भाग 1|ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनसे 3 बी मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में अति सक्रियता मधुमेह गुर्दे की बीमारी की प्रगति की भविष्यवाणी करता है

जियानहुई लिआंग, एट अल

1रक्त शोधन केंद्र, नेफ्रोलॉजी संस्थान, झेंग्झौ विश्वविद्यालय, झेंग्झौ, चीन का पहला संबद्ध अस्पताल; 2डिपार्टमेंट ऑफ मेडिसिन, डिवीजन ऑफ किडनी डिजीज एंड हाइपरटेंशन, रोड आइलैंड हॉस्पिटल, ब्राउन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, प्रोविडेंस, रोड आइलैंड, यूएसए; और 3डिपार्टमेंट ऑफ मेडिसिन, डिवीजन ऑफ नेफ्रोलॉजी, यूनिवर्सिटी ऑफ टोलेडो कॉलेज ऑफ मेडिसिन, टोलेडो, ओहियो, यूएसए

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बढ़ते सबूत ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनसे (जीएसके) 3 बी को विविध में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में इंगित करते हैंगुर्दा रोग. हालांकि, इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के एक महत्वपूर्ण ट्रांसड्यूसर के रूप में, मधुमेह में GSK3b की भूमिकागुर्दा बीमारीअनिश्चित रहता है। डीबी / डीबी चूहों में, कुल और सक्रिय जीएसके 3 बी की गुर्दे की अभिव्यक्ति तेजी से बढ़ रही थी। यह मधुमेह के विकास से पहले थागुर्दा बीमारीऔर के संकेतों की प्रगति के साथ सहसंबद्धमधुमेहगुर्दाचोट, जिसमें एल्बुमिनुरिया और ग्लोमेरुली और ट्यूबलोइंटरस्टीशियल में बाह्य मैट्रिक्स संचय शामिल हैं। इन विट्रो में, ग्लोमेरुलर पॉडोसाइट्स, मेसेंजियल सेल्स, और रीनल ट्यूबलर सेल्स का डायबिटिक परिवेश से प्रेरित GSK3boverexpression और हाइपरएक्टिविटी के लिए एक्सपोजर, जो इसे प्राप्त करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त लगता हैमधुमेहगुर्दे की कोशिकाओं में सेलुलर क्षति, क्योंकि डायबिटिक मिलियू के साइटोपैथिक प्रभाव को जीएसके 3 बी नॉकडाउन द्वारा कम किया गया था, लेकिन सामान्य परिवेश में भी संवैधानिक रूप से सक्रिय जीएसके 3 बी की एक्टोपिक अभिव्यक्ति द्वारा नकल की गई थी। डायबिटिक नेफ्रोपैथी के अलग-अलग चरणों वाले रोगियों से प्राप्त गुर्दे की बायोप्सी नमूनों में असंगति, डायबिटिक नेफ्रोपैथी की गंभीरता से जुड़े ग्लोमेरुली और रीनल ट्यूबल में कुल और सक्रिय जीएसके 3 बी की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का पता चला। इसके अलावा, टाइप 2 मधुमेह के रोगियों के पूर्वव्यापी समूहों में, जिनका पांच वर्षों से अधिक समय तक पालन किया गया था, बैंक्ड यूरिनरी एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में जीएसके 3 बी की सापेक्ष गतिविधि गुर्दे की हानि के विकास या प्रगति के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता वक्र विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में जीएसके 3 बी गतिविधि ने मधुमेह के रोगियों को स्थिर किडनी फ़ंक्शन वाले प्रगतिशील गुर्दे की हानि के साथ भेदभाव करने में एल्ब्यूमिन्यूरिया की तुलना में बेहतर शक्ति प्रदान की। इस प्रकार, जीएसके3बी की वृक्क अभिव्यक्ति और गतिविधि प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​मधुमेह अपवृक्कता में प्रवर्धित होती है। इसलिए, मूत्र छूटने वाली कोशिकाओं में GSK3b मधुमेह की भविष्यवाणी के लिए एक उपन्यास बायोमार्कर के रूप में काम कर सकता हैगुर्दाबीमारीप्रगति।

मधुमेह गुर्दे की बीमारी(डीकेडी) संयुक्त राज्य अमेरिका और अन्य विकसित देशों में अंतिम चरण के गुर्दे की विफलता का एक प्रमुख कारण बना हुआ है। हालांकि, मधुमेह मेलेटस वाले प्रत्येक रोगी मधुमेह नेफ्रोपैथी (डीएन) विकसित नहीं करते हैं, जैसा कि कई लंबे समय से प्रमाणित है- शब्द महामारी विज्ञान अनुवर्ती अध्ययन। 3 इस विषम परिणाम का कारण पूरी तरह से समझा नहीं गया है, लेकिन प्रतीत होता है कि बहुक्रियात्मक है, जिसमें आनुवंशिकी, वातावरण, पूर्व-मौजूदा सहित विभिन्न कारक शामिल हैं।गुर्दाबीमारी, और मधुमेह की गंभीरता। 4,5 खराब ग्लाइसेमिक नियंत्रण एल्बुमिनुरिया और डीएन के लिए एक प्रसिद्ध जोखिम कारक रहा है। फिर भी, रोगियों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा तंग ग्लाइसेमिक नियंत्रण के बावजूद अभी भी डीएन विकसित करता है। नैदानिक ​​​​अभ्यास में, मधुमेह के रोगियों को गुर्दे की हानि के लिए प्रगति के जोखिम में स्तरीकृत करने के लिए एक संवेदनशील और सटीक बायोमार्कर को अपनाना आवश्यक है। वर्षों से, एल्ब्यूमिन्यूरिया को मधुमेह की किडनी की जटिलताओं का एक सरोगेट मार्कर माना जाता रहा है। 7,8 फिर भी, साक्ष्य के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि एल्बुमिनुरिया सटीक नहीं हो सकता है। 9,10 डीएन में एल्बुमिनुरिया और गुर्दे की हानि के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को नोट किया गया है। 11,12 यूनाइटेड किंगडम प्रॉस्पेक्टिव डायबिटीज स्टडी के आंकड़ों के अनुसार, उन रोगियों में से 13, जिन्होंने गुर्दे की दुर्बलता विकसित की, 61 प्रतिशत में पहले से एल्बुमिनुरिया नहीं था और 39 प्रतिशत ने अध्ययन के दौरान कभी भी एल्बुमिनुरिया विकसित नहीं किया। इसी तरह, अल्बुमिनुरिया विकसित करने वाले रोगियों में से केवल 24 प्रतिशत ने बाद में अध्ययन के दौरान गुर्दे की हानि का विकास किया। दूसरे शब्दों में, माइक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया या मैक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया वाले रोगियों के लिए, प्रचलित बहुमत गुर्दे की हानि का विकास नहीं कर सकता है। इस प्रकार ये डेटा डीकेडी की प्रगति के दौरान हमेशा गुर्दे की हानि से पहले एल्बुमिनुरिया के शास्त्रीय प्रतिमान को चुनौती देते हैं। जैसे, उपन्यास बायोमार्कर की पहचान करना अनिवार्य है।

डीएन की भविष्यवाणी के लिए या डीएन के शीघ्र निदान के लिए। पिछले एक दशक में, कई नए अणुओं का परीक्षण किया गया है। 14-16 इनमें से ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनसे 3 (जीएसके3) एक आकर्षक उम्मीदवार के रूप में उभरा है। GSK3 एक अत्यधिक संरक्षित, सर्वव्यापी रूप से व्यक्त सेरीन / थ्रेओनीन-प्रोटीन किनेज है जिसे मूल रूप से इंसुलिन सिग्नलिंग कैस्केड का एक प्रमुख ट्रांसड्यूसर और ग्लाइकोजेनेसिस को नियंत्रित करने की विशेषता थी। GSK3 में रुचि इस अहसास के साथ बहुत बढ़ गई कि यह इसमें शामिल कई सेल सिग्नलिंग पाथवे के लिए एक अभिसरण बिंदु के रूप में भी कार्य करता है।सूजन और जलन, इम्युनोमोड्यूलेशन, भ्रूणजनन, ऊतक की चोट, मरम्मत और पुनर्जनन। 17-19 GSK3 2 आइसोफॉर्म के रूप में मौजूद है: GSK3a और GSK3b। विभिन्न अंग ऊतकों में, 2 आइसोफोर्म अलग-अलग व्यक्त किए जाते हैं। गुर्दा प्रांतस्था में, बी आइसोफॉर्म मुख्य रूप से व्यक्त किया जाता है और ग्लोमेरुली और समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में स्थित होता है। 20,21 रेनल जीएसके 3 बी ओवरएक्टिविटी गुर्दे की बीमारियों की एक विविध श्रेणी से जुड़ी हुई है, जिसमें प्रोटीन्यूरिक ग्लो-न्यूरोपैथिस और प्रगतिशील क्रोनिक किडनी रोग शामिल हैं। 22 फिर भी , इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के एक प्रमुख ट्रांसड्यूसर के रूप में, DN के रोगजनन में GSK3b की भूमिका अभी तक अज्ञात है। यह चित्रित किया जाना बाकी है कि क्या गुर्दे में GSK3b विकृति डीएन में शामिल है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने गैर-इंसुलिन-आश्रित डीएन के डीबी / डीबी मुराइन मॉडल से प्राप्त गुर्दे के नमूनों में कुल और सक्रिय जीएसके 3 बी की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की और टाइप 2 डीएन के अलग-अलग चरणों वाले रोगियों से किडनी बायोप्सी ऊतकों में। इसके अलावा, टाइप 2 मधुमेह वाले रोगियों के पूर्वव्यापी समूहों में, कुल और सक्रिय GSK3b के अभिव्यक्ति स्तर को मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में मापा गया था, जिन्हें मूत्र-आधारित तरल किडनी बायोप्सी के रूप में नमूना लिया गया था। हमने बेसलाइन यूरिनरी एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में GSK3b के अभिव्यक्ति स्तर या इसके सक्रिय रूप और मधुमेह के रोगियों में गुर्दे की हानि के विकास या प्रगति के बीच संबंधों की जांच की।

परिणाम

GSK3b डीबी/डीबी चूहों में वृक्क पैरेन्काइमल कोशिकाओं में अतिसक्रिय और अतिसक्रिय है, जो एल्बुमिनुरिया और मधुमेह गुर्दे की चोट की प्रगति से जुड़ा है

लेप्टिन रिसेप्टर की कमी वाले डीबी / डीबी चूहों टाइप 2 मधुमेह मेलिटस और डीएन के लिए अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं। 10 सप्ताह की उम्र से शुरू होकर, db/db चूहों में स्वतः ही . के शुरुआती लक्षण विकसित हो जाते हैंगुर्दे की चोटें, प्रगतिशील एल्बुमिनुरिया और ग्लोमेरुली में मैट्रिक्स संचय की विशेषता है। इसके विपरीत, आयु-मिलान नियंत्रण (डीबी / एम) चूहों में सामान्य ग्लाइसेमिया होता है और इसका कोई ध्यान देने योग्य प्रमाण नहीं होता हैगुर्दे की बीमारी. 10 सप्ताह की आयु से शुरू होने वाले एक प्रयोग में, db/db चूहों बनाम नियंत्रण db/m चूहों में कुल (चित्र 1) और सक्रिय (चित्र 2) GSK3b (Y216 [p-GSK3B] पर फॉस्फोराइलेटेड) की गुर्दे की अभिव्यक्ति उत्तरोत्तर उन्नत की गई थी ( चित्रा 1 बी और 2 बी)। यह मुख्य रूप से ग्लोमेरुली (चित्रा 1 ए) में पोडोसाइट्स और मेसेंजियल कोशिकाओं और ट्यूबलोइंटरस्टीशियल (चित्रा 2 ए) में ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के लिए स्थानीयकृत था, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला द्वारा दिखाया गया है। पूरे किडनी होमोजेनेट्स (चित्रा 1 सी और 2 सी) के इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा रूपात्मक निष्कर्षों की पुष्टि की गई थी। प्रतिगमन विश्लेषण से पता चला है कि ग्लोमेरुली में कुल (चित्रा 1 डी) और सक्रिय (चित्रा 2 डी) जीएसके 3 बी की धुंधला तीव्रता अलग-अलग उम्र में डीबी / डीबी चूहों में एल्ब्यूमिन्यूरिया के मूत्र उत्सर्जन के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है। यहां तक ​​कि डीबी/डीबी चूहों में मधुमेह के प्रारंभिक चरण में, जैसे कि 10 या 14 सप्ताह की उम्र में, जीएसके 3 बी की गतिविधि गुर्दे में प्रमुखता से बढ़ गई थी, जैसा कि पी-जीएसके 3 बी (चित्र 2) के एक महत्वपूर्ण प्रेरण से परिलक्षित होता है। ऐसा लगता है कि प्रारंभिक अवस्था में db/db चूहों के गुर्दे में GSK3b अति सक्रियता काफी हद तक पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों के कारण थी, जैसे कि Y216 पर फॉस्फोराइलेशन, लेकिन बाद के चरण में, यह मुख्य रूप से कुल GSK3b की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के कारण था।

डीएन की प्रगति ग्लोमेरुली और इंटरस्टीशियल दोनों में बाह्य मैट्रिक्स के बढ़ते संचय को दर्शाती है। दरअसल, जैसा कि एफएल फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला द्वारा दिखाया गया है, डीबी / डीबी माउस किडनी ने ग्लोमेरुली और इंटरस्टिशियल (चित्रा 3 ए) दोनों में फाइब्रोनेक्टिन की उत्तरोत्तर वृद्धि की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन IV (चित्रा 3बी और सी) के लिए गुर्दे के समरूपों के इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा इसकी पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, कुल और सक्रिय GSK3b की अभिव्यक्ति सकारात्मक रूप से फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ सहसंबद्ध हैगुर्दे के ऊतक(चित्रा 3डी)।

आगे यह निर्धारित करने के लिए कि क्या जीएसके 3 बी सक्रियण डीकेडी के विकास से पहले है, डीबी / डीबी और डीबी / एम चूहों को प्रीडायबिटीज चरण के दौरान 4 सप्ताह की उम्र से शुरू होने वाले एक अलग प्रयोग में पालन किया गया था। सप्ताह 7 में, db/db चूहों ने स्पष्ट हाइपरग्लाइसेमिया (सप्लीमेंट्री फिगर S1A) का प्रदर्शन किया, जो मधुमेह का सूचक है, लेकिन DKD के कोई संकेत नहीं हैं, जैसा कि सामान्य एल्बुमिनुरिया (सप्लीमेंट्री फिगर S1B) द्वारा दिखाया गया है। ध्यान दें, मधुमेह के ऐसे प्रारंभिक चरण में भी, GSK3b और p-GSK3b की गुर्दे की अभिव्यक्ति के साथ-साथ GSK3b की सापेक्ष गतिविधि को p-GSK3b / GSK3b अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया था, जैसा कि गुर्दे की बायोप्सी ऊतकों के इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा मापा गया था। इसके बाद डेंसिटोमेट्री (सप्लीमेंट्री फिगर S1C और D) है। इसके अलावा, रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि सप्ताह 7 में गुर्दे की GSK3b गतिविधि सकारात्मक रूप से 13 सप्ताह में एल्बुमिनुरिया और DKD के विकास के साथ सहसंबद्ध है (पूरक चित्रा S1E)। इसके अलावा, रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि 7 सप्ताह की उम्र में डीबी / डीबी चूहों में गुर्दे की जीएसके 3 बी गतिविधि, जब डीकेडी के कोई संकेत नहीं थे, एल्बुमिनुरिया और डीकेडी (पूरक चित्रा) के विकास की भविष्यवाणी करने में उत्कृष्ट सटीकता और शक्ति प्रदान की। एस1एफ)।

मधुमेह के वातावरण में गुर्दे की कोशिकाओं के संपर्क में आने से GSK3b की अतिसक्रियता और अति सक्रियता का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप मधुमेह संबंधी साइटोपैथिक परिवर्तन होते हैं

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या मधुमेह की स्थिति सीधे GSK3b सक्रियण को बढ़ाती हैगुर्दे की कोशिकाएं, विभिन्न किडनी सेल लाइनों की इन विट्रो संस्कृतियों में, जिसमें म्यूरिन पॉडोसाइट्स, मेसेंजियल सेल और ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं, का उपयोग किया गया था और एक मधुमेह परिवेश के संपर्क में आया था जिसमें उच्च परिवेश ग्लूकोज और ट्रांसफ़ॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (TGF) b1 होता है। डायबिटिक परिवेश में पॉडोसाइट्स के संपर्क में आने से पॉडोसाइट चोट लग गई, जो पॉडोसाइट मार्कर प्रोटीन सिनैप्टोपोडिन के नुकसान से चिह्नित है। यह कुल और सक्रिय GSK3b के प्रमुख प्रेरण के साथ किराए पर लिया गया था, जैसा कि FL फ्लोरोसेंट इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री धुंधला (चित्र 4a और b) द्वारा दिखाया गया है और इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है

(चित्र 4c और d)। सुसंस्कृत मेसेंजियल कोशिकाओं में, कुल (चित्रा 5 ए) और सक्रिय (चित्रा 5 बी) की अभिव्यक्ति जीएसके 3 बी को इसी तरह डायबिटिक मिलियू के संपर्क में आने के बाद संवर्धित किया गया था, फाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 5) जैसे बाह्य मैट्रिक्स अणुओं की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के समानांतर। इसी तरह, सुसंस्कृत वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं डायबिटिक मिलियू उपचार के बाद कुल और सक्रिय GSK3b से अधिक हो जाती हैं, और यह ट्यूबलर सेल की शिथिलता और समर्पण के साथ था, जो ज़ोनुला ऑक्लुडेंस -1 (ZO) जैसे उपकला तंग जंक्शन अणुओं की कम और बाधित अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है। -1) (चित्र 6a-d)। इसके विपरीत, ऑस्मोलैलिटी नियंत्रण के रूप में, सभी किडनी कोशिकाओं के मैनिटोल उपचार के परिणामस्वरूप कोई अलग प्रभाव नहीं पड़ा, जो सामान्य परिवेश ग्लूकोज युक्त सामान्य परिवेश द्वारा व्यक्त किया गया था। मानव मधुमेह में न केवल हाइपरग्लेसेमिया बल्कि इंसुलिन प्रतिरोध भी शामिल है। हालांकि पशु मॉडल या रोगियों में इंसुलिन प्रतिरोध से हाइपरग्लेसेमिया को पूरी तरह से अलग करना असंभव है, इन विट्रो मॉडल में उच्च ग्लूकोज बनाम इंसुलिन प्रतिरोध के पृथक प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। इंसुलिन प्रतिरोध की स्थिति की नकल करने के लिए, इंसुलिन रिसेप्टर के बी आइसोफॉर्म को सुसंस्कृत पोडोसाइट्स, मेसेंजियल कोशिकाओं और रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं (सप्लीमेंट्री फिगर S2A-C) में खटखटाया गया, और इसने GSK3b की अभिव्यक्ति और गतिविधि को सामान्य रूप से भी बढ़ाया। परिवेश, जैसा कि इम्युनोब्लॉट विश्लेषण और डेंसिटोमेट्री द्वारा दिखाया गया है। मधुमेह परिवेश के संपर्क में आने के बाद इस क्रिया को सुदृढ़ किया गया, जो GSK3b को सक्रिय करने पर इंसुलिन प्रतिरोध और उच्च ग्लूकोज के सहक्रियात्मक प्रभाव को दर्शाता है।

GSK3b अतिसक्रियता गुर्दे की कोशिका की चोट और मधुमेह के वातावरण से उत्पन्न शिथिलता के लिए आवश्यक और पर्याप्त है

यह पता लगाने के लिए कि क्या GSK3b अतिसक्रियता गुर्दे की कोशिकाओं में साइटोपैथिक परिवर्तनों में शामिल है, GSK3b गतिविधिसुसंस्कृत किडनीआरएनए हस्तक्षेप द्वारा कोशिकाओं को कृत्रिम रूप से हेरफेर किया गया था

(आरएनएआई) या जीन ओवरएक्प्रेशन। जैसा कि चित्र 7a में दिखाया गया है, RNAi स्क्रैम्बल स्मॉल का उपयोग करते हुए, RNA को दखल देने से गुर्दे की सभी कोशिकाओं में डायबिटिक मिलियू के साइटोपैथिक प्रभाव को बमुश्किल प्रभावित करता है। इसके विपरीत, GSK3b साइलेंसिंग ने पॉडोसाइट्स में डायबिटिक मिलियू-इंस्टीगेटेड सिनैप्टोपोडिन दमन को काफी हद तक निरस्त कर दिया, मेसेंजियल कोशिकाओं में फाइब्रोनेक्टिन इंडक्शन, और ZO -1 रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं में व्यवधान, यह सुझाव देते हुए कि GSK3b मधुमेह से संबंधित साइटोपैथिक परिवर्तनों को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक है। गुर्दे की कोशिकाएं। यह समझने के लिए कि क्या जीएसके 3 बी ओवरएक्प्रेशन और हाइपरएक्टिविटी डायबिटिक मिलियू से प्रेरित साइटोपैथिक प्रभावों के लिए पर्याप्त हैं, कोशिकाओं को क्षणिक रूप से एक खाली वेक्टर या जीएसके 3 बी (एस 9 ए) के संवैधानिक रूप से सक्रिय म्यूटेंट को कूटने वाले वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। हालांकि खाली वेक्टर ट्रांसफ़ेक्शन ने मुश्किल से कोई प्रभाव डाला, S9A के एक्टोपिक ओवरएक्प्रेशन के परिणामस्वरूप पॉडोसाइट्स में सिनैप्टोपोडिन अभिव्यक्ति का नुकसान हुआ, मेसेंजियल कोशिकाओं में फ़ाइब्रोनेक्टिन का उत्पादन बढ़ गया, और सामान्य परिवेश में भी वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में ZO -1 अभिव्यक्ति कम हो गई (चित्र) 7 बी), मधुमेह परिवेश के साइटोपैथिक प्रभाव की याद दिलाता है।

मानव डीएन की प्रगति जीएसके 3 बी ओवरएक्प्रेशन और रीनल ग्लोमेरुली और नलिकाओं में अति सक्रियता के साथ मेल खाती है

आगे यह सत्यापित करने के लिए कि क्या पशु और कोशिका संस्कृति मॉडल में उपरोक्त निष्कर्ष नैदानिक ​​​​डीएन पर भी लागू होते हैं, सामान्य विषयों से संग्रहीत गुर्दे की बायोप्सी ऊतक और डीएन के अलग-अलग चरणों वाले रोगियों को जीएसके 3 बी और पी-जीएसके 3 बी के लिए पेरोक्सीडेज इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के लिए संसाधित किया गया था। नियंत्रण विषयों और रोगियों की विशेषताओं को पूरक तालिका S1 में संक्षेपित किया गया है। जैसा कि चित्र 8a में दिखाया गया है, वृक्क

कुल और सक्रिय GSK3b की अभिव्यक्ति को डीएन प्रगति के साथ-साथ आवधिक एसिड-शिफ धुंधला के आधार पर रोग वर्गीकरण के अनुसार वर्गीकृत किया गया था। यह नेफ्रोसेक डेटा के अनुरूप है, जो डीएन (सप्लीमेंट्री फिगर एस 3) के रोगियों से किडनी बायोप्सी ऊतकों में काफी बढ़ी हुई जीएसके 3 बी अभिव्यक्ति को भी प्रदर्शित करता है। कुल और सक्रिय GSK3b की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति मुख्य रूप से ग्लोमेरुली में पोडोसाइट्स और मेसेंजियल कोशिकाओं और ट्यूबलोइंटरस्टीशियल (चित्रा 8 ए) में ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के लिए स्थित थी, डीबी / डीबी चूहों में निष्कर्षों के साथ। रूपात्मक परिणामों को कम्प्यूटरीकृत रूपमितीय विश्लेषण द्वारा और पुष्ट किया गया, जिससे कुल (चित्रा 8 बी) या सक्रिय (चित्रा 8 सी) जीएसके 3 बी और डीएन की गंभीरता के अभिव्यक्ति स्तरों के बीच एक सकारात्मक संबंध का पता चला।

GSK3b मधुमेह के रोगियों से एकत्रित मूत्र की एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में अति सक्रिय है और गुर्दे की हानि की प्रगति की भविष्यवाणी करता है शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत, गुर्दे की उपकला कोशिकाओं, जैसे ग्लोमेरुलर पॉडोसाइट्स और ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं का कारोबार और बहाव लगातार होता है, जिससे निरंतर उत्सर्जन होता है। मूत्र में वृक्क पैरेन्काइमल कोशिकाओं का। अनुसंधान और नैदानिक ​​​​उद्देश्यों के लिए मूत्र-आधारित गैर-इनवेसिव तरल किडनी बायोप्सी के रूप में मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। 24,25 उपरोक्त निष्कर्षों को प्रदान किया गया है कि डीएन और डीबी / डीबी के रोगियों में वृक्क पैरेन्काइमल कोशिकाओं में कुल और सक्रिय जीएसके 3 बी की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। एल्ब्यूमिन्यूरिया के प्रकट होने से पहले प्रारंभिक अवस्था में भी चूहों, हमने सोचा कि क्या मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में जीएसके 3 बी को मापने का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है

मानव DKD का विकास या प्रगति। यह अंत करने के लिए, हमने मधुमेह के बायोबैंक का उपयोग किया और एक पूर्वव्यापी कोहोर्ट अध्ययन किया। कुल मिलाकर, टाइप 2 डायबिटीज मेलिटस वाले 127 रोगियों, जिनका 2010 से झेंग्झौ विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल में अंशांकित मूत्र के बैंक्ड नमूनों के साथ पालन किया गया था, को इस अध्ययन में शामिल करने के लिए जांच की गई थी। इन रोगियों में से, 67 को बाहर रखा गया था, 10 फॉलो-अप के लिए खो गए थे, 52 को गुर्दे की शिथिलता थी या बीमारी की शुरुआत में प्रोटीनमेह था, और 5 को बाद में गुर्दे की बायोप्सी या इमेजिंग द्वारा अन्य गुर्दे की बीमारियों के रूप में निदान किया गया था। अंततः, इस पूर्वव्यापी कोहोर्ट अध्ययन (चित्र 9) में 60 रोगियों को नामांकित किया गया था। बेसलाइन पर इन रोगियों की जनसांख्यिकीय और नैदानिक ​​​​विशेषताओं को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है। किसी भी मरीज को गुर्दे की शिथिलता या बेसलाइन पर प्रोटीनुरिया से अधिक नहीं था, और अनुवर्ती अवधि के दौरान किसी ने भी डायलिसिस थेरेपी शुरू नहीं की थी। एल्ब्यूमिन्यूरिया के परिमाण के अनुसार, रोगियों को 2 उपसमूहों में वर्गीकृत किया गया था: नॉर्मोएल्ब्यूमिन्यूरिया और माइक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया समूह। मूत्र एल्ब्यूमिन उत्सर्जन (यूएई) के स्तर को छोड़कर, रोगियों के 2 उपसमूह मधुमेह की अवधि, ग्लाइकेटेड हीमोग्लोबिन स्तर, गुर्दा समारोह, रक्तचाप और निर्धारित उपचार सहित अन्य सभी नैदानिक, जैव रासायनिक और शारीरिक मापदंडों में आधार रेखा पर सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं थे। . 5 वर्षों के अनुवर्ती अनुवर्ती के बाद, 60 रोगियों में से 29 ने गुर्दे की हानि की प्रगति का प्रदर्शन किया, जिसे अनुमानित ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (ईजीएफआर) में 25 प्रतिशत की कमी या एल्बुमिनुरिया स्थिति की प्रगति के रूप में परिभाषित किया गया था, जैसा कि गंभीरता की वृद्धि से संकेत मिलता है। डीएन के विभिन्न नैदानिक ​​​​चरणों के साथ एल्बुमिनुरिया का, यानी नॉर्मोएल्ब्यूमिन्यूरिया, माइक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया, माइक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया, या ओवरट प्रोटीनुरिया। इसके विपरीत, शेष 31 रोगियों ने गुर्दे की बीमारी के बढ़ने के कोई लक्षण नहीं दिखाए (चित्र 9)। 5 साल के अनुवर्ती (तालिका 2) के बाद गुर्दे की हानि की प्रगति की स्थिति के अनुसार रोगियों के आधारभूत डेटा को स्तरीकृत किया गया था। गुर्दे की हानि की प्रगति वाले मरीजों की तुलना में, बिना प्रगति वाले लोगों की तुलना में, ईजीएफआर में उल्लेखनीय कमी और संयुक्त अरब अमीरात में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या GSK3b गुर्दे की कोशिकाओं में अतिसक्रिय या अतिसक्रिय था और

गुर्दे की हानि की प्रगति की भविष्यवाणी करने के लिए बेसलाइन एल्बुमिनुरिया के सापेक्ष मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में GSK3b गतिविधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए मापा जाता है। जैसा कि चित्र 11 में दिखाया गया है, मूत्र छूटने वाली कोशिकाओं में GSK3b की सापेक्ष गतिविधि, जिसे p-GSK3b / GSK3b अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया है, ने ROC के तहत क्षेत्र के साथ स्थिर गुर्दा समारोह वाले लोगों से प्रगतिशील गुर्दे की हानि वाले रोगियों में भेदभाव करने में उत्कृष्ट सटीकता और शक्ति का प्रदर्शन किया। कर्व 0.844 (95 प्रतिशत कॉन्फिडेंस इंटरवल, 0.747–0.941; P ¼ 0.001 ), जो बेसलाइन एलएन (यूएई) ({{20}}.750; 95 प्रतिशत विश्वास अंतराल, 0.626–0.874) के लिए आरओसी वक्र के तहत क्षेत्र से काफी बेहतर था। Youden के सूचकांक को अधिकतम करने वाली कटऑफ p-GSK3b/GSK3b अनुपात के लिए 1.24 और UAE के लिए 76 mg/24 h थी। इन कटऑफ पर, पी-जीएसके3बी/जीएसके3बी अनुपात के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता 69 प्रतिशत और 87.1 प्रतिशत और एलएन (यूएई) के लिए 69 प्रतिशत और 77.4 प्रतिशत थी। इसके अलावा, मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में कुल GSK3b स्तर के साथ p-GSK3b / GSK3b अनुपात के संयोजन ने विभेदक शक्ति में काफी सुधार किया है, ROC वक्र के तहत क्षेत्र 0.971 (95 प्रतिशत आत्मविश्वास अंतराल, 0.931–1) के साथ है। {{48} }). इन परिणामों से पता चलता है कि मधुमेह के रोगियों में गुर्दे की हानि की प्रगति की भविष्यवाणी करने में मूत्र एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में जीएसके 3 बी गतिविधि का माप यूएई की तुलना में बेहतर सटीकता प्रदान कर सकता है।

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 मिलीग्राम/24 घंटे)। बेसलाइन पर बैंक की गई यूरिनरी एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं को GSK3b और p-GSK3b (सप्लीमेंट्री फिगर S4A और B) के लिए इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा पुनर्प्राप्त और जांचा गया। GSK3b की गतिविधि का अनुमान नियंत्रण नमूनों (सप्लीमेंट्री फिगर S4C) के मूल्य के सापेक्ष प्रत्येक नमूने के लिए p-GSK3b के डेंसिटोमेट्रिक अनुपात से कुल GSK3b तक लगाया गया था।

विविध नैदानिक/जैव रासायनिक चरों में, बेसलाइन यूरिनरी एक्सफ़ोलीएटेड कोशिकाओं में GSK3b गतिविधि (p-GSK3b/GSK3b अनुपात) उन रोगियों की तुलना में काफी अधिक थी, जिन्होंने DKD विकसित नहीं किया था (सप्लीमेंट्री टेबल S3)। इसके अलावा, आरओसी वक्र विश्लेषण से पता चलता है कि मूत्र छूटने वाली कोशिकाओं में जीएसके 3 बी (पी-जीएसके 3 बी / जीएसके 3 बी अनुपात) की सापेक्ष गतिविधि ने प्रारंभिक चरण के मधुमेह रोगियों (पूरक चित्रा एस 4 डी) में डीकेडी के विकास की भविष्यवाणी करने में उत्कृष्ट सटीकता और शक्ति प्रदान की।