भाग 2: सर्कैडियन जीन पेर1 का एपिजेनेटिक विनियमन हिप्पोकैम्पस मेमोरी में उम्र से संबंधित परिवर्तनों में योगदान देता है

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Per1 की दस्तक लंबी अवधि को खराब करती हैस्मृतियुवा चूहों में।अगला, यह परीक्षण करने के लिए कि क्या पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 का अपग्रेडेशन लंबी अवधि के लिए आवश्यक हैस्मृतिगठन, हमने 10- मिनट OLM प्रशिक्षण से 48 घंटे पहले युवा चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 को लक्षित करते हुए siRNA को संक्रमित किया। Per1 siRNA के जलसेक ने पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में PER1 प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन किया, जैसा कि अंतिम परीक्षण सत्र (छवि 4d, अनुपूरक चित्र 5) के बाद 2 घंटे मापा गया। PER1 प्रोटीन (~ 30 प्रतिशत) की यह अपेक्षाकृत मामूली खराबी गंभीर रूप से क्षीण हुईस्मृतिओएलएम के लिए गठन; Per1 siRNA से संक्रमित चूहों ने प्रशिक्षण और परीक्षण के बीच DI में कोई उल्लेखनीय वृद्धि नहीं दिखाई और परीक्षण के दौरान नियंत्रण चूहों (चित्र 4e) की तुलना में परीक्षण के दौरान चलती वस्तु के लिए महत्वपूर्ण रूप से कम वरीयता प्रदर्शित की, जिसका परीक्षण पर कुल वस्तु अन्वेषण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 4f) और पूर्व-प्रशिक्षण आवास सत्र (सप्लीमेंट्री अंजीर। 8c) के दौरान आंदोलन में कोई अंतर नहीं है। यह पहली बार प्रदर्शित करता है कि हिप्पोकैम्पस के भीतर चुनिंदा रूप से एक कोर सर्कैडियन क्लॉक जीन का स्थानीय व्यवधान ख़राब हो सकता हैस्मृतिगठन।

Per1 ओवरएक्प्रेशन में सुधार होता हैस्मृतिउम्र बढ़ने के चूहों में। आखिरकार,यह निर्धारित करने के लिए कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 की अधिकता उम्र से संबंधित सुधार के लिए पर्याप्त है या नहींस्मृतिहानि, हमने दो पूरक विधियों का उपयोग करके स्थानीय रूप से Per1 को अपग्रेड किया। सबसे पहले, हमने एक v5 एपिटोप टैग (pLVX-v5Per1) (चित्र। 5a, अनुपूरक चित्र। 6a) के साथ जंगली-प्रकार Per1 को व्यक्त करने वाले एक लेंटवायरस का उपयोग किया। यह पुष्टि करने के लिए कि यह प्लास्मिड Per1 को ओवर-एक्सप्रेस करता है, हमने HT22 कोशिकाओं को pLVX-v5Per1 या pLVX-EV के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया और Per1 mRNA अभिव्यक्ति को मापा। अभिकर्मक के बाद 24 और 48 घंटे दोनों में, Per1 mRNA को नियंत्रण प्लास्मिड (छवि 5 बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के सापेक्ष pLVX-v5Per1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया गया था। pLVX-v5Per1 के ट्रांसफ़ेक्शन के कारण 24 घंटे (सप्लीमेंट्री फ़िगर 6b) पर Per2 (एक पीरियड क्लॉक परिवार का सदस्य जो Per1 के साथ इंटरैक्ट करता है) के लिए mRNA में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, हालाँकि यह वृद्धि Per1 (पर) में देखी गई वृद्धि से बहुत कम थी। 24 घंटे, Per1: 466-EV की तुलना में गुना वृद्धि, Per2: 1.6-EV की तुलना में गुना वृद्धि)। Per1 ओवरएक्प्रेशन ने निकटतम डाउनस्ट्रीम जीन Hes7 के ट्रांसक्रिप्शन को प्रभावित नहीं किया, हालांकि (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6c)।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या Per1 ओवरएक्प्रेशन में सुधार होता हैस्मृतिउम्र बढ़ने वाले चूहों में प्रदर्शन, pLVX-v5Per1 को व्यवहार से 2 सप्ताह पहले 18-मो चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में संक्रमित किया गया था। pLVX-v5Per1 चूहों ने उल्लेखनीय रूप से सुधार दिखायास्मृतिपीएलवीएक्स-ईवी (खाली वेक्टर) नियंत्रण (छवि 5 सी) के सापेक्ष परीक्षण में ओएलएम के लिए। केवल pLVX-v5Per1 चूहों ने परीक्षण के दौरान कुल अन्वेषण में कोई देखे गए समूह अंतर के साथ प्रशिक्षण के सापेक्ष चलती वस्तु के लिए वरीयता में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई (चित्र। 5d) या आवास के दौरान आंदोलन में (पूरक छवि। 8d)।

व्यवहार के बाद, जानवरों के एक उपसमुच्चय से हिप्पोकैम्पस ऊतक को विवो में उपयुक्त समूहों में pLVX-EV और pLVX-v5Per1 टेप की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए RNA अनुक्रमण के लिए संसाधित किया गया था (पूरक चित्र। 7a, b, f, g)।

इस दृष्टिकोण को पूरक करने के लिए, हमने पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को चलाने के लिए CRISPR/dCas9 सिनर्जिस्टिक एक्टिवेशन मध्यस्थ (एसएएम) सिस्टम33 का भी उपयोग किया। इस प्रणाली में तीन लेंटिवायरल घटक होते हैं: एक उत्प्रेरकनिष्क्रिय Cas9 (dCas9) एक GFP टैग (dCas 9-VP64-GFP) के साथ एक VP64 ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेशन डोमेन से जुड़े हुए हैं, एक संशोधित सिंगल-गाइड RNA (sgRNA) दो MS2 RNA एप्टामर्स के साथ Per1 को लक्षित करता है जो कर सकते हैं तीसरे घटक की भर्ती करें, एक MS2- डबल ट्रांसक्रिप्शनल एक्टीवेटर (MS2-p65-HSF1) फ्यूजन प्रोटीन(चित्र। 5e)। नियंत्रण जानवरों को एक नियंत्रण sgRNA प्राप्त हुआ जिसमें SAM प्रणाली को Per1 (जिसे ctrl sgRNA कहा जाता है) को लक्षित करने के लिए आवश्यक 20 न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम की कमी थी। Per1 प्रमोटर पर इन घटकों की असेंबली तीन प्रभावकारी डोमेन (VP64, p65, और HSF1) को Per1 ट्रांसक्रिप्शन को चलाने की अनुमति देती है। पुष्टि करने के लिए, चित्र 5 की प्रभावशीलता पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 का ओवरएक्प्रेशन, वस्तु स्थान में उम्र से संबंधित दोषों को कम करता हैस्मृति. खाली वेक्टर नियंत्रण (pLVX-EV) की तुलना में v{0}} टैग किए गए Per1 (pLVX-v5Per1) को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लेंटवायरस निर्माण का एक योजनाबद्ध। EV के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं की तुलना में HT22 कोशिकाओं में pLVX-v5Per1 के ट्रांसफ़ेक्शन के बाद b Per1 mRNA 24 और 48 घंटे में उल्लेखनीय रूप से बढ़ गया था (टू-वे एनोवा: ग्रुप x टाइमपॉइंट इंटरैक्शन (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" सिदक="" के="" पोस्ट="" हॉक="" टेस्ट,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3)।="" c="" 18-="" plvx-v5per1="" के="" हिप्पोकैम्पल="" इन्फ्यूजन="" दिए="" गए="" मो="" चूहों="" ने="" plvx-ev="" नियंत्रण="" वायरस="" दिए="" गए="" चूहों="" की="" तुलना="" में="" olm="" के="" लिए="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" बेहतर="" मेमोरी="" दिखाई="" (टू-वे="" एनोवा:="" वायरस="" x="" सेशन="" इंटरेक्शन,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" पी=""><0.05), सिदक="" के="" पोस्ट="" हॉक="" टेस्ट,="" **पी=""><0.01, ***पी=""><0.001, एन="16," 15,="" सभी="" पुरुष)।="" d="" परीक्षण="" में="" दोनों="" समूहों="" के="" लिए="" कुल="" अन्वेषण="" समान="" था="" (t(29)="0.57," p="0.57)।" सीआरआईएसपीआर/डीसीएएस9="" सिनर्जिस्टिक="" एक्टिवेशन="" मेडिएटर="" (एसएएम)="" सिस्टम="" का="" ई="" योजनाबद्ध="" per1="" ट्रांसक्रिप्शन="" को="" चलाने="" के="" लिए="" उपयोग="" किया="" जाता="" है।="" शीर्ष:="" सैम="" के="" व्यक्तिगत="" घटक।="" निचला:="" per1="" प्रमोटर="" पर="" इकट्ठे="" हुए="" घटक,="" per1="" ट्रांसक्रिप्शन="" को="" चला="" रहे="" हैं।="" f="" per1="" mrna="" को="" नियंत्रण="" sgrna="" (टू-वे="" एनोवा:="" ग्रुप="" x="" टाइमपॉइंट="" इंटरेक्शन="" (f(1,8)="14.77)" के="" साथ="" ट्रांसफ़ेक्ट="" की="" गई="" कोशिकाओं="" की="" तुलना="" में="" ht22="" कोशिकाओं="" में="" crispr-sam="" घटकों="" के="" ट्रांसफ़ेक्शन="" के="" बाद="" 48="" घंटे="" में="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" बढ़ाया="" गया="" था।="" ,="" पी=""><0.01), सिडक="" के="" पोस्ट="" हॉक="" टेस्ट,="" **पी=""><0.001, एन="3,3,3,3)।" जी="" 18-मो="" चूहों="" ने="" सीआरआईएसपीआर-एसएएम="" सिस्टम="" के="" हिप्पोकैम्पल="" इन्फ्यूजन="" को="" sgrna="" लक्ष्यीकरण="" per1="" के="" साथ="" दिया,="" जो="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" बेहतर="">स्मृतिनियंत्रण sgRNA के साथ EV नियंत्रण चूहों की तुलना में OLM के लिए (दो-तरफ़ा एनोवा: वायरस x सत्र इंटरैक्शन (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" सिडक="" के="" पोस्ट="" हॉक="" टेस्ट,="" ***पी=""><0.001, एन="17," 15,="" सभी="" पुरुष)।="" h="" कुल="" अन्वेषण="" परीक्षण="" में="" दोनों="" समूहों="" के="" लिए="" समान="" था="" (t(30)="0.41," p="0.68)।" डेटा="" को="" crispr-sam="" सिस्टम="" में="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" प्रस्तुत="" किया="" जाता="" है,="" हमने="" ht22="" कोशिकाओं="" को="" तीनों="" प्लास्मिड="" के="" साथ="" ट्रांसफ़ेक्ट="" किया,="" 24="" या="" 48="" घंटे="" बाद="" कोशिकाओं="" को="" काटा,="" और="" per1="" mrna="" अभिव्यक्ति="" को="" मापा।="" अभिकर्मक="" के="" बाद="" 48="" घंटे="" तक,="" per1="" mrna="" को="" नियंत्रण="" (छवि="" 5f)="" की="" तुलना="" में="" per1="" sgrna="" दिए="" गए="" समूह="" में="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" बढ़ाया="" गया="" था,="" यह="" पुष्टि="" करते="" हुए="" कि="" crispr-sam="" प्रणाली="" प्रभावी="" रूप="" से="" per1="" mrna="" अभिव्यक्ति="" को="" संचालित="" करती="" है।="" हमने="" per2="" mrna="" (सप्लीमेंट्री="" अंजीर।="" 6e)="" या="" hes7="" mrna="" (सप्लीमेंट्री="" अंजीर।="" 6f)="" के="" लिए="" अभिव्यक्ति="" में="" कोई="" बदलाव="" नहीं="" देखा,="" यह="" दर्शाता="" है="" कि="" crispr-sam="" सिस्टम="" लक्ष्य="" जीन,="" per1="" के="" चयनात्मक="" ओवरएक्प्रेशन="" को="" चलाता="">

इसके बाद, 18-मो चूहों को सीआरआईएसपीआर-एसएएम लेंटिवायरस (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6डी) का इंट्रा-हिप्पोकैम्पल इन्फ्यूजन दिया गया और 2 सप्ताह बाद ओएलएम में प्रशिक्षित किया गया। जैसा कि हमारे pLVX- v5Per1 ओवरएक्प्रेशन के साथ देखा गया है, CRISPR-SAM-मध्यस्थता Per1 ओवरएक्प्रेशन में उल्लेखनीय रूप से सुधार हुआ हैस्मृतिजानवरों को नियंत्रित करने के सापेक्ष Per1 sgRNA-संक्रमित चूहों में प्रदर्शन (चित्र। 5g) कुल अन्वेषण (छवि 5h) या आवास के दौरान आंदोलन को प्रभावित किए बिना (पूरक छवि। 8e)। केवल Per1 sgRNA दिए गए चूहों ने प्रशिक्षण के सापेक्ष गतिमान वस्तु के लिए वरीयता में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, जो अक्षुण्ण दर्शाता हैस्मृतिवस्तु स्थानों के लिए (चित्र 5g)। व्यवहार के बाद, जानवरों के एक सबसेट से हिप्पोकैम्पस ऊतक को विवो में उपयुक्त समूहों में CRISPR टेप की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए RNA अनुक्रमण के लिए संसाधित किया गया था (पूरक चित्र। 7c-g)। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 की अधिकता दीर्घकालिक वस्तु स्थान स्मृति में उम्र से संबंधित दोषों को दूर करने के लिए पर्याप्त है। इसलिए, Per1 एक प्रमुख जीन है जो दीर्घकालिक स्मृति निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है, HDAC3 द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और वृद्ध मस्तिष्क में बिगड़ा हुआ है।

बहस

हमारे परिणामों से पता चलता है कि दमनकारी हिस्टोन डीएसेटाइलेज़ एचडीएसी 3 का विलोपन या विघटन दीर्घकालिक दोनों में उम्र से संबंधित दोषों को दूर कर सकता है।स्मृतिऔर सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी। इसके अलावा, HDAC3 का विलोपन पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में सर्कैडियन जीन Per1 की अनुभव-प्रेरित अभिव्यक्ति को पुनर्स्थापित करता है। चूंकि हिप्पोकैम्पस PER1 अभिव्यक्ति दीर्घकालिक स्मृति निर्माण (छवि 4) के लिए महत्वपूर्ण है और हिप्पोकैम्पस में Per1 की अधिकता उम्र से संबंधित स्मृति हानि (छवि 5) को ठीक करती है, PER1 एक संभावित तंत्र है जिसके माध्यम से HDAC3 के विलोपन में सुधार होता हैस्मृतिऔर उम्र बढ़ने वाले चूहों में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी। मोटे तौर पर, Per1 की उम्र से संबंधित व्यवधान, संरचना के आधार पर, दीर्घकालिक स्मृति और सर्कैडियन लयबद्धता दोनों में उम्र से संबंधित हानि को जोड़ सकता है।

वर्तमान अध्ययन से एक महत्वपूर्ण निष्कर्ष यह निकला कि हिप्पोकैम्पस एलटीपी में उम्र से संबंधित दोषों को एचडीएसी3 विलोपन या व्यवधान के साथ सुधारा जा सकता है। यह साजिकुमार लैब के हालिया काम के अनुरूप है, जिसमें दिखाया गया है कि HDAC3 की औषधीय नाकाबंदी सहयोगी हिप्पोकैम्पस LTP34 में उम्र से संबंधित दोषों को भी ठीक कर सकती है। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि पुराने HDAC3flox/flox और HDAC3 (Y298H) जानवरों के स्लाइस युवा HDAC3flox/flox या HDAC3 (Y298H) जानवरों (चित्र 2c, f) के स्लाइस के समान क्षमता के स्तर तक पहुंचने में विफल रहे, यह सुझाव देते हुए कि उम्र बढ़ने वाले दिमाग में युवा दिमाग की तुलना में कम प्लास्टिसिटी सीलिंग हो सकती है। पोटेंशिएशन में इस अंतर के लिए एक संभावित व्याख्या यह है कि CA122 में सिनैप्टिक संपर्कों की उम्र से संबंधित हानि उम्र बढ़ने वाले हिप्पोकैम्पस में प्लास्टिसिटी सीलिंग को कम कर सकती है, क्योंकि कम उपलब्ध सिनेप्स युवा डीएच में अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में सिनेप्स की तुलना में अधिक तेज़ी से संतृप्त हो जाएंगे। यदि यह मामला है, तो उत्तेजना प्रोटोकॉल को मजबूत करना या अंतराल उत्तेजना मुकाबलों को प्रदान करना उम्र बढ़ने वाले हिप्पोकैम्पस में एलटीपी को और नहीं बढ़ाना चाहिए, क्योंकि कोई अतिरिक्त सिनेप्स उपलब्ध नहीं हैं। इस अंतर के अंतर्निहित तंत्र को निर्धारित करने के लिए आगे काम करना आवश्यक होगा।

हमारे आरएनए अनुक्रमण परिणामों ने प्रदर्शित किया कि जीन का केवल एक छोटा उपसमुच्चय HDAC3 विलोपन (छवि 3e) द्वारा वृद्ध मस्तिष्क में बहाल होने के मानदंड नहीं है। इस प्रकार, युवा मस्तिष्क के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को पुन: उपयोग करने के बजाय, उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क में एचडीएसी 3 को हटाने से कुछ प्रमुख जीनों की अनुभव-प्रेरित अभिव्यक्ति बहाल हो गई जो कि दीर्घकालिक स्मृति गठन के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं, जिनमें Per1 भी शामिल है। Per1 को HDAC3 द्वारा सीधे विनियमित किया जाता है, क्योंकि HDAC3 का फोकल विलोपन अनुभव-प्रेरित Per1 अभिव्यक्ति को पुनर्स्थापित करता है और HDAC3 को OLM प्रशिक्षण के जवाब में Per1 प्रमोटर से शारीरिक रूप से हटा दिया जाता है। इसके अलावा, Per1 व्यंजक के लिए आवश्यक हैस्मृति, डीएच बिगड़ा दीर्घावधि में PER1 प्रोटीन के siRNA की मध्यस्थता वाली दस्तक के रूप मेंस्मृतियुवा चूहों में गठन, और overexpression में सुधार हुआस्मृतिउम्र बढ़ने वाले चूहों में ओएलएम के लिए। विशेष रूप से, दोनों लेंटिवायरल सिस्टम Per1 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए उपयोग किए जाते हैं, केवल पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6a, d) के CA1b क्षेत्र में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या को ट्रांसफ़ेक्ट करते हैं, जिससे आरएनए-अनुक्रमण के साथ इन निर्माणों की उपस्थिति की पुष्टि करना आवश्यक हो जाता है। ) जैसा कि पिछले काम ने दिखाया है कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस का यह सटीक क्षेत्र OLM36 के लिए महत्वपूर्ण है, यह दर्शाता है कि स्मृति-प्रासंगिक संरचना के भीतर Per1 का एक छोटा फोकल परिवर्तन भी दीर्घकालिक स्मृति गठन को प्रभावित कर सकता है। यह पिछले शोध का विस्तार करता है जिसमें दिखाया गया है कि पूरे मस्तिष्क में Per1 का गैर-विलोपन युवा चूहों में स्मृति गठन को ख़राब कर सकता है। असामान्य HDAC 3- उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क में Per1 का मध्यस्थता दमन इसलिए एक महत्वपूर्ण घटना है जो दीर्घकालिक स्मृति निर्माण और सर्कैडियन लयबद्धता दोनों में उम्र से संबंधित हानि का कारण बन सकती है। यद्यपि यह अध्ययन स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि Per1 एक महत्वपूर्ण जीन है जिसके माध्यम से HDAC3 वृद्ध मस्तिष्क में दीर्घकालिक स्मृति को नियंत्रित करता है, अन्य जीन HDAC3 विलोपन के स्मृति-बढ़ाने वाले प्रभावों में सबसे अधिक योगदान करते हैं। सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और मेमोरी पर HDAC3 के प्रभावों की मध्यस्थता करने के लिए प्रस्तावित अन्य जीनों में NF-κB34, FMRP37 और Nr4a226 शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन में, हमने एक अतिरिक्त तीन जीन (चित्र 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) की पहचान की, जो कि Per1 की तरह, उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क में बिगड़ा हुआ अभिव्यक्ति दिखाते हैं जो HDAC3 विलोपन द्वारा सुधारा जाता है। HDAC3 विलोपन के स्मृति-बढ़ाने वाले प्रभावों में ये विभिन्न जीन विशिष्ट रूप से कैसे योगदान करते हैं, यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, ये सभी जीन सीबीपी / सीआरईबी मार्ग के साथ इंटरफेस करते हैं, जो दीर्घकालिक स्मृति गठन 38,39 के लिए महत्वपूर्ण है और PER16,28 के ऊपर और नीचे दोनों हैं। जैसा कि PER1 CREB फॉस्फोराइलेशन6 के अपस्ट्रीम है, यह संभव है कि Per1 का HDAC 3- मध्यस्थता दमन CREB फॉस्फोराइलेशन को कम करता है, अंततः Fmrp40,41 और Nr4a जीन परिवार के सदस्यों Nr4a1 और Nr4a226 जैसे CREB की मध्यस्थता वाले जीन के प्रतिलेखन को ख़राब करता है। HDAC3, PER1 और इन अन्य आणविक खिलाड़ियों के बीच जटिल गतिशीलता को समझना भविष्य के अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य होगा।

वर्तमान अध्ययन में, हमने उम्र बढ़ने के मस्तिष्क में Per1 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए दो पूरक विधियों का उपयोग किया: pLVX-v5Per1 का उपयोग करके पूर्ण लंबाई वाले Per1 cDNA निर्माण का ओवरएक्प्रेशन और CRISPR-SAM सिस्टम का उपयोग करके अंतर्जात Per1 का ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण। हालाँकि pLVX की मध्यस्थता वाले ओवरएक्प्रेशन ने Per1 mRNA (छवि 5 बी) में बड़ी वृद्धि की, यह Per2 में वृद्धि के साथ था, एक अन्य अवधि परिवार के सदस्य (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6 बी)। हालाँकि, डाउनस्ट्रीम जीन Hes7 की अभिव्यक्ति pLVX-v5Per1 (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6c) द्वारा अपरिवर्तित थी। दूसरी ओर, CRISPR-SAM प्रणाली ने Per1 mRNA में अधिक सूक्ष्म वृद्धि का उत्पादन किया, जो Per2 या Hes7 अभिव्यक्ति (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6e-f) के ऑफ-टारगेट एन्हांसमेंट से बचा। जैसा कि दोनों दृष्टिकोण समान रूप से दीर्घकालिक सुधार करते हैंस्मृतिउम्र बढ़ने वाले चूहों में, यह संभावना नहीं है कि pLVX-v5Per1 के साथ मनाया गया Per2 में ऑफ-टारगेट वृद्धि दीर्घकालिक स्मृति में देखे गए सुधार का कारण थी।

लंबी अवधि पर सर्कैडियन प्रभावस्मृतिपरंपरागत रूप से एससीएन के भीतर विकृति से उपजा माना जाता है, जो तब पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस की तरह स्मृति निर्माण में शामिल परिधीय संरचनाओं में परिवर्तन को प्रेरित करता है। सर्कैडियन लयबद्धता और दीर्घकालिक स्मृति गठन के बीच एक स्पष्ट संबंध के बावजूद, डीएच में व्यक्तिगत सर्कैडियन क्लॉक जीन की भूमिका के बारे में बहुत कम जानकारी है। मेमोरी समय-समय पर निकटता से जुड़ी हुई है, क्योंकि प्लास्टिसिटी से संबंधित जीन कैस्केड सर्कैडियन दोलनों को दिखाते हैं औरस्मृतिसर्कैडियन चक्र की कुछ निश्चित अवधियों में अधिक आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, संदर्भ भय कंडीशनिंग दिन के दौरान अधिक मजबूती से हासिल की जाती है, जब एमएपीके फॉस्फोराइलेशन का स्तर चरम 3 होता है। इसके अलावा, यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि उम्र बढ़ने के साथ सर्कैडियन लय का टूटना होता है, संभवतः केंद्रीय सर्कैडियन घड़ी में परिवर्तन के कारण, सुप्राचैस्मैटिक न्यूक्लियस (एससीएन) (समीक्षा 1 के लिए)। सर्कैडियन क्लॉक में यह व्यवधान उम्र से संबंधित विकारों से कैसे संबंधित है?स्मृतिएक खुला प्रश्न है। हमारे परिणाम बताते हैं कि HDAC3 उम्र बढ़ने के हिप्पोकैम्पस में अनुभव-प्रेरित Per1 को सीमित करता है, संभवतः दीर्घकालिक स्मृति में देखे गए दोषों में योगदान देता है। Per1 का एपिजेनेटिक दमन इसलिए सर्कैडियन लयबद्धता और दीर्घकालिक स्मृति गठन दोनों में उम्र से संबंधित दुर्बलताओं के बीच एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

कोर कैनोनिकल सर्कैडियन क्लॉक जीन में से, Per1 विशिष्ट रूप से हिप्पोकैम्पस दीर्घकालिक को नाटकीय रूप से प्रभावित करने के लिए तैयार हैस्मृति. Per1 मुख्य रूप से SCN आउटपुट पाथवे में शामिल प्रतीत होता है और SCN के परिधीय घड़ियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जैसे कि हिप्पोकैम्पस। इसके अलावा, हाल के काम से पता चलता है कि Per1 CREB फॉस्फोराइलेशन 6,28,29 को नियंत्रित करके पूरे दिन / रात के चक्र में स्थानिक स्मृति निर्माण को "गेट" कर सकता है। दरअसल, हिप्पोकैम्पस Per1 mRNA अपग्रेडेशन को चूहों में काम सहित कम से कम तीन अन्य RNA-seq अध्ययनों में संदर्भ या स्थानिक सीखने के बाद देखा गया है, यह दर्शाता है कि Per1 को आमतौर पर प्रजातियों में सीखने के बाद अपग्रेड किया जाता है। वर्तमान अध्ययन के परिणामों के साथ, यह कार्य इंगित करता है कि PER1 अभिव्यक्ति हिप्पोकैम्पस दीर्घकालिक स्मृति निर्माण के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है; PER1 में कमी जो रात29 में या उम्र बढ़ने के साथ होती है, हिप्पोकैम्पस को ख़राब कर सकती हैस्मृति. तारीख तक,

Per1 in . को दर्शाने वाला अनुसंधानस्मृतिगठन विशेष रूप से वैश्विक नॉकआउट पर निर्भर करता है जो हिप्पोकैम्पस 6,28,29,45,46 जैसी स्मृति-प्रासंगिक संरचनाओं के अलावा कोर सर्कैडियन घड़ी और अन्य क्षेत्रों में Per1 अभिव्यक्ति को बाधित करता है, जिससे यह निर्धारित करना असंभव हो जाता है कि हिप्पोकैम्पस PER1 के लिए विशेष रूप से आवश्यक है या नहीं स्मृति गठन। दरअसल, वैश्विक Per1 विलोपन कुछ रिपोर्टों में सर्कैडियन लयबद्धता को प्रभावित करता है। यहां, हम पहली बार दिखाते हैं कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में सीधे PER1 अभिव्यक्ति को कम करने से हानि हो सकती हैस्मृतियुवा चूहों में जबकि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में Per1 की स्थानीय अतिसक्रियता उम्र बढ़ने वाले चूहों में स्मृति में सुधार कर सकती है। पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में चयनात्मक विलोपन HDAC3 (जो Per1 को नियंत्रित करता है) का वर्तमान अध्ययन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4) में सर्कैडियन गतिविधि पैटर्न पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, और यहां तक ​​​​कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के इलेक्ट्रोलाइटिक घाव भी सर्कैडियन लयबद्धता को प्रभावित करने के लिए अपर्याप्त हैं, ऐसा लगता नहीं है। पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के भीतर Per1 में हेरफेर करना केंद्रीय सर्कैडियन घड़ी के कार्य को प्रभावित करता है। फिर भी, यह संभव है कि Per1 में अनुभव-प्रेरित वृद्धि या Per1 के वायरस-मध्यस्थता वाले ओवरएक्प्रेशन, अन्य आणविक खिलाड़ियों के सर्कैडियन दोलन को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि अन्य घड़ी जीन, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के भीतर, यहां तक ​​​​कि सर्कैडियन गतिविधि पैटर्न को प्रभावित किए बिना भी। यह समझना कि Per1 स्मृति निर्माण को बदलने के लिए कैसे कार्य करता है, जिसमें इन संभावित अंतःक्रियात्मक भागीदारों की पहचान करना शामिल है, भविष्य के कार्य का लक्ष्य होगा।

साथ में, ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि कोर सर्कैडियन क्लॉक जीन Per1 स्थानीय के भीतर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैस्मृतिस्मृति निर्माण को बदलने के लिए संरचनाएं, एक भूमिका जो एससीएन में अपने कार्य से स्वतंत्र है। अधिक सामान्यतः, यह पारंपरिक परिकल्पना को चुनौती देता है कि सर्कैडियन में परिवर्तन होता हैस्मृतिगठन कोर सर्कैडियन घड़ी में परिवर्तन द्वारा संचालित होते हैं और इसके बजाय इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि सर्कैडियन क्लॉक जीन हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं में अधिक स्वायत्त भूमिका निभाते हैं, संभवतः दिन के समय के आधार पर स्मृति निर्माण को गेटिंग करते हैं।

तरीकों

चूहे। परीक्षण के समय युवा वयस्क चूहों की उम्र 2 से 4 महीने के बीच थी और उम्र बढ़ने वाले चूहों की उम्र 18 से 20 महीने के बीच थी। सभी चूहे C57BL/6J थे या C57BL/6 बैकग्राउंड (HDAC3 plus / plus और HDAC3flox/flox चूहों) पर बनाए हुए थे। चूहे के पास भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी और रोशनी को 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था। सभी व्यवहार परीक्षण प्रकाश चक्र के दौरान किए गए थे। सभी प्रयोग जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

शल्य चिकित्सा। चूहे को आइसोयूरेन (प्रेरित, 4 प्रतिशत; बनाए रखा 1.5-2। 0 प्रतिशत) के साथ संवेदनाहारी किया गया और स्टीरियोटैक्सिक में रखा गया। इंजेक्शन सुइयों को पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में 0.2 मिमी/15 एस (एपी, −2। 0 मिमी; एमएल, ± 1.5 मिमी, डीवी, - 1.5 मिमी ब्रेग्मा के सापेक्ष कम किया गया था। ) लक्ष्य की गहराई तक पहुँचने के दो मिनट बाद, 1.0 उल ऑफ़ वायरस या siRNA को द्विपक्षीय रूप से DH में 6 ul/h की दर से संक्रमित किया गया। CRISPR-SAM लेंटिवायरल इन्फ्यूजन के लिए, तीन वायरस के एक कॉकटेल को समान दर पर 1.5 μL प्रति गोलार्द्ध की अंतिम मात्रा में संक्रमित किया गया था। इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन की सुई दो मिनट तक बनी रही ताकि वायरस फैल सके। इंजेक्टरों को तब 0.1 मिमी उठाया गया और 0.1 मिमी प्रति 15 एस की दर से हटाए जाने से पहले एक और मिनट के लिए बैठने दिया गया। व्यवहार विश्लेषण से 2 सप्ताह पहले वायरल संक्रमण किया गया था, जबकि प्रशिक्षण से पहले siRNA नॉकडाउन 2d का प्रदर्शन किया गया था। सभी इंजेक्शन प्रयोगों के लिए, जानवरों को अलग-अलग इंजेक्शन स्थितियों (HDAC3 प्लस / प्लस और HDAC3flox / flox चूहों के अपवाद के साथ, जो सभी AAV-CaMKII-Cre के साथ इंजेक्ट किए गए थे) को बेतरतीब ढंग से सौंपा गया था। सभी व्यवहार प्रयोगों के लिए, प्रत्येक वायरल स्थिति के भीतर जानवरों को बेतरतीब ढंग से होमकेज / प्रशिक्षित समूहों को सौंपा गया था और सभी स्थितियों (वस्तुओं, बक्से, आदि) को समूहों के बीच असंतुलित किया गया था।

एएवी उत्पादन। AAV2.1-CaMKII-Cre को पेन वेक्टर कोर (टाइटर: 1.81 × 1013 GC/ml) से खरीदा गया था। AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 के लिए, हमने हिप्पोकैम्पस सीडीएनए से वाइल्डटाइप HDAC3 को बढ़ाया और CMV प्रमोटर और -ग्लोबिन इंट्रॉन के नियंत्रण में उत्पाद को एक संशोधित pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) में क्लोन किया। 3 × -FLAG टैग, IRES तत्व, और hrGFP को वेक्टर से हटा दिया गया और V5 टैग के साथ बदल दिया गया, जिससे HDAC3 (प्लास्मिड MW91) के लिए C-टर्मिनल फ्यूजन की अनुमति मिल गई। बिंदु उत्परिवर्तन बनाने के लिए, हमने अमीनो एसिड 298 (प्लास्मिड MW92) पर टायरोसिन के स्थान पर एक हिस्टिडीन अवशेष के लिए न्यूक्लियोटाइड को कोड में बदल दिया। खाली वेक्टर नियंत्रण के लिए, HDAC3 कोडिंग अनुक्रम मौजूद नहीं था, लेकिन अन्य सभी तत्व बने रहते हैं (प्लास्मिड MW87)। AAV को पेन वेक्टर कोर द्वारा बनाया गया था और अंतिम टाइटर्स qPCR (AAV-HDAC3 (Y298H): 6.48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1.35 × 1013 GC/ml) द्वारा निर्धारित किए गए थे।

लेंटवायरस उत्पादन। CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) सिस्टम के लिए, dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) और MS2- के लिए Addgene से लेंटिवायरल प्लास्मिड खरीदे गए। P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) कंस्ट्रक्शंस (8×106 TU/ml से अधिक या उसके बराबर टाइटर्स)। Per1 sgRNA के लिए, हमने Addgene sgRNA (MS2) क्लोनिंग बैकबोन (# 61427) में Per1 प्रमोटर (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) में CRE तत्व के अनुरूप एक एंटीसेंस गाइड अनुक्रम को क्लोन और सम्मिलित किया। नियंत्रण sgRNA समान था, सिवाय इसके कि कोई गाइड अनुक्रम प्लास्मिड में क्लोन नहीं किया गया था। Per1 sgRNA (titer: 6.8 × 107 IFU/ml) और नियंत्रण sgRNA (3.5 × 107 IFU/ml) दोनों के लिए Lentiviruses USC स्कूल ऑफ फार्मेसी लेंटिवायरल लेबोरेटरी द्वारा निर्मित किए गए थे।

pLVX-V5Per1 ओवरएक्प्रेशन निर्माण के लिए, हमने Addgene pCMV-Sport2-mPer1 प्लास्मिड (#16203) से पूर्ण-लंबाई वाले वाइल्डटाइप Per1 को बढ़ाया और उत्पाद को एक संशोधित pLVX-EF1 -IRES-mCherry में क्लोन किया। रीढ़ की हड्डी (तकरा, #631987)। IRES और mCherry तत्वों को हटा दिया गया और उन्हें V5 टैग से बदल दिया गया, जिससे PER1 (प्लास्मिड MW206) के लिए N-टर्मिनल फ्यूजन की अनुमति मिल गई। खाली वेक्टर (EV) नियंत्रण के लिए, PER1 कोडिंग अनुक्रम मौजूद नहीं था लेकिन अन्य सभी तत्व बने रहे (प्लास्मिड MW93)। यूएससी स्कूल ऑफ फार्मेसी लेंटिवायरल लेबोरेटरी द्वारा pLVX-v5Per1 (टाइटर: 1.3 × 108 IFU/ml) और pLVX-EV (टाइटर: 1.5 × 108 IFU/ml) के लिए लेंटिवायरस तैयार किए गए थे। सभी लेंटिवायरल निर्माण EF1 प्रमोटर के तहत व्यक्त किए गए थे।

pLVX-v5Per1 और CRISPR-SAM का सेल कल्चर सत्यापन। यह सत्यापित करने के लिए कि pLVX-v5Per1 Per1 mRNA की अधिकता उत्पन्न करता है, माउस HT22 कोशिकाओं (साल्क इंस्टीट्यूट, ला जोला, CA, # T09031) को लिपोफ़ेक्टाइन LTX (Invitrogen) का उपयोग करके pLVX-v5Per1 या pLVX- EV (चित्र 5a) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। इसी तरह, यह सत्यापित करने के लिए कि CRISPR-SAM प्रणाली प्रभावी रूप से Per1 प्रतिलेखन को चला सकती है, HT22 कोशिकाओं को dCas 9-VP64 (लेंटी MS2-P65_HSF1_के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। फेंग झांग एडजीन प्लास्मिड #61425), एमएस2-पी65-HSF1 (लेंटी डीसीएएस-वीपी64_ब्लास्ट से एक उपहार फेंग झांग, एडजीन प्लास्मिड #61426) से एक उपहार था, और या तो Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) या गैर-लक्षित नियंत्रण sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2) _ ज़ीओ बैकबोन, लिपोफ़ेक्टामाइन LTX (Invitrogen) का उपयोग करके फेंग झांग, एडजीन प्लास्मिड #61427) का एक उपहार था। कोशिकाओं को 24 या 48 घंटे के बाद काटा गया, लाइस किया गया, और एमआरएनए को ऊपर वर्णित के अनुसार अलग किया गया। qRT-PCR को ऊपर वर्णित Per1, Per2, और Hes7 प्राइमरों और तालिका S4 में सूचीबद्ध जांच का उपयोग करके किया गया था।

सिरना. Per1 नॉकडाउन प्रयोग के लिए, Accell SMARTpool छोटे दखल देने वाले RNA (siRNAs; धर्मकॉन, GE) Per1 को लक्षित करते हुए ddH20 में 1 0 μM की कुल कुल एकाग्रता को पतला किया गया और DH (1.0 ul / साइड) में संक्रमित किया गया। एक्सेल नॉन-टारगेटिंग पूल siRNA को नियंत्रण (कुल एकाग्रता, 10 μM) के रूप में इस्तेमाल किया गया था और उसी तरह से संक्रमित किया गया था। SiRNA प्रयोगों के लिए, ऊपर वर्णित अनुसार चूहों को संभाला और अभ्यस्त किया गया था और अभ्यस्त होने के अंतिम दिन के बाद सर्जरी की गई थी। सर्जरी के बाद चूहे को ठीक होने का पूरा दिन दिया गया और अगले दिन (~ सर्जरी के बाद 48 घंटे) को अधिकतम लक्ष्य नॉक-डाउन सुनिश्चित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया। नॉकडाउन सुनिश्चित करने के लिए, चूहों को परीक्षण के बाद ~ 1 घंटे की बलि दी गई और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से घूंसे को PER1 प्रोटीन की खराबी सुनिश्चित करने के लिए पश्चिमी धब्बों के साथ संसाधित किया गया।

वस्तु स्थान और वस्तु पहचानस्मृतिकार्य। ऑब्जेक्ट लोकेशन और ऑब्जेक्ट रिकग्निशन मेमोरी कार्यों के लिए, चूहों को 4 दिन के लिए 2 मिनट / दिन के लिए संभाला गया और फिर वस्तुओं की अनुपस्थिति में लगातार छह दिनों तक 5 मिनट / दिन के संदर्भ में अभ्यस्त किया गया। प्रशिक्षण के दौरान, चूहों को दो समान वस्तुओं (100 मिलीलीटर बीकर, मसाला टिन, या ग्लास मोमबत्ती धारक) से अवगत कराया गया और 10 मिनट तक तलाशने की अनुमति दी गई। प्रतिधारण परीक्षण के दौरान (24 घंटे बाद में लंबी अवधि के लिएस्मृतिया 60 मीटर बाद में अल्पकालिक स्मृति के लिए), चूहों को 5 मिनट तक तलाशने की अनुमति दी गई। वस्तु स्थान के लिएस्मृति, दो परिचित वस्तुओं में से एक को एक नए स्थान पर ले जाया गया। वस्तु पहचान के लिएस्मृति, वस्तु स्थान स्थिर रहे लेकिन वस्तुओं में से एक को एक नए आइटम से बदल दिया गया। ओएलएम परीक्षण के पूरा होने के कम से कम एक सप्ताह बाद ऑब्जेक्ट रिकग्निशन मेमोरी की आदत शुरू हुई और एक नया संदर्भ और अपरिचित वस्तुओं का उपयोग किया गया। जब माउस का सिर वस्तु की ओर उन्मुख होता है और 1 सेमी के भीतर आता है या जब नाक वस्तु को छूती है तो अन्वेषण किया गया था। कुल अन्वेषण समय दर्ज किया गया था (टी) और उपन्यास आइटम के लिए वरीयता एक भेदभाव सूचकांक (डीआई=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 प्रतिशत) के रूप में व्यक्त की गई थी। प्रशिक्षण सत्रों के लिए, परीक्षण में स्थानांतरित करने के लिए नामित वस्तु को प्रशिक्षण और परीक्षण DI की सीधे तुलना करने की अनुमति देने के लिए उपन्यास वस्तु के रूप में उपयोग किया गया था। परीक्षण के दौरान 2 एस से कम या प्रशिक्षण के दौरान 3 एस से कम दोनों वस्तुओं का पता लगाने वाले चूहे को आगे के विश्लेषण से हटा दिया गया। प्रशिक्षण के दौरान एक वस्तु के लिए वरीयता दिखाने वाले चूहे (DI> ± 20) को भी हटा दिया गया। किसी भी भूलभुलैया व्यवहार विश्लेषण सॉफ्टवेयर (Stoelting Co) का उपयोग करके आदत सत्रों का विश्लेषण किया गया था (यात्रा की गई दूरी और गति निर्धारित करने के लिए)। प्रायोगिक समूहों के लिए अंधे प्रयोगकर्ताओं द्वारा सभी आवास, प्रशिक्षण, परीक्षण और स्कोरिंग का प्रदर्शन किया गया।

स्थिति के लिए संदर्भ डर। प्रासंगिक भय कंडीशनिंग के लिए, चूहों को पहली बार 5 दिनों के लिए संभाला गया था। अधिग्रहण के दौरान, चूहों को 2 मिनट और 28 सेकेंड के लिए संदर्भ से अवगत कराया गया, इसके बाद 2 एस (0.75 एमए) झटका लगा, एक प्रोटोकॉल जो आमतौर पर मजबूत दीर्घकालिक स्मृति 12,20 पैदा करता है। चूहे हटाए जाने से पहले अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए संदर्भ में बने रहे। प्रशिक्षण के बाद 60 मीटर चूहों की बलि दी गई, साथ ही घरेलू पिंजरे के नियंत्रण जिन्हें संभाला गया लेकिन प्रशिक्षित नहीं किया गया। एथोविजन 11 सॉफ्टवेयर (नोल्डस)12 का उपयोग करके बर्फ़ीली व्यवहार को मापा गया।

एलिवेटेड प्लस-भूलभुलैया। प्लस-भूलभुलैया प्रयोगात्मक समूहों के लिए नेत्रहीन एक प्रयोगकर्ता द्वारा आयोजित किया गया था। ओआरएम के पूरा होने के एक सप्ताह बाद, प्लस-भूलभुलैया पर चूहों के एक सबसेट का परीक्षण किया गया। भूलभुलैया की दो भुजाएँ खुली थीं (30 × 5 सेमी) और दो भुजाएँ संलग्न थीं (30 × 5 × 15 सेमी), एक केंद्रीय मंच (5 × 5 सेमी) से जुड़ी हुई थीं। भूलभुलैया को फ़्लोर से 40 सेमी ऊपर उठाया गया था। तंत्र पर 5 मिनट के लिए चूहे का परीक्षण किया गया, जिसमें प्रत्येक माउस को खुले हाथों में से एक का सामना करने वाले केंद्रीय मंच पर रखना शामिल था। विषयों के बीच, भूलभुलैया को 70 प्रतिशत इथेनॉल से साफ किया गया था। बंद और खुली बाहों में बिताए गए समय का प्रतिशत किसी भी भूलभुलैया सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्कोर किया गया था।

सर्कैडियन लय विश्लेषण। युवा ({0}}मो) और उम्र बढ़ने (18-मो) HDAC3 प्लस / प्लस और HDAC3flox/flox चूहों को 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे (LD) चक्र के तहत नस्ल और रखा गया था। AAV-CaMKII-Cre जलसेक (ऊपर वर्णित) के दो सप्ताह बाद, चूहों को 7 दिनों के लिए एक पृथक 12 h LD प्रवेश कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया। चूहे को तब एक प्रकाश-संरक्षित गतिविधि विश्लेषण कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया था, जहां ऑप्टिकल बीम मोशन डिटेक्टर (फिलिप्स रेस्पिरोनिक्स) का उपयोग करके लोकोमोटर गतिविधि का विश्लेषण किया गया था। अतिरिक्त 3 सप्ताह के लिए चूहों को निरंतर अंधेरे (डीडी) में बदलने से पहले प्रकाश-संरक्षित कमरे में एलडी चक्र प्रवेश के 2 सप्ताह के दौरान गतिविधि की निगरानी की गई थी। यह निर्धारित करने के लिए कि डीएच प्रभावित अंतर्जात सर्कैडियन लय में HDAC3 विलोपन, डीडी चरण के दौरान गतिविधि निगरानी जारी रही। मिनिमीटर वाइटल व्यू 5.0 का उपयोग करके डेटा एकत्र किया गया था और क्लॉकलैब सॉफ्टवेयर (एक्टिमेट्रिक्स) का उपयोग मुफ्त गतिविधि की शुरुआत को निर्धारित करने के लिए किया गया था। ताऊ मूल्यों की गणना इस शुरुआत के ढलान को प्राप्त करके और क्लॉकलैब सॉफ्टवेयर 49, 50 के साथ कम से कम वर्गों की गणना करके की गई थी।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। व्यवहार के पूरा होने के बाद, गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और उनके दिमाग को हटा दिया गया और बर्फ-ठंडे आइसोपेंटेन में राख-जमे हुए। बीस-माइक्रोमीटर स्लाइस पूरे पृष्ठीय हिप-कैंपस में एकत्र किए गए, स्लाइड्स पर थॉ-माउंट किए गए और −8 0 डिग्री पर संग्रहीत किए गए। स्लाइड्स को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (10- मिनट) के साथ तय किया गया था, जिसे 0 में पारगम्य किया गया था। 01 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 0.1 एम पीबीएस (5- मिनट) में। , और 8 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम (जैक्सन) के साथ 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया। स्लाइड्स को रातोंरात (4 डिग्री) खरगोश एंटीबॉडी में HDAC3 (1:250, Abcam, क्लोन Y415, ab32369) या V5 (1:1000, Abcam, ab9116), या चिकन एंटीबॉडी से GFP (1:250, Aves Labs) में इनक्यूबेट किया गया था। # जीएफपी1010)। अगले दिन, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 (एचडीएसी3 और वी5; 1:1000, थर्मोफिशर, #ए -11008) या बकरी विरोधी चिकन एलेक्सा 488 (जीएफपी) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड्स को धोया और ऊष्मायन किया गया। ; 1:1000, थर्मोफिशर, #A-11039) अंधेरे में। स्लाइड्स को तब पीबीएसटी से धोया गया और न्यूरोट्रेस 530/615 (1:50; थर्मोफिशर, # एन21482), एक फ्लोरोसेंट निस्सल दाग में 50 मीटर के लिए इनक्यूबेट किया गया। गैर-विशिष्ट ऑटो-यूरेसेंस को बुझाने के लिए, स्लाइस को पीबीएस में 0.01 प्रतिशत ट्राइटन के साथ धोया गया, पानी में धोया गया, और 50 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर में 10 मिमी CuSO4 में 10- मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। स्लाइस को फिर से पानी में धोया गया, पीबीएस में धोया गया, और वेक्टाशील्ड एंटिफेड माउंटिंग माध्यम (वेक्टर लेबोरेटरीज) के साथ कवर किया गया।

सभी छवियों को एक ओलिंप स्कैनर VS11 0 के साथ 20x एपोक्रोमैटिक उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 0.75) के साथ VS110 स्कैनर सॉफ्टवेयर के साथ हासिल किया गया था। प्रत्येक स्लाइड पर सभी उपचार समूहों का प्रतिनिधित्व किया गया था और एक स्लाइड पर सभी छवियों को एक ही एक्सपोज़र समय के साथ गैर-संतृप्त परिस्थितियों में कैप्चर किया गया था। CA1 में सेल परत के ऑप्टिकल घनत्व का नमूना लेकर और उसी छवि में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के एक नमूने को घटाकर ImageJ के साथ इम्यूनोलैबलिंग तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी। सभी एएवी प्रयोगों के लिए, जो जानवर पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में वायरस को व्यक्त करने में विफल रहे, उन्हें विश्लेषण से बाहर रखा गया। प्रायोगिक स्थितियों के लिए अंधे प्रयोगकर्ताओं द्वारा इमेजिंग और परिमाणीकरण का प्रदर्शन किया गया।

पश्चिमी धब्बा। PER1 नॉकडाउन को सत्यापित करने के लिए, Per1 siRNA और नियंत्रण siRNA चूहों को परीक्षण के बाद 2 घंटे के लिए त्याग दिया गया और दिमाग राख-जमे हुए थे। दिमाग को कोरोनली सेक्शन किया गया था और 5 0 0 माइक्रोन स्लाइस से 1 मिमी डीएच पंच एकत्र किए गए थे। पंचों को टी-प्रति बफर (थर्मो फिशर) में हॉल्ट प्रोटीज और फॉस्फेटस इनहिबिटर (थर्मो फिशर) के साथ एक डाउंस होमोजेनाइज़र का उपयोग करके समरूप बनाया गया था। प्रोटीन lysates को एक संशोधित ब्रैडफोर्ड परख (BioRad) का उपयोग करके परिमाणित किया गया था और 5 0 कुल प्रोटीन lysate को 7.5 प्रतिशत NuPAGE Bis-Tris gel (थर्मो फिशर) के प्रत्येक लेन में लोड किया गया था। जैल 200 वोल्ट पर 50 मिनट तक चला और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (नोवेक्सी, एलसी2001) पर 4 डिग्री पर 15 वी पर रातोंरात ब्लॉट्स स्थानांतरित कर दिए गए। अगले दिन, झिल्ली को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में (0.01 प्रतिशत ट्वीन 20 के साथ ट्रिस-बफर खारा में 5 प्रतिशत नॉनफैट दूध), धोया गया (टीबीएस में 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20) और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500) में ऊष्मायन किया गया। खरगोश विरोधी Per1, थर्मो फिशर #PA1-524) प्राथमिक एंटीबॉडी बफर में (टीबीएस में 3 प्रतिशत बीएसए 0.1 प्रतिशत ट्वीन के साथ) रातोंरात 4 डिग्री पर। झिल्लियों को तब धोया गया और एचआरपी-संयुग्मित माउस एंटीबॉडी में खरगोश (1:10, 000, जैक्सन लेबोरेटरीज, लाइट चेन-स्पेसी, # 211-032-171) में 1 घंटे के लिए लगाया गया। पियर्स सुपरसिग्नल वेस्ट पिको केमिलुमिनसेंट सबस्ट्रेट (पियर्स, 34077) का उपयोग करके झिल्ली को धोया और विकसित किया गया था। रैखिकता को सत्यापित करने के लिए एकाधिक फिल्म एक्सपोजर का उपयोग किया गया था। रिस्टोर वेस्टर्न ब्लॉट स्ट्रिपिंग बफर (थर्मो फिशर # 21059) के साथ ब्लास्ट को 10 मीटर के लिए धोया और छीन लिया गया, फिर से धोया गया, और फिर GAPDH (1: 1000, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, SC25778) के लिए एक खरगोश एंटीबॉडी के साथ रातोंरात (4 डिग्री) फिर से जांच की गई। ) पूर्ण-लंबाई वाले PER1 और GAPDH ब्लॉट्स को पूरक चित्र 5 में दिखाया गया है। सापेक्ष ऑप्टिकल घनत्व की गणना स्कैन किए गए lm से ImageJ (यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ) का उपयोग करके प्रायोगिक स्थितियों के लिए एक प्रयोगकर्ता अंधे द्वारा की गई थी। GAPDH अभिव्यक्ति स्तरों के लिए सभी मान सामान्यीकृत किए गए थे।

क्यूआरटी-पीसीआर। ऊतक डीएच घूंसे (ऊपर वर्णित) से एकत्र किया गया था और प्रसंस्करण तक −80 डिग्री पर जमे हुए थे। आरएनए को एक आरनेसी मिनिकिट (क्यूजेन, #74104) का उपयोग करके अलग किया गया था और सीडीएनए को ट्रांसक्रिप्टर फर्स्ट स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (रोच, 0437901201) का उपयोग करके बनाया गया था। प्राइमर और प्रोब Roche Universal ProbeLibrary (टेबल S4) से लिए गए थे और Roche लाइट-साइकिल 480 II मशीन (Roche) में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए उपयोग किए गए थे। Gapdh के लिए सभी मान सामान्यीकृत किए गए थे। Pfaffl पद्धति 52,53 पर आधारित Roche मालिकाना एल्गोरिदम और REST 2009 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण और आँकड़े किए गए थे।

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 हमारे विश्लेषण में शामिल थे। प्रत्येक समूह के लिए सीडीएनए पुस्तकालय TruSeq RNA नमूना तैयारी गाइड (इलुमिना) के अनुसार तैयार किए गए थे। प्रत्येक माउस से कुल आरएनए के दो सौ पचास नैनोग्राम को पॉली-टी ओलिगो-संलग्न चुंबकीय मोतियों और गर्मी खंडित के साथ शुद्ध किया गया था। पहले और दूसरे स्ट्रैंड के सीडीएनए को तब संश्लेषित और शुद्ध किया गया था। समाप्त होने के बाद, एडेप्टर बंधाव के दौरान टेम्पलेट के संयोजन को रोकने के लिए 3′ छोर को एडिनाइलेट किया गया था। प्रत्येक समूह के लिए, सीडीएनए के सिरों पर एक अद्वितीय एडेप्टर सेट जोड़ा गया था और पुस्तकालयों को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया था। पुस्तकालय की गुणवत्ता का मूल्यांकन Bioanalyzer द्वारा किया गया था और एक वाणिज्यिक अनुक्रमण पुस्तकालय (Illumina) से तैयार मानक वक्र के साथ qRT-PCR का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। नमूनों को बहुसंकेतन किया गया था, प्रत्येक व्यवहार समूह को सीक्वेंसर के प्रत्येक फ्लो सेल में दर्शाया गया था। प्रत्येक पुस्तकालय के 10 एनएम को चार मल्टीप्लेक्स पुस्तकालयों में जमा किया गया था और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में जीनोमिक हाई-थ्रूपुट सुविधा द्वारा संचालित एकल-पढ़ने वाले 50 बीपी अनुक्रमण के दौरान एक इलुमिना हाईसेक 2500 उपकरण पर अनुक्रमित किया गया था। प्रत्येक पुस्तकालय के लिए परिणामी अनुक्रमण डेटा को FastQ फ़ाइलें बनाने के लिए पोस्ट-प्रोसेस किया गया था। डेटा को तब इल्लुमिना कासावा 1.8.2 सॉफ्टवेयर के साथ-साथ इन-हाउस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डीमल्टीप्लेक्स और बदल दिया गया था। खराब-गुणवत्ता वाले रीड्स (इलुमिना के मानक गुणवत्ता परीक्षणों में विफल) और नियंत्रण रीड्स को सफलतापूर्वक PhiX नियंत्रण जीनोम से संरेखित किया गया था, विश्लेषण से हटा दिए गए थे। सीक्वेंसिंग रन (सप्लीमेंट्री अंजीर 3 ए) के बेस-कॉलिंग चरण के दौरान वास्तविक समय में उत्पादित PHRED गुणवत्ता स्कोर का उपयोग करके शेष अनुक्रमों की गुणवत्ता का और अधिक मूल्यांकन किया गया था।

संदर्भ जीनोम और प्रतिलेख के लिए संरेखण। प्रत्येक प्रयोग के रीड्स को शॉर्ट-रीड एलाइनर्स ELAND v2e (इलुमिना) और Bowtie24 का उपयोग करके संदर्भ जीनोम और संबंधित ट्रांसक्रिप्टोम से अलग-अलग संरेखित किया गया था। ज्ञात एक्सॉन या ब्याह जंक्शनों के लिए दोनों उपकरणों द्वारा विशिष्ट रूप से संरेखित किए गए रीड के किसी भी 25 बीपी टुकड़े पर दो से अधिक बेमेल नहीं हैं, जो प्रतिलेख में शामिल थे। विशिष्ट रूप से संरेखित पढ़ता है, लेकिन पढ़ने के किसी भी 25 बीपी टुकड़े पर दो से अधिक बेमेल के साथ विश्लेषण से हटा दिया गया था। इसी तरह, संदर्भ जीनोम में कई स्थानों से मेल खाने वाले रीड्स को विश्लेषण से हटा दिया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए संदर्भ जीनोम और ट्रांसक्रिपटॉम को सौंपे गए रीड्स का प्रतिशत प्रतिकृति के प्रत्येक समूह (सप्लीमेंट्री अंजीर 3 बी) के लिए सूचित किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप प्रति नमूना औसतन लगभग 30 मिलियन रीड्स हुए।

लेंटिवायरल जलसेक के बाद पीएलवीएक्स और सीआरआईएसपीआर-एसएएम प्लास्मिड की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, हमने व्यवहार के बाद प्रति समूह तीन जानवरों के सबसेट से हिप्पोकैम्पस नमूनों पर आरएनए अनुक्रमण चलाया। चूंकि विवो में लेंटिवायरस से संक्रमित कोशिकाओं की संख्या RT-qPCR (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6a, d) का उपयोग करके उपयुक्त टेप की उपस्थिति का मज़बूती से पता लगाने के लिए बहुत कम थी, इसलिए हमने उपस्थिति का पता लगाने के लिए RNA-seq को अधिक संवेदनशील विधि के रूप में उपयोग किया। इन प्रतिलेखों के। जीनोम असेंबली और जीनोम एनोटेशन का एक अद्यतन संस्करण क्रमशः मूल mm10 माउस जीनोम और mm10 माउस जीनोम एनोटेशन के लिए प्लास्मिड निर्माणों के अनुक्रम और एनोटेशन को जोड़कर बनाया गया था। Tuxedo Suite54 में रीड अलाइनमेंट टूल TopHat का उपयोग करते हुए, रीड्स को जीनोम में मैप किया गया था और केवल हिट जो अंतर्जात माउस संदर्भ जीनोम की तुलना में प्लास्मिड टेप के लिए अद्वितीय थे, उन्हें प्लास्मिड निर्माणों के लिए "मिलान रीड" माना जाता था। प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक निर्माण के लिए मिलान किए गए रीड्स की संख्या तब निर्धारित की गई थी।

जीन अभिव्यक्ति और अंतर विश्लेषण। प्रत्येक प्रतिकृति के लिए रीड अलाइनमेंट परिणामों से सीधे जीन अभिव्यक्ति के स्तर की गणना की गई। मानक RPKM मान 55, प्रति मिलियन मैप किए गए एक्सॉन मॉडल के प्रति किलोबेस पढ़ता है) अनुक्रमण डेटा द्वारा कवर किए गए प्रत्येक जीन और इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्रत्येक प्रतिकृति के लिए निकाले गए थे।

ओएलएम के बाद ऊपर या नीचे विनियमित जीन की पहचान करने के लिए समूहों की प्रत्येक जोड़ी (होमकेज बनाम 6 0 मीटर प्रशिक्षण के बाद) में साइबर T56,57 का उपयोग करके विभेदक ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण किए गए थे। वर्तमान अध्ययन के लिए प्रशिक्षित 18-महीने पुराने HDAC3 प्लस / प्लस और HDAC3flox/flox चूहों के अलावा, {{10} महीने पुराने C57 वाइल्डटाइप चूहों ( होमकेज और ओएलएम-प्रशिक्षित उसी तरह से वर्तमान अध्ययन) पिछले अध्ययन से अंतर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रत्येक समूह के लिए जानवरों (जैविक प्रतिकृति) की संख्या थी: युवा एचडीएसी प्लस / प्लस एचसी: 6, यंग एचडीएसी 3 प्लस / प्लस ओएलएम: 6, पुराना एचडीएसी 3 प्लस / प्लस एचसी: 6, पुराना एचडीएसी 3 प्लस / प्लस ओएलएम: 6, पुराना HDAC3flox/flox HC: 8, Old HDAC3flox/flox OLM: 8. किसी तकनीकी प्रतिकृति का उपयोग नहीं किया गया था। विभेदक व्यंजक निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला p-मान थ्रेशोल्ड सभी समूहों के लिए 0.05 है। बेंजामिनी और होचबर्ग (बीएच) क्यू-वैल्यू द्वारा मापी गई झूठी खोज दर (एफडीआर) का उपयोग 0.15 की एफडीआर सीमा के साथ कई परीक्षण के लिए सही करने के लिए किया गया था। इन 3 समूहों (युवा जंगली प्रकार, उम्र बढ़ने HDAC प्लस / प्लस, या उम्र बढ़ने HDAC3flox / flox) के लिए अनुभव (होमकेज की तुलना में) के बाद अपग्रेड किए गए जीनों के सेट को दो या दो से अधिक समूहों के लिए सामान्य जीन निर्धारित करने के लिए प्रतिच्छेद किया गया था। ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए प्रत्येक समूह का संवर्धन, जीन ओन्टोलॉजी शब्द58, और केईजीजी मार्ग 59,60 व्यवहार के बाद अंतर व्यक्त जीन के आधार पर DAVID61 का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। पायथन के लिए "मैटप्लोटलिब" और आर के लिए "जीजीप्लॉट" का उपयोग करके डेटा विज़ुअलाइज़ेशन किया गया था।

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रूवमेंट। चिप को मिलिपोर चिप किट 11,12,62 से प्रोटोकॉल के आधार पर डीएच पंचों पर प्रदर्शित किया गया था। ऊतक को 1 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड (सिग्मा), लाइसेड और सोनिकेटेड के साथ क्रॉस-लिंक किया गया था, और क्रोमेटिन को रात भर में 2 उल एंटी-एच 4 के 8 एसी (मिलिपोर # 17-10099) या 4 उल एंटी- एचडीएसी 3 (मिलिपोर # {{) के साथ प्रतिरक्षित किया गया था। 13}}) या सामान्य खरगोश सीरम (H4K8Ac नकारात्मक नियंत्रण, मिलिपोर) या एंटी-माउस IgG (HDAC3 नकारात्मक नियंत्रण, मिलिपोर) की समकक्ष मात्रा। धोने के बाद, क्रोमेटिन को मोतियों से अलग किया गया और डीएनए के कॉलम शुद्धिकरण से पहले प्रोटीनएज़ K की उपस्थिति में रिवर्स क्रॉस-लिंक किया गया। प्रत्येक जीन के प्रमोटरों के लिए प्राइमर सीक्वेंस को प्राइमर 3 प्रोग्राम (टेबल S4) द्वारा डिजाइन किया गया था। इनपुट के पांच उल, एंटी-एच4के8एसी आईजीजी/एंटी-एचडीएसी3 आईजीजी, या प्रत्येक जानवर से एंटी-खरगोश/माउस आईजीजी इम्युनोप्रेसीटेट की दो प्रतियों में जांच की गई। चिप-क्यूपीसीआर डेटा को सामान्य करने के लिए, हमने प्रतिशत इनपुट पद्धति का उपयोग किया। इनपुट नमूने को 100 प्रतिशत तक समायोजित किया गया था और आईपी और आईजीजी दोनों नमूनों की गणना इस इनपुट के प्रतिशत के रूप में सूत्र 100 * एई ^ (समायोजित इनपुट - सीटी (आईपी)) का उपयोग करके की गई थी। गुना संवर्धन की गणना चिप के औसत IgG के अनुपात के रूप में की गई थी। एक इन-प्लेट मानक वक्र निर्धारित प्रवर्धन दक्षता (AE)।

स्लाइस की तैयारी और रिकॉर्डिंग। युवा (लगभग 3-mo) और उम्र बढ़ने (18-mo) चूहों को स्टीरियोटैक्सिक रूप से वायरस से संक्रमित किया गया था। पहले प्रयोग के लिए, युवा और पुराने HDAC3 प्लस / प्लस और HDAC3flox / flox चूहों को AAV-CaMKII- Cre के साथ द्विपक्षीय रूप से DH में संक्रमित किया गया था। दूसरे प्रयोग के लिए, युवा और पुराने वाइल्डटाइप C57 चूहों को AAV-HDAC3 (Y298H) के साथ एक गोलार्ध के DH और दूसरे गोलार्ध में AAV-EV नियंत्रण में संक्रमित किया गया था। जलसेक के दो सप्ताह बाद (इष्टतम वायरस अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए) 2, अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस स्लाइस (320 माइक्रोन) को पहले से गरम (31 डिग्री 1 डिग्री) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (124 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, 1.25 मिमी) के साथ एक इंटरफ़ेस रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया था। KH2PO4, 1.5 मिमी MgSO4, 2.5 मिमी CaCl2, 26 मिमी NaHCO3, और 10 मिमी D-ग्लूकोज)। स्लाइस को लगातार 1.75-2 मिली प्रति मिनट की दर से सुगंधित किया जाता था, जबकि स्लाइस की सतह को गर्म, नमीयुक्त 95 प्रतिशत O2/5 प्रतिशत CO2 के संपर्क में लाया जाता था। ऊष्मायन के कम से कम 2 घंटे के बाद रिकॉर्डिंग शुरू हुई।

फील्ड एक्साइटेटरी पोस्टसिनेप्टिक पोटेंशिअल (fEPSPs) को CA1b स्ट्रेटम रेडिएटम से 2 M NaCl से भरे एक ग्लास पिपेट (2–3MΩ) का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। उत्तेजना दालों (0। 05 हर्ट्ज) को सीए1सी में तैनात द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड (मुड़ निक्रोम तार, 65 माइक्रोन) का उपयोग करके शेफ़र संपार्श्विक-कमिसुरल अनुमानों तक पहुंचाया गया। वर्तमान तीव्रता को अधिकतम fEPSP प्रतिक्रिया का 50 प्रतिशत प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था। एक स्थिर बेसलाइन स्थापित होने के बाद, एलटीपी को पांच थीटा बर्स्ट की एक ट्रेन से प्रेरित किया गया था, जिसमें प्रत्येक बर्स्ट (100 हर्ट्ज पर चार पल्स) को 200 एमएस अलग (यानी, थीटा आवृत्ति पर) वितरित किया गया था। टीबीएस के दौरान उत्तेजना की तीव्रता में वृद्धि नहीं हुई थी। डेटा को एनएसी 2.0 न्यूरोडाटा एक्विजिशन सिस्टम (थीटा बर्स्ट) द्वारा एकत्र और डिजिटाइज़ किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण। प्रिज्म 6 (ग्राफपैड) का उपयोग करते हुए पाठ और आकृति किंवदंतियों में संकेत के अनुसार सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। हमारे विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण पहले प्रकाशित कार्य12,20,63,64 पर आधारित हैं। नमूना आकारों को पूर्व-निर्धारित करने के लिए कोई सांख्यिकीय विधियों का उपयोग नहीं किया गया था, लेकिन हमारे नमूना आकार आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले समान हैं, जिनमें पिछले प्रकाशनों में रिपोर्ट किए गए 12,20,64,65 शामिल हैं। डेटा वितरण को सामान्य माना गया था, समूहों के बीच समान भिन्नता देखी गई थी, लेकिन यह औपचारिक रूप से परीक्षण नहीं किया गया था। जब एक प्रयोग में तुलना करने के लिए दो समूह थे, तो दो-पूंछ वाले छात्र के t -ests का उपयोग किया गया था। जब दो कारकों की तुलना की जाती है, (जैसे कि आयु और जीनोटाइप या सत्र और समूह), डेटा का विश्लेषण दो-तरफ़ा एनोवा के साथ किया गया था, जिसके बाद सिडक की कई तुलनाएँ पोस्ट हॉक टेस्ट थीं। सभी विश्लेषण दो-पूंछ वाले हैं, जिसमें महत्व के लिए 0.05 का मान आवश्यक है। सभी आँकड़ों में त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। सभी प्रयोगों के लिए, समूह माध्य से मान ± 2SD को आउटलेयर माना जाता था और विश्लेषण से हटा दिया जाता था।

डेटा उपलब्धता। इस अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन करने वाले डेटा उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक से उपलब्ध हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा एनसीबीआई के जीन एक्सप्रेशन ऑम्निबस में जमा किया गया है और जीईओ सीरीज परिग्रहण संख्या जीएसई94832 के माध्यम से पहुँचा जा सकता है।

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