भाग 1: एक्टोसाइड काउंटरैक्ट्स इंटरल्यूकिन-1 -मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज और एनएफκबी सेलुलर सिग्नलिंग पाथवे के मॉड्यूलेशन के माध्यम से प्रेरित कैटाबोलिक प्रक्रियाएं

एक्टियोसाइड काउंटरैक्ट्स इंटरल्यूकिन-1 -मिटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज और एनएफκबी सेल्युलर सिग्नलिंग पाथवे के मॉड्यूलेशन के माध्यम से कैटाबोलिक प्रक्रियाओं को प्रेरित करता है

हयांगी लिम, 1 दो क्यूंग किम, 1 ताए-ह्योन किम, 1 क्योंग-रोक कांग, 1 जियोंग-येओन सेओ, 1,2 सेउंग सिक चो, 3 यंगही यूं, 4,5 ये-योंग चोई, 4,5 जुंगटे लीम , 4,5 ह्युन-वू किम, 6 जियोन-उंग जो, 6

चान-जिन ओह, 6 ड्यूक-सिल ओह, 6 हांग-सुंग चुन, 2 और जे-सुंग किम 1

संपर्क करना:joanna.jia@wecistanche.com

1 दंत विज्ञान संस्थान, चोसुन विश्वविद्यालय, ग्वांगजू 61452, कोरिया गणराज्य

2बायोमेडिकल साइंस विभाग, चोसुन विश्वविद्यालय, ग्वांगजू 61452, कोरिया गणराज्य

3 बायोमेडिसिन, स्वास्थ्य और जीवन अभिसरण विज्ञान विभाग, बीके 21 फोर, फार्मेसी कॉलेज, मोकपो नेशनल यूनिवर्सिटी,

जोन्नम 58554, कोरिया गणराज्य

4चुंग-येओन मेडिकल इंस्टीट्यूट, ग्वांगजू 61949, कोरिया गणराज्य

5अनुसंधान और विकास संस्थान, सीवाई फार्मा कं, सियोल 06224, कोरिया गणराज्य

6Jeollanamdo वन संसाधन संस्थान, Naju, Jeollanamdo, 58213, कोरिया गणराज्य

जे-सुंग किम को पत्राचार किया जाना चाहिए; जेएस_kim@chosun.ac.kr

2 जुलाई 2020 को प्राप्त हुआ; संशोधित 15 फरवरी 2021; स्वीकृत 6 मार्च 2021; 25 मार्च 2021 को प्रकाशित

अकादमिक संपादक: जोएल आर ड्रेवेट

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गुर्दे की बीमारी का इलाज कर सकता है सिस्टैन्च गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार

ऑस्टियोआर्थराइटिस (OA) श्लेष जोड़ों में आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन के कारण पुराने जोड़ों के दर्द के साथ सबसे आम अपक्षयी संयुक्त रोग है।एक्टियोसाइड, एक ca-eoylphenylethanoid ग्लाइकोसाइड, में विभिन्न जैविक गतिविधियाँ होती हैं जैसे कि रोगाणुरोधी, एंटी-इन-एम्मेटरी, एंटीकैंसर, एंटीऑक्सिडेंट, साइटोप्रोटेक्टिव और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव। इसके अलावा, का मौखिक प्रशासनएक्टोसाइडएक उच्च खुराक पर जीनोटॉक्सिसिटी का कारण नहीं बनता है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य के एंटीकाटाबोलिक प्रभावों को सत्यापित करना हैएक्टोसाइडऑस्टियोआर्थराइटिस और इसके एंटीकाटाबोलिक सिग्नलिंग मार्ग के खिलाफ।एक्टियोसाइडसामान्य कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स के रूप में उपयोग किए जाने वाले माउस broblast L929 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम नहीं किया।एक्टियोसाइडमैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज- (एमएमपी-) 13, एमएमपी-1, और एमएमपी जैसे कार्टिलेज-डिग्रेडिंग एंजाइमों की अभिव्यक्ति और सक्रियण को दबाकर चोंड्रोसाइट्स और आर्टिकुलर कार्टिलेज में आईएल -1 - प्रेरित प्रोटीयोग्लाइकेन नुकसान का प्रतिकार किया। {{ 6}}. आगे,एक्टोसाइडइंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़, साइक्लोऑक्सीजिनेज-2, नाइट्रिक ऑक्साइड, और प्रोस्टाग्लैंडीन E2 जैसे इन-एम्मेटरी मध्यस्थों की अभिव्यक्ति को प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में IL-1 से उपचारित किया गया। इसके बाद, प्रोइन-एम्मेटरी साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति में कमी आईएक्टोसाइडप्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में आईएल -1 के साथ इलाज किया जाता है। इसके अलावा, एक्टोसाइड ने आईएल -1 के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में न केवल माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस के फॉस्फोराइलेशन को दबा दिया, बल्कि इसके फॉस्फोराइलेशन के दमन के माध्यम से साइटोसोल से न्यूक्लियस में एनएफκबी का अनुवाद भी किया। 5 और 10 मिलीग्राम / किग्रा एक्टियोसाइड के मौखिक प्रशासन ने औसत दर्जे का मेनिस्कस की अस्थिरता से उत्पन्न ऑस्टियोआर्थराइटिक माउस मॉडल में आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन को क्षीण कर दिया। हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि एक्टोसाइड एक संभावित संभावित एंटीकाटाबोलिक एजेंट या पूरक है जो आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन को कम करने या रोकने के लिए पूरक है।

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1 परिचय

ऑस्टियोआर्थराइटिस (OA) श्लेष जोड़ों में आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन के कारण पुराने जोड़ों के दर्द के साथ सबसे आम अपक्षयी संयुक्त रोग है [1]।

जीवन प्रत्याशा में वृद्धि के कारण, गतिशीलता के नुकसान के साथ ओए की व्यापकता और श्लेष जोड़ों में आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन के कारण पुराने जोड़ों का दर्द रजोनिवृत्ति के बाद और पुरुषों में क्रमशः 18 प्रतिशत और 9.6 प्रतिशत महिलाओं में होने का अनुमान है। ]. हालाँकि OA का विश्वव्यापी प्रचलन सालाना बढ़ता है, OA का पैथोफिज़ियोलॉजिकल एटियलजि अभी भी अज्ञात है। यह उम्र बढ़ने, लिंग, आनुवंशिक विरासत, दर्दनाक संयुक्त चोट, और गंभीर यांत्रिक संयुक्त भार जैसे बहुत जटिल और बहुक्रियात्मक जोखिम कारकों के कारण हो सकता है। इसके अलावा, आर्टिकुलर कार्टिलेज के प्रगतिशील अध: पतन और पुराने जोड़ों के दर्द के विकास के बीच न्यूरोपैथोलॉजिकल संबंध अज्ञात हैं [3]। इसलिए, ओए के रोगियों के लिए नैदानिक ​​प्रबंधन का लक्ष्य पुराने जोड़ों के दर्द से राहत के माध्यम से, औषधीय और गैर-औषधीय दृष्टिकोण और संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी का उपयोग करके शरीर की गतिशीलता और यांत्रिक संयुक्त कार्य को बनाए रखना है। बुजुर्ग आबादी में यांत्रिक संयुक्त कार्य के रखरखाव के माध्यम से जीवन की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए OA को रोकने या क्षीण करने के लिए दीर्घकालिक जैविक सुरक्षा के साथ प्रभावी हस्तक्षेप या पूरकता के विकास की मांग बढ़ रही है।

जैसा कि चित्र एक में दिखाया गया है,एक्टोसाइड(सीएएस नंबर 61276-17-3; C29H36O15) कई हर्बल पौधों जैसे वर्बास्कम क्लोराइड [4], बुडलेजा ग्लोबोसा [5], और प्लांटैगो ऑस्ट्रेलिस [6] से अलग किया गया एक कैओइलफेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड है। एक्टिओइड में विभिन्न जैविक गतिविधियाँ होती हैं जैसे कि रोगाणुरोधी [5], विरोधी भड़काऊ [7], एंटीकैंसर [8], एंटीऑक्सिडेंट [9], साइटोप्रोटेक्टिव [9], और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव [10]। इसके अलावा, का मौखिक प्रशासनएक्टोसाइडउच्च खुराक पर जीनोटॉक्सिसिटी का कारण नहीं बनता है [11]।

इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि एंटी-इंफ्लेमेटरी बायोलॉजिकल सेफ्टी वाले एक्टोसाइड में एंटीकैटोबोलिक प्रभाव होते हैं, जो आर्टिकुलर कार्टिलेज के संरक्षण से जुड़े होते हैं, जो कि प्रोइन-एम्मेटरी साइटोकिन्स, इन-एम्मेटरी मध्यस्थों और सिनोवियल जोड़ों में कार्टिलेज-डिग्रेडिंग एंजाइम जैसे कैटोबोलिक कारकों के दमन के माध्यम से आर्टिकुलर कार्टिलेज के संरक्षण से जुड़ा होता है। . इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य जांच करना थाएक्टोसाइड-चूहे के घुटने के जोड़ के आर्टिकुलर कार्टिलेज से पृथक प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स का उपयोग करते हुए, और विवो में, चूहों के घुटने के जोड़ में औसत दर्जे के मेनिस्कस के सर्जिकल अस्थिरता द्वारा उत्पन्न OA पशु मॉडल का उपयोग करते हुए, इन विट्रो में प्रेरित एंटीकाटाबोलिक प्रभाव और इसके सेलुलर सिग्नलिंग मार्ग।

एक्टोसाइडमेंसिस्टैंचेकर सकते हैंसुधारेंरोग प्रतिरोधक शक्ति

2. तरीके

2.1. कोश पालन।

प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को संस्थागत द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल (CIA-CUC2019-A0027) के अनुसार चूहे (5-दिन पुराना; Sprague-Dawley) घुटने के जोड़ों के आर्टिकुलर कार्टिलेज से अलग किया गया था। चोसुन विश्वविद्यालय, ग्वांगजू, कोरिया गणराज्य की पशु देखभाल और उपयोग समिति। डल्बेको के मोदी-एड ईगल मीडियम/न्यूट्रिएंट मिक्सचर एफ-12 (डीएमईएम/एफ12) (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) में पृथक प्राथमिक चूहा चोंड्रोसाइट्स बनाए रखा गया था, जो 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ पूरक था। , ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए), एंटीबायोटिक्स (50U/mL पेनिसिलिन और 50ug/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन), और 50ug/mL एस्कॉर्बिक एसिड। सामान्य माउस broblast L-929 सेल लाइन अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC) से खरीदी गई थी। एटीसीसी से प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार, एल -929 कोशिकाओं को ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम में संवर्धित किया गया था, जिसमें 10 प्रतिशत एफबीएस था, और 5 प्रतिशत सीओ2 के साथ 37 डिग्री पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में उगाए गए थे।

2.2. सेल व्यवहार्यता परख।

डाइमिथाइल थियाज़ोलिल डिपेनिल टेट्राजोलियम साल्ट (एमटीटी) परख एक सामान्य सेल के रूप में उपयोग किए जाने वाले माउस broblast सेल लाइन L929 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया गया था और एक्टियोसाइड के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स। ब्रीfly, L929 कोशिकाओं, और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को 24 घंटे के लिए संस्कृति प्लेटों में 8 × 105 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व पर सुसंस्कृत किया गया और फिर 2.5, 5, 10, 25, 50 और 100μM के साथ इलाज किया गया।एक्टोसाइड24 घंटे के लिए। MTT समाधान के साथ उपचार के बाद, L929 कोशिकाओं और चोंड्रोसाइट्स दोनों को 4 घंटे के लिए और सुसंस्कृत किया गया। ऊष्मायन के बाद, गठित एमटीटी क्रिस्टल को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड में पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया था और सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक स्पेक्ट्रोमीटर (एपोच माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, बायोटेक®, वीनोस्की, वीटी, यूएसए) का उपयोग करके 570nm पर अवशोषण के लिए मापा गया था।

2.3. सेल लाइव / डेड परख।

सेल लाइव / डेड परख किट (आणविक जांच, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके सेल अस्तित्व का प्रदर्शन किया गया था, जो कि जीवित कोशिकाओं को लेबल करने के लिए हरे कैल्सिन-एएम से बना है (हरे रंग की प्रतिदीप्ति के साथ) और एथिडियम होमोडीमर -1 मृत लेबल करने के लिए कोशिकाएं (लाल प्रतिदीप्ति के साथ)। संक्षेप में, L929 कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स दोनों को 24 घंटे के लिए चैम्बर स्लाइड्स (Nunc® Lab-Tek® चैंबर स्लाइड ™ सिस्टम; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क KGaA) पर 8 × 105 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व पर सुसंस्कृत किया गया और फिर इसके साथ इलाज किया गया। 24 घंटे के लिए 50 और 100μM एक्टोसाइड। खेती के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सेल सर्वाइवल परख की गई। इसके बाद, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (ग्रहण TE200; निकॉन इंस्ट्रूमेंट्स, मेलविले, एनवाई) का उपयोग करके दाग वाली कोशिकाओं की नकल की गई।

2.4. डाइमिथाइलमेथिलीन ब्लू (DMMB) परख।

आईएल -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 21 दिनों के लिए एक्टियोसाइड के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में प्रोटीयोग्लाइकेन सामग्री के परिवर्तन का आकलन करने के लिए डीएमएमबी परख की गई थी। 21 दिनों के लिए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स की विशेषताओं को बनाए रखने के लिए, प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स (2 × 106 कोशिकाओं) को 1.2 प्रतिशत एल्गिनेट के 1mL में निलंबित कर दिया गया था और फिर 105mM CaCl2 के समाधान के लिए सेल / एल्गिनेट निलंबन को टपकाकर इनकैप्सुलेट किया गया था। एल्गिनेट में एनकैप्सुलेटेड प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को 24 घंटे के लिए DMEM/F12 (10 प्रतिशत FBS, 50U/mL पेनिसिलिन, 50ug/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 50ug/mL एस्कॉर्बिक एसिड युक्त) के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर DMEM/F12 में 24 घंटे के लिए अनुकूलित किया गया था जिसमें 1 प्रतिशत था। मिनी-इंसुलिन-ट्रांसफेरिन-सेलेनियम (मिनी-आईटीएस) और 50ug/mL एस्कॉर्बिक एसिड। इसके बाद, चोंड्रोसाइट्स का इलाज 50 या 100μM . के साथ किया गयाएक्टोसाइड21 दिनों के लिए 1ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। 21 वें दिन, प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को डीएमएमबी परख का उपयोग करके प्रोटीओग्लिकैन सामग्री के मूल्यांकन के लिए एकत्र किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित है [12]। इसके अलावा, प्रति सेल प्रोटीओग्लिकैन सामग्री की मात्रा निर्धारित करने और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स के प्रसार का आकलन करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, पिकोग्रीन (आणविक जांच, कार्ल्सबैड, सीए) का उपयोग करके डीएनए परख द्वारा सेल नंबरों को मापा गया। 7 दिनों के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति। संस्कृति अवधि के अंत में, नमूने एकत्र किए गए थे और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए 72 घंटे के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किए गए थे।

2.6. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण।

7 दिनों के लिए 10ng / mL IL -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किए गए आर्टिकुलर कार्टिलेज में प्रोटीओग्लिकैन नुकसान को सत्यापित करने के लिए सफारी-ओ और फास्ट ग्रीन स्टेनिंग का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण किया गया था। ब्रीफ, फिक्स्ड आर्टिकुलर कार्टिलेज के नमूनों को एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड में डीकैल्सीड किया गया और फिर पैराएन में एम्बेड किया गया। इसके बाद, आर्टिकुलर कार्टिलेज वाले तैयार पैराएन ब्लॉकों को क्रमिक रूप से 5μm मोटाई में काटा गया और स्लाइड्स पर रखा गया। बाद में आर्टिकुलर कार्टिलेज ग्राउंड पदार्थ में प्रोटियोग्लाइकन नुकसान का आकलन करने के लिए Safranin-O और फास्ट ग्रीन स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया। इसके अलावा, हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधला हो जाना आर्टिकुलर कार्टिलेज की सामान्य आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए किया गया था।

2.7. पश्चिमी सोख्ता।

MMP-13, MMP-1, MMP-3, इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (iNOS), और साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 (COX सहित) कैटोबोलिक कारकों की अभिव्यक्ति की जांच के लिए पश्चिमी सोख्ता किया गया था। -2) और सेल्युलर सिग्नलिंग मॉलिक्यूल्स जैसे माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेसेस और न्यूक्लियर फैक्टर-कप्पा बी (NFκB) में बदलाव। 24 घंटे के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ब्रीसी, चूहे के प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स का 50 या 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, चूहे के प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाइसिस ब्यूर (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए) का उपयोग करके लाइस किया गया। इसके अलावा, NFκB के परमाणु अनुवाद को सत्यापित करने के लिए, चूहे के प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स को 24 घंटे के लिए 10ng / mL IL -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 50 या 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार NE-PER™ न्यूक्लियर और साइटोप्लाज्मिक निष्कर्षण अभिकर्मकों (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके साइटोसोलिक और परमाणु अंश निकाले गए। प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स से निकाले गए कुल प्रोटीन की सांद्रता निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बाइसीनोनिक एसिड प्रोटीन परख किट (थर्मो साइंटिfic, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, चोंड्रोसाइट्स से स्रावित कार्टिलेज-डिग्रेडिंग एंजाइम के स्तर का पता लगाने के लिए वातानुकूलित माध्यम एकत्र किया गया था। प्रोटीन और वातानुकूलित माध्यम की समान मात्रा को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) पर इलेक्ट्रोफोर किया गया और फिर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया। इसके बाद, एमएमपी -13, एमएमपी -1, एमएमपी -3, आईएनओएस, सीओएक्स -2, फॉस्फो-ईआरके 1/2, कुल के खिलाफ लक्षित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता का प्रदर्शन किया गया। -ERK1/2, फॉस्फो-पी38, टोटल-पी38, फॉस्फो-जेएनके, टोटल जेएनके, फॉस्फो-एनएफκबी, टोटल एनएफκबी, -एक्टिन, और लैमिन बी। इम्मुनोरिएक्टिव बैंड्स को एक एन्हांस्ड केमिलुमिनेसिसेंस सिस्टम (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड) का उपयोग करके देखा गया। , आईएल, यूएसए) निर्माता के निर्देश के अनुसार और फिर एक माइक्रोकेमी डिवाइस (डीएनआर बायोइमेजिंग सिस्टम, जेरूसलम, इज़राइल) द्वारा इमेज किया गया।

2.8. क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) और क्वांटिटेटिव रियल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर)।

प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स का इलाज 50 या 100μM . के साथ किया गया थाएक्टोसाइड24 घंटे के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) का उपयोग करके कुल RNA को प्राथमिक चूहे के चोंड्रोसाइट्स से अलग कर दिया गया। कुल आरएनए एकाग्रता को नैनोड्रॉप 2000 (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार थर्मोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पीसीआर सिस्टम (इनविट्रोजेन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके 1ug आरएनए को रिवर्स ट्रांसकोड किया गया था। सीडीएनए का qPCR 2 × TOPsimple ™ DyeMIX-Taq (एंजाइमिक्स, सियोल, कोरिया गणराज्य) और एक TaKaRa PCR थर्मल साइक्लर डिवाइस (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) पर विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके किया गया था। इसके बाद, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए पीसीआर उत्पादों को एक agarose जेल पर इलेक्ट्रोफोर किया गया। ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) का उपयोग अंतर्जात नियंत्रण के रूप में किया गया था। इसके अलावा, क्यूआरटी-पीसीआर के लिए, सीडीएनए को एक इको ™ रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (इल्यूमिन इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके बढ़ाया गया था। -एक्टिन का उपयोग अंतर्जात नियंत्रण के रूप में किया गया था। QPCR और qRT-PCR में प्रयुक्त प्राइमरों के अनुक्रमों को क्रमशः तालिका 1 और 2 में संक्षेपित किया गया है।

2.9. जिलेटिन जिमोग्राफी।

प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में एमएमपी की सक्रियता का आकलन करने के लिए जिलेटिन ज्योग्राफी का प्रदर्शन किया गया। संक्षिप्त, प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स का उपचार 5 0 या 1 0 0 μM एक्टोसाइड के साथ 24 घंटे के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया था। इसके बाद, वातानुकूलित माध्यम की एक समान मात्रा को 10 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर 0.2 प्रतिशत (1 मिलीग्राम / एमएल) पोर्सिन त्वचा जिलेटिन के साथ कोपोलिमराइज़ किया गया था। वैद्युतकणसंचलन के बाद, जेल को ज़ीमोग्राम रेनेट्यूरिंग ब्यूर (50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl, और 0.05 प्रतिशत ब्रिज -35) में 72 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया था। एमएमपी के पुनर्विकास के बाद, जेल को 0.1 प्रतिशत Coomassie Brilliant Blue R250 के साथ दाग दिया गया था। जिलेटिनोलिटिक बैंड को एक समान रूप से हल्के नीले रंग की पृष्ठभूमि पर स्पष्ट बैंड के रूप में प्रकट किया गया था और फिर एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

2.10. नाइट्रिक ऑक्साइड का मापन (NO)।

24 घंटे के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स का 50 या 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, वातानुकूलित माध्यम के 50μL को 50μL प्रत्येक सल्फानिलमाइड और N-1-नैफ्थाइल एथिलीनडायमाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड के साथ प्रतिक्रिया दी गई थी। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एपोच स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, बायोटेक, विनोस्की, वीटी, यूएसए) का उपयोग करके अवशोषण को तब 540nm तरंग दैर्ध्य पर मापा गया था।

2.11. प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2) परख।

प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स का इलाज 50 या 100μM . के साथ किया गया थाएक्टोसाइड24 घंटे के लिए 10ng/mL IL-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार PGE2 सांद्रता को PGE2 पैरामीटर परख किट (R&D Systems Inc., मिनियापोलिस, MN, USA) का उपयोग करके मापा गया।

2.12. साइटोकाइन सरणी।

प्राथमिक चूहे के चोंड्रोसाइट्स को 24 घंटे के लिए 10ng / mL IL -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 50μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, पहले वर्णित [13] के रूप में कुल प्रोटीन निकाले गए और परिमाणित किए गए। इसके बाद, निर्माता के निर्देशों (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) के अनुसार साइटोकाइन उत्पादन में परिवर्तन की जांच के लिए एक साइटोकिन सरणी का प्रदर्शन किया गया।

2.13. परमाणु अनुवाद परख।

प्राथमिक चूहा चोंड्रोसाइट्स का इलाज 50 और 100ug/mL . के साथ किया गया थाएक्टोसाइड10एनजी/एमएल आईएल-1 की उपस्थिति में। 30 मिनट के बाद, प्राथमिक चूहे के चोंड्रोसाइट्स को 1 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था, 0.2 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 में पारगम्य किया गया था, और बड़े पैमाने पर फॉस्फेट-बर्ड खारा से धोया गया था। सामान्य बकरी सीरम का उपयोग करके गैर-विशिष्ट संकेतों को अवरुद्ध कर दिया गया था। कई धोने के बाद, चोंड्रोसाइट्स को खरगोश विरोधी NFκB एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद FITC-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश IgG (थर्मो फिशर साइंटिc, Waltham, MA, USA) के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, कोरिया बेसिक साइंस इंस्टीट्यूट (ग्वांगजू, कोरिया गणराज्य) की ग्वांगजू शाखा में एक लेजर कन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप सिस्टम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके दाग वाली कोशिकाओं की नकल की गई।

2.14. ऑस्टियोआर्थराइटिक जानवरों की पीढ़ी।

ऑस्टियोआर्थराइटिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए, औसत दर्जे का मेनिस्कस (DMM) IACUC दिशानिर्देशों (CIACUC {{4} के अनुसार BALB / c चूहों (औसत शरीर के वजन 19:3 ± 0: 5g) के घुटने के जोड़ों में शल्य चिकित्सा द्वारा अस्थिर किया गया था। }ए0029)। OA- प्रेरित जानवरों को 5 प्रतिशत इथेनॉल (प्रायोगिक समूह; n =5) या वाहन (5 प्रतिशत इथेनॉल) (DMM समूह; n =5) में हल किए गए 5 और 10 मिलीग्राम / किग्रा एक्टियोसाइड के साथ मौखिक रूप से इलाज किया गया था। दूसरे दिन 8 सप्ताह के लिए। संस्कृति अवधि के अंत में, घुटने के जोड़ों को विच्छेदित किया गया और हिस्टोलॉजिकल आकलन करने के लिए 7 दिनों के लिए 5 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके तय किया गया। मैनकिन ग्रेड [14, 15] के अनुसार आर्टिकुलर कार्टिलेज के सफारी-ओ और तेजी से हरे रंग के धुंधला होने वाले ऊतकों की जांच की गई।

2.15. सांख्यिकीय विश्लेषण।

प्रायोगिक डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और विचरण के विश्लेषण का उपयोग करके तुलना की जाती है, इसके बाद SPSS सॉफ़्टवेयर संस्करण 25 (IBM Corp.) का उपयोग करके पोस्ट हॉक मल्टीपल तुलना (Tukey's test) किया जाता है। पशु अध्ययन को छोड़कर सभी डेटा प्राप्त किए गए थे। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से।

एक्टोसाइडमेंसिस्टैंचे

3। परिणाम

3.1. Acteoside L929 सेल और प्राथमिक चूहा चोंड्रोसाइट व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है।

सामान्य कोशिकाओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले माउस broblast सेल लाइन L929 को 2.5, 5, 10, 25, 50, और 24 घंटे के लिए 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, L929 कोशिकाओं पर एक्टोसाइड की साइटोटोक्सिसिटी का आकलन करने के लिए MTT परख की गई। जैसा कि चित्र 2(a) में दिखाया गया है, L929 कोशिकाओं की सापेक्ष व्यवहार्यता 94:8±8 प्रतिशत, 93:6±7 प्रतिशत, 100 ± 5 प्रतिशत, 103:9±5 प्रतिशत, 126:1±8 प्रतिशत निर्धारित की गई थी। , और 122:7 ± 4 प्रतिशत 2.5, 5, 10, 25, 50, और 100μM एक्टोसाइड पर, क्रमशः नियंत्रण (100:02 ± 3 प्रतिशत) की तुलना में। इसके अलावा, प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स पर एक्टोसाइड की साइटोटोक्सिसिटी को सत्यापित करने के लिए, एमटीटी परख को चित्र 2 (बी) में दिखाया गया था। 2.5, 5, 10, 25, 50, और 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स की व्यवहार्यता 114 ± 4 प्रतिशत, 117:8 ± 6 प्रतिशत, 123: 9 ± 5 प्रतिशत, 132: 6 ± 4 प्रतिशत के रूप में निर्धारित की गई थी। नियंत्रण (100:4±5 प्रतिशत) की तुलना में क्रमशः 153:1±7 प्रतिशत और 142:1±6 प्रतिशत। इसके अलावा, L929 कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स दोनों की व्यवहार्यता पर एक्टोसाइड के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, एक सेल लाइव / डेड परख किया गया था जैसा कि चित्र 2 (सी) में दिखाया गया है। लाल प्रतिदीप्ति के रूप में दागी गई मृत कोशिकाओं की संख्या L929 कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स दोनों के लिए 50 और 100μM एक्टोसाइड के साथ 24 घंटे के लिए इलाज नहीं हुई। इन आंकड़ों ने लगातार प्रदर्शित किया कि निर्धारित खुराकएक्टोसाइडL929 कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया। इस प्रकार, 50μM एक्टोसाइड और 100μM एक्टोसाइड, जो L929 कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स दोनों में गैर-विषैले खुराक हैं, का उपयोग प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स का उपयोग करके इन विट्रो अध्ययनों में इसके एंटीकाटाबोलिक प्रभावों को सत्यापित करने के लिए किया गया था।

3.2. Acteoside प्रतिकार IL-1 -प्राथमिक चूहा चोंड्रोसाइट्स में प्रोटीयोग्लीकैन हानि को प्रेरित करता है।

एल्गिनेट मोतियों में एम्बेडेड प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को 21 दिनों के लिए 1ng / mL IL - 1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 50 और 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, चित्र 3 (ए) में दिखाए गए अनुसार प्रोटीयोग्लीकैन सामग्री में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक डीएमएमबी परख की गई। सापेक्ष प्रोटीयोग्लीकैन सामग्री को 88:3 ± 18:1 प्रतिशत और 86: 8 ± 16:3 प्रतिशत प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में क्रमशः 50 और 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज के रूप में निर्धारित किया गया था, नियंत्रण की तुलना में (103:8 ±) 32:3 प्रतिशत)। यद्यपि एक्टोसाइड द्वारा सापेक्ष प्रोटीयोग्लाइकेन सामग्री को कम किया गया था, ये परिणाम महत्वपूर्ण नहीं थे। हालांकि, 1ng/mL IL-1 के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में सापेक्ष प्रोटीयोग्लाइकेन सामग्री में 37:1±14:7 प्रतिशत की उल्लेखनीय कमी आई है, लेकिन 50 और 100μM एक्टोसाइड महत्वपूर्ण रूप से प्रोटिओग्लाइकेन सामग्री को 57 ± 12:4 तक कम कर दिया है। 1ng/mL IL-1 की उपस्थिति में क्रमशः प्रतिशत और 64 ± 14:5 प्रतिशत। इसके बाद, यह सत्यापित करने के लिए कि क्या एक्टोसाइड आईएल -1 - प्रेरित प्रोटीयोग्लीकैन नुकसान को दबाता है, चूहे के घुटने के जोड़ों से विच्छेदित आर्टिकुलर कार्टिलेज को 10एनजी/एमएल आईएल-1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 7 दिनों के लिए 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। तत्पश्चात, एच एंड ई धुंधला और सफारी-ओ और तेजी से हरे रंग के धुंधला का उपयोग करते हुए हिस्टोलॉजिकल आकलन किया गया जैसा कि चित्र 3 (बी) में दिखाया गया है। एच एंड ई धुंधला का उपयोग करके रूपात्मक परिवर्तन नहीं देखा गया था; हालांकि, सफारी-ओ और तेजी से हरे रंग के धुंधलापन से पता चला है कि लाल रंग के रूप में दागे गए प्रोटीओग्लिकैन ने नियंत्रण में तुलना में 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किए गए आर्टिकुलर कार्टिलेज में बदलाव नहीं किया। हालांकि, आर्टिकुलर कार्टिलेज में 10ng/mLIL-1 द्वारा गंभीर प्रोटीयोग्लाइकेन नुकसान प्रेरित किया गया था, और 100μM एक्टोसाइड ने 10ng/mL IL- 1 के साथ इलाज किए गए आर्टिकुलर कार्टिलेज में प्रोटियोग्लाइकेन नुकसान को काफी हद तक दबा दिया था। सामूहिक रूप से, ये आंकड़े लगातार दिखाते हैं कि एक्टोसाइड में एक एंटीकाटाबोलिक प्रभाव होता है जो आईएल -1 - प्रेरित प्रोटीयोग्लाइकेन नुकसान का प्रतिकार करके आर्टिकुलर कार्टिलेज के अध: पतन को रोकता है।

एक्टोसाइडमेंसिस्टैंचेपर अच्छा प्रभाव पड़ता हैएंटीऑक्सिडेंट

3.3. Acteoside में एक एंटीकाटाबोलिक प्रभाव होता है जो IL के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में MMP अभिव्यक्ति और सक्रियण को दबा देता है -1।

यह जांचने के लिए कि क्या एक्टियोसाइड-प्रेरित एंटीकाटाबोलिक प्रभाव एमएमपी अभिव्यक्ति और सक्रियण के दमन के साथ जुड़ा हुआ है, प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स को 24 घंटे के लिए 10ng / mL IL -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 50 और 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, एमएमपी में परिवर्तन की जांच की गई। जैसा कि चित्र 4 (ए) में दिखाया गया है, हालांकि प्राथमिक चूहे के वातानुकूलित मीडिया में एमएमपी -13, एमएमपी -1, और एमएमपी -3 जैसे कार्टिलेज-डिग्रेडिंग एंजाइमों की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी। चोंड्रोसाइट्स को 10ng/mL IL-1 से उपचारित किया गया, यह कम हो गयाएक्टोसाइडखुराक पर निर्भर तरीके से। इसके अलावा, qPCR (चित्र 4(b)) और qRT-PCR (चित्र 4(c)) दोनों के परिणामों से पता चला है कि IL-1 ने MMP के mRNA स्तर जैसे MMP-13, MMP{ में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की है। {6}}, और एमएमपी-3 प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में। हालांकि, उन्होंने 50 और 100μM एक्टोसाइड के साथ इलाज किए गए प्राथमिक चूहे चोंड्रोसाइट्स में खुराक पर निर्भरता कम कर दी। इसके अलावा, 50 और 100μM एक्टोसाइड ने 10ng/mL IL-1 (चित्र 4(d)) के साथ इलाज किए गए चूहे प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स में MMP की सक्रियता को सक्रिय रूप से दबा दिया। एक साथ लिया गया, ये डेटा लगातार संकेत देते हैं कि एक्टोसाइड में एक एंटीकाटाबोलिक प्रभाव होता है जो उपास्थि-अपमानजनक एंजाइमों की अभिव्यक्ति और सक्रियण को दबा देता है।