भाग 1: एक क्लोन कुत्ते का उत्पादन करने के लिए एक सेल रक्षक के रूप में एक्टियोसाइड का प्रभाव

जी हाई ली1☯, जू लैन चुन1☯, केउन जंग किम1, यून यंग किम1, डोंग-ही किम1, बो माययोंग ली1, किल वू हान1, कांग-सन पार्क1, क्यूंग-बॉन ली2, मिन क्यू किम1*

1 डिवीजन ऑफ एनिमल एंड डेयरी साइंस, कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चर एंड लाइफ साइंस, चुंगनाम नेशनल यूनिवर्सिटी, डेजॉन, कोरिया गणराज्य,

2 जीव विज्ञान शिक्षा विभाग, शिक्षा महाविद्यालय,चोंनाम नेशनल यूनिवर्सिटी, ग्वांगजू, कोरिया गणराज्य

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सार

सोमैटिक सेल न्यूक्लियर ट्रांसफर (SCNT) एक प्रसिद्ध प्रयोगशाला तकनीक है। SCNT के सिद्धांत में एक दैहिक कोशिका को एक प्राप्तकर्ता oocyte में इंजेक्ट करके एक दैहिक नाभिक को पुन: प्रोग्राम करना शामिल है जिसका नाभिक हटा दिया गया है। इसलिए, नाभिक दाता कोशिकाओं को SCNT में एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है। G0/G1 चरण में नाभिक दाता कोशिकाओं के सेल चक्र तुल्यकालन को संपर्क अवरोध या सीरम भुखमरी से प्रेरित किया जा सकता है। इस अध्ययन में,एक्टोसाइड, एक फेनिलप्रोपेनाइड ग्लाइकोसाइड यौगिक, यह निर्धारित करने के लिए जांच की गई थी कि क्या यह सेल चक्र तुल्यकालन, साइटोप्रोटेक्शन को प्रेरित करने और कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट में SCNT दक्षता में सुधार के लिए लागू है। प्राथमिक कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट का इलाज के साथ किया गया थाएक्टोसाइड(10, 30, 50 μM) विभिन्न समयावधियों (24, 48, और 72 घंटे) के लिए। G0/G1 चरण में सेल चक्र तुल्यकालन प्रेरण की विधि के साथ महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था:एक्टोसाइडउपचार, संपर्क निषेध, या सीरम भुखमरी। हालांकि, इन तीन उपचारों में, सीरम भुखमरी के परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) (99.5 ± 0.3 प्रतिशत) और एपोप्टोसिस के स्तर में काफी वृद्धि हुई है। परिणामों से यह भी पता चला किएक्टोसाइडकैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट में परिगलन सहित आरओएस और एपोप्टोसिस प्रक्रियाओं को कम किया, और सेल अस्तित्व में सुधार हुआ। कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट के साथ इलाज किया जाता हैएक्टोसाइडG0/G1 चरण में सफलतापूर्वक गिरफ्तार किया गया। इसके अलावा, एक्टोसाइड के साथ इलाज किए गए नाभिक दाता कोशिकाओं का उपयोग करके पुनर्निर्मित भ्रूण ने एक स्वस्थ क्लोन कुत्ते का उत्पादन किया, लेकिन संपर्क अवरोध के अधीन नाभिक दाता कोशिकाओं का उपयोग करके उत्पादित भ्रूण नहीं। निष्कर्ष के तौर पर,एक्टोसाइडन्यूक्लियस डोनर सेल्स का प्रेरित सेल साइकल सिंक्रोनाइज़ेशन कैनाइन SCNT की दक्षता में सुधार करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका होगा क्योंकि इसके साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव हैं।

सिस्टैंच एक्टोसाइड प्रतिरक्षा बढ़ा सकता है

परिचय

SCNT तकनीक का उपयोग कृषि उद्देश्यों के लिए और जैव चिकित्सा संसाधनों के रूप में आनुवंशिक रूप से बेहतर या हेरफेर किए गए जानवरों के उत्पादन के लिए किया गया है। रोग के पशु मॉडल की बढ़ती आवश्यकता के साथ, विलुप्त होने के खतरे में जानवरों को बचाने, पुनर्योजी चिकित्सा के लिए स्टेम सेल, अंग प्रत्यारोपण, आदि, SCNT का उपयोग करने वाले जानवरों के क्लोनिंग में रुचि हाल के दिनों में बढ़ रही है [1-5]। भले ही क्लोन किए गए जानवरों का उत्पादन सफल रहा हो, एससीएनटी की दक्षता अभी भी बहुत कम है [6]। कम SCNT भ्रूण विकास क्षमता के कारणों में कई कारक शामिल हैं जो प्राप्तकर्ता oocytes की गुणवत्ता, नाभिक दाता कोशिकाओं की गुणवत्ता और सरोगेट मदर की स्थिति से संबंधित हैं [7–10]।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एपोप्टोसिस को महिला प्रजनन प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए जाना जाता है, जिसमें विवो और इन विट्रो [11-14] में ओओसीट विकास शामिल है। आरओएस भ्रूण में साइटोप्लाज्मिक संघनन, डीएनए क्षति और एपोप्टोसिस को प्रेरित करके भ्रूण के विकास को बाधित करता है। सहायक अध्ययनों ने बताया है कि आरओएस को कम करने से इन विट्रो संस्कृति [15-17] के दौरान एससीएनटी भ्रूण विकास क्षमता में सुधार होता है। एपोप्टोसिस एक शारीरिक प्रक्रिया है जो डीएनए क्षतिग्रस्त / खराब कोशिकाओं को हटाकर सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए सामान्य प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण विकास के दौरान स्वचालित रूप से होती है। आरओएस डीएनए विखंडन का कारण बनता है और एपोप्टोटिक ब्लास्टोमेरेस को बढ़ाता है जो भ्रूण के विकास को परेशान करता है। इन विट्रो फर्टिलाइजेशन [18, 19] की तुलना में एससीएनटी के बाद आरओएस और एपोप्टोसिस की घटना अधिक बार देखी जाती है। कई अध्ययनों ने बताया कि एससीएनटी भ्रूण विकास क्षमता को सेलेनियम [20], इंसुलिन-ट्रांसफेरिन-सेलेनियम [17, 21], मेलाटोनिन [22] और ग्लूटाथियोन [23] जैसे एंटीऑक्सिडेंट का उपयोग करके आरओएस और एपोप्टोसिस के स्तर को कम करके बचाया जाता है।

पिछले अध्ययनों ने बताया कि G {0}}/G1 चरण में गिरफ्तार किए गए दाता कोशिकाओं के उपयोग ने SCNT [7, 9, 24-28] की दक्षता में सुधार किया। G0/G1 चरण में दाता कोशिकाओं में क्रोमैटिन को SCNT भ्रूण विकास क्षमता के लिए सबसे प्रभावी माना गया है। दाता कोशिका चक्र को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, संपर्क अवरोध, सीरम भुखमरी, और रासायनिक उपचारों का अक्सर उपयोग किया गया है [7, 25, 29, 30]। हालांकि, सीरम भुखमरी ने कोशिका अस्तित्व को कम कर दिया और डीएनए विखंडन को बढ़ा दिया, जिससे एपोप्टोसिस [31] हो गया। रासायनिक निषेध G0/G1 चरण में कोशिका चक्र को रोकने के लिए एक अन्य रणनीति है जिसमें रोस्कोविटाइन [29, 32], डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) [33], और साइक्लोहेमेसाइड (CHX) [34] जैसे अवरोधकों का उपयोग किया जाता है। सिंक्रनाइज़ेशन के लिए उपयोग की जाने वाली विधि की दक्षता दाता कोशिकाओं के प्रकार और प्रजातियों से प्रभावित होती है। इष्टतम दाता सेल सिंक्रनाइज़ेशन के लिए, उपयोग की जाने वाली विधियों के विभिन्न पहलुओं का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है।

एक्टियोसाइड(वर्बास्कोसाइड के रूप में भी जाना जाता है) [{0}}(3, 4-डायहाइड्रॉक्सी फिनाइल एथिल)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] सिरिंगा वल्गरिस के बैंगनी फूलों से अलग किया जाता है। एक्टोसाइड युक्त पौधों को एंटी-माइक्रोबियल और एंटी-फंगल गतिविधियों के लिए जाना जाता है [35-37], और सूजन को रोकते हैं। दरअसल, एक्टोसाइड इन विट्रो और विवो में विभिन्न जैविक गतिविधियों को प्रदर्शित करता है जैसे कि एंटी-ऑक्सीडेटिव गतिविधि, एंटी-एपोप्टोटिक गतिविधि, विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ साइटोटोक्सिसिटी, और जी 0 / जी 1 चरण में सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन एक साइक्लिन-आश्रित के रूप में किनेज (सीडीके) अवरोधक [38]। उदाहरण के लिए ली एट अल। [38] ने बताया कि एक्टोसाइड उपचार G0/G1 चरण में कोशिका चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करके मानव प्रोमायलोसाइटिक एचएल -60 ल्यूकेमिया कोशिकाओं के प्रसार को रोक सकता है। हालांकि, कैनाइन एससीएनटी की दक्षता पर एक्टोसाइड-उपचारित दाता कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन किया जाना बाकी है।

इस अध्ययन में, के प्रभावएक्टोसाइडसेल चक्र तुल्यकालन पर, ROS, औरapoptosisकैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट की जांच की गई। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके कोशिका चक्र तुल्यकालन, ROS और एपोप्टोसिस का विश्लेषण किया गया था। एक्टोसाइड से उपचारित दाता कोशिकाओं की दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, SCNT भ्रूणों को सुसंस्कृत किया गया और एक प्राप्तकर्ता कुत्ते में स्थानांतरित किया गया, और सफलतापूर्वक एक स्वस्थ क्लोन कुत्ते का उत्पादन किया गया।

सिस्टैंचेइलाज कर सकते हैंगुर्दारोग में सुधारगुर्देसमारोह

सामग्री और तरीके

नैतिक वक्तव्य

इस अध्ययन में, 44 मादा मोंगरेल कुत्तों (1-6 वर्ष की आयु) का उपयोग ओओसीट दाताओं और भ्रूण स्थानांतरण सरोगेट्स के रूप में किया गया था, और एक मादा बीगल (2 वर्ष की आयु) का उपयोग भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों की स्थापना के लिए किया गया था। सभी पशु प्रयोगों को चुंगनाम राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या: CNU -00487) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था और IACUC द्वारा प्रकाशित "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। चुंगनाम राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के। कुत्तों को एक तापमान और वेंटिलेशन नियंत्रण प्रणाली के साथ अलग-अलग पिंजरों में घर के अंदर पाला गया। कुत्तों को एक दिन में एक बार व्यावसायिक आहार दिया जाता था और पानी का विज्ञापन दिया जाता था। सभी जानवरों के प्रयोगों में, कुत्तों को शुरू में 6 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन और ज़ाइलाज़िन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और 2 प्रतिशत आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी स्थिति में बनाए रखा गया था। सर्जरी के अंत में, किसी भी संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक्स (प्रोकेन पेनिसिलिन जी, बेंजाथिन पेनिसिलिन जी, और डायहाइड्रोस्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट) का प्रबंध किया गया था। सर्जरी के बाद, कुत्तों को मीठे पानी के साथ अपने व्यक्तिगत पिंजरों में स्थानांतरित कर दिया गया, निगरानी की गई, और पशु चिकित्सक प्रभारी से विशेष देखभाल प्रदान की गई, ताकि जानवरों को इसकी आवश्यकता होने पर आवश्यक उपचार किया जा सके।

रसायन

सभी रसायनों को सिग्मा-एल्ड्रिच केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। Acteoside चीन में Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. से प्राप्त किया गया था।

कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट {0}} दिन पुराने भ्रूण से प्राप्त किए गए थे। संक्षेप में, एक मादा बीगल को एक नर बीगल के शुक्राणु के साथ कृत्रिम रूप से निषेचित किया गया था। 28 दिनों के बाद, मादा बीगल में गर्भावस्था की पुष्टि की गई और सेलियोहिस्टेरेक्टॉमी द्वारा 5 भ्रूण प्राप्त किए गए। भ्रूण को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस; गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक, वॉलथम, मैसाचुसेट्स, यूएसए) में तीन बार धोया गया था। भ्रूण के सिर, आंतरिक अंगों और अंगों को सर्जिकल ब्लेड से हटा दिया गया और शरीर के शेष हिस्सों को पीबीएस में कीमा बनाया गया। भ्रूण के टुकड़ों को 5 मिनट के लिए 400 × पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा दो बार धोया गया और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (उत्पाद संख्या P4458) और 20 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS; गिब्को) के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM; गिब्को) में सुसंस्कृत किया गया। 5 प्रतिशत CO2 और 95 प्रतिशत हवा के आर्द्र वातावरण में 39 डिग्री पर। जब कोशिकाएँ 5-7 दिनों के बाद संगम पर पहुँचीं, तो उन्हें 2 मिनट के लिए 0.25 प्रतिशत ट्रिप्सिन-ईडीटीए (गिब्को) से उपचारित किया गया और काटा गया। दो अलग-अलग भ्रूणों से दो कैनाइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनें स्थापित की गईं। कोशिकाओं को एफबीएस में 10 प्रतिशत डीएमएसओ में जमे हुए थे और तरल नाइट्रोजन में -196 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था जब तक कि उनका उपयोग नहीं किया गया।

सेल उपचार

जमे हुए कैनाइन फ़ाइब्रोब्लास्ट को 8 0 प्रतिशत संगम तक पिघलाया और सुसंस्कृत किया गया था। बाद के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को 4 से 7 बार काटा और पारित किया गया। कोशिकाओं को 60 मिमी संस्कृति व्यंजनों में 106/एमएल की एकाग्रता में वरीयता दी गई थी। कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था (1) डीएमईएम 10 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पांच दिनों के लिए पूरक (संपर्क निषेध), (2) डीएमईएम 0.5 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पांच दिनों के लिए पूरक (सीरम भुखमरी) , या (3) डीएमईएम 10 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है जिसमें 10 माइक्रोन, 30 माइक्रोन, या 50 माइक्रोन 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे (एक्टोसाइड उपचार) के लिए एक्टोसाइड होता है।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिका चक्र विश्लेषण

कोशिका चक्र चरणों के विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को {0}}.25 प्रतिशत ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके काटा गया और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया। अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरने वालों को त्याग दिया गया और कोशिकाओं को 0 .3 एमएल पीबीएस में फिर से जोड़ा गया। निर्धारण के लिए, {{10}}.7 एमएल कोल्ड एब्सोल्यूट इथेनॉल को सेल सस्पेंशन में ड्रॉप-वार जोड़ा गया, कोमल भंवर द्वारा मिश्रित किया गया, और रात भर 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। स्थिर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज किया गया और दो बार ठंडे पीबीएस से धोया गया। कोशिकाओं को 0.25 एमएल पीबीएस में 10 मिलीग्राम/एमएल RNase के 5 μL के साथ पूरक किया गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। फिर, 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) का 10 μL जोड़ा गया। सेल चक्र का विश्लेषण G0/G1 (2n), S (2n और 4n के बीच), और G2/M (4n) चरणों में FACS कैलिबर फ्लो साइटोमीटर (बेक्टन डिकिंसन, सैन जोस, CA) का उपयोग करके सेल आबादी में डीएनए सामग्री की मात्रा द्वारा किया गया था। , अमेरीका)।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा आरओएस का पता लगाना

जीवित कोशिकाओं में ROS का मूल्यांकन एक इमेज-iT™ लाइव ग्रीन रिएक्टिव ऑक्सीजन स्पीशीज़ डिटेक्शन किट (आणविक जांच, यूजीन, OR, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, संस्कृति माध्यम को हटाने के बाद कोशिकाओं को पीबीएस में धोया गया था, और 100 माइक्रोन टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड (टीबीएचपी) काम करने वाले समाधान के 2 एमएल को जोड़ा गया था। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन के बाद, टीबीएचपी काम कर रहे समाधान को हटा दिया गया था, और कोशिकाओं को धीरे से 3 बार गर्म डल्बेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस; गिब्को) में धोया गया था। कोशिकाओं को तब 25 μM 5- (और -6) -कार्बोक्सी -2, 7-डाइक्लोरोडिहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (कार्बोक्सी-H2DCFDA) में 37 डिग्री पर 37 डिग्री पर अंधेरे में इनक्यूबेट किया गया था। . ऑक्सीकृत होने पर, कार्बोक्सी-H2DCFDA हरे रंग की प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, जिससे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ROS के मूल्यांकन की सुविधा मिलती है। टीबीएचपी, जो आरओएस उत्पादन का एक प्रेरक है, का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कोशिकाओं के नाभिक को Hoechst 33342 के साथ दाग दिया गया था। पीबीएस के साथ 3 बार धोने के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा काटा गया, पीबीएस में निलंबित कर दिया गया, और एक FACS कैलिबर फ्लो साइटोमीटर (बेक्टन डिकिंसन, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया। ) आरओएस गठन की दर की गणना आरओएस सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को कुल सेल संख्या से विभाजित करके और मूल्यों को प्रतिशत में परिवर्तित करके की गई थी।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस विश्लेषण

एपोप्टोसिस विश्लेषण एक Vybran1 एपोप्टोसिस परख किट # 2 (आणविक जांच, यूजीन, या, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा काटा गया और ठंडे पीबीएस के साथ 2 बार धोया गया। इसके बाद, 1 × एनेक्सिन-बाइंडिंग बफर के 100 μL, एलेक्सा फ्लोर 488 एनेक्सिन V के 5 μL और PI के 1 μL को कोशिकाओं में जोड़ा गया। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, 1 × एनेक्सिन-बाइंडिंग बफर के 400 μL को जोड़ा गया और सेल निलंबन को धीरे से मिलाया गया। एनेक्सिन वी, जो एक सीए 2 प्लस-निर्भर फॉस्फोलिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन है, में फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस) के लिए एक उच्च संबंध है। जीवित कोशिकाओं में, PS आंतरिक साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पर स्थित होता है और एपोप्टोटिक कोशिकाओं में बाहरी साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में स्थानांतरित हो जाता है। एपोप्टोटिक कोशिकाओं को बाहरी झिल्ली पर पीएस के लिए बाध्यकारी एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ लेबल किए गए एनेक्सिन वी द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है। इसके अलावा, पीआई, जो एक न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग डाई है, लाल फ्लोरेसेंस के साथ नेक्रोटिक कोशिकाओं को दाग देता है। इसलिए, हरे रंग की प्रतिदीप्ति के साथ एपोप्टोटिक कोशिकाओं, लाल प्रतिदीप्ति के साथ परिगलित कोशिकाओं, और कोशिकाओं में बहुत कम या कोई प्रतिदीप्ति के साथ जीवित कोशिकाओं का विश्लेषण एफएसीएस कैलीबुर प्रवाह साइटोमीटर (बेक्टन डिकिंसन, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। दरों की गणना जीवित, परिगलित, या एपोप्टोटिक कोशिकाओं के सेल नंबरों को कुल सेल नंबर से विभाजित करके और परिकलित मानों को प्रतिशत में परिवर्तित करके की गई थी।

विवो में परिपक्व oocytes का संग्रह

प्रत्येक कुत्ते में ओव्यूलेशन का पता लगाने के लिए, सीरम प्रोजेस्टेरोन (पी 4) एकाग्रता को एक डीएसएल -3900 सक्रिय प्रोजेस्टेरोन कोटेड-ट्यूब रेडियोइम्यूनोसे किट (डायग्नोस्टिक सिस्टम लेबोरेटरीज, इंक।, TX, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। जैसा कि पहले बताया गया था [39, 40], जिस दिन पी4 की सांद्रता 4 एनजी/एमएल से अधिक हो गई थी, उस दिन को ओव्यूलेशन का दिन माना जाता था। ओव्यूलेशन के बाद 72 घंटे में, सड़न रोकनेवाला सर्जिकल प्रक्रियाओं का उपयोग करके लैपरोटॉमी द्वारा oocytes को पुनः प्राप्त किया गया। डिंबवाहिनी के फिम्ब्रिया को बर्सल स्लिट के माध्यम से संपर्क किया गया था और एक उल्टे निकला हुआ बल्ब स्टील सुई (18 गेज, 7.5 सेमी) का उपयोग करके कैन्युलेट किया गया था। एक 24 गेज इंट्रावेनस (IV) कैथेटर (एंजियोकैथ ™ प्लस, बेक्टन डिकिसन कोरिया इंक, सियोल, कोरिया) को यूटरोट्यूबल जंक्शन के पास डिंबवाहिनी के इस्थमस में डाला गया था, और मध्यम 199 (गिब्को) को 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया था। IV कैथेटर के माध्यम से 5 प्रतिशत FBS को डिंबवाहिनी में पेश किया गया था। Oocytes को तुरंत प्रयोगशाला में ले जाया गया। 31 कुत्तों से कुल 316 oocytes एकत्र किए गए थे।

दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण और भ्रूण स्थानांतरण SCNT पहले वर्णित [39] के रूप में किए गए थे। संक्षेप में, विवो परिपक्व oocytes में क्यूम्यलस कोशिकाओं को हटाने के लिए, क्यूम्यलस-ओओसाइट-कॉम्प्लेक्स (सीओसी) को 0 .1 प्रतिशत हाइलूरोनिडेस में दोहराव से पाइप किया गया था। पहले ध्रुवीय शरीर और मेटाफ़ेज़- II गुणसूत्रों को आकांक्षा द्वारा हटा दिया गया था। Hoechst 33342 (बिस्बेनज़िमाइड) के साथ धुंधला हो जाने से सम्मिलन की पुष्टि हुई। कैनाइन भ्रूण फ़ाइब्रोब्लास्ट का इलाज 48 घंटे के लिए 3 0 μM एक्टोसाइड के साथ किया गया और फिर 0 .25 प्रतिशत ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ काटा गया। एक एकल कोशिका, जिसमें एक चिकनी कोशिका झिल्ली होती है, को प्रत्येक सम्मिलित अंडाणु के पेरिविटेलिन स्थान में स्थानांतरित किया गया था। दोहे संतुलित जलसेक माध्यम थे, जो 0.26 एम मैनिटोल माध्यम है जिसमें 0.1 मिमी HEPES, 0.5 मिमी MgSO4, और 0.05 प्रतिशत BSA, और दो दालों से जुड़े हुए हैं। इलेक्ट्रो-सेल फ्यूजन उपकरण (एनईपीए जीन कं, चिबा, जापान) से प्रत्यक्ष वर्तमान (15 μs के लिए 69-75 वी) का। इन दोहों को मध्यम 199 में 1 घंटे 30 मिनट के लिए 10 प्रतिशत एफबीएस के साथ पूरक किया गया था। जुड़े हुए SCNT भ्रूणों की जाँच की गई और उन्हें 4 मिनट के लिए 10 μM कैल्शियम आयनोफोर (उत्पाद संख्या C7522, सिग्मा) में इनक्यूबेट करके रासायनिक सक्रियता को प्रेरित किया गया। SCNT भ्रूणों को धोया गया और फिर एक संशोधित सिंथेटिक डिंबवाहिनी द्रव माध्यम (mSOF) [41] में रखा गया जिसमें 1.9 mM 6- डाइमिथाइलैमिनोपुरिन (6- DMAP) 3 घंटे 30 मिनट के लिए था। एससीएनटी के बाद 4 घंटे के भीतर इंजीनियर भ्रूणों को शल्यचिकित्सा से ऑस्ट्रस-सिंक्रनाइज़्ड सरोगेट्स के डिंबवाहिनी में स्थानांतरित कर दिया गया। भ्रूण स्थानांतरण के 26 दिनों (जल्द से जल्द) में अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा गर्भावस्था की पुष्टि की गई थी।

सक्रिय घटकएक्टोसाइडमेंसिस्टैंचे

क्लोन भ्रूणों की इन विट्रो संस्कृति में

SCNT के बाद, क्लोन किए गए भ्रूणों को संशोधित सिंथेटिक डिंबवाहिनी द्रव माध्यम (mSOF) (माइक्रोड्रॉप प्रति 10 क्लोन भ्रूण) के 40 μL सूक्ष्म बूंदों में 38.5 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 और 95 प्रतिशत हवा में खनिज तेल से मढ़ा गया था। SCNT भ्रूण का विकास दिन 2 से दिन 8 तक देखा गया।

एक क्लोन कुत्ते का माइक्रोसेटेलाइट और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए विश्लेषण

कुल डीएनए परमाणु दाता कोशिकाओं से निकाला गया था, और निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार जी-स्पिन ™ जीनोमिक डीएनए एक्सट्रैक्शन किट (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, कोरिया) द्वारा oocyte दाता कुत्तों, सरोगेट कुत्तों और क्लोन कुत्ते की त्वचा को निकाला गया था। और फिर TE बफर के 1 0 0 μL (10 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 1 मिमी ईडीटीए, पीएच 8.0) में eluted किया गया था। डीएनए की मात्रा को बायोस्पेक-नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमदज़ु कॉर्प, जापान) द्वारा मापा गया था।

माइक्रोसेटेलाइट जीनोटाइपिंग के लिए, निम्नलिखित 7 विशिष्ट जीनों का चयन किया गया: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054, और FH2079। पीसीआर को 95 डिग्री पर 10 मिनट के लिए प्रारंभिक विकृतीकरण के साथ प्रदर्शन किया गया था, 20 चक्रों में 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण शामिल था, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री ({15}} .1 डिग्री / चक्र), विस्तार के 1 मिनट पर 72 डिग्री, और 15 और चक्रों में 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण, 56 डिग्री पर 30 सेकंड के लिए एनीलिंग, 72 डिग्री पर 1 मिनट का विस्तार, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार शामिल है।

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अनुक्रमण के लिए, कैनाइन mtDNA (जेनबैंक परिग्रहण संख्या: U96639) के पूर्ण न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों को संश्लेषित किया गया था: साइटोक्रोम बी क्षेत्र (L14,252 -L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG, R: AGTTCCGAATAAGGGATGGCAGAG; साइटोक्रोम c ऑक्सीडेज सबयूनिट II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAAACT, R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 -L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; डी-लूप क्षेत्र (L15,622 - L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC, R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]। इस विश्लेषण के लिए पीसीआर चक्रों में शामिल हैं: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री प्रारंभिक विकृतीकरण, 95 डिग्री पर 30 सेकंड के लिए विकृतीकरण के 5 चक्र, 60 डिग्री पर 40 सेकंड की एनीलिंग (-1 डिग्री / चक्र), विस्तार के 1 मिनट 72 डिग्री, और 95 डिग्री पर 30 सेकंड के लिए विकृतीकरण के अगले 30 चक्र, 55 डिग्री पर एनीलिंग के 40 सेकंड, 72 डिग्री पर विस्तार के 1 मिनट, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार। एबीआई प्रिज्म 3100 जेनेटिक एनालाइजर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स इंक, यूएसए) का उपयोग करके विभिन्न प्रयोगों से पीसीआर अंशों का विश्लेषण किया गया। बायोएडिट सॉफ्टवेयर (v.7.0.5.3) के साथ नियंत्रण क्षेत्रों के लिए अनुक्रम असेंबली, कई संरेखण, और संरेखण ट्रिमिंग का प्रदर्शन किया गया।

एक्टोसाइडमेंसिस्टैंचेप्रतिरक्षा प्रणाली को बढ़ा सकते हैं