भाग 1 चूहों में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस पर सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड के निवारक प्रभाव

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

सार

पार्श्वभूमि:सिस्टैंच ट्यूबुलोसा एक पारंपरिक चीनी हर्बल दवा है जिसका व्यापक रूप से प्रतिरक्षा को विनियमित करने के लिए उपयोग किया जाता है।सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स(CPhGs) इस संयंत्र से मुख्य रूप से प्रभावोत्पादक सामग्री हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य चूहों में बीएसए-प्रेरित हेपेटिक फाइब्रोसिस पर सीपीएचजी के निवारक और चिकित्सीय प्रभावों का मूल्यांकन करना और संबंधित आणविक तंत्र में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं को शामिल करना था। एक अन्य पारंपरिक चीनी हर्बल दवा बीजीआरंगन (बीजेआरजी) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। तरीके: विवो प्रयोगों में, 75 एसडी चूहों को बेतरतीब ढंग से 6 समूहों में विभाजित किया गया था: सामान्य (आसुत जल-उपचार), मॉडल (बीएसए-उपचारित), सकारात्मक दवा (बीएसए-उपचारित प्लस बीजेआरजी 6 0 {{29} } मिलीग्राम/किग्रा/दिन), और बीएसए-उपचारित प्लस सीपीएचजी (125, 250, और 500 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) समूह। यकृत और प्लीहा सूचकांक, एस्पार्टेट एमिनोट्रांस्फरेज (एएसटी), ऐलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज (एएलटी), हेक्साडेसेनोइक एसिड (एचए), लैमिनिन (एलएन), टाइप III प्रोकोलेजन (पीसीIII), टाइप IV कोलेजन (IV-C), हाइड्रोक्सीप्रोलाइन का सीरम स्तर ( Hyp), और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर 1 (TGF - 1) को चूहे के लीवर में मापा गया। एच एंड ई और मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला का उपयोग करके प्रत्येक समूह के लिए यकृत फाइब्रोसिस के लिए हिस्टोपैथोलॉजिकल ग्रेड का मूल्यांकन किया गया था। TGF - 1, कोलेजन I (Col-I), और कोलेजन III (Col-III) की अभिव्यक्ति एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला विधि द्वारा निर्धारित की गई थी। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा NF-pB p65 और Col-I के अभिव्यक्ति स्तरों का निर्धारण करके इन प्रभावों का इन विट्रो में मूल्यांकन किया गया था। पश्चिमी सोख्ता द्वारा Col-I प्रोटीन अभिव्यक्ति की भी जांच की गई। परिणाम: सीपीएचजी के सभी खुराक समूहों (125, 25 0, और 500 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) ने यकृत और प्लीहा सूचकांक को काफी कम कर दिया, एएलटी, एएसटी, एचए, एलएन, पीसीआईआईआई, आईवी-सी सीरम स्तर में कमी आई। टीजीएफ - 1 सामग्री (पी <0.01, पी=""><0.01, और="" पी=""><0.01), और="" हाइप="" सामग्री।="" cphgs="" ने="" यकृत="" कोशिकाओं="" की="" सूजन="" को="" भी="" स्पष्ट="" रूप="" से="" कम="" किया="" और="" हेपेटोसाइट="" नेक्रोसिस="" और="" भड़काऊ="" सेल="" घुसपैठ="" को="" प्रभावी="" ढंग="" से="" रोका।="" इम्यूनोहिस्टोकेमिकल="" परिणामों="" से="" पता="" चला="" है="" कि="" cphgs="" ने="" tgf="" -="" 1="" (p=""><0.01, p=""><0.01, और="" p=""><0.01), col-i="" और="" col-iii="" की="" अभिव्यक्ति="" को="" काफी="" कम="" कर="" दिया="" है।="" hsc-t6="" पर="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" और="" 25="" ug/ml)="" के="" इन="" विट्रो="" प्रभावों="" से="" पता="" चला="" है="" कि="" cphgs="" ने="" nf-κb="" p65="" और="" col-i="" की="" mrna="" अभिव्यक्ति="" को="" काफी="" कम="" कर="" दिया="" है,="" और="" cphgs="" ने="" col-i="" प्रोटीन="" अभिव्यक्ति="" को="" भी="" डाउनग्रेड="" कर="" दिया="" है।="" निष्कर्ष:="" सीपीएचजी="" में="" एक="" महत्वपूर्ण="" यकृत-रोधी="" फाइब्रोसिस="" प्रभाव="" होता="" है,="" और="" यकृत="" फाइब्रोसिस="" के="" उपचार="" के="" लिए="" हेपेटोप्रोटेक्टिव="" एजेंटों="" के="" रूप="" में="" उपयोग="" किया="" जा="" सकता="">

कीवर्ड: हेपेटिक फाइब्रोसिस, सिस्टैंच ट्यूबुलोसा, फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड, केमोकाइन बीएसए, रोकथाम और चिकित्सा।

पार्श्वभूमि

हेपेटिक फाइब्रोसिस गंभीर जिगर की चोट के लिए घाव भरने की प्रतिक्रिया है जो विभिन्न कारकों से प्रेरित क्रोनिक हेपेटाइटिस के रोगजनन में होती है। ये कारक वायरल संक्रमण, शराब का दुरुपयोग, कोलेस्टेसिस और चयापचय और ऑटोइम्यून रोग हैं [1-3]। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) का प्रगतिशील संचय और घटी हुई रीमॉडेलिंग यकृत की सामान्य वास्तुकला को बाधित करती है, जिसके परिणामस्वरूप यकृत फाइब्रोसिस [4] होता है। हेपेटिक फाइब्रोसिस पुरानी जिगर की बीमारी में महत्वपूर्ण है और अक्सर अपरिवर्तनीय सिरोसिस और कार्सिनोजेनेसिस में विकसित होता है। वर्तमान में, यकृत फाइब्रोसिस के उपचार के लिए कोई विधि या प्रभावी दवाएं नहीं हैं। इसलिए, एक एंटी-हेपेटिक फाइब्रोसिस दवा ढूंढना जरूरी है जो फाइब्रोसिस और कैंसर के लिए जिगर की चोट की प्रगति को कम कर देगी।सिस्टैंच ट्यूबुलोसाडब्ल्यू (ओरोबंचेसी परिवार का) एक परजीवी पौधा है जो चीन के झिंजियांग के दक्षिणी क्षेत्र में व्यापक रूप से उगाया जाता है [5]। लोग आमतौर पर इसका उपयोग गुर्दे को मजबूत करने, रक्त को पोषण देने, आंत्र को आराम देने और बुढ़ापा में देरी करने के लिए करते हैं। यह आधिकारिक तौर पर चीनी फार्माकोपिया [6] में सूचीबद्ध है। C. ट्यूबुलोसा में विभिन्न प्रकार के सक्रिय घटक होते हैं। इसमे शामिल हैसिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स(CPhGs), इरिडोइड्स, और पॉलीसेकेराइड्स। कई सक्रिय घटकों में से एक के रूप मेंसी ट्यूबुलोसा, CPhGs ने विवो और इन विट्रो अध्ययन [7] दोनों में आश्वस्त करने वाले एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी थकान, न्यूरोप्रोटेक्टिव और विरोधी भड़काऊ प्रभाव प्रदर्शित किए हैं। हाल के वर्षों में, यह बताया गया है कि CPhGs (सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स) हेपेटोप्रोटेक्टिव प्रभाव है। इन प्रभावों में अंतर्निहित संभावित तंत्र मुक्त कणों की सफाई, यकृत झिल्ली की सुरक्षा, प्रतिरक्षण, एपोप्टोसिस का निषेध, HBsAg और HBeAg की अभिव्यक्ति का निषेध, और HBV डीएनए प्रतिकृति और अन्य [8-11] का निषेध है। हालांकि, साहित्य में कुछ अध्ययन ग्राफिक्स के एंटी-यकृत फाइब्रोसिस प्रभाव को संबोधित करते हैं। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य चूहों में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस के एक मॉडल का उपयोग करके जीपीएचसी के एंटी-यकृत फाइब्रोसिस प्रभाव की जांच करना है। HSC-T6 कोशिकाओं में संबंधित आणविक तंत्र की जांच की गई।

तरीकों

रसायन और अभिकर्मक

एक हाइड्रोक्सीप्रोलाइन किट (क्षारीय हाइड्रोलिसिस) (लॉट: 20140616) नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट (चीन) से खरीदी गई थी। रैट टीजीएफ- 1 सैंडविच एलिसा किट (लॉट: 238240615) लियान्के बायोटेक कं, लिमिटेड (चीन) से खरीदे गए थे। रैबिट एंटी-कोलेजन I एंटीबॉडी (लॉट: 140619), रैबिट एंटी-कोलेजन III एंटीबॉडी (लॉट: 980788 W), और रैबिट एंटी-TGF- 1 एंटीबॉडी (लॉट: 140619) बीजिंग बायोसिंथेसिस बायोटेक्नोलॉजी कंपनी द्वारा प्रदान किया गया था। लिमिटेड (चीन)। सामान्य भेड़ सीरम (काम कर रहे तरल पदार्थ) (लॉट: WP141214), PV -6000 (लॉट: WK141225), और DAB किट (लॉट: K136621D) के साथ संलग्न Zhongshan गोल्डन ब्रिज बायोटेक कंपनी लिमिटेड (चीन) से खरीदे गए थे। . प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए 2. एंटीबॉडी सॉल्यूशन (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) और 2. Invitrogen Company (USA) से खरीदे गए एंटीबॉडी सॉल्यूशन (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (लॉट: 272387) का इस्तेमाल किया गया। ) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) (लॉट: SLBG8239V) सिग्मा (यूएसए) से खरीदा गया था। उपयोग करने से पहले, बीएसए को सामान्य खारा में 18 ग्राम / एल पर तैयार किया गया था, बैक्टीरिया को निस्पंदन द्वारा हटा दिया गया था, और बीएसए को 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। भेड़ के बालों से 1 ग्राम लिपिड युक्त फ्रायंड का अधूरा सहायक (लॉट: AF0220LA14, शंघाई युआन ये बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (चीन)) को 2 ग्राम तरल पैराफिन (लॉट: 20130815, टियांजिन फुयू फाइन केमिकल कं,) के साथ मिलाया गया था। लिमिटेड (चीन,), एक भाप आटोक्लेव में निष्फल, और 4 डिग्री पर संग्रहीत। सकारात्मक दवा बीजेआरजी को इनर मंगोलिया फुरुई मेडिकल साइंस कं, लिमिटेड (चीन) से बीजीरंगन गोलियों के रूप में प्राप्त किया गया था। बीजेआरजी दवा स्टॉक को भंग करके तैयार किया गया था। आसुत जल में बीजेआरजी टैबलेट 600 मिलीग्राम/किलोग्राम की एकाग्रता पर।

संयंत्र सामग्री

सी ट्यूबुलोसा(ओरोबंचेसी परिवार) चीन के झिंजियांग के मिनफेंग क्षेत्र से खरीदा गया था। सामग्री को शिनजियांग के मटेरिया मेडिका संस्थान, उइघुर मेडिसिन के लिए प्रमुख प्रयोगशाला शोधकर्ता जून झाओ द्वारा प्रमाणित किया गया था। वाउचर के नमूने झिंजियांग के मटेरिया मेडिका संस्थान में जमा किए गए थे।

सीपीएचजी की तैयारी(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स)

के सूखे और कटे हुए प्रकंदसी ट्यूबुलोसा(6.0 किग्रा) को रिफ्लक्स के तहत 7 0 प्रतिशत इथेनॉल के साथ लगातार तीन बार निकाला गया, और इथेनॉल निकालने के लिए विलायक को हटा दिया गया। इथेनॉल के अर्क को फिनाइल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स (CPhGs) प्राप्त करने के लिए AB -8 राल का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। पशु अध्ययन में विभिन्न खुराक समूहों के लिए उपयोग किए जाने वाले सीपीएचजी के स्टॉक समाधान (क्रमशः 500 मिलीग्राम/किलोग्राम, 250 मिलीग्राम/किलोग्राम, और 125 मिलीग्राम/किलोग्राम) 0.5 प्रतिशत (5 ग्राम/ली) कार्बोक्सिमिथाइल सेलुलोज (सोडियम नमक) में भंग कर दिए गए थे।

सीपीएचजी की मात्रा(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स)

सीपीएचजी में दो घटकों (इचिनाकोसाइड और एक्टोसाइड) की सामग्री एचपीएलसी द्वारा पहले बताई गई विधि (झांग एट अल। 2 0 04) [12] का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। एचपीएलसी को शिमदज़ू एलसी -10 यूवी डिटेक्टर से लैस एचपीएलसी का उपयोग करके किया गया था। एचपीएलसी कॉलम एक फेनोमेनेक्स जेमिनी ओडीएस कॉलम (250 × 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन) था। लोकतांत्रिक मोबाइल चरण में मेथनॉल-एसीटोनिट्राइल -1 प्रतिशत एसिटिक एसिड (15:10:75, v/v/v) शामिल था। रेफरेंस 40 मिनट के लिए था और प्रवाह दर 0.6 एमएल/मिनट पर रखा गया था। स्तंभ का तापमान 30 डिग्री पर स्थिर रखा गया था। यूवी डिटेक्शन 334 एनएम पर था।

पशु और HSC-T6 सेल लाइन

[ग्रेड एसपीएफ़] स्वस्थ वयस्क नर स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों (180-220 ग्राम) को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी एनिमल सेंटर, लाइसेंस नंबर: एससीएक्सके (नया) 2011-0004 से खरीदा गया था। चूहों को विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ़) चाउ खिलाया गया। पशु प्रयोगों से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों (25 डिग्री और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र) के तहत पिंजरों में रखा गया था और मानक चूहा गोली भोजन और नल के पानी तक उनकी मुफ्त पहुंच थी। उपचार से पहले चूहों को अभ्यस्त किया गया था। एक अमर चूहा यकृत स्टैलेट सेल लाइन, HSC-T6, वुहान प्रोसेल जीन बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड से प्राप्त किया गया था। (वुहान, चीन)। HSC-T6 कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (गिब्को, दक्षिण अमेरिका), 100 IU / ml पेनिसिलिन, और 100 ug / ml स्ट्रेप्टोमाइसिन (बीजिंग) के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (उच्च ग्लूकोज) (DMEM, बीजिंग, चीन) में संवर्धित किया गया था। , चीन) 5 प्रतिशत CO2 के साथ 37 डिग्री पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में।

बीएसए प्रेरित जिगर की चोट और उपचार

पचहत्तर एसडी चूहों को बेतरतीब ढंग से छह समूहों में विभाजित किया गया था: सामान्य (आसुत जल-उपचार), मॉडल (बीएसएट्रीटेड), सकारात्मक दवा (बीएसए-उपचारित प्लस बीजेआरजी 600 मिलीग्राम / किग्रा / दिन), और बीएसए-उपचारित प्लस सीपीएचजी(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स)(125, 250, 5{{20}}0 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) समूह। बीएसए-उपचारित प्लस सीपीएचजी (125, 250, 5 00 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) समूहों में प्रत्येक समूह में 13 चूहे थे, और दूसरे समूह में प्रत्येक समूह में 12 चूहे थे। बीएसए-प्रेरित जिगर की चोट के मॉडल को प्राथमिक संवेदीकरण में विभाजित किया गया है जिसके बाद एक प्रतिरक्षाविज्ञानी हमला होता है) [13]। सामान्य समूह को छोड़कर, अन्य समूहों को प्राथमिक संवेदीकरण के लिए 0.5 मिली (9 मिलीग्राम / एमएल) बीएसए फ्रायंड के अधूरे सहायक दिन 1, दिन 15, दिन 22, दिन 29 और दिन 36 के साथ कई चमड़े के नीचे के इंजेक्शन दिए गए थे। पांचवें इंजेक्शन के सात दिन बाद, चूहे की रेटिनल वेन प्लेक्सस के माध्यम से रक्त प्राप्त किया गया और सीरम एल्ब्यूमिन एंटी-बॉडीज के लिए परीक्षण किया गया। चूहे के सीरम में बीएसए एंटीबॉडी का पता डबल एगर डिफ्यूजन विधि द्वारा लगाया गया था। सामान्य खारा में बीएसए के 0.4 मिलीलीटर का प्रशासन करके हमला इंजेक्शन किया गया था, बीएसए एंटीबॉडी-पॉजिटिव चूहों में दुम की नस के माध्यम से सप्ताह में दो बार दस बार के लिए किया गया था। इंजेक्शन की सांद्रता और समय 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 और 10.00 थे। जी/एल दिन 46, दिन 50, दिन 53, दिन 57, दिन 60, दिन 64, दिन 67, दिन 71, दिन 74 और दिन 78, क्रमशः। सामान्य समूह में, बीएसए के बजाय प्रतिरक्षाविज्ञानी प्राथमिक (संवेदीकरण) और माध्यमिक (हमले) इंजेक्शन के लिए सामान्य खारा का उपयोग किया गया था, और अन्य स्थितियां मॉडल समूह की तरह ही थीं। सामान्य समूह को 10 मिली/किलो/दिन की खुराक के साथ मौखिक रूप से आसुत जल दिया गया। मॉडल समूह को मौखिक रूप से 10 मिली/किग्रा/दिन 0.5 प्रतिशत सीएमसी-ना समाधान दिया गया था। सकारात्मक दवा समूह को मौखिक रूप से 600 मिलीग्राम / किग्रा / दिन BJRG प्रशासित किया गया था। बीएसए-उपचारित प्लस सीपीएचजी (125,

250, और 500 मिलीग्राम/किलो/दिन) समूहों को मौखिक रूप से 125, 250, और 500 मिलीग्राम/किग्रा/दिन सीपीएचजी प्रशासित किया गया था(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स), क्रमश। अंतिम इंजेक्शन के बाद चूहों की दैनिक खुराक दो सप्ताह तक जारी रही। प्रायोगिक अवधि के बाद, चूहों को 10 प्रतिशत क्लोरल हाइड्रेट से पहले 12 घंटे के लिए उपवास किया गया और फिर तुरंत इच्छामृत्यु दी गई। प्रत्येक चूहे से सीरम के नमूने एकत्र किए गए और तुरंत उपयोग किए गए। लीवर को दो उद्देश्यों के लिए काटा गया था: (1) हाइप किट के लिए तरल नाइट्रोजन में संरक्षण और (2) हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परीक्षाओं के लिए 10 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड में निर्धारण। पशु अध्ययन की पूरी अवधि 93 दिन थी।

जिगर और प्लीहा सूचकांक

लीवर और प्लीहा को लैपरोटॉमी द्वारा विच्छेदित किया गया और 4 डिग्री सामान्य खारा से धोया गया। फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने के बाद, संबंधित सूचकांकों की गणना करने के लिए यकृत और प्लीहा को तौला गया: सापेक्ष अंग भार=अंग द्रव्यमान (जी)/व्यक्तिगत शरीर द्रव्यमान (जी) × 100 प्रतिशत [14]।

सेल प्रयोग

HSC-T6 कोशिकाओं को एक 96-वेल प्लेट में चढ़ाया गया था। प्रारंभ में, कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 1 0 प्रतिशत FBS युक्त DMEM के साथ सुसंस्कृत किया गया था। तब माध्यम को 12 घंटे के लिए कोशिकाओं को भूखा रखने के लिए बिना FBS के DMEM से बदल दिया गया था। कोशिकाओं को तब डीएमईएम के साथ सुसंस्कृत किया गया था जिसमें 24 घंटे के लिए 5.0 एनजी / एमएल टीजीएफ - 1 (एफबीएस के बिना) था। अंत में, CPhGs की विभिन्न सांद्रता(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स)(100ug/ml, 50ug/ml, और 25ug/ml), एक्टोसाइड (6 ug/ml, 3 ug/ml, और 1.5 ug/ml), और इचिनाकोसाइड (500ug/ml, 250ug/ml, और 125ug/ml) प्लेट में चौगुनी कुओं में किया गया और 48 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया।

रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण

NF-κB, p65 और कोलेजन I का mRNA अभिव्यक्ति स्तर वास्तविक समय पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। एचएससी-टी6 कोशिकाओं में एमआरएनए अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं (4 × 105 कोशिकाओं) को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में 3 एमएल डीएमईएम के साथ 10 प्रतिशत एफबीएस के साथ रखा गया था और 37 डिग्री और 5 प्रतिशत सीओ 2 पर रातोंरात ऊष्मायन किया गया था, जिसके बाद सेल संस्कृति मीडिया सीरम मुक्त DMEM में बदल दिया गया। अगला, सीपीएचजी(सिस्टैंच से फेनिल इथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स)(100 ug/ml, 50 ug/ml, और 25 ug/ml), एक्टोसाइड (6 ug/ml, 3 ug/ml, और 1.5 ug/ml), और इचिनाकोसाइड (500 ug/ml) , 250 ug/ml, और 125 ug/ml) को कुओं में मिलाया गया। CPhG या मोनोमेरिक रचनाओं के साथ ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, कुल RNA को TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen, USA) का उपयोग करके निकाला गया और 15 s के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ सख्ती से उत्तेजित किया गया। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के बाद, lysate को 12, 000 × g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। जलीय चरण में आरएनए को आइसोप्रोपेनॉल के साथ अवक्षेपित किया गया था, और ऊपरी जलीय चरण को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था। आरएनए को 0.75 प्रतिशत इथेनॉल जोड़कर अवक्षेपित किया गया था, जिसके बाद माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र 12, 000 × जी 4 डिग्री पर 5 मिनट से अधिक नहीं। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और आरएनए को कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सुखाया गया था। प्राइमरों के विशिष्ट सेट (सैंगोन, शंघाई, चीन) जिनका उपयोग चूहे-एक्टिन [जेनबैंक: एनएम _031144 .3], कोलेजन I [जेनबैंक: एनएम _ 053304 .1], और एनएफ के प्रवर्धन के लिए किया गया था। -κB p65 [जेनबैंक: NM_199267.2] जीन को बैच प्राइमर 3 का उपयोग करके डिजाइन किया गया था। फॉरवर्ड (fw) और रिवर्स (rv) प्राइमर इस प्रकार थे: कोलेजन I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG) , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -एक्टिन (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT) जी, आरवी: आगा जीजीसी एटीए सीएजी जीजीए सीएए सीएसी ए)। परिणामों को आंतरिक नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग जीन-एक्टिन के mRNA के लिए सामान्यीकृत किया गया और सापेक्ष mRNA स्तर के रूप में प्रस्तुत किया गया। 8 μL iQ SYBR ग्रीन सुपरमिक्स, 1 μL 10 pM प्राइमर जोड़ी, 8.5 μL आसुत जल और 2.5 μL सीडीएनए के साथ प्रतिक्रियाएं की गईं। प्रत्येक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन निम्नलिखित परिस्थितियों में किया गया था: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री, फिर 95 डिग्री पर 10 एस के 40 चक्र, 55 डिग्री पर 30 एस, और 55 डिग्री पर 10 एस - विस्तार के लिए 95 डिग्री, इसके बाद एकल प्रतिदीप्ति माप . अंतिम परिणाम सापेक्ष मूल्यों (2-ΔΔCt) के साथ वर्णित किए गए थे। गणना और विश्लेषण iQ5 रीयल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम द्वारा किया गया था।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

कोलेजन I (Abcam, कैम्ब्रिज, यूके, आर्ट नंबर: ab3471 0) प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर वेस्टर्न ब्लॉटिंग [विथ -एक्टिन (लॉट: 60008-1- lg; प्रोटीनटेक, चीन) द्वारा हाउसकीपिंग कंट्रोल के रूप में निर्धारित किया गया था। 1 प्रतिशत हॉल्ट प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (थर्मो साइंटिफिक, यूएसए) और 1 प्रतिशत हॉल्ट फॉस्फेटस इनहिबिटर कॉकटेल (थर्मो साइंटिफिक, यूएसए) के साथ रेडियोइम्यूनोप्रेजर्वेशन परख (आरआईपीए) (थर्मो साइंटिफिक, यूएसए) बफर का उपयोग करके पूरे सेल के अर्क तैयार किए गए थे। ब्रैडफोर्ड विधि [18] द्वारा प्रोटीन सांद्रता को मापा और परिमाणित किया गया था। प्रोटीन (10-50 कुरूप) को 10 प्रतिशत एसडीएस-पेज जेल पर अलग किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर, यूएसए) में स्थानांतरित कर दिया गया। 5 प्रतिशत बीएसए के साथ कमरे के तापमान पर झिल्ली को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध कर दिया गया था, और प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-कोला जीन I एंटीबॉडी, 1: 200 कमजोर पड़ने या माउस एमएबी ऑफ -एक्टिन, 1: 5000 कमजोर पड़ने) को रातोंरात 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। संबंधित Alk-Phos. संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया था। अंत में, झिल्लियों को 1 × ट्रिस-एचसीएल खारा के साथ 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20 के साथ तीन बार धोया गया, और संकेतों को स्कैन किया गया और जीईएल डीओसी एक्सआर इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड) द्वारा कल्पना की गई। डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण ब्याज के प्रोटीन पर किया गया था और जीईएल डीओसी इमेज स्टूडियो सॉफ्टवेयर (बायो-रेड) द्वारा -एक्टिन को सामान्यीकृत किया गया था। -एक्टिन का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

शापिरो-विल्क सामान्यता परीक्षण और लेवेन के विचरण समरूपता परीक्षण को सामान्यता और यू एट अल को सत्यापित करने के लिए लागू किया गया था। दारू जर्नल ऑफ फार्मास्युटिकल साइंसेज (2015) 23:52 पेज 4 ऑफ 13 एकरूपता की भिन्नता। विचरण का विश्लेषण (एनोवा) के बाद तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट का उपयोग सांख्यिकीय अंतरों की पहचान करने के लिए किया गया था, जो सामान्य रूप से वितरित डेटा में अमानवीय थे। क्रुस्कल-वालिस गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया गया था जो सामान्य रूप से वितरित या सजातीय नहीं था। परिणाम माध्य ± एसडी के रूप में व्यक्त किए गए थे। महत्व P < 0.05="" पर="" निर्धारित="" किया="" गया="" था।="" सभी="" डेटा="" का="" विश्लेषण="" spss="" 16.0="" सॉफ्टवेयर="" (शिनजियांग="" मेडिकल="" यूनिवर्सिटी)="" द्वारा="" किया="" गया="">

परिणाम

CPhGs का मात्रात्मक निर्धारण

सी. ट्यूबुलोसा में सीपीएचजी में दो फेनिलथाइल अल्कोहल ग्लाइकोसाइड, इचिनाकोसाइड और एक्टोसाइड होते हैं, और सीपीएचजी में उनकी सामग्री एचपीएलसी विश्लेषण (छवि 1) द्वारा 42.71 ± 0.42 प्रतिशत और 14.27 ± {{7 होने के लिए निर्धारित की गई थी। }}.18 प्रतिशत, क्रमशः।

जिगर और प्लीहा सूचकांक

जैसा कि तालिका 1 दिखाया गया था, मॉडल समूह के यकृत और प्लीहा सूचकांकों को काफी ऊंचा किया गया था [पी <0। 0="" 1,="" पी=""><0.05]। मॉडल="" समूह="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0" की="" तुलना="" में="" अलग-अलग="" खुराक="" समूहों="" में="" सकारात्मक="" दवा="" bjrg="" और="" cphgs="" के="" यकृत="" और="" प्लीहा="" सूचकांक="" काफी="" कम="" हो="" गए="" थे।="" 004,="" प्लिवर="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," क्रमशः]।="" मॉडल="" समूह="" की="" तुलना="" में="" यकृत="" और="" प्लीहा="" सूचकांक="" कम="">

एएलटी, एएसटी गतिविधियों और यकृत फाइब्रोसिस मार्करों पर सीपीएचजी का प्रभाव

वर्तमान अध्ययन में, मॉडल समूह में हेपेटिक एंजाइम एएसटी और एएलटी के सीरम स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, जो बीएसए प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस चूहों में हेपेटोसेलुलर क्षति को दर्शाता है। हालाँकि, प्रयोग।

BJRG (600 mg/kg) और CPhGs (125, 250, और 5{{10}}0 के साथ उस उपचार को दिखाया। mg/kg) ने AST को काफी कम कर दिया [PAST <0.0{{60}}1, past="">< 0.001,="" past=""><0.001, past=""><0.001 हेपेटिक="" फाइब्रोसिस="" चूहों="" में="" स्तर="" .="" (तालिका="" 2)।="" मॉडल="" चूहों="" में="" ha,="" ln,="" pc="" और="" iv-c="" के="" स्तर="" में="" काफी="" वृद्धि="" हुई="" थी="" [pha=""><0.001, pln=""><0.001, ppciii="0.002," piv-c=""><0.001, क्रमशः]।="" मॉडल="" समूह="" की="" तुलना="" में,="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," क्रमशः]="" के="" स्तर,="" एलएन="" [पीएलएन="0.011," पी="" एलएन="0.004," पी="" एलएन="0.026," पी="" एलएन="0.069," क्रमशः],="" पीसी="" iii="" [पी="" पीसीiii="" {="" {47}}.006,="" पी="" पीसीiii="0.067," पी="" पीसीiii="0.136," पी="" पीसीiii="0.296," क्रमशः],="" और="" आईवी-सी="" [पी="" iv-सी="">< 0.001,="" p="" iv-c=""><0.001, p="" iv-c=""><0.001, p="" iv-c=""><0.001, क्रमशः]="" चूहों="" में="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" और="" cphgs="" द्वारा="" अलग-अलग="" खुराक="" समूहों="" (125,="" 250,="" और="" 500="" मिलीग्राम/किग्रा)="" (तालिका="" 3)।="" हाइप="" सामग्री="" और="" टीजीएफ="" -="" 1="" जिगर="" के="" ऊतकों="" में="" हाइपो="" के="" स्तर="" को="" मापकर="" कोलेजन="" सामग्री="" का="" भी="" पता="" लगाया="" गया="" था।="" जैसा="" कि="" तालिका="" 4="" में="" दिखाया="" गया="" है,="" माध्य="">मॉडल समूह में स्तर सामान्य समूह की तुलना में काफी अधिक था, लेकिन बीजेआरजी समूह और विभिन्न सीपीएचजी खुराक समूहों में यह स्पष्ट रूप से कम हो गया था। चूहों में मॉडल समूह के टीजीएफ {{0}} की यकृत सांद्रता में काफी वृद्धि हुई थी [पी <0।001]। मॉडल="" समूह="" की="" तुलना="" में,="" सकारात्मक="" दवा="" के="" टीजीएफ="" -="" 1="" स्तर="" और="" विभिन्न="" सीपीएचजी="" खुराक="" समूहों="" में="" स्पष्ट="" रूप="" से="" कमी="" आई="" थी="" [पी="" टीजीएफ="" -="" 1=""><0.001, पी="" टीजीएफ="" -="" 1=""><0.001, पी="" टीजीएफ-="" 1=""><0.001, पीटीजीएफ-="" 1=""><0.001, क्रमशः]।="" परिणामों="" का="" सारांश="" सारणी="" चार="" में="">

हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा

एच एंड ई और मैसन के ट्राइक्रोम के साथ दागे गए सामान्य यकृत ऊतक वर्गों के अवलोकन अलग-अलग हेपेटिक लोब्यूल और हेपेटिक साइनसॉइड प्रदर्शित करते हैं। मॉडल चूहों में यकृत ऊतक संरचना अव्यवस्थित थी, और यकृत ऊतक और यकृत साइनसोइड्स को बड़ी मात्रा में संयोजी ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। हालांकि, मॉडल समूह की तुलना में उपचार समूह में अधिक सामान्य साइटोआर्किटेक्चर और कम संयोजी ऊतक पाए गए।

एच एंड ई धुंधला

सामान्य समूह में, असामान्य पोर्टल क्षेत्रों और यकृत साइनसॉइड के बिना यकृत लोब्यूल संरचनात्मक अखंडता देखी गई। यकृत डोरियों को एक व्यवस्थित तरीके से व्यवस्थित किया गया था, जिसमें कोर गोल और स्पष्ट था। नाभिक कोशिका के केंद्र में प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म के साथ स्थित होते हैं। केवल पोर्टल क्षेत्र में रेशेदार ऊतक की थोड़ी मात्रा होती है (चित्र 2a)। मॉडल समूह में, लोब्युलर संरचना गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो गई थी। जिगर की कोशिकाओं ने हल्के पानी के अध: पतन को दिखाया, ज्यादातर गुब्बारा अध: पतन और / या वसायुक्त अध: पतन। भड़काऊ सेल घुसपैठ का गठन, व्यापक रेशेदार ऊतक हाइपरप्लासिया, बड़ी संख्या में रेशेदार सेप्टम का गठन, विभाजित लोब्यूल और महत्वपूर्ण यकृत कोशिकाओं का प्रसार भी देखा गया। इन टिप्पणियों ने हेपेटिक फाइब्रोसिस (छवि 2 बी) के चूहे की प्रतिरक्षा चोट पशु मॉडल की स्थापना की सफलता की पुष्टि की। मॉडल समूह की तुलना में, विभिन्न सीपीएचजी में भड़काऊ सेल घुसपैठ में कमी आई थी। यह भी देखा गया कि कम परिगलन और यकृत कोशिकाओं के वसायुक्त अध: पतन के साथ-साथ फाइब्रोसिस का उन्मूलन भी देखा गया। सीपीएचजी ने चूहों में बीएसए-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस की विकृति को काफी कम कर दिया, यकृत कोशिकाओं की सूजन को कम कर दिया, और हेपेटोसाइट नेक्रोसिस और भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ को प्रभावी ढंग से रोका, यह सुझाव देते हुए कि सीपीएचजी बीएसए-प्रेरित चूहे यकृत फाइब्रोसिस पर एक सुरक्षात्मक प्रभाव डालते हैं। (चित्र 2सी-एफ)। मेसन का ट्राइक्रोम धुंधला सामान्य समूह में, यकृत ऊतक सामान्य था। यकृत पोर्टल क्षेत्र में नीले कोलेजन फाइबर की एक छोटी संख्या दिखाई दी, और यकृत ऊतक सामान्य रूप से संरचित था (चित्र 3 ए)। सामान्य समूह के यकृत ऊतक की तुलना में, रेशेदार ऊतक केंद्रीय पत्रक द्वारा फैलता है और यकृत पैरेन्काइमा में विस्तारित होता है। कोलेजन फाइबर विस्तारित और जुड़े हुए हैं और

पूरे लोब्यूल को ढँक दिया और केंद्रीय शिरा को घेर लिया। हेपेटोसाइट फाइब्रोसिस, लोबुलर संरचनात्मक क्षति, पेरिपोर्टल फाइब्रोसिस, और स्यूडोलोबुल गठन (छवि 3 बी) के साथ इन प्रभावों ने सबूत दिया कि मॉडल स्थापित किया गया था। मॉडल समूह की तुलना में, सकारात्मक दवा नियंत्रण समूह में कोलेजन फाइबर को परिधीय पोर्टल क्षेत्र (छवि 3 सी) से हल्के से बाहर की ओर बढ़ाया गया था। मॉडल समूह के साथ तुलना में, विभिन्न सीपीएचजी खुराक समूहों में कोलेजन फाइबर काफी कम हो गए थे, फाइबर प्रसार को रोक दिया गया था, और यकृत पैरेन्काइमा के भीतर रेशेदार ऊतक का प्रसार काफी कम हो गया था। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि CPhGs ने चूहों को BSA- प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस (चित्र। 3d-f) से बचाया।

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना

महत्वपूर्ण रूप से, कोलेजन प्रकार I और कोलेजन प्रकार III की अभिव्यक्ति यकृत फाइब्रोसिस के विकास में आवश्यक भूमिका निभाती है, और यकृत ऊतक में उनकी पीढ़ी और जमाव एंटी-यकृत फाइब्रोसिस प्रभावकारिता के एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में काम कर सकता है। परिणाम तालिका 5 में संक्षेपित हैं

कोलेजन प्रकार I

सामान्य समूह ने मुख्य रूप से रक्त वाहिकाओं और पोर्टल क्षेत्र में कोलेजन प्रकार I को व्यक्त किया। मॉडल समूह ने पोर्टल क्षेत्रों में अत्यधिक व्यक्त कोलेजन प्रकार I संवहनी फाइब्रोसिस। डिसे के स्थान में, कोलेजन प्रकार I धुंधला को धारियाँ या एक पैची वितरण के रूप में देखा गया था। स्यूडोलोबुल बनाने के लिए कोलेजन ने रेशेदार सेप्टा को घेर लिया। इन प्रयोगों में, बीजेआरजे (600 मिलीग्राम/किग्रा) और सीपीएचजी एस (125, 250, और 500 मिलीग्राम/किग्रा) के विभिन्न खुराक समूहों के लिए कम रेशेदार सेप्टा का गठन किया गया था [पीसीओएल I=0 .002, पीसीओएल I {{ 6}}.001, पीसीओएल I=0.023, और पी कर्नल I=0.044, क्रमशः]। अर्ध-मात्रात्मक परिणामों से पता चला कि उनके कोलेजन प्रकार I की अभिव्यक्ति मॉडल समूह (छवि 4) की तुलना में काफी कम थी।

कोलेजन प्रकार III

कोलेजन प्रकार III को सामान्य समूह में कमजोर रूप से व्यक्त किया गया था, और पोर्टल और यकृत शिराओं के आसपास के परिधीय क्षेत्रों ने निरंतर तंतुओं (छवि 5 ए) के बजाय थोड़ी मात्रा में ठीक पीले रंग का प्रदर्शन किया। मॉडल समूह में, कोलेजन फाइबर ने व्यापक और मोटी डोरियों का प्रदर्शन किया, जो मजबूत अभिव्यक्ति का संकेत देते हैं, मुख्य रूप से पोर्टल और रेशेदार ऊतक क्षेत्रों (छवि 5 बी) में स्थित हैं। बीजेआरजे (600 मिलीग्राम/किलोग्राम) के कोलेजन फाइबर और सीपीएचजी (125, 250, और 500 मिलीग्राम/किलोग्राम) के विभिन्न खुराक समूह फिलामेंटस थे और केंद्रीय शिरा और पोर्टल क्षेत्रों के आसपास वितरित किए गए थे। मॉडल समूह की तुलना में, कोलेजन फाइबर काफी कम हो गए थे, धुंधला पीला और पतला था, और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला कमजोर रूप से सकारात्मक था (छवि 5c-f)। ये अर्ध-मात्रात्मक परिणाम बताते हैं कि सकारात्मक और विभिन्न खुराक समूहों में सकारात्मक रूप से व्यक्त कोशिकाएं [पीसीओएल III=0.015, पीसीओएल III=0.001, पीसीओएल III=0.010, और P Col III=0.037, क्रमशः] मॉडल समूह के लोगों से भिन्न थे।

टीजीएफ- 1

सामान्य चूहे के जिगर की कोशिकाओं में टीजीआईएफ {{0}} की अभिव्यक्ति बहुत कम थी। अभिव्यक्ति कम संख्या में अंतरालीय कोशिकाओं (छवि 6 ए) तक सीमित थी। मॉडल समूह में, TGF - 1 अभिव्यक्ति व्यापक रूप से पोर्टल क्षेत्र, रेशेदार रिक्त स्थान, यकृत स्टैलेट कोशिकाओं, भड़काऊ कोशिकाओं, साइनसोइडल दीवार और साइटोप्लाज्म में वितरित की गई थी। एक विशेष पोर्टल क्षेत्र ने भूरा-पीला धुंधला (छवि 6 बी) के साथ एक जोरदार सकारात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। पोर्टल क्षेत्र और बीजेआरजे (600 मिलीग्राम/किलो) के रेशेदार सेप्टा और सीपीएचजी (125, 250, और 500 मिलीग्राम/किलो) के विभिन्न खुराक समूहों में अभिव्यक्ति की एक छोटी मात्रा थी। मॉडल समूह की तुलना में इन समूहों में सकारात्मक धुंधलापन की सीमा काफी कम हो गई थी। रेशेदार सेप्टा और भड़काऊ कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में अंतरालीय कोशिकाओं में धुंधलापन कम हो गया था (चित्र 6c-f)। अर्ध-मात्रात्मक परिणामों से पता चला कि BJRJ और CPhGs के विभिन्न खुराक समूह [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 <0.001, p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" क्रमशः]="" मॉडल="" समूह="" की="" तुलना="" में="" महत्वपूर्ण="" थे।="" जैसा="" कि="" पहले="" लेख="" में="" उल्लेख="" किया="" गया="" है,="" टीजीएफ="" -="" 1="" लीवर="" के="" पैथोफिजियोलॉजी="" में="" एक="" महत्वपूर्ण="" साइटोकिन="">

फाइब्रोसिस, बाह्य मैट्रिक्स के उत्पादन को उत्तेजित करता है [19]। हमने दिखाया कि टीजीएफ का स्तर - 1 मॉडल समूह में लिवर फाइब्रोसिस की गंभीरता के अनुरूप बढ़ गया। लीवर में TGF- 1 की अभिव्यक्ति का स्तर सीरम TGF- 1 स्तरों के अनुरूप था। यह इंगित करता है कि सीपीएचजी ईसीएम के संश्लेषण और गिरावट में भाग लेकर टीजीएफ - 1 अभिव्यक्ति के कारण लीवर फाइब्रोसिस को काफी कम कर सकते हैं। कोलेजन प्रकार I, कोलेजन प्रकार III, और TGF - 1 की अभिव्यक्ति यकृत फाइब्रोसिस की रोग प्रक्रिया का पता लगा सकती है। उपचार समूहों में उनकी अभिव्यक्ति के स्तर में काफी कमी आई और सचित्र किया गया कि सीपीएचजी कोलेजनेज गतिविधि में सुधार कर सकते हैं, यकृत ईसीएम संश्लेषण और गिरावट के गतिशील संतुलन को बनाए रखते हैं, इस प्रकार यकृत फाइब्रोसिस के गठन में देरी और रोकथाम करते हैं।