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आई-फेंग वांग, 1,2 यिहान वांग, 2 यी-हुआ यांग, 1,3,4 गुओ-जेन हुआंग, 5,6 कुएन-जेर त्साई, 3,4, * और चे-कुन जेम्स शेन 1,2,7 ,*

1 ग्रेजुएट इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरल रीजनरेटिव मेडिसिन, कॉलेज ऑफ मेडिकल साइंस एंड टेक्नोलॉजी, ताइपे मेडिकल यूनिवर्सिटी, ताइपे 11031, ताइवान

2आणविक जीवविज्ञान संस्थान, एकेडेमिया सिनिका, ताइपे 11529, ताइवान

3इंस्टीट्यूट ऑफ क्लिनिकल मेडिसिन, कॉलेज ऑफ मेडिसिन, नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी, ताइनान 70403, ताइवान

4रिसर्च सेंटर ऑफ क्लिनिकल मेडिसिन, नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, कॉलेज ऑफ मेडिसिन, नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी, ताइनान 70403, ताइवान

5विभाग और बायोमेडिकल साइंसेज के स्नातक संस्थान, मेडिसिन कॉलेज, चांग गंग विश्वविद्यालय, ताओयुआन 33302, ताइवान

6 तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान केंद्र, चांग गंग मेमोरियल अस्पताल, लिंको 33302, ताइवान

7लीड संपर्क

*पत्राचार: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (के.-जेटी), ckshen@tmu.edu.tw (सी.-केजेएस)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

याददाश्त में सुधार कर सकता है सिस्टैन्च

सारांश

प्राकृतिक चयन द्वारा कोशिका और जीव विकास के लिए फेनोटाइपिक भिन्नता एक मूलभूत शर्त है। जबकि आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं की फेनोटाइपिक विविधता में स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति की भूमिका का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति और जानवरों में व्यक्तिगत व्यवहार भिन्नता के बीच संबंधों के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एक विशिष्ट miRNA (miR-466f-3p) को मॉरिस वॉटर भूलभुलैया कार्य पर अलग-अलग इनब्रेड चूहों के एक हिस्से के हिप्पोकैम्पस में अपग्रेड किया जाता है। उल्लेखनीय रूप से, miR- 466f-3p सकारात्मक रूप से न्यूरॉन आकृति विज्ञान, कार्य और स्थानिक सीखने को नियंत्रित करता है, औरस्मृतिचूहों की क्षमता। यंत्रवत् रूप से, miR-466f-3p MEF2A के अनुवाद को दबा देता है, जो सीखने/ सीखने का एक नकारात्मक नियामक है।स्मृति. अंत में, हम दिखाते हैं कि हिप्पोकैम्पस miR-466f-3p के विविध अपचयन का परिणाम व्यक्तियों में हिप्पोकैम्पस चक्रीय AMP (cAMP)-प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी (CREB) के यादृच्छिक फॉस्फोराइलेशन से होता है। स्थानिक शिक्षा के मॉडुलन की यह खोज औरस्मृतिन्यूरोनल उत्तेजना पर एक यादृच्छिक हिप्पोकैम्पस सिग्नलिंग अक्ष के माध्यम से एक प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है कि ऊतक जीन अभिव्यक्ति में भिन्नता विभिन्न जानवरों के व्यवहार की ओर कैसे ले जाती है।

परिचय

व्यक्तियों के बीच फेनोटाइपिक भिन्नता एक विकासवादी लाभ का समर्थन करती है क्योंकि यह जनसंख्या विविधता प्रदान करती है जिस पर प्राकृतिक चयन कार्य करता है (पावलिसेव एट अल।, 2011)। आनुवंशिक पृष्ठभूमि और पर्यावरणीय कारक ऐसी प्राकृतिक भिन्नता उत्पन्न करने में योगदान करते हैं (बेंडेस्की और बर्गमैन, 2011)। प्रायोगिक तौर पर, इनब्रेड चूहों का उपयोग अक्सर औसत फेनोटाइप और व्यवहार के आणविक और सेलुलर आधार का अध्ययन करने के लिए किया जाता है ताकि परीक्षण किए गए व्यक्तियों (कैसेलस, 2011) के बीच आनुवंशिक अंतर के प्रभाव को कम किया जा सके। हालांकि, अलग-अलग आइसोजेनिक चूहों के बीच ऊतक प्रतिलेख बहुतायत में भिन्नता दिखाई गई है। अत्यधिक परिवर्तनशील अभिव्यक्ति स्तरों को प्रदर्शित करने वाले जीन अक्सर प्रतिरक्षा कार्य, तनाव प्रतिक्रियाओं और हार्मोनल विनियमन से जुड़े होते हैं, अर्थात, पर्यावरणीय संकेतों के प्रति संवेदनशील प्रक्रियाएं (वेडेल एट अल।, 2011)। इनमें से कुछ अध्ययनों से यह भी पता चला है कि जीन अभिव्यक्ति या सेलुलर सिग्नलिंग में अंतर, पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव के साथ या बिना मातृ चाट, गर्भाशय में पोषक तत्व प्रावधान, या तनाव-प्रेरित लचीलापन बनाम संवेदनशीलता (बेल, 2015; डैनचिन एट अल) लोर्शो

एट अल।, 2019; पेडरसन एट अल।, 2011), फेनोटाइप्स और व्यवहारों में अंतर पैदा कर सकता है (कैसलस, 2011; लोके एट अल।, 2015; लूस एट अल।, 2015; ओए एट अल।, 2015)।

स्थानिक शिक्षा औरस्मृतिमस्तिष्क द्वारा नियंत्रित गठन को दो प्रणालियों में विभाजित किया जा सकता है: (1) आत्म-आंदोलन और आंतरिक संकेतों को नियोजित करने वाला अहंकारी नेविगेशन और (2) आबंटित नेविगेशन मुख्य रूप से हिप्पोकैम्पस और आस-पास की मस्तिष्क संरचनाओं को शामिल करता है जो जीवों के बाहर बाहर के संकेतों से प्रेरित होते हैं (एकस्ट्रॉम एट अल।, 2014)। स्थानिक सीखने की क्षमता औरस्मृतिअधिकांश पशु प्रजातियों को स्थानिक और अस्थायी रूप से परिवर्तनशील वातावरण में अनुकूलित करने के लिए अपने व्यवहार को उत्तरोत्तर समायोजित करने की अनुमति देता है, जो उनके अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। यह मॉरिस वॉटर भूलभुलैया (MWM) (वोरहेस एंड विलियम्स, 2014) जैसे व्यवहार प्रतिमानों को लागू करके प्रयोगशाला जानवरों में मूल्यांकन किया जा सकता है। विशेष रूप से, आनुवंशिक रूप से समान इनब्रेड कृन्तकों को स्थानिक सीखने में फेनोटाइपिक भिन्नता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है औरस्मृति(त्साई एट अल।, 2002), लेकिन इस व्यवहार भिन्नता के अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहे।

नई यादों का निर्माण एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए गतिविधि-निर्भर जेनेरेशन ट्रांसक्रिप्शन, नए प्रोटीन संश्लेषण की आवश्यकता होती है, और

चित्र 1. स्थानिक सीखने की भिन्नता और . के बीच संबंधस्मृतिक्षमता और miR-466f-3p प्रेरण

(ए) जंगली प्रकार के इनब्रेड C57BL/6J चूहों का MWM कार्य। बायां पैनल: GLN चूहों (डॉट्स) और PLN चूहों (वर्गों) का MWM प्रदर्शन। परीक्षण किए गए कुल 289 चूहों में से 180 को जीएलएन और 109 के रूप में पीएलएन के रूप में वर्गीकृत किया गया था। राइटपैनल: प्रोबेटेस्टोफ एमडब्ल्यूएम टास्क (एन =47 और 30 प्रत्येक समूह)। पी, लापता मंच का स्थान; टी, पी के बिना लक्ष्य क्षेत्र; आर, दायां क्षेत्र; हे, विपरीत क्षेत्र; एल, बाएं क्षेत्र। (बी) miRNA अभिव्यक्ति का RT-qPCR विश्लेषण। मस्तिष्क-समृद्ध सकारात्मक नियंत्रण के रूप में miR-466-669 क्लस्टर और miR-132-3p के भीतर स्थित छह miRNAs के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण किया गया और GLN और PLN माउस हिप्पोकैम्पस से आंतरिक नियंत्रण U6 snRNA के साथ सामान्यीकृत किया गया। (एन=9-18 प्रति समूह)। मैं, एमआईआर-466f- 3p; II, एमआईआर-466जी; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; वी, एमआईआर-467एफ; VI, miR-669f; सातवीं, एमआईआर-132-3पी.

विशेष रूप से विशिष्ट न्यूरोनल नेटवर्किंग के रूप में ट्यून किया गयास्मृतिनए न्यूरोनल कनेक्शन और निरंतर प्लास्टिसिटी (असोक एट अल।, 2019) बनाने के लिए एनग्राम। हिप्पोकैम्पस एनग्राम, जो डेंटेट गाइरस (डीजी) में न्यूरॉन्स की विरल आबादी हैं, के बाद बढ़ी हुई गतिविधि को प्रदर्शित करने वाले न्यूरॉन्स के समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं।स्मृतिगठन। जबकि डीजी एनग्राम न्यूरॉन्स जीन अभिव्यक्ति का एक अत्यधिक विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित करते हैं (राव-रुइज़ एट अल।, 2019), अंतर्निहित एनग्राम-विशिष्ट आणविक तंत्र।स्मृतिसमेकन काफी हद तक अज्ञात रहता है। विभिन्न कारकों और सिग्नलिंग मार्ग को सकारात्मक या नकारात्मक रूप से सीखने को विनियमित करने के लिए जाना जाता है औरस्मृतिप्रक्रियाओं की पहचान की गई है (अब्राहम एट अल।, 2019; ह्यूम्यू और चॉकेट, 2019)। उनमें से, चक्रीय एएमपी (सीएमपी) -प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन (सीआरईबी) का सक्रिय रूप, न्यूरॉन्स (कंडेल, 2012) में इंट्रासेल्युलर सीए 2 प्लस की गतिविधि-निर्भर इन-क्रीज के जवाब में जीन प्रतिलेखन को उत्तेजित करता है। दूसरी ओर, शिविर/PKApathwayrepressesmyocyteenhancer factor 2 (MEF2) अपने सह-दमनकर्ता, HDAC5 के परमाणु निर्यात और सह-सक्रियकर्ता NFAT (बेल्डेल्ड एट अल।, 2006) के परमाणु आयात को रोककर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि। इसके अलावा, CREB के विपरीत, MEF2A गतिविधि बाधाएँस्मृतिगठन (कोल एट अल।, 2012)। प्रोटीन कारकों के अलावा, माइक्रोआरएनए (miRNAs) भी सीखने और स्मृति (मैकनील और वैन वेक्टर, 2012) सहित न्यूरोनल कार्यों को विनियमित करने में शामिल हैं। miRNAs छोटे (22 एनटी) गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो मुख्य रूप से विशिष्ट एमआरएनए (डौगार्ड और हैनसेन, 2017) के 30 अनट्रांसलेटेड क्षेत्रों (30 यूटीआर) में उनकी मान्यता साइटों के साथ अनुक्रम-विशिष्ट बेस-पेयरिंग के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के रूप में कार्य करते हैं। miRNAs पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग मार्ग की एक श्रृंखला में भाग लेते हैं, और वे गतिविधि-निर्भर सेलुलर प्रक्रियाओं में मध्यस्थता करते हैं, जिसमें वृक्ष के समान विकास और शाखाएं, सिनैप्स गठन और परिपक्वता शामिल हैं। जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करके, वे अन्तर्ग्रथनी प्लास्टिसिटी के लंबे समय तक चलने वाले रूपों में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जो कि अंतर्निहित हैंस्मृतिगठन, पुनर्प्राप्ति, और समेकन (चेन और शेन, 2013; वांग एट अल।, 2012बी)।

निम्नलिखित में, हम स्टोकेस्टिक ऊतक जीन अभिव्यक्ति और जानवरों में व्यक्तिगत व्यवहार भिन्नता के बीच एक प्रेरक लिंक के लिए साक्ष्य प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, हम दिखाते हैं कि हिप्पोकैम्पस CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A अक्ष का स्टोकेस्टिक सक्रियण स्थानिक सीखने की व्यक्तिगत भिन्नता को नियंत्रित करता है औरस्मृतिइनब्रेड चूहों में क्षमता।

परिणाम

स्थानिक सीखने की व्यक्तिगत भिन्नता औरस्मृतिक्षमता एक विशिष्ट miRNA क्लस्टर से miR-466f-3p प्रेरण के साथ सहसंबद्ध है

सीखने के नियमन में शामिल miRNAs की पहचान करना औरस्मृतिगठन, हमने MWM कार्य का उपयोग इनब्रेड वाइल्ड-टाइप C57BL/6J चूहों को अच्छे या खराब सीखने और स्मृति क्षमता (चित्रा 1 ए) के साथ भेद करने के लिए किया। हमने पिछले (6वें) सत्र में 30 सेकंड के भीतर कार्य पूरा करने वाले चूहों को 'अच्छे शिक्षार्थी' (GLN) के रूप में परिभाषित किया, जबकि चूहों को पिछले सत्र में 30 सेकंड के भीतर मंच नहीं मिला, उन्हें 'गरीब शिक्षार्थी' माना गया। ' (पीएलएन)। जैसा कि चित्र 1ए (बाएं पैनल) में दिखाया गया है, 62 प्रतिशत चूहे जीएलएन समूह (289 चूहों में से 180) से संबंधित थे, जो 98.1 एस (पहला सत्र) से 21.8 एस (6वें सत्र) तक पलायन विलंबता में उल्लेखनीय कमी प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, शेष 38 प्रतिशत चूहों, पीएलएन समूह (289 चूहों में से 109) की पलायन विलंबता पहले और छठे सत्र के बीच मामूली रूप से कम हो गई थी (पहले सत्र में 111.8 सेकेंड से 6वें सत्र में 82.1 सेकेंड तक) . जांच परीक्षण, यह दर्शाता है कि चूहों ने वास्तव में छह सत्रों में कार्य सीखा था, यह भी दिखाया कि जीएलएन चूहों पीएलएन चूहों (चित्रा 1 ए, दाएं पैनल में बार की बाईं जोड़ी) की तुलना में प्लेटफॉर्म क्षेत्र में अधिक समय तक रहे।

इसके बाद, हमने miRNA माइक्रोएरे संकरण (n=4 प्रत्येक समूह) द्वारा GLN और PLN चूहों के हिप्पोकैम्पस से RNA का विश्लेषण किया। सामान्य तौर पर, हमने GLN और PLN चूहों से हिप्पोकैम्पस miRNAs के अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अपेक्षाकृत मामूली अंतर देखा। हालाँकि, हमने नोट किया कि शीर्ष 10 miRNAs जिनके लिए PLN चूहों की तुलना में GLN चूहों में अभिव्यक्ति का स्तर अधिक था (डेटा नहीं दिखाया गया) सभी एक ही कृंतक-विशिष्ट miRNA क्लस्टर, miR -466-669 से प्राप्त हुए थे, जो इंट्रॉन 10 में स्थित थे। mSfmbt2 जीन (नीचे देखें)। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR) के आधार पर क्लस्टर में चयनित miRNAs के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण करते हुए, हमने आगे की जांच के लिए miR-466f-3p को चुना (चित्र 1B)। इस miRNA की औसत अभिव्यक्ति PLN चूहों के सापेक्ष GLN चूहों के हिप्पोकैम्पस में 1.5-गुना अधिक थी। विशेष रूप से, हिप्पोकैम्पस miR-466f-3p का औसत स्तर PLN समूह, होम केज (HC) नियंत्रण समूह और तैराकी नियंत्रण समूह (चित्र 1C) के बीच समान था, जिससे व्यायाम-संबंधी प्रभावों को छोड़कर तैरना और आगे इस विचार का समर्थन करना कि miR-466f-3p स्थानिक सीखने के दौरान प्रेरित किया गया था औरस्मृतिगठन।

चित्र 1C में, डेटा से पता चलता है कि GLN चूहों के 42 प्रतिशत से अधिक हिप्पोकैम्पस miR-466f-3p का अभिव्यक्ति स्तर कम से कम 1.5-के औसत अभिव्यक्ति स्तर से गुना अधिक था। एचसी नियंत्रण चूहों, जबकि पीएलएन चूहों के 15 प्रतिशत में स्तर एचसी चूहों के आधे थे। लगभग 25 प्रतिशत GLN चूहों और 55 प्रतिशत PLN चूहों में समान स्तर का miR-466f{{10}}p (0.8- से 1.2- था। एचसी के सापेक्ष गुना)। पीयरसन सहसंबंध स्कैटरप्लॉट, जांच परीक्षण के दौरान मंच पर miR-466f-3p स्तरों और प्रतिशत अवधि के बीच सकारात्मक सहसंबंध को दर्शाता है, चित्र 1D में प्रस्तुत किया गया है। हमने GLN और PLN दोनों चूहों (चित्र 1E) में मस्तिष्क के स्लाइस के स्वस्थानी संकरण (ISH) में miR-466f-3p और U6 छोटे परमाणु RNA (snRNA) का भी प्रदर्शन किया। ISH के माध्यम से miR- 466f-3p संकेतों के सांख्यिकीय विश्लेषण ने पुष्टि की कि miR-466f- 3p का प्रेरण वास्तव में GLN चूहों के DG में अधिक था।

PLN चूहों, जबकि U6 snRNA संकेतों की तुलना करने पर कोई अंतर नहीं पाया गया (दायां हिस्टोग्राम, चित्र 1E)। हालांकि डीजी में अलग-अलग ग्रेन्युल कोशिकाओं के बीच miR-466-3p सिग्नल समान नहीं थे, फिर भी वे PLN चूहों की तुलना में GLN चूहों के हिप्पोकैम्पस में महत्वपूर्ण और सर्वव्यापी रूप से बढ़े। इसलिए, miR-466f-3p इंडक्शन केवल कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से में नहीं हुआ, जैसे, एनग्राम न्यूरॉन्स। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि MWM कार्य के दौरान miR-466f-3p का अपग्रेडेशन बेहतर स्थानिक सीखने के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है औरस्मृतिGLN चूहों के एक महत्वपूर्ण अनुपात के बीच क्षमता।

हमने RT-qPCR द्वारा कई मस्तिष्क-विशिष्ट miRNAs के औसत अभिव्यक्ति स्तरों का भी विश्लेषण किया। उनमें से, miR-132-3p को MWM कार्य के बाद माउस हिप्पोकैम्पस में अपग्रेड किया गया था, लेकिन हमने GLN और PLN समूहों (बार जोड़ी VII, चित्र 1B) के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा। miR-335-5p और miR-22 के अभिव्यक्ति स्तर GLN, PLN और HC समूहों (चित्र S1A) के बीच समान थे। इस प्रकार, miR-466f-3p के विपरीत, MWM प्रशिक्षण के दौरान इन miRNAs की हिप्पोकैम्पस अभिव्यक्ति का स्थानिक शिक्षा से कोई संबंध नहीं है औरस्मृतिचूहों की क्षमता।

miR-466f-3p अपग्रेडेशन न्यूराइट के बढ़ने और डेंड्राइटिक स्पाइन फॉर्मेशन को बढ़ावा देता है

यह पुष्टि करने के लिए कि miR-466f-3p वास्तव में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था, हमने प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में न्यूरो और MAP2 के इम्यूनो-यूरेसेंस (IF) धुंधला के साथ संयुक्त miRNA ISH का प्रदर्शन किया। परिणामों से पता चला कि अन्य miRNAs (कोहेन एट अल।, 2011; थॉमस एट अल।, 2017) के समान, miR-466f-3p मुख्य रूप से कुछ अतिरिक्त संकेतों के साथ, न्यूरोनल सोमा क्षेत्र में व्यक्त किया गया था। डेंड्राइट्स में (चित्र S2A)। सीखने और सीखने के साथ अपग्रेड किए गए miR-466f-3p के जुड़ाव के आणविक और सेलुलर आधार को समझनास्मृतिनिर्माण के लिए, हमने pFUGW- miR-466f-3p से ubiquitin प्रमोटर के नियंत्रण में dsRed फ्यूजन पॉलीपेप्टाइड के साथ मिलकर पहली बार क्षणिक रूप से miR-466f-3p को ओवरएक्सप्रेस्ड किया है। DIV10 प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स (चित्रा S2B) में dsRed प्लाज्मिड। MiRNA ISH के माध्यम से, हमने पुष्टि की कि miR-466f-3p सिग्नल, miR-466f-3p overexpression group में वेक्टर नियंत्रण या उत्परिवर्ती miR{{ के सापेक्ष अधिक मजबूत है। 12}}f-3p समूह (तीर, चित्र S2B)। समानांतर में, हमने miR-466f-3p फंक्शन के नुकसान की जांच करने के लिए एक प्लेटफॉर्म भी स्थापित किया, जो miR-466f-3p में स्थित miR-sponge का उपयोग करके अवरोधित करता है। ईजीएफपी एमआरएनए के 30 यूटीआर को पीएफयूजीडब्ल्यू-एमआईआर-स्पंज-ईजीएफपी प्लास्मिड (चित्रा एस2सी) से व्यक्त किया गया है। स्पंज प्लास्मिड में ईजीएफपी रिपोर्टर ने अभिकर्मक दक्षता के एक संकेतक और सेलुलर miRNA गतिविधि के एक सेंसर (क्लुइवर एट अल।, 2012) दोनों के रूप में कार्य किया। ट्रांसफ़ेक्टेड HEK293T कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण हिस्से में, जंगली प्रकार के miR-466f-3p के साथ सह-अभिव्यक्ति पर EGFP सिग्नल कम हो गया, लेकिन उत्परिवर्ती miR-466f{{32 के साथ नहीं }}p, 30 UTR में miR-466f-3p को miR- स्पंज से बांधकर EGFP mRNA अनुवाद के निषेध के कारण (बाएं चार छवियों और दो उनके कार्यक्रम, चित्र S2C की तुलना करें) . इसके विपरीत, हमने पीएफयूजीडब्ल्यू-एससीआर-स्पंज-ईजीएफपी प्लास्मिड से या तो miR -466 f -3 p या इसके उत्परिवर्ती (दाएं चार छवियों और दो हिस्टोग्राम की तुलना करें)।

जैसा कि चित्र 2क में दिखाया गया है, miR-466f-3p की अस्थानिक अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स के रूपात्मक परिवर्तन हुए, सबसे विशेष रूप से dsRed-व्यक्त वेक्टर pFUGW के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए न्यूरॉन्स को नियंत्रित करने के सापेक्ष न्यूराइट के प्रकोप को बढ़ाया गया- dsRed या उत्परिवर्ती miR-466f-3p-व्यक्त प्लाज्मिड pFUGW-म्यूट-miR- 466f-3p-dsRed. मात्रात्मक डेटा से पता चला है कि प्रति न्यूरॉन औसत वृक्ष के समान शाखा संख्या miR-466f-3p-overexpressing group (bar II) और वेक्टर या उत्परिवर्ती नियंत्रण (बार I और III) (दाएं) के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थी। ऊपरी हिस्टोग्राम, चित्रा 2ए)। हालांकि, औसत डेंड्राइट लंबाई और प्राथमिक डेंड्राइट की औसत लंबाई miR-466f-3p overexpression पर बढ़ गई (बार II की तुलना बार I और III से करें, चित्र 2A का दायां निचला हिस्टोग्राम)। समानांतर में, हमने miR-स्पंज का उपयोग करके अंतर्जात miR-466f-3p को बाधित किया। जैसा कि देखा गया है, miR-466f-3p-निषेध और नियंत्रण समूहों के बीच वृक्ष के समान शाखा संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (बार IV की तुलना बार I और V से करें, दायां ऊपरी हिस्टोग्राम, चित्र 2A) , लेकिन miR-466f-3p-निषेध समूह ने अन्य समूहों के सापेक्ष औसत कुल डेंड्राइट लंबाई के साथ-साथ प्राथमिक और माध्यमिक डेंड्राइट की औसत लंबाई में उल्लेखनीय कमी प्रदर्शित की (बार IV की तुलना बार I और वी, चित्रा 2ए का दायां निचला हिस्टोग्राम)। इसके अलावा, IF धुंधला ने प्रदर्शित किया कि miR - 466 f -3 p ओवरएक्प्रेशन, लेकिन निषेध नहीं, डेंड्राइटिक स्पाइन (चित्र 2B, ऊपरी पैनल और निचले बाएँ हिस्टोग्राम) के घनत्व में भी वृद्धि हुई है। हमने पोस्टसिनेप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (PSD -95) के लिए सह-धुंधला भी किया और उत्तेजक सिनैप्स (चित्र 2B, निचला दायां हिस्टोग्राम) की सटीक संख्या स्थापित करने के लिए कोलोकलाइज़्ड डेंड्राइटिक स्पाइन के घनत्व की गणना की, जिससे पता चला कि miR{{40 }}f-3p overexpression ने अन्य नियंत्रण समूहों की तुलना में PSD-95-सकारात्मक रीढ़ की घनत्व में वृद्धि की। हालांकि, miR-466f-3p निषेध ने PSD के घनत्व को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला-95-नियंत्रण समूहों के संबंध में सकारात्मक रीढ़ (चित्र 2B, निचला दायां हिस्टोग्राम)। साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि न्यूरोनल उत्तेजना के अभाव में, miR-466f-3p निषेध अकेले उत्तेजक सिनैप्स या कुल वृक्ष के समान रीढ़ की घनत्व को प्रभावित नहीं करता है।