भाग 1 एक्टियोसाइड सी-फॉस इंडक्शन और एनएफ-केबी पाथवे को रोककर और आरओएस प्रोडक्शन को कम करके RANKL-मध्यस्थता वाले ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को दबा देता है
Mar 07, 2022
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चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी के क्लिनिकल मेडिसिन के 1 अनुसंधान संस्थान, चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल के बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट, जोंजू, चोनबुक, दक्षिण कोरिया, 2 ऑर्थोडॉन्टिक्स विभाग, ओरल बायोसाइंसेज संस्थान और दंत चिकित्सा संस्थान, चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी, जीनजू, चोनबुक, दक्षिण कोरिया, 3 बायोएक्टिव मैटेरियल साइंसेज विभाग, बायोएक्टिव मैटेरियल्स का रिसर्च सेंटर, चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी, जोंजू, चोनबुक, दक्षिण कोरिया
सार
कई अध्ययनों ने बताया है कि भड़काऊ साइटोकिन्स ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं, जिससे अत्यधिक हड्डियों का पुनर्जीवन और ऑस्टियोपोरोसिस होता है।एक्टोसाइड, का मुख्य सक्रिय यौगिकरहमानिया ग्लूटिनोसापारंपरिक ओरिएंटल चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता होती है। इस अध्ययन में, हमने पाया किएक्टोसाइडन्यूक्लियर फैक्टर-कप्पा (NF-kB) लिगैंड (RANKL) के रिसेप्टर एक्टिवेटर द्वारा उत्तेजित अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (BMM) और RAW264.7 मैक्रोफेज से ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और गठन को स्पष्ट रूप से बाधित किया। एक्टियोसाइड प्रीट्रीटमेंट ने खुराक पर निर्भर तरीके से परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा हड्डियों के पुनर्जीवन को भी रोका।एक्टोसाइड(10 मिमी) ने p38 किनसे, बाह्य संकेत-विनियमित किनेसेस, और c-जून एन-टर्मिनल किनसे के RANKL-उत्तेजित सक्रियण को देखा, और p65 सबयूनिट और अवरोधक kBa के फॉस्फोराइलेशन को रोककर NF-kB सक्रियण को भी दबा दिया। इसके अलावा, सी-फॉस और सक्रिय टी-कोशिकाओं के परमाणु कारक, साइटोप्लाज्मिक 1 (एनएफएटीसी 1) की अभिव्यक्ति में और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए, इंटरल्यूकिन (आईएल)-1बी के उत्पादन में RANKL की मध्यस्थता बढ़ जाती है। , और आईएल -6 स्पष्ट रूप से एक्टोसाइड प्रीट्रीटमेंट द्वारा बाधित थे। इसके अलावा, मौखिकएक्टोसाइडस्तरों को नियंत्रित करने के लिए ओवरीएक्टोमी-प्रेरित हड्डी हानि और भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन को कम किया। हमारा डेटा सुझाव देता है किएक्टोसाइडमाइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस के RANKL- प्रेरित सक्रियण और NF-kB, c-Fos, और NFATc1 जैसे प्रतिलेखन कारकों को दबाकर ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और ऑस्टियोक्लास्टिक अग्रदूतों से परिपक्वता को रोकता है। सामूहिक रूप से, ये परिणाम बताते हैं किएक्टोसाइडऑस्टियोक्लास्ट सक्रियण को अवरुद्ध करके हड्डियों के नुकसान को कम करने के लिए एक एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट के रूप में कार्य कर सकता है।
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परिचय
संतुलित ऑस्टियोक्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट गतिविधि [1] द्वारा हड्डी को लगातार फिर से तैयार किया जाता है। ऑस्टियोक्लास्ट मोनोसाइट/मैक्रोफेज वंश के हेमटोपोइएटिक अग्रदूत कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जबकि ऑस्टियोब्लास्ट मेसेनकाइमल वंश के होते हैं [2]। असामान्य ऑस्टियोक्लास्ट सक्रियण या कम ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस हड्डी के होमियोस्टेसिस को बाधित कर सकता है, अंततः ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया और हड्डी के कैंसर जैसी बीमारियों का कारण बन सकता है [3,4]। ऑस्टियोपोरोसिस एक आम हड्डी की बीमारी है जिससे फ्रैक्चर का खतरा बढ़ जाता है। ऑस्टियोपोरोसिस का सबसे आम रूप रजोनिवृत्त महिलाओं में एस्ट्रोजन की कमी के कारण होता है। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और एंटी-एपिलेप्टिक्स जैसी दवाएं भी हड्डियों के पुनर्जीवन और गठन के बीच असंतुलन का कारण बन सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऑस्टियोपोरोसिस [5] हो सकता है। ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स, कैल्सीटोनिन, एस्ट्रोजन और चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर मॉड्यूलेटर सहित कई एंटी-रिसोरप्टिव इनहिबिटर का उपयोग किया गया है। ये अवरोधक ऑस्टियोक्लास्ट समारोह [6] को रोककर हड्डी के द्रव्यमान को बनाए रखते हैं। पोस्टमेनोपॉज़ल ऑस्टियोपोरोसिस को रोकने और उसका इलाज करने के लिए एस्ट्रोजन रिप्लेसमेंट थेरेपी सबसे लोकप्रिय उपचार है। हालांकि, लंबे समय तक एस्ट्रोजन रिप्लेसमेंट थेरेपी एंडोमेट्रियल और स्तन कैंसर के खतरे को बढ़ा सकती है। इसलिए, कई जांचकर्ताओं ने एक नया एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट विकसित करने के अपने प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया है जिसका कोई साइड इफेक्ट नहीं है [7-10]। क्योंकि अस्थिशोषक अस्थि पुनर्जीवन में कार्य करते हैं, विशेष रूप से अस्थिशोषकों को रोकना कई अध्ययनों में मुख्य लक्ष्य माना गया है। ऑस्टियोक्लास्ट बहु-केंद्रीय विशाल कोशिकाएं हैं जो मोनोसाइट/मैक्रोफेज परिवार के मोनोन्यूक्लियर पूर्वजों द्वारा हेमटोपोइएटिक अग्रदूत कोशिकाओं [11] के अनुक्रमिक प्रसार, भेदभाव और संलयन के माध्यम से बनाई गई हैं। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक (एनएफ) के रिसेप्टर एक्टिवेटर (एनएफ) -केबी (आरएएनके) लिगैंड (आरएएनकेएल) ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव के लिए आवश्यक कारक हैं [12]। इसके अलावा, कई भड़काऊ साइटोकिन्स, जैसे कि ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF) और इंटरल्यूकिन (IL) -1 b, RANKL, ऑस्टियोप्रोटीन और M-CSF [7,13] के प्रेरण को संशोधित करके ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस में योगदान करते हैं। सेल-सतह के लिए RANKL बाइंडिंग RANK रिसेप्टर का परिणाम RANKL/RANK/TNFR . होता है
संबद्ध कारक (TRAF) कॉम्प्लेक्स जो क्रमिक रूप से NFkB और माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेसेस (MAPKs) को सक्रिय करते हैं, जिनमें cJun N-टर्मिनल किनसे (JNK), p38 kinase, और एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-संबंधित किनेज (ERK) [14] शामिल हैं। यह सक्रियण ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव, सक्रियण और उत्तरजीविता की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। RANKL सक्रिय टी-कोशिकाओं के परमाणु कारक, साइटोप्लाज्मिक 1 (NFATc1) और-Fos जैसे प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को भी सक्रिय करता है, जो ऑस्टियोक्लास्ट विकास के लिए आवश्यक हैं [ 7,9]। इसलिए, RANKL सिग्नलिंग को एंटी-रिसोरप्टिव एजेंटों का मुख्य लक्ष्य माना जाता है जो ऑस्टियोक्लास्ट सक्रियण को दबाते हैं और कमजोर होते हैं।एक्टोसाइडरहमानिया ग्लूटिनोसा का मुख्य सक्रिय यौगिक है, जिसका व्यापक रूप से पारंपरिक ओरिएंटल चिकित्सा में उपयोग किया जाता है [15,16]।एक्टोसाइडएक मजबूत एंटीऑक्सिडेंट है और इसमें एंटी-हेपेटोटॉक्सिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-नोसिसेप्टिव गतिविधियां हैं [17-20]। हमने पहले पाया था किएक्टोसाइडईआरके सिग्नलिंग [21] को विनियमित करके टाइरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन बायोसिंथेसिस को कम करता है, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) से बचाता है-मसूड़े की क्षति [22], और मायकोटॉक्सिन-मध्यस्थता कोशिका क्षति [23] को दबाता है। ये प्रभाव निकट से संबंधित हैंएक्टोसाइडआरओएस को हटाने और एमएपीके-मध्यस्थता सिग्नलिंग को विनियमित करने की क्षमता। विशेष रूप से, आरओएस को ओस्टियोक्लास्ट में आरएएनसीएल-प्रेरित सिग्नलिंग मार्ग और सेलुलर घटनाओं की मध्यस्थता करने का सुझाव दिया जाता है। एंटीऑक्सिडेंट के साथ प्रीट्रीटमेंट ने NF-kB, ERK, और IkBa के RANKL- प्रेरित सक्रियण को रोक दिया, जिससे ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस [24] को दबा दिया गया। इन निष्कर्षों ने दृढ़ता से सुझाव दिया कि, विरोधी भड़काऊ गतिविधि के अलावा, और एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि एक एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकारएक्टोसाइडRANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को दबा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने पता लगाया कि क्याएक्टोसाइडहड्डी के नुकसान पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है। हमने के प्रभावों की जांच कीएक्टोसाइडऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और अस्थि पुनर्जीवन और संबंधित सेलुलर तंत्र इन विट्रो और विवो प्रायोगिक प्रणालियों का उपयोग करते हुए।
सामग्री और तरीके
नैतिक वक्तव्य
पशु देखभाल और उपयोग प्रथाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग में नैतिकता पर चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी कमेटी (परमिट नंबर सीबीयू 2010-0007) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में सभी प्रयोग विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
चूहे, रसायन और प्रयोगशाला के सामान
चार-सप्ताह की मादा ICR चूहों को OrientBio Inc. (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया था और 2261uC और 5565 प्रतिशत आर्द्रता 12 h प्रकाश / अंधेरे चक्र पर भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ रखा गया था। Acteoside (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (अंजीर। S1) को रहमानिया की पत्तियों से अलग किया गया था। ग्लूटिनोसा Acteoside उपयोग करने से पहले फॉस्फेट-बफर खारा (PBS) में भंग कर दिया गया था। RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, और M-CSF को R & D सिस्टम (मिनियापोलिस, MN, USA) से खरीदा गया था। c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, और b-actin के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। ) P-p38 और p38 के लिए एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (Danvers, MA, USA) से खरीदे गए थे। सीरम जैव रासायनिक मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कैल्शियमएसे और ओस्टियोकैल्सिन (ओसी) ईआईए किट क्रमशः बायोएसे सिस्टम्स (हेवर्ड, सीए, यूएसए) और बायोमेडिकल टेक्नोलॉजीज (स्टॉटन, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। सीरम TRAP5b स्तर को मापने के लिए माउस टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (TRAP) परख किट (इम्यूनोडायग्नोस्टिक सिस्टम, स्कॉट्सडेल, AZ, यूएसए) का भी उपयोग किया गया था। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सिग्मा केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से अतिरिक्त रसायन प्राप्त किए गए थे, और प्रयोगशाला के सामान एसपीएल लाइफ साइंसेज (पोचुन, दक्षिण कोरिया) से थे।
कोशिका संवर्धन
पहले वर्णित विधियों के अनुसार 6 सप्ताह की मादा आईसीआर चूहों के टिबिया और मादा से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त किया गया था [25]। अस्थि मज्जा निलंबन को 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ की उपस्थिति में एक 100-मिमी कल्चर डिश में इनक्यूबेट किया गया था। 3 दिनों के बाद, ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए आसन्न कोशिकाओं को अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (बीएमएम) के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कुछ अस्थि मज्जा कोशिकाओं को भी एम-सीएसएफ के बिना 48 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था, और अनुयाई कोशिकाओं को एक ऑस्टियोब्लास्ट विभेदक माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था, जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [25]। RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 mM L ग्लूटामाइन और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में सुसंस्कृत किया गया था। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस पर एक्टोसाइड के प्रभाव का पता लगाने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग बीएमएम के लिए एक समकक्ष सेल लाइन के रूप में किया गया था।
ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव और ट्रैप धुंधला हो जाना
बीएमएम को 100 एनजी / एमएल आरएएनसीएल के साथ उत्तेजित करने से पहले 2 घंटे के लिए एक्टियोसाइड के विभिन्न सांद्रता (0-50 मिमी) के साथ दिखाया गया था। संस्कृति मीडिया को 2 और 5 दिनों में ताजा मीडिया से बदल दिया गया था। ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद, संस्कृतियों को 4 प्रतिशत पीबीएस-बफर पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिग्मा एल्ड्रिच किट का उपयोग करके टीआरएपी के साथ दाग दिया गया था। टीआरएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गिना जाता था, और 3 या अधिक नाभिक वाले कोशिकाओं को ऑस्टियोक्लास्ट माना जाता था। 2 घंटे के लिए एक्टियोसाइड के साथ प्रीट्रीटमेंट के बाद रॉ 264.7 कोशिकाओं को भी 100 एनजी / एमएल आरएएनसीएल से अवगत कराया गया था, और ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं को टीआरएपी धुंधला के लिए संसाधित किया गया था।
सेल व्यवहार्यता का मापन
सेल व्यवहार्यता एक पानी में घुलनशील टेट्राजोलियम नमक (WST) -8 अभिकर्मक का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, BMM या RAW264.7 कोशिकाओं को एक विकास माध्यम में संवर्धित किया गया जिसमें 10 प्रतिशत FBS और एंटीबायोटिक दवाओं का इलाज 10 mM एक्टोसाइड या फेनोलिक यौगिकों जैसे कि क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन, एपिजेनिन, या एपिगैलोकैटेचिन -3-गैलेट (EGCG) के साथ किया गया था। WST -8 अभिकर्मक को 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद संस्कृतियों में जोड़ा गया था। अतिरिक्त 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, WST -8- विशिष्ट अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर (पैकर्ड इंस्ट्रूमेंट कंपनी, डाउनर्स ग्रोव, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके 450 एनएम पर मापा गया था।
अस्थि पुनर्जीवन परख
बीएमएम (16105 सेल/एमएल) को 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ और 100 एनजी/एमएल आरएएनसीएल युक्त एक-एमईएम में निलंबित कर दिया गया था, फिर कैल्शियम फॉस्फेट नैनोक्रिस्टल (ओएएएस {{6} के साथ लेपित एक 24- अच्छी तरह से प्लेट में विभाजित किया गया था। }; ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि परख सबस्ट्रेट, ओस्कोटेक इंक., चोंगनाम, दक्षिण कोरिया) 26104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर एक्टियोसाइड के साथ और बिना। 7 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 5 प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ प्लेटों से हटा दिया गया था, और एक ऑप्टिक माइक्रोस्कोप के तहत गड्ढे का गठन देखा गया था। पुनर्जीवित क्षेत्र को एक छवि विश्लेषक द्वारा भी मापा गया और नियंत्रण मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया।
वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण
पूरे प्रोटीन लाइसेट्स को एक लसीका बफर में तैयार किया गया था जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [26]। साइटोसोलिक और परमाणु प्रोटीन पहले वर्णित [25] के रूप में तैयार किए गए थे। प्रोटीन निकालने की समान मात्रा को 12-15 प्रतिशत एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और पॉलीविनाइल डिफ़्लुओराइड झिल्ली पर दाग दिया गया। 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धमाकों की जांच की गई थी। धमाकों को उन्नत रसायनयुक्त रसायन (एमर्सहम फार्माशिया बायोटेक इंक, बकिंघमशायर, यूके) के साथ विकसित किया गया था और एक्स-रे फिल्म (ईस्टमैन-कोडक कं, रोचेस्टर, एनवाई, यूएसए) के संपर्क में लाया गया था।
एमएपीके गतिविधि परख
कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए एक्टोसाइड के साथ दिखाया गया और फिर अतिरिक्त -30 मिनट के लिए RANKL से प्रेरित किया गया। MAPK गतिविधियों को इम्युनोमेट्रिक परख किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसे कि p-p38kinase परख किट (परख डिजाइन, इंक।, MI, यूएसए), p-ERK एंजाइम परख किट (परख डिजाइन), और p-SAPK / JNK सैंडविच एलिसा किट ( सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, एमए, यूएसए)। सभी प्रक्रियाओं ने निर्माता के निर्देशों का पालन किया, और एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा अवशोषण को मापा गया।
इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (EMSA)
डीएनए-प्रोटीन बाध्यकारी प्रतिक्रियाएं कमरे के तापमान पर 3 0 मिनट के लिए की गईं, 20 मिलीलीटर बफर में 10-15 मिलीग्राम प्रोटीन के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 0.5 मिलीग्राम / एमएल पॉली (डीआई-डीसी), 5 प्रतिशत ग्लिसरॉल , 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी पीएमएसएफ, 10 मिमी ट्रिस-सीएल (पीएच 7.5), 50 मिमी NaCl, 30, 000 सीपीएम [ए -32 पी] डीसीटीपी-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और क्लेनो टुकड़ा डीएनए पोलीमरेज़ का। नमूने 6 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर अलग किए गए थे, जिन्हें सुखाकर एक्स-रे फिल्म (ईस्टमैन कोडक कंपनी) में 12-24 घंटे के लिए 270 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। एनएफ के लिए विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर अनुक्रम थे 59-एएजी जीसीसी टीजीटी जीसीटी सीसीजी जीजीए सीटीटी टीसीसी सीटीजीजीसीसी टीजीजी ए-39 और 39-जीजीए सीएसी जीएजीजीसीसी सीटीजीएएएजीजीजीएसीसीजीजीएसीसीसीटीजीजीएए{{30 }}.
एनएफ-केबी लूसिफ़ेरेज़ परख
RAW264.7 मैक्रोफेज 24-अच्छी तरह से प्लेटों को 0.8 मिलीग्राम kB-luciferase रिपोर्टर वेक्टर के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2 मिलीलीटर Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के बाद 24 घंटे में, कोशिकाओं को RANKL की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उत्तेजित किया गया थाएक्टोसाइड24 घंटे के लिए कोशिकाओं को 100 मिलीलीटर रिपोर्टर lysis बफर (Promega, मैडिसन, WI, यूएसए) में फिर से जोड़ा गया। समान मात्रा में प्रोटीन के नमूनों को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में रखा गया और ल्यूसिफरेज सब्सट्रेट के साथ मिलाया गया। Luminescence को एक माइक्रोप्लेट ल्यूमिनोमीटर (MicroLumat Plus LB 964, बर्थोल्ड टेक्नोलॉजीज, बैड वाइल्डबैड, जर्मनी) का उपयोग करके मापा गया था। इस प्रयोग में, एक पारगम्य NF-B अवरोधक पेप्टाइड (BIOMOL, बटलर पाइक, PA, USA) को एक सकारात्मक kB अवरोधक के रूप में उपयोग किया गया था।
साइटोकिन्स का मापन
BMM या RAW264.7 कोशिकाओं को RANKL से 24-वेल कल्चर प्लेट्स में एक्टोसाइड की उपस्थिति में प्रेरित किया गया था। ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार TNF-a-, IL-1b- और IL-6-विशिष्ट OptEIATM किट का उपयोग करके एलिसा द्वारा संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्र और मूल्यांकन किया गया था।
रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)
ओस्टियोक्लास्टिक मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति, जैसे कि सी-फॉस, एनएफएटी 1 और टीएनएफ-ए, वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, निर्माता के निर्देशों (Invitrogen) के अनुसार Trizolreagent के साथ मैक्रोफेज से कुल RNA निकाला गया था। cDNA को SuperScriptReverse Transcriptase II और प्राइमरों (Invitrogen) का उपयोग करके कुल RNA के 1 मिलीग्राम के साथ संश्लेषित किया गया था। पावर SYBRGreen PCR मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) का उपयोग एबीआई 7500 सीक्वेंस डिटेक्शन सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) के साथ साइकिल चलाने के दौरान पीसीआर उत्पाद के संचय का पता लगाने के लिए किया गया था। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के बाद, पीसीआर था
इंट्रासेल्युलर आरओएस का मापन
29,79-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन-डायसेटेट (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, जर्मनी) का एक स्टॉक समाधान DMSO में तैयार किया गया था और इसे अंधेरे में 220uC पर संग्रहीत किया गया था। संक्षेप में, बीएमएम (106 कोशिकाओं / एमएल 6-वेल प्लेट्स) को 24 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएलएम-सीएसएफ के साथ सुसंस्कृत किया गया था और फिर 100 के साथ उत्तेजना से पहले एक्टोसाइड 2 घंटे के विभिन्न सांद्रता (0-10 मिमी) के साथ इलाज किया गया था। एनजी/एमएलRANKL. सह-ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, इन कोशिकाओं को बाद में 30 मिनट के लिए 25 मिमी DCFH-DA के साथ ऊष्मायन किया गया। 29, 79-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (DCF) का हरा प्रतिदीप्ति 515 एनएम (FL 1) पर एक FACS सहूलियत प्रणाली (बेक्टन-डिकिंसन, सैन जोस, सीए, यूएसए) और 10, 000 घटनाओं का उपयोग करके दर्ज किया गया था। प्रति नमूना गिना गया।
ओवरीएक्टोमी-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस का प्रेरण
इस अध्ययन के लिए महिला आईसीआर चूहों (6 सप्ताह पुरानी) का इस्तेमाल किया गया। चूहे को एनेस्थीसिया के तहत एक दिखावा ऑपरेशन (शाम, एन=10) या सर्जिकल ओवरीएक्टोमाइज्ड (OVX, n=20) प्राप्त हुआ। सर्जरी के एक सप्ताह बाद, OVX चूहों को बेतरतीब ढंग से 10 चूहों के 2 समूहों में विभाजित किया गया था: द्विपक्षीय OVX और द्विपक्षीय OVX को 200 मिलीलीटर पीबीएस के साथ पूरक किया गया जिसमें 1 मिमी एक्टोसाइड मौखिक रूप से (एसी समूह) था। मौखिकएक्टोसाइडसर्जरी के बाद 8 सप्ताह के लिए हर 3 दिनों में एक बार प्रशासित किया गया था, और पीबीएस की समान मात्रा शाम और ओवीएक्स समूहों को दी गई थी। अंतिम प्रशासन के 1 दिन के बाद, चूहों की बलि दी गई और फिर सीरम और 3-आयामी अस्थि संरचना में जैव रासायनिक मापदंडों का विश्लेषण किया गया।
सीरम जैव रासायनिक पैरामीटर्स का निर्धारण
रक्त के नमूने कार्डियक पंचर के माध्यम से एकत्र किए गए और सीरम को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया। सीरम के नमूने जैव रासायनिक मापदंडों के विश्लेषण के लिए 280 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। आईएल-1बी और आईएल-6 के सीरम स्तर का अनुमान ऊपर वर्णित एलिसा किट का उपयोग करके लगाया गया था, जबकि क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि को जैव रासायनिक वर्णमिति परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जो पी की मात्रा को मापता है। -नाइट्रोफेनॉल एक पी-नाइट्रोफेनॉल फॉस्फेट सब्सट्रेट से उत्पन्न होता है, जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [27]। हड्डी के निर्माण और पुनर्जीवन के बायोमार्कर का अनुमान लगाने के लिए, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार सीरम OC, कैल्शियम और TRAP5b का स्तर भी निर्धारित किया गया था।
अस्थि संरचना और रूपमितीय पैरामीटरों का विश्लेषण
चूहों के फीमोरा (शाम, ओवीएक्स, और एसी समूह) को यांत्रिक परीक्षण के लिए विच्छेदित और शारीरिक खारा से भर दिया गया था। फीमर की यांत्रिक शक्ति को अन्यत्र वर्णित [28] के रूप में मापा गया था। सही फीमर फ्रैक्चर के मध्य-शाफ्ट के बिंदु पर न्यूटन में फ्रैक्चर लोड को शिखर बल के रूप में दर्ज किया गया था। इसके अलावा, एक माइक्रो कंप्यूटर टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) प्रणाली (स्काईस्कैन 1076 माइक्रोफोकस एक्स-रे सिस्टम, कोंटिच, बेल्जियम) का उपयोग करके प्रत्येक जानवर के प्रकाश फीमर का हिस्टोमोर्फोमेट्रिक रूप से विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, स्कैन के दौरान सूखने से बचाने के लिए, 4 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड भंडारण में हड्डियों को प्लास्टिक की ''क्लिंग-फिल्म'' या पैराफिल्म में लपेटने से पहले कागज के ऊतक पर सतही रूप से सुखाया गया था। प्रत्येक प्लास्टिक-लिपटे हड्डी को प्लास्टिक/पॉलीस्टायर्न फोम ट्यूबों में रखा गया था जो माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए 1076 स्कैनर नमूना कक्ष में लंबवत क्षैतिज रूप से घुड़सवार थे। 100 केवी स्रोत वोल्टेज और 35 मिमी रिज़ॉल्यूशन के साथ 140 एमए स्रोत वर्तमान का उपयोग करके स्कैनिंग की गई थी। स्काईस्कैन सीटी एनालाइज़र संस्करण 1.11 का उपयोग करके फीमर की ट्रैब्युलर हड्डियों के त्रि-आयामी मॉडल का पुनर्निर्माण किया गया था। ट्रैब्युलर बोन मिनरल डेंसिटी (BMD, g/cm3), बोन वॉल्यूम (बोन वॉल्यूम (BV)/टिशू वॉल्यूम (TV), प्रतिशत), मोटाई (Tb.Th, mm), सेपरेशन (Tb.Sp) जैसे संरचनात्मक पैरामीटर , मिमी), और संख्या (Tb.N, 1/mm) को तब मापा गया।
ओस्टोजेनिक भेदभाव और खनिजकरण परख
{{{10}}}} में सुसंस्कृत अस्थि मज्जा कोशिकाओं को डीएजी (10 एनएम डेक्सामेथासोन, 50 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, और 20 मिमी बी-ग्लिसरोफॉस्फेट) के साथ 10 मिमी एक्टोसाइड की उपस्थिति में इलाज किया गया था। 2 सप्ताह के विभेदन के बाद, कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए बर्फ-ठंडा70 प्रतिशत (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ तय किया गया था और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.2 प्रतिशत एलिज़रीन लाल पाप आसुत जल के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं के नष्ट हो जाने और हवा में सूखने के बाद, सेल कल्चर प्लेटों का मूल्यांकन एक उल्टे माइक्रोस्कोप (Nikon TS100, Japan) का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। लाल डाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए, दाग को 10 प्रतिशत एसिटाइल पाइरिडिनियम क्लोराइड के साथ 20 मिनट तक हिलाकर साफ किया गया और अवशोषण 560 एनएम पर मापा गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल परतों में जमा कैल्शियम की मात्रा को कैल्शियम किट (वाको केमिकल इंक। ओसाका, जापान) का उपयोग करके भी मापा गया। इसके अलावा, हड्डी-विशिष्ट mRNA मार्करों की अभिव्यक्ति, जैसे कि रनट-संबंधित प्रतिलेखन कारक -2 (Runx2), ओस्टरिक्स, बोन सियालोप्रोटीन (BSP), और OC वास्तविक समय RT-PCR द्वारा निर्धारित किया गया था। इन मार्करों के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों को प्राइमरएक्सप्रेस सॉफ्टवेयर 3.0 (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके 200 बीपी से कम उत्पाद आकार के साथ डिजाइन किया गया था जैसा कि अन्यत्र वर्णित है।
सांख्यिकीय विश्लेषण
जब तक अन्यथा इंगित नहीं किया जाता है, सभी डेटा को 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। SPSS संस्करण 12.0 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए कई तुलनाओं के लिए एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग किया गया था। एक p-मान ,0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
परिणाम
एक्टोसाइड एक खुराक पर निर्भर तरीके से मैक्रोफेज द्वारा ऑस्टियोक्लास्ट गठन को रोकता है
ओस्टियोक्लास्ट में बीएमएम भेदभाव पर एक्टोसाइड के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं को 50 एनजी / एमएल एम सीएसएफ और 100 एनजी / एमएल आरएएनसीएल की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए एक्टियोसाइड के विभिन्न सांद्रता (0-20 मिमी) के साथ सुसंस्कृत किया गया था। . एक्टियोसाइड ने खुराक पर निर्भर तरीके से ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या को कम कर दिया। जब कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 10 एमएम एक्टियोसाइड के साथ दिखाया गया था, तो ऑस्टियोक्लास्ट संख्या में एम-सीएसएफ और आरएएनसीएल (छवि 1 ए) के साथ पूरक कोशिकाओं की तुलना में 43 प्रतिशत की कमी आई है। अंजीर। 1B एक्टोसाइड के साथ संयुक्त उपचार द्वारा RANKL की मध्यस्थता वाले ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और इसके निषेध को दर्शाता है। इस परिणाम के अनुरूप, एक्टोसाइड प्रीट्रीटमेंट ने RAW264.7cells और ऑस्टियोक्लास्ट गठन (अंजीर। 1C और D) के RANKL- उत्तेजित भेदभाव को कम कर दिया। जब बीएमएम पर एक्टोसाइड की ओस्टियोक्लास्टिक क्षमता की तुलना एक ही एकाग्रता (10 मिमी) पर कई फेनोलिक यौगिकों की ओस्टियोक्लास्ट विरोधी क्षमता के साथ की गई, तो ल्यूटोलिन ने उच्चतम गतिविधि (छवि 2 ए) दिखाई। हालांकि, ल्यूटोलिन, क्वेरसेटिन, या एपिजेनिन ने ही कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम कर दिया (चित्र 2बी)। सभी यौगिकों ने निम्नलिखित सापेक्ष गतिविधियों के साथ RAW264.7 मैक्रोफेज द्वारा ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव को रोक दिया: ल्यूटोलिन। क्वेरसेटिन=एपिजेनिन। ईजीसीजी=एक्टोसाइड (चित्र। 2सी)। ल्यूटोलिन, क्वेरसेटिन, या एपिजेनिन ने भी कोशिकाओं की घटी हुई व्यवहार्यता को दिखाया (चित्र 2डी)। इसके विपरीत, क्वेरसेटिन उपचार ने केवल बीएमएम और रॉ 264.7 कोशिकाओं दोनों में व्यवहार्यता की एक महत्वपूर्ण कमी का कारण बना, जब इन कोशिकाओं को 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ, 100 एनजी/एमएल RANKL के साथ 2 दिनों के लिए प्रत्येक यौगिक के 10 मिमी के संपर्क में लाया गया था। या दोनों (डेटा नहीं दिखाया गया)। जब इन यौगिकों की सांद्रता 50 प्रतिशत को बाधित करने के लिए आवश्यक होती है
BMMs (IC50) में ऑस्टियोक्लास्ट के गठन की गणना एकाग्रता-गतिविधि घटता का उपयोग करके की गई थी, एक्टोसाइड, क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन, एपिजेनिन और EGCG का IC50 क्रमशः 5.1, 2.3, 2.6, 4.8 और 6.6 mM था (चित्र 2E)। यह परिणाम उस मामले के समान था जिसमें रॉ 264.7 मैक्रोफेज की जांच की गई थी। इन आंकड़ों ने सुझाव दिया कि ल्यूटोलिन और क्वेरसेटिन में एक्टोसाइड की तुलना में एंटी-क्लस्टोजेनिक गतिविधियां अधिक थीं। इसके विपरीत, IC50 में क्वेरसेटिन का कोशिकाओं पर हल्का विषाक्त प्रभाव भी पड़ा (डेटा नहीं दिखाया गया)।
एक्टोसाइडमैक्रोफेज द्वारा अस्थि पुनर्जीवन को रोकता हैएक्टोसाइड ने खुराक पर निर्भर तरीके से RANKL की मध्यस्थता वाली हड्डी के पुनर्जीवन को भी रोका, जैसा कि इन विट्रो मॉडल सिस्टम (छवि 3 ए) द्वारा मापा जाता है। जब बीएमएम को 1 एमएम एक्टोसाइड (छवि 3 बी) के साथ जोड़ा गया था, तो अस्थि पुनर्जीवन काफी बाधित हो गया था। एक 10 एमएम एक्टियोसाइड उपचार ने बीएमएम द्वारा लगभग पूरी तरह से आरएएनसीएल-प्रेरित पिट गठन को देखा। इसी तरह, एक्टोसाइड ने RANKL-उत्तेजित RAW264.7 कोशिकाओं (अंजीर। S2A और B) में हड्डियों के पुनर्जीवन को कम कर दिया। की क्षमताएक्टोसाइडRANKL उत्तेजना के सापेक्ष उपचार के समय पर निर्भर अस्थि पुनर्जीवन को रोकना। RANKL उत्तेजना के 4 दिन बाद Acteoside(10 mM) जोड़ा गया, जिससे BMM में गड्ढे का निर्माण कम नहीं हुआ, जबकि इसने बनने वाले ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या को दबा दिया (चित्र 3C)। यह अलग परिणाम RANKL उत्तेजना गठन (छवि 3D) के 4 दिनों के बाद पहले से ही बने गड्ढे क्षेत्र के कारण था।
एक्टोसाइडडाउन-रेगुलेट अर्ली RANKL सिग्नलिंगपाथवे
RANKL ऑस्टियोक्लास्ट अग्रदूतों में 3 प्रसिद्ध MAPK और NF-kB की सक्रियता को प्रेरित करता है, और यह सक्रियण प्रारंभिक ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव के लिए आवश्यक है। संभावित तंत्र को समझने के लिए जिसके द्वारा एक्टोसाइड ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को रोकता है, हमने मैक्रोफेज में एमएपीके और एनएफ-बी सक्रियण पर एक्टोसाइड के प्रभाव की जांच की। BMM और RAW264.7 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 10 मिमी एक्टोसाइड के साथ दर्शाया गया और फिर 30 मिनट के लिए 100 एनजी / एमएल RANKL से प्रेरित किया गया। MAPK फास्फारिलीकरण की जांच पश्चिमी सोख्ता और इम्यूनोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा की गई। RANKL ने p38, ERK, और JNK inBMMs (चित्र। 4A) और RAW264.7 कोशिकाओं (चित्र। 4B) के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित किया। Acteoside ने p-p38, p-ERK, और p-JNK में इन RANKL- प्रेरित वृद्धि को रोका। इस परिणाम को इम्युनोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा समर्थित किया गया था, जो कि 10 मिमी एक्टोसाइड के साथ दिखावा इन मैक्रोफेज (छवि 4C) में फॉस्फोराइलेटेड एमएपीके के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करता है। RANKL उपचार ने NF-kB के डीएनए-बाइंडिंग को बढ़ा दिया, जबकि एक्टोसाइड ने NF-kB-DNA बाइंडिंग (छवि 5A) के RANKL- प्रेरित सक्रियण को रोक दिया। RAW264.7 कोशिकाओं की तुलना में BMM में यह अवरोध अधिक प्रमुख था। Acteoside ने RANKL-उत्तेजित p65 और IkBa फॉस्फोराइलेशन को BMMs और RAW264.7 कोशिकाओं (अंजीर। 5B और C) में भी कम कर दिया। 10 mMacteoside जोड़ने से BMMs में IkBa की गिरावट और सक्रियण दोनों लगभग पूरी तरह से बाधित हो गए (चित्र 5B)। आगे यह पुष्टि करने के लिए कि NF kB सक्रियण एक्टोसाइड की कार्रवाई में शामिल है, kB प्रमोटर-लूसिफ़ेरेज़ निर्माणों को RAW264.7cells में क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। 100 एनजी/एमएल RANKL के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं में 3- उच्च kB प्रमोटर गतिविधि गुना थी, जिसे 10 mM एक्टोसाइड (चित्र 5डी) द्वारा महत्वपूर्ण रूप से देखा गया था।
Acteoside भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन और TNF-a, c-Fos और NFATc1in RANKL- उत्तेजित मैक्रोफेज की अभिव्यक्ति को दबाता है
टीएनएफ-ए, आईएल-1बी, और आईएल-6 ऑस्टियोक्लास्ट गठन और कार्य में महत्वपूर्ण हैं, जो एनएफ-केबी सिग्नलिंग इनआरएनकेएल-उत्तेजित मैक्रोफेज द्वारा मध्यस्थता है। RANKL ने इन साइटोकिन्स के उत्पादन को प्रेरित किया, और इस उत्पादन को BMMs (चित्र। 6A) में 10 mM एक्टोसाइड प्रीट्रीटमेंट द्वारा स्पष्ट रूप से कम किया गया था। इसी तरह, एक्टियोसाइड ने RAW264.7 मैक्रोफेज (चित्र। S3) में IL -6 को छोड़कर, साइटोकिन्स के RANKL- प्रेरित उत्पादन को देखा। ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस में एक्टोसाइड कार्रवाई के आणविक तंत्र को समझने के लिए, हमने आगे TNF-a, c-Fos, और NFATc1 अभिव्यक्ति पर एक्टोसाइड के प्रभाव की जांच की। RANKL ने BMM और RAW264.7 कोशिकाओं (अंजीर। 6B और C) में इन कारकों की mRNA अभिव्यक्ति को विनियमित किया। 10 एमएम एक्टियोसाइड के साथ प्रीट्रीटमेंट ने दोनों में इन कारकों की RANKL- प्रेरित अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया
BMM और RAW264.7 सेल। एक्टियोसाइड प्रीट्रीटमेंट ने RANKL-उत्तेजित BMM (छवि 6D) में c-Fos और NFATc1 के प्रोटीन स्तर को भी दृढ़ता से कम कर दिया। ये परिणाम बताते हैं किएक्टोसाइडजीन और प्रोटीन के स्तर पर ऑस्टियोक्लास्ट गठन के मध्यस्थों को प्रेरित करने वाले RANKL को डाउन-रेगुलेट करता है।
एक्टोसाइड खुराक पर निर्भर तरीके से बीएमएम में इंट्रासेल्युलर आरओएस पीढ़ी को कम करता है
चूंकि यह ज्ञात है कि इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन आरएएनसीएल-उत्तेजित ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस के साथ सहसंबद्ध है, हमने जांच की कि क्या एक्टोसाइड सेल-पारगम्य, ऑक्सीकरण-संवेदनशील डाई, डीसीएफएच-डीए का उपयोग करके आरएएनसीएल-मध्यस्थता ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव के दौरान आरओएस उत्पादन को रोकता है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि बीएमएम में डीसीएफ के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 7 ए) की तुलना में आरएएनसीएल के साथ उत्तेजना के बाद स्पष्ट रूप से सही-स्थानांतरित किया गया था। यह बदलाव उस मामले के समान था जब RANKL उत्तेजना (डेटा नहीं दिखाया गया) के बाद RAW264.7 मैक्रोफेज देखे गए थे। एक्टोसाइड के साथ बीएमएम का इलाज करने से खुराक पर निर्भर तरीके से डीसीएफ की सिग्नल तीव्रता कम हो गई। 10 एमएम एक्टियोसाइड के साथ प्रीट्रीटमेंट ने ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव के दौरान उत्पादित इंट्रासेल्युलर आरओएस के स्तर को लगभग पूरी तरह से कम कर दिया है, जो गैर-उपचार नियंत्रण स्तर (छवि 7 बी) के लिए है।
ओरल एक्टियोसाइड एडमिनिस्ट्रेशन ऑस्टियोपोरोटिक बायोकेमिकल मार्करों के परिवर्तन को रोकता है और ओवरीएक्टोमाइज्ड चूहों में हड्डी का नुकसान होता है
हड्डी के नुकसान पर एक्टोसाइड के प्रभाव का पता लगाने के लिए, हमने ओवरीएक्टोमी द्वारा एक ऑस्टियोपोरोटिक पशु मॉडल तैयार किया। प्रयोगात्मक अवधि (डेटा नहीं दिखाया गया) के दौरान ओवीएक्स और शम्मीस के बीच शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। शाम समूह (चित्र 8) की तुलना में समूह में IL-1b और IL-6 का सीरम स्तर काफी अधिक था। इन भड़काऊ साइटोकिन्स में ओवरीएक्टोमी-प्रेरित वृद्धि को मौखिक एक्टोसाइड प्रशासन (एसी समूह) द्वारा देखा गया था। OVX समूह में बोन टर्नओवर मार्कर जैसे ALP, कैल्शियम, TRAP5b और OC के सीरम स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। इन ऑस्टियोपोरोटिक मार्करों में से, OVX चूहों में कैल्शियम, TRAP5b और OC के बढ़े हुए स्तर को एक्टियोसाइड उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से बाधित किया गया था, जबकि उपचार द्वारा एएलपी के सीरम स्तर को नहीं बदला गया था। दाएं ऊरु शाफ्ट के मध्य में औसत अधिकतम फ्रैक्चर लोड ओवीएक्स समूह में शाम समूह (छवि 9 ए) की तुलना में काफी कम था। एक्टियोसाइड उपचार ने अधिकतम फ्रैक्चर बैकअप को शाम समूह के लिए बढ़ा दिया। जब फीमर की कोर्टिकल हड्डी को ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी द्वारा विच्छेदित और देखा गया था, तो ओवीएक्स समूह में दिखाए गए ऑस्टियोपोरोटिक लक्षण एसी चूहों (छवि 9 बी) में लगभग पूरी तरह से गायब हो गए थे। ओवीएक्स-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस मॉडल पर एक्टोसाइड के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, प्रकाश समीपस्थ फीमर के ट्रैब्युलर में बीएमडी और बोन मॉर्फोलॉजिक मापदंडों का सूक्ष्म-सीटी द्वारा विश्लेषण किया गया था। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 9C, OVX चूहों में ऊरु ट्रैब्युलर आर्किटेक्चर का एक परिवर्तन पाया गया था, जबकि यह परिवर्तन एक्टोसाइड के साथ उपचार से कम हो गया था। माइक्रो-सीटी विश्लेषण के परिणामों से पता चला कि बीएमडी, हड्डी की ताकत का एक उपाय, ओवीएक्स चूहों (छवि 9 डी) में नाटकीय रूप से कम हो गया था। शाम समूह की तुलना में, OVX चूहों ने भी BV/TV, Tb में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाए। सपा, और टीबी। एन, लेकिन टीबी नहीं। ओवीएक्स चूहों के मौखिक एक्टोसाइड उपचार ने बीएमडी के साथ-साथ बीवी/टीवी और टीबीएन में परिवर्तन को काफी हद तक रोका।
