन फ्लेवोनोइड्स का निरोधात्मक प्रभाव बी-रिंग में समूहों की बढ़ती संख्या के साथ शक्तिशाली हो गया, और उन्होंने एमएमपी पर कुछ फ्लेवोनोइड्स की संरचना-गतिविधि संघ की जांच की-1 यूवी-विकिरणित मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट में जीन अभिव्यक्ति।

3. सामग्री और तरीके

3.1. रसायन और अभिकर्मक

मर्क मिलिपोर इंटरनेशनल (डार्मस्टाड, जर्मनी) द्वारा ड्यूटेरेटेड मेथनॉल-डी 4 (सीएच 3 ओएच-डी 4), नॉन-ड्यूटेरेटेड केएच 2 पीओ 4, सोडियम ड्यूटेरियम ऑक्साइड (एनएओडी), ट्राइमेथिल सिलील प्रोपियोनिक एसिड-डी 4 सोडियम नमक (टीएसपी), इथेनॉल और मेथनॉल की आपूर्ति की गई थी। क्वेरसेटिन, फॉस्फेट बफर, 2, 2-डिपेनिल-1-पिक्रिलहाइड्राज़िल (डीपीपीएच),2,2-एज़िनोबिस (3-एथिल-बेंजोथियाज़ोलिन-6-सल्फ़ोनिक एसिड) [ABTS ], ट्रोलॉक्स, पोटेशियम परसल्फेट, 2,2'-एज़ोबिस (2- एमिडिनोप्रोपेन) [एएपीएच, एपिगैलोकैटेचिन गैलेट (ईजीसीजी), एचईपीईएस बफर, इलास्टेज एंजाइम, एन-मेथॉक्सी स्यूसिनिल-अला-अला-प्रो-क्लोरो, एन -मेथॉक्सीसुकिनिल-अला-अला-प्रो-वैल-पी-नाइट्रोएनिलाइड और ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) की आपूर्ति सिग्मा (एल्ड्रिच, जर्मनी) द्वारा की गई थी।

3.2. संयंत्र सामग्री और नमूना

O.jacanica, P. माइनस, और C.longa की ताजी पत्तियों को Felda Sungai Koyan Satu, Raub, और Pahang से एकत्र किया गया था। V.negundo के पत्ते इंस्टीट्यूट ऑफ बायोसाइंस, यूनिवर्सिटी पुत्र मलेशिया से प्राप्त किए गए थे। पी. इंडिका की ताजी पत्तियों को यूनिवर्सिटी एग्रीकल्चर पार्क, यूनिवर्सिटी पुत्र मलेशिया में काटा गया, और सी। कॉडटस के पत्तों की ताजी पत्तियों को कृषि संस्थान, सेरडांग, सेलांगोर में एकत्र किया गया। इन जड़ी बूटियों का एक वाउचर नमूना हर्बेरियम, इंस्टीट्यूट ऑफ बायोसाइंस, यूनिवर्सिटी पुत्र मलेशिया में रखा गया था, और प्रत्येक नमूने को वनस्पतिशास्त्री द्वारा मान्य किया गया था।एंटी एजिंग सिस्टैन्चमेटाबोलाइट्स सामग्री की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए सभी पत्तियों को सुबह धूप के दिनों में लगातार काटा गया। प्रत्येक जड़ी बूटी के लिए खुले मैदान में भूखंड को छह भागों में विभाजित किया गया था और प्रत्येक नमूने को प्रत्येक खंड से छह प्रतिकृति के रूप में एकत्र किया गया था।

3.3.नमूना तैयार करना

एक बार कटाई के बाद, ताजे पत्तों को सभी अवशेषों को हटाने के लिए बहते पानी के नीचे धोया गया, प्रयोगशाला टिशू पेपर से सुखाया गया, और सभी एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए तुरंत तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए और लियोफिलाइजेशन से पहले मेटाबोलाइट्स को संरक्षित किया गया। नमूनों को तब LABCONCO (कैनसस सिटी, MO, USA) फ्रीज ड्रायर में सुखाया गया, जब तक कि लगातार वजन और नमी की मात्रा 10 प्रतिशत से कम न हो जाए। सभी सूखे नमूनों को एक प्रयोगशाला ब्लेंडर का उपयोग करके एक महीन पाउडर में पीस लिया गया था और एक समान आकार प्राप्त करने के लिए एक प्रयोगशाला परीक्षण छलनी (ENDECOTTS LTD. लंदन, इंग्लैंड) का आकार 300 um का उपयोग करके छलनी किया गया था। पाउडर के नमूनों को प्रकाश के संपर्क और आर्द्रता से बचाने के लिए एक एल्यूमीनियम पैकेजिंग में वैक्यूम-पैक किया गया था और विश्लेषण से पहले -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था।

3.4. निष्कर्षण

मेडियानी एट अल द्वारा वर्णित निष्कर्षण प्रक्रिया । [105] का पालन कुछ संशोधनों के साथ किया गया। संक्षेप में, प्रत्येक पाउडर के नमूने के 10 ग्राम को एम्बर शंक्वाकार फ्लास्क में 100 एमएल 60 प्रतिशत इथेनॉल में डुबोया गया था और नियंत्रित तापमान (40 डिग्री से नीचे) के तहत एक अल्ट्रासोनिक स्नान सोनिकेटर (WiseClean, मॉडल WUC-D10H, सियोल, कोरिया) का उपयोग करके 1 घंटे के लिए sonicated किया गया था। . नमूने व्हाटमैन फिल्टर पेपर नंबर 1 के माध्यम से फ़िल्टर किए गए थे और अवशेषों को दो बार फिर से निकाला गया था और पहला निष्कर्षण पूरा होने के बाद फ़िल्टर किया गया था। अर्क को तब 40 डिग्री पर एक वैक्यूम के तहत रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करके जमा और केंद्रित किया गया था। व्युत्पन्न चिपचिपे पदार्थों को तब पानी के व्यापक उन्मूलन को सुनिश्चित करने के लिए LABCONCO फ्रीज ड्रायर का उपयोग करके फ्रीज-सूखा किया गया था और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। अंत में, सूखे कच्चे अर्क को किए गए सभी जांचों के लिए आवश्यक सांद्रता में पतला किया गया।

3.5. डीपीपीएच रेडिकल स्कैवेंजिंग गतिविधि

कोंग एट अल द्वारा विकसित तकनीक का पालन करके नमूनों की कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि निर्धारित की गई थी। [1 0 6], जिसे ब्रांड-विलियम्स एट अल की एक संशोधित विधि से विकसित किया गया था। [107]थोड़े से संशोधन के साथ। संक्षेप में, मेथनॉल में अलग-अलग सांद्रता (0 से 500 ug/mL) पर 50uL नमूना अर्क को 195uL के साथ जोड़ा गया था जो ताज़ा रूप से तैयार 0.2mMmमेथनॉलिक2, 2- डिपेनिल -1- पिक्रिलहाइड्राज़िल (DPPH) समाधान और संग्रहीत किया गया था। एक 96 वेलप्लेट में सभी परीक्षण तैयार किए गए थे। अंधेरे में 60 मिनट ऊष्मायन के बाद और सकारात्मक नियंत्रण और खाली नमूनों की तुलना में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बायोटेक ईएल 800 माइक्रोप्लेट रीडर, बायो-टेक, वीनोस्की, वीटी, यूएसए) का उपयोग करके 515 एनएम पर डीकोलोराइजिंग प्रक्रिया दर्ज की गई थी। कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि का प्रतिशत निम्नलिखित समीकरण के अनुसार मापा गया था:

जहां एक नियंत्रण पौधे के अर्क के बिना नियंत्रण का अवशोषण है और सरल पौधे के अर्क का अवशोषण है।

संयंत्र के अर्क या सकारात्मक नियंत्रण सांद्रता, जो स्थिर मुक्त मूलक DPPH के 50 प्रतिशत को परिमार्जन करते हैं, की गणना आईसीएस के रूप में की गई थी, जो कि कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि प्रतिशत के रैखिक ग्राफ का उपयोग कर रहा था।

पौधे के अर्क / सकारात्मक नियंत्रण सांद्रता। लोअर ICso ने उच्च एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का संकेत दिया। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्रोलॉक्स और क्वेरसेटिन के साथ छह प्रतिकृति में सभी प्रयोग चलाए गए थे।

3.6.ABTS रेडिकल स्कैवेंजिंग परख

ABTS कट्टरपंथी मैला ढोने की परख के लिए, विश्लेषण अर्नाओ एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया के बाद किया गया था। [1 0 8] कुछ संशोधनों के साथ। तैयार किए गए स्टॉक समाधान 7 मिमी एबीटीएस प्लस समाधान और 2.45 मिमी पोटेशियम पर्सल्फेट समाधान थे। कार्यशील घोल तैयार करने के लिए, दो स्टॉक समाधानों को समान मात्रा में मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए अंधेरे में प्रतिक्रिया करने के लिए छोड़ दिया गया। फिर, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (यूवी -1650 पीसी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, शिमदज़ु, क्योटो, जापान) का उपयोग करके 734 एनएम पर 0.700 ± 0.005 इकाइयों का अवशोषण प्राप्त करने के लिए आसुत जल के साथ काम कर रहे समाधान को पतला किया गया था और इसे जाना जाता है एबीटीएस प्लस समाधान। एबीटीएस प्लस समाधान हर परख के लिए नए सिरे से तैयार किया गया था। इस ABTS प्लस समाधान 900 μL） को 2 मिनट के लिए 100 μL जड़ी बूटी के अर्क के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई थी। तब स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण को 734 एनएम पर पढ़ा गया था। 3.1 ug/mL to और 50 ug/mL Trolox युक्त मानक वक्र विकसित किया गया था, और परिणाम mg Trolox समतुल्य एंटीऑक्सीडेंट क्षमता/g नमूना (mg TEAC/g नमूना) के रूप में व्यक्त किए गए थे।

3.7. ओआरएसी रेडिकल स्कैवेंजिंग परख

हुआंग एट अल द्वारा बताए गए अनुसार पेरोक्सिल रेडिकल मैला ढोने की प्रभावकारिता को मापने के लिए एक ओआरएसी परख लागू की गई थी। [109] फ्लुओस्टार ऑप्टिमा माइक्रोप्लेट फ्लोरोसेंस रीडर (बीएमजी लैबटेक, ऑरटेनबर्ग, जर्मनी) का उपयोग करते हुए। प्रत्येक जड़ी बूटी निकालने और ट्रोलॉक्स (मानक) 75 मिमी फॉस्फेट बफर समाधान-पीबीएस-पीएच 7.4 में तैयार किए गए थे। 96-वेल ब्लैक माइक्रोप्लेट में, कुल 150 μL फ़्लोरेसिन 10 nM, जो PBS-में घुला हुआ था, को 25 μL ट्रॉलॉक्स, पौधे के अर्क, या पीबीएस के रूप में एक रिक्त के रूप में जोड़ा गया था। इन समाधानों को तीन प्रतियों के कुओं में पिपेट किया गया था। माइक्रोप्लेट को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया और ढक्कन के साथ कवर किया गया। प्रतिदीप्ति को 458 एनएम पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 520 एनएम पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ मापा गया था। हर 90 सेकेंड में माप लेकर बैकग्राउंड सिग्नल का निर्धारण किया गया था।

उसके बाद, 2,2'-एज़ोबिस (2-एमिडिनोप्रोपेन) (एएपीएच, पीबीएस में 240 एमएम) ताजा तैयार 25 यूएल को ऑन-बोर्ड इंजेक्टर द्वारा पेश किया गया था। प्रतिदीप्ति का क्षय तब उसी उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके 90 मिनट तक लिया गया था। नमूनों (प्रतिदीप्ति बनाम समय) के लिए वक्र के तहत क्षेत्रों के लिए मूल्यांकन किया गया था, रिक्त के लिए वक्र के नीचे का क्षेत्र और एक मानक वक्र （ 25-400 μM Trolox） की तुलना में। ट्रॉलॉक्स से संबंधित ओआरएसी मूल्यों की गणना निम्नानुसार समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

3.8. इलास्टेज निषेध परख

इलास्टेज निरोधात्मक गतिविधि क्रूस एट अल द्वारा वर्णित तकनीक के अनुसार निर्धारित की गई थी। [11 0], एनडलोवु एट अल द्वारा मामूली संशोधनों के साथ। [75]. नमूना कुओं में 25 μL 0.1 M HEPES बफर pH7.5）, 25 μL जड़ी बूटी निकालने （100 ug/mL）, और 25 μL इलास्टेज एंजाइम （1 ug/mL） शामिल थे। खाली कुओं में केवल 75 μL HEPES बफर होता है और नकारात्मक नियंत्रण कुओं में 50 μL HEPES बफर और 25 μL इलास्टेज एंजाइम होता है। सकारात्मक नियंत्रण कुओं में 25 μL HEPES बफर, 25 μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-chloro（10 ug/mL） और 25μL इलास्टेज एंजाइम होता है। विलायक नियंत्रण कुओं में 25 μL HEPES बफर, 10 प्रतिशत मेथनॉल के 25 μL और 25 μL इलास्टेज एंजाइम होते हैं। जड़ी-बूटियों के अर्क के लिए रिक्त नियंत्रण (परीक्षण किए गए प्रत्येक अर्क के रंग नियंत्रण के लिए) में 150 μL HEPES बफर और जड़ी बूटी के अर्क के 25 uL शामिल थे। माइक्रो-वेल प्लेट को तब कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद, 100μL सब्सट्रेट N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide,1 mM) जोड़ा गया। फिर प्लेटों को अतिरिक्त 40 मिनट के लिए 25 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, 405 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बायोटेक EL800microplate रीडर) का उपयोग करके अवशोषण को पढ़ा गया था। जड़ी बूटी के अर्क के प्रतिशत निषेध की गणना समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

जहां ए नियंत्रण इलास्टेज और सॉल्वेंट के साथ बफर का अवशोषण है और एटेस्ट बफर, इलास्टेज, और हर्ब एक्सट्रैक्ट या एन-मेथॉक्सीसुकिनिल-अला-अला-प्रो-क्लोरो का अवशोषण है।

3.9. Collagenase निषेध परख

मैड्रोन एट अल द्वारा संशोधनों के साथ वैन-वार्ट और स्टीनब्रिंक [111] (1981) की विधि के बाद कोलेजनेज़ निषेध गतिविधि आयोजित की गई थी। [92]. परीक्षण 50 मिमी टीईएस बफर (पीएच7.4 0.36 मिमी CaCl2 के साथ) में लागू किया गया था। क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकम (ChC-EC.3.4.23.3) से कोलेजनेज़ एंजाइम 0.8 यूनिट/एमएल (टीईएस बफर स्टॉक समाधान में भंग) की एकाग्रता पर तैयार किया गया था। सिंथेटिक सब्सट्रेट N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) TES बफर स्टॉक सॉल्यूशन में 2 mM की सांद्रता में तैयार किया गया था। अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए 15 0 μL की कुल मात्रा में 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA 0.8 मिमी FALGPA अंतिम एकाग्रता）, 18.7 μL कोलेजनेज़ एंजाइम （0.1 इकाइयों/एमएल अंतिम एकाग्रता）, और 25μL जड़ी बूटी के अर्क शामिल थे। 100 ug/mL）. टीईएस बफर में जड़ी बूटी के अर्क और एंजाइम को रासायनिक प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए सब्सट्रेट जोड़ने से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया था। टीईएस बफर के साथ नकारात्मक नियंत्रण किया गया। सब्सट्रेट जोड़ने के बाद, 96 अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों में स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बेंचमार्क प्लस माइक्रोप्लेट, बायो-रेड 170-6930, बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके अवशोषण को तुरंत 340 एनएम पर पढ़ा गया और लगातार दूसरे के लिए मापा गया। बीस मिनट। 12.5ug/mL पर एपिगैलोकैटेचिन गैलेट (ईजीसीजी) का उपयोग करके सकारात्मक नियंत्रण किया गया। नमूनों के प्रतिशत निषेध की गणना निम्न प्रकार से समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

जहां ए नियंत्रण टीईएस बफर का अवशोषण है और एटेस्ट टीईएस बफर, कोलेजनेज एंजाइम, और पौधे निकालने या FALGPA का अवशोषण है।

3.10. 'एच-एनएमआर मापन' का उपयोग करके मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग

चयनित जड़ी बूटियों के एच-एनएमआर का उपयोग करके मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग किम एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर की गई थी। [47] थोड़े संशोधनों के साथ। कच्चे जड़ी बूटी के अर्क (25mg) को एक mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था। दाओ (पीएच 6.0) में मेथनॉल-डी4 और केएचपीओ4 बफर का मिश्रण जिसमें 0.1 प्रतिशत ट्राइमेथिल सिलीप्रोपियोनिक एसिड सोडियम नमक (टीएसपी) होता है, को जड़ी-बूटी के नमूनों में { {10}}.7mL (1:1)अनुपात पर। जड़ी-बूटियों के अर्क वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए भंवर में डाल दिया गया और उसके बाद 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिकेशन किया गया। फिर, मिश्रण को 1 0 मिनट के लिए 5678 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया ताकि सतह पर तैरनेवाला किसी भी अघुलनशील सामग्री से अलग हो सके। इसके बाद, 0.6mL स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला NMR ट्यूबों में शामिल किया गया और 'H-NMR विश्लेषण' के अधीन किया गया। 'H-NMR' का विश्लेषण 500 मेगाहर्ट्ज वेरियन इनोवा एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर (वेरियन इंक, पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए) के माध्यम से पूरा किया गया था, जो 499.887 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति पर संचालित होता था और स्पेक्ट्रा 26 डिग्री पर दर्ज किया गया था। प्रत्येक एकल स्पेक्ट्रम में 3.53 मिनट के अधिग्रहण समय और 20 पीपीएम की चौड़ाई के साथ 64 स्कैन शामिल थे। डेटा का विश्लेषण चेनोमक्स सॉफ़्टवेयर (v.6.2) (Clhenomx Inc, एडमोंटन, AB, कनाडा) का उपयोग करके किया गया था ताकि एक सुसंगत सेटिंग के साथ चरणबद्ध और आधारभूत सुधार किया जा सके। SIMCA सॉफ्टवेयर (संस्करण 13.0, यूमेट्रिक्स, उमिया, स्वीडन) का उपयोग करके बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण किया गया था। 3.11. 'एच-एनएमआर स्पेक्ट्रा' की बकेटिंग

बकेटिंगऑफ एच-एनएमआर स्पेक्ट्रा को चेनोमक्ससॉफ्टवेयर (v.6.2, एडमोंटन, एबी, कनाडा) का उपयोग करके लागू किया गया था। सभी स्पेक्ट्रा 0। 5-10। 0 पीपीआरएन क्षेत्र से समान पैरामीटर वाले थे। मापदंडों में 0.04 की वर्णक्रमीय चौड़ाई शामिल थी जिसने प्रत्येक एनएमआर स्पेक्ट्रम के लिए कुल 245 एकीकृत क्षेत्र प्राप्त किए। पानी और अवशिष्ट मेथनॉल-डी के लिए रासायनिक बदलाव क्रमशः 4.70-4.90 और δ3.27-3.35 पर समाप्त हो गए। यूनिफ़ॉर्म बिन्ड डेटा को तब बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण (एमवीडीए) के अधीन किया गया था।

3.12. मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष मात्रा का ठहराव

पहचाने गए मेटाबोलाइट्स की उनके सापेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए जांच की गई थी, जिसकी गणना एलएच-एनएमआर स्पेक्ट्रा के बाइनिंग के बाद संकेतों के औसत शिखर क्षेत्र के आधार पर की गई थी।

3.13. सांख्यिकीय विश्लेषण

छह प्रतिकृति के सभी परिणामों को ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया था। कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों के मापन के लिए, इलास्टेज और कोलेजनेज़ गतिविधियों का निषेध, और मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष मात्रा का ठहराव, मिनिटैब 16 (संस्करण 16, मिनिटैब इंक।, स्टेट कॉलेज, पीए, यूएसए) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। पी के साथ साधनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की जांच के लिए विचरण (एनोवा) का विश्लेषण लागू किया गया था<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4। निष्कर्ष

एमवीडीए के साथ एच-एनएमआर विश्लेषण का प्रयोग चयनित जड़ी-बूटियों के चयापचयों में भिन्नता की जांच करने में सफल रहा। पीसीए स्कोर प्लॉट ने जड़ी-बूटियों को उनके समूहों के अनुसार अलग-अलग अलग दिखाया। इस अध्ययन से पता चला कि पी. माइनस में डीपीपीएच और एबीटीएस एसेज़ के माध्यम से उच्चतम कट्टरपंथी मैला ढोने का प्रभाव था और उच्चतम एंटी-एजिंग गतिविधियों का प्रदर्शन किया। पीएलएस विश्लेषण के दो बायप्लॉट ने इस परिणाम को और अधिक मान्य किया, क्योंकि पी। माइनस में पहचाने गए मेटाबोलाइट्स और परीक्षण किए गए बायोएक्टीविटी के बीच एक मजबूत संबंध पाया गया था। माना जाता है कि सक्रिय मेटाबोलाइट्स कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों में योगदान करते हैं और पी.मिनस के एंटी-एजिंग गुणों में क्वेरसेटिन, क्वेरसेटिन -3- ओ-रम्नोसाइड, मायरिकेटिन डेरिवेटिव, कैटेचिन, आइसोरामनेटिन, एस्ट्रैगैलिन और एपिजेनिन शामिल हैं। इसलिए, यह माना जा सकता है कि ये मेटाबोलाइट्स शक्तिशाली कट्टरपंथी मैला ढोने के प्रभाव और पी। माइनस के उच्च विरोधी उम्र बढ़ने के गुणों के लिए जिम्मेदार थे। ये मेटाबोलाइट्स मुख्य रूप से फ्लेवोनोइड्स समूह से थे, विशेष रूप से फ्लेवोनोल्स में। इसलिए, यह सुझाव दिया जा सकता है कि पी। माइनस से मेटाबोलाइट्स एक आशाजनक मुक्त कट्टरपंथी उन्मूलन और उम्र बढ़ने वाले एंजाइम अवरोधक हो सकते हैं जिनका उपयोग उम्र बढ़ने के लक्षणों में देरी और उम्र बढ़ने से जुड़ी पुरानी बीमारियों के उपचार के लिए किया जा सकता है। ये निष्कर्ष एंटी-एजिंग एजेंटों के संभावित प्राकृतिक स्रोत के रूप में और एक प्राकृतिक मुक्त कट्टरपंथी उन्मूलन के रूप में पी। माइनस की शक्ति को स्थापित करने में सहायता करेंगे।

यह लेख अणु 2019, 24, 3208 से निकाला गया है; डीओआई:10.3390/अणु 24173208 www.mdpi.com/journal/molecules