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बहस

एनग्राम गठन के आणविक आधार बहुत रुचि का क्षेत्र रहा है। यहां हम क्रोमेटिन एक्सेसिबिलिटी, 3-डी जीनोमिक आर्किटेक्चर, और एक एनग्राम सेल के जीवनकाल में जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए टीआरएपी माउस मॉडल का लाभ उठाते हैं। सबसे पहले, हम सीधे दिखाते हैं किस्मृतिएन्कोडिंग का क्रोमैटिन अभिगम्यता पर व्यापक और दीर्घकालिक प्रभाव पड़ता है। एक बार जब यह क्रोमैटिन अवस्था स्थापित हो जाती है, तो बाद की घटनाएं जैसेस्मृतिक्रोमेटिन परिदृश्य पर समेकन और स्मरण का मामूली प्रभाव पड़ता है। यह संभव है कि रिकॉल के लिए चुना गया समय बिंदु पुन: सक्रिय कोशिकाओं की क्रोमैटिन घटनाओं को पूरी तरह से कैप्चर नहीं कर सकता है और बाद में क्रोमेटिन परिवर्तन के साथ जुड़ा हो सकता हैस्मृतिपुन: समेकन या विलुप्त होना8. महत्वपूर्ण रूप से, पिछले प्रकाशनों 12, 13,23 के अनुरूप, हमारा डेटा सुझाव देता है किस्मृतिगठन काफी हद तक एक बढ़ाने वाली घटना है।

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दूसरा, हमारा अध्ययन के विभिन्न चरणों के दौरान 3डी-जीनोम वास्तुकला का पहला व्यापक परिदृश्य प्रदान करता हैस्मृतिगठन, जैसा कि हमने बड़े क्रोमैटिन खंडों के पुन: स्थानीयकरण और इन डिब्बों के भीतर विशिष्ट प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन को गतिशील दिखाया, जो विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों के फाइन-ट्यूनिंग को सक्षम करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि डाउन-रेगुलेटेड जीन के प्रमोटर उन एन्हांसर्स के साथ अधिक बार बातचीत करते हैं जो ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स को परेशान करते हैं और इसके विपरीत।

अंत में, हमारा काम एक कार्यात्मक प्राइमिंग घटना के लिए पहला सबूत प्रदान करता है, जो कि अपेक्षित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के बिना, एन्कोडिंग के दौरान एन्हांसर एक्सेसिबिलिटी में प्रारंभिक वृद्धि की विशेषता है। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि पुनर्सक्रियन के साथ, एनग्राम न्यूरॉन्स डेनोवोप्रोमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन के एक सबसेट का उपयोग करते हैं, जहां प्राइमेड एन्हांसर्स को उनके संबंधित प्रमोटरों के संपर्क में एमआरएनए ट्रांसपोर्ट में शामिल जीन और सिनैप्टिक डिब्बों में स्थानीय प्रोटीन अनुवाद में शामिल किया जाता है। ये परिवर्तन अपेक्षित रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों के अनुरूप थे। सामूहिक रूप से, ऐसा प्रतीत होता है कि एंग्राम कोशिकाओं को एपिजेनेटिक स्तर पर चिह्नित किया जाता है और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी, 3 डी-जीनोम आर्किटेक्चर और प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन के बीच परस्पर क्रिया एक अच्छी तरह से समन्वित प्रणाली का वर्णन करती है जो एनग्राम पुनर्सक्रियन के दौरान विलंबित ट्रांसक्रिप्शनल उछाल की ओर ले जाती है।

किसी भी काम की तरह, अध्ययन की भी कई सीमाएँ थीं। टैमोक्सीफेन-आश्रित टीआरएपी चूहों का उपयोग अस्थायी समाधान के लिए अनुमति देता है लेकिन लगभग 12 घंटे की एक लेबलिंग विंडो खोलता है जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स की गैर-विशिष्ट टैगिंग हो सकती है जो सीएफ़सी अनुभव का हिस्सा नहीं हैं। इसके अलावा, जैसा कि पहले सुझाव दिया गया था, आर्क-टैग किए गए न्यूरॉन्स विषम हो सकते हैं और इसमें अलग-अलग पहनावा शामिल हो सकते हैं जो दोनों को नियंत्रित करते हैंस्मृतिभेदभाव और सामान्यीकरण। इसके अलावा, 1.5-2 घंटे (शुरुआती) से पहले का कोई भी समय, डीएनए पुनर्संयोजन, यानी Cre recombinase की अभिव्यक्ति और eYFP जीन 5 की अंतिम अभिव्यक्ति के कारण होने वाली ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल घटनाओं को पकड़ने के लिए पर्याप्त नहीं होगा। इसलिए, हम मानते हैं कि डीईजी के कई प्रारंभिक-क्षणिक क्लस्टर छूट गए थे, जैसा कि पहले दिखाया गया था कि कई आईईजी 2 घंटे (आर्क46 को छोड़कर) के बाद आधारभूत स्तर पर लौट आते हैं। अंत में, हालांकि हमारा अध्ययन हिप्पोकैम्पस पर केंद्रित था, संरचनात्मक और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों, जैसे प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, एमिग्डाला में सूचना के दीर्घकालिक भंडारण से जोड़ा गया है। भविष्य के अध्ययनों को यह निर्धारित करना चाहिए कि क्या ये एपिजेनेटिक परिवर्तन दीर्घकालिक गठन और यादों के प्रतिधारण में शामिल वैश्विक महत्वपूर्ण प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं या यदि यह हिप्पोकैम्पस सर्किट के लिए अद्वितीय है।

तरीकों

चूहे और व्यवहार

जैसा कि पहले बताया गया है, ArcCreERT2 (प्लस) चूहों को R26R-STOP-floxed- पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eYFP) समरूप रेखा के साथ प्रतिबंधित किया गया था। ~ 140 बाद के पुरुष संतानों को जैक्सन प्रयोगशाला जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीनोटाइप किया गया था। 40-60 प्रतिशत आर्द्रता के साथ 22 डिग्री पर 12 घंटे (06: 00-18: 00) हल्के-अंधेरे कॉलोनी के कमरे में चूहे चार से पांच प्रति पिंजरे में रखे गए थे। इबिटम में भोजन और पानी मुहैया कराया गया। प्रकाश चरण के दौरान व्यवहार परीक्षण किया गया था। व्यवहार परीक्षण से 1 घंटे पहले, चूहों को 4-Hydroxytamoxifen (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich) की एक खुराक मिली, जो ~12 घंटे की लेबलिंग विंडो5 खोलता है। गैर-विशिष्ट ईवाईएफपी लेबल को कम करने के लिए, व्यवहार कार्य (जैसे सीएफ़सी) से एक दिन पहले, चूहों को 24 घंटे के अंधेरे/अंधेरे कमरे में रखा गया था। इसके अलावा, चिंता के स्तर को कम करने के लिए, पिंजरे में आश्रय और घोंसले के शिकार के लिए एक ट्यूब जोड़ा गया था। अगले दिन, सीएफ़सी से पहले चूहों को TAM 1h के साथ इंजेक्ट किया गया। व्यवहार कार्य के बाद, चूहों को 1.5-2 घंटे के बाद या तो euthanized किया गया था, और दिमाग एकत्र किए गए थे। या अगले 48 घंटे के लिए वापस अंधेरे कमरे में रख दिया। चूहों को अंधेरे से बाहर निकालने के बाद, उन्हें एक ही कमरे में सामान्य 12 घंटे (06:00–18:00) प्रकाश-अंधेरे चक्र में लौटा दिया गया। 3 दिन बाद (सीएफसी के बाद कुल 5 दिन), चूहों के आधे समूह को इच्छामृत्यु दिया गया और मस्तिष्क एकत्र किया गया, जबकि अन्य आधे परीक्षण कक्ष में लौट आए, जहां वे भय-उत्प्रेरण क्यू (स्वर और संदर्भ) के संपर्क में थे। . मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में तुलनात्मक चिकित्सा विभाग की पशु देखभाल समिति द्वारा सभी माउस काम को मंजूरी दी गई थी। Cistanche में सुधार हो सकता हैस्मृति.

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प्रासंगिक भय कंडीशनिंग

प्रासंगिक भय कंडीशनिंग (सीएफसी) उपकरण और अधिग्रहण कार्यक्रम टीएसई-सिस्टम्स से थे। चूहों को सीएफ़सी कक्ष में पेश किया गया था, प्रारंभिक आवास के 3 मिनट के बाद 8 0 डीबी तीव्रता के साथ 3 किलो हर्ट्ज टोन 30 सेकंड के लिए प्रस्तुत किया गया था और 1 सेकंड के लिए 0.7 एमए फुट शॉक के साथ सह-समाप्त किया गया था। पिंजरों को साफ करने के लिए प्रयोगों के बीच 70 प्रतिशत आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग किया गया था। 5 दिनों के बाद चूहों को टोन के साथ जोड़े गए मूल वातानुकूलित संदर्भ में पेश किया गया था और ठंड के स्तर को 3 मिनट के लिए मापा गया था (TSE सॉफ़्टवेयर डिफ़ॉल्ट पैरामीटर जो ठंड के व्यवहार की निगरानी के लिए उपयोग किए जाते हैं), प्रासंगिक गधे के लिएस्मृति. संदर्भ बी एक संशोधित संदर्भ ए था। स्टेनलेस स्टील की सलाखों को एक सफेद प्लास्टिक डालने के साथ कवर किया गया था, कक्षों की बाहरी दीवारों को कक्ष की उपस्थिति बदलने के लिए नलिका टेप के आकार से ढका दिया गया था। कक्ष वेनिला से सुगंधित था, कमरे की रोशनी बहुत तेज थी और चूहों को संदर्भ ए से एक अलग गाड़ी में उपकरण में ले जाया गया था।

दवाओं

ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP ट्रांसजेनिक चूहों में पुनर्संयोजन 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich) का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। 4-OHT को 2.5ml EtOH/100 प्रतिशत में घोलकर 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर हिलाया गया। इसके बाद, 5 मिलीलीटर मकई का तेल जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर हिलाया गया। अंत में, EtOH के पूर्ण वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए ट्यूबों को 60 डिग्री पर 30 मिनट के लिए रखा गया था। 50 मिलीग्राम / किग्रा के एकल इंजेक्शन को इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्ट किया गया था।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC)

चूहे को ट्रांसकार्डियल रूप से 25 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ सुगंधित किया गया था, इसके बाद पीबीएस में 4 0 मिलीलीटर 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड। दिमाग को हटा दिया गया और 4 डिग्री पीएफए ​​​​में रातोंरात 4 डिग्री पर पोस्ट-फिक्स्ड कर दिया गया और सेक्शनिंग तक पीबीएस में स्थानांतरित कर दिया गया। सुपरग्लू का उपयोग करके एक वाइब्रेटोम स्टेज (Leica VT1000S) पर दिमाग लगाया गया और 40 माइक्रोन की एक स्लाइस मोटाई के साथ सेक्शन किया गया। स्लाइस को पीबीएस से धोया गया और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 0.1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स 100 (पीबीएसटी) युक्त पीबीएस में तैयार 1 प्रतिशत बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) का उपयोग करके अवरुद्ध कर दिया गया। ब्लॉकिंग बफर को बाहर निकाल दिया गया था और स्लाइस को उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी (सप्लीमेंट्री टेबल 11) के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर एक प्रकार के बरतन पर लगाया गया था। स्लाइस को तब अवरुद्ध बफर के साथ तीन बार 15 मिनट में धोया गया था, और फिर एलेक्सा फ्लोर 488, 594, या 647 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ब्लॉकिंग बफर के साथ प्रत्येक 15 मिनट में तीन वॉश और 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक अंतिम वॉश के बाद, स्लाइस को फ्लोरोमाउंट-जी (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक साइंसेज) के साथ लगाया गया था। Cistanche में सुधार हो सकता हैस्मृति.

स्वस्थानी संकरण में (RNAscope®)

RNAscope® मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट v2 परख (उन्नत सेल डायग्नोस्टिक्स, यूएसए) के लिए निर्माता के निर्देशों के आधार पर नमूने तैयार किए गए थे, कुछ संशोधनों के साथ और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त। सबसे पहले, नमूनों को प्राथमिक (आर्क और जीएफपी) और माध्यमिक (एलेक्सा फ्लोर 488 और 594, क्रमशः) एंटीबॉडी (जैसा कि ऊपर आईएचसी प्रोटोकॉल में वर्णित है) के लिए दाग दिया गया था। ब्रेन स्लाइस एक कांच की स्लाइड पर एम्बेडेड थे और

आरटी में 30 मिनट के लिए निर्जलित। इसके बाद, इमेज ™ हाइड्रोफोबिक पेन के साथ प्रत्येक खंड के चारों ओर एक अवरोध खींचा गया था और नमूनों को आरटी पर 10 मिनट के लिए आरएनएस्कोप® हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज किया गया था (कोई लक्ष्य पुनर्प्राप्ति और प्रोटीज उपचार लागू नहीं किया गया था)। निर्माता के निर्देशों के आधार पर, अनुभागों को जांच संकरण (RNAscope® Probe- Mm-Gria1, 26241, उन्नत सेल डायग्नोस्टिक्स), प्रवर्धन, और HRP-C1 सिग्नल विकास के अधीन TSA® Plus साइनाइन 5 चैनल का उपयोग करके किया गया था। सिस्टैंच याददाश्त में सुधार कर सकता है.

इमेजिंग विश्लेषण

सभी स्थितियों के लिए समान सेटिंग्स पर 10 ×, 20 ×, 40 ×, या 63 × उद्देश्यों के साथ LSM 710 या LSM 880 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (Zeiss) का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण किया गया था। ImageJ 1.42q या Imarisx 64 8.1.2 (बिटप्लेन, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके छवियों की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, परिमाणीकरण के लिए कम से कम पांच जानवरों में से पांच कोरोनल वर्गों का उपयोग किया गया था। सिस्टैंच याददाश्त में सुधार कर सकता है.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6μM) अविशिष्ट लेबलिंग को हटाने के लिए, CA1, CA3 और DG में डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव किया गया। सिस्टैंच याददाश्त में सुधार कर सकता है.

Eif और Gria1 प्रोटीन/mRNA की मात्रा का ठहराव- सरफेस मॉड्यूल का उपयोग GFP सिग्नल के आधार पर न्यूरॉन्स एक्सॉन का पता लगाने और 3D रेंडर करने के लिए किया गया था। EiF2a, Eif4E, Eif3E, और Gria 1 - पॉज़िटिव पंक्टा को तब स्पॉट मॉड्यूल का उपयोग करके गिना गया था। अंत में, स्पॉट क्लोज़-टू-सरफेस एक्सटेंशन मॉड्यूल को स्पॉट के सबसेट को खोजने के लिए चलाया गया था जो परिभाषित 1uM थ्रेशोल्ड की तुलना में सतह की वस्तुओं के करीब हैं, और इस सीमा से बाहर आने वाले स्पॉट को बाहर करते हैं।

रीढ़ की आकृति विज्ञान - रीढ़ की लंबाई (L), सिर के व्यास (Dh) और गर्दन के व्यास (Dn) के आधार पर रीढ़ को तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया गया था। ठूंठदार रीढ़ - डीएन=एल, पतली रीढ़ - एल> डीएन और डीएच डीएन से अधिक या उसके बराबर, मशरूम की रीढ़ - डीएच 2 डीएन से अधिक या उसके बराबर, बढ़े हुए मशरूम रीढ़ - डीएच 2 डीएन से अधिक या बराबर। सिस्टैंच याददाश्त में सुधार कर सकता है।

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ऊतक तैयारी

हिप्पोकैम्पस ऊतक को निकाला गया और फ्लैश फ्रोजन किया गया। निष्कर्षण के बाद, नमूनों को तुरंत {0}} .5 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस में प्रोटीज इनहिबिटर (पाई) (1183617 0 0 0 1, रोश के साथ समरूप बनाया गया था। ) जितना संभव हो छँटाई प्रभाव को कम करने के लिए, केवल NC-RNAseq और कैप्चर-HiC प्रयोगों में, निलंबन को 1 प्रतिशत (NC-RNAseq/HiC के लिए) या 2 प्रतिशत (पीसी-HiC) पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 10 मिनट के लिए निर्धारित किया गया था, बुझाया गया 5 मिनट के लिए ग्लाइसिन 2.5 एम के साथ, और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोया । यह प्रक्रिया ट्रांसक्रिप्शनल और क्रोमैटिन परिदृश्य को संरक्षित करती है और छँटाई पूर्वाग्रह को कम करती है। ATACseq, RNAseq और कैप्चर-HiC के लिए, निलंबन को 1200 g, 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था और गोली को 5 एमएल NF -1 हाइपोटोनिक बफर (0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100) में फिर से जोड़ा गया था। 0.1M सुक्रोज/5mM MgCl2/1mM EDTA/10mM Tris-HCl, pH 8.0, Pi)। इसके बाद, निलंबन को 30 स्ट्रोक के साथ डौंस-होमोजेनाइज्ड (मूसल ए) किया गया और मूसल को 10 एमएल के संयुक्त कुल के लिए अतिरिक्त 5 एमएल एनएफ -1 बफर से धोया गया। निलंबन सभी को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र किया गया था, 70 माइक्रोन मेष फिल्टर (08- 771-2, फाल्कन) के साथ फ़िल्टर किया गया और 30 मिनट के लिए बर्फ पर लगाया गया। पेलेटेड नाभिक (सभी अपकेंद्रित्र 4 डिग्री, 15 मिनट के लिए 1,600 × जी थे) को 10 एमएल पीबीएस प्लस 1 प्रतिशत बीएसए प्लस पाई में फिर से जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए बर्फ पर लगाया गया। नाभिक नीचे काता गया था और गोली को 1 एमएल पीबीएसटी प्लस 1 प्रतिशत बीएसए प्लस पाई में फिर से जोड़ा गया था और 4 डिग्री में रात भर के लिए न्यूरो, आर्क और जीएफपी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। अनबाउंड एंटीबॉडी को 5 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और अंत में 1 एमएल पीबीएस प्लस 1 प्रतिशत बीएसए प्लस पाई और सेकेंडरी एंटीबॉडी को 2-4 घंटे के लिए 4 डिग्री पर फिर से जोड़ा गया। दो धोने के बाद, नाभिक को 0.5 एमएल (पीबीएस प्लस 1 प्रतिशत बीएसए प्लस पाई) में फिर से जोड़ा गया और एफएसीएस छँटाई के लिए 40 माइक्रोन मेष फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया। 4′, 6-डायमिडीन-2′-फेनिलइंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI) को सीधे FACS ट्यूबों (1:5000, 10236276001, सिग्मा-एल्ड्रिच) में जोड़ा गया। Cistanche में सुधार हो सकता हैस्मृति.

फ़्लो साइटॉमेट्री

फ्लो साइटोमेट्री के लिए, नाभिक को पहले मलबे को छोड़कर आगे और साइड स्कैटर पल्स एरिया पैरामीटर (एफएससी-ए और एसएससी-ए) का उपयोग करके गेट किया गया था, इसके बाद पल्स चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू और एसएससी-डब्ल्यू) का उपयोग करके समुच्चय का बहिष्करण किया गया था। तब एनईयूएन प्लस, एआरसी प्लस और जीएफपी प्लस गेट्स को सेट करने के लिए आइसोटाइप कंट्रोल स्टेनिंग का इस्तेमाल किया गया था। एक सजातीय न्यूरोनल आबादी को सुरक्षित करने के लिए, एआरसी प्लस और जीएफपी प्लस प्रतिदीप्ति के आधार पर आबादी को गेट करने से पहले न्यूरॉन प्लस आबादी को गेट किया गया था। हमने तीन अलग-अलग समय बिंदुओं से चार अलग-अलग आबादी को क्रमबद्ध किया; FS के संपर्क में आने के लगभग 1.5-2 घंटे बाद i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-। पांच दिनों के बाद, पुनर्प्राप्ति के अभाव में, हमने iii) न्यूरॉन प्लस / जीएफपी प्लस एकत्र किया। एक अलग समूह में, चूहों को वातानुकूलित उत्तेजना के लिए फिर से उजागर किया गया। पुन: एक्सपोजर के 1.5-2 घंटे बाद हमने एकत्र किया iv) न्यूरॉन प्लस /एआरसी प्लस /जीएफपी प्लस। सभी नाभिकों को 1.5 एमएल एपपेन्डोर्फ ट्यूबों में क्रमबद्ध किया गया था; 500 उल पीबीएस प्लस 1 प्रतिशत बीएसए प्लस पाई एटीसीएसेक के लिए, 200 उल पाचन बफर (रिकवरऑल ™ टोटल न्यूक्लिक एसिड आइसोलेशन किट एफएफपीई, कैट। एएम1975, इंविट्रोजन) आरएनएसेक के लिए, 500 उल फ्रेश आइस-कोल्ड लाइसिस हाई-सी/कैप्चर-एचआईसी के लिए बफर (10 एमएम ट्रिस पीएच =8, 10 एमएम NaCl, 0.2 प्रतिशत इगेपल सीए -630, पाई और पीसीआर ग्रेड वॉटर)। फ्लोजो (v10) के साथ डेटा विश्लेषण किया गया था।

चिप-qPCR

निम्नलिखित छँटाई के तुरंत बाद, 10, 000 कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री, 1,600 × जी पर पिलाया गया, और एसडीएस लसीका बफर में फिर से जोड़ा गया। चिप को एंटी- H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) और एंटी-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) एंटीबॉडीज। SsoFast™ EvaGreen® qPCR अभिकर्मक मिश्रण (बायो-रेड, 172–5202) का उपयोग करके एक बायो-रेड CFX96 कनेक्ट रीयल-टाइम पीसीआर इकाई में चिप परख का प्रदर्शन किया गया। नमूनों की तीन प्रतियों में परख की गई और परिणाम इनपुट के लिए सामान्य किए गए। चिप-क्यूपीसीआर assays के लिए प्राइमर जोड़े के अनुक्रम अनुपूरक तालिका 12 में सूचीबद्ध हैं।

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ATAC-seq

पुस्तकालयों की तैयारी—ATAC seq पुस्तकालयों को पहले में वर्णित के रूप में 49 में मामूली संशोधन के साथ तैयार किया गया था। प्रत्येक समूह से 10,000 कोशिकाओं को 8-10 अलग-अलग चूहों से खींचा गया और एन के रूप में माना गया =1। पुस्तकालय की तैयारी के लिए 3-4 जैविक प्रतिकृति (एन =3-4) का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित छँटाई के तुरंत बाद, कोशिकाओं को नीचे गिरा दिया गया (15 मिनट के लिए 4 डिग्री, 1,600 × जी) और ताजा 50 उल कोल्ड लिसीज़ बफर (इगपाल के बजाय 0.15 प्रतिशत एनपी -40) में फिर से स्थापित किया गया और 10 मिनट के लिए बर्फ पर हिलाया गया। . इसके बाद, विभाजन प्रतिक्रिया (नेक्सटेरा डीएनए नमूना प्रस्तुत करने का किट 24 प्रतिक्रियाएं, एफसी -121 -1030, इलुमिना) 25 उल मात्रा (12.5 उल टीडी, 1.25 उल टीडीई 1, 11.25 उल न्यूक्लियस-मुक्त पानी) में 30 के लिए किया गया था। कोमल रॉकिंग के साथ 37c पर मिनट। पीसीआर प्रतिक्रिया (1 चक्र; 5 मिनट - 72 सी, 30 सेकंड - 98 सी, 10 चक्र; 15 सेकंड - 98 सी, 30 सेकेंड - 60 सी, 3 मिनट - 72 सी) का उपयोग करके संवर्धित डीएनए टुकड़े प्रवर्धित और बारकोड किए गए थे। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, प्रवर्धित डीएनए को 1.8x AMPure मोतियों (AmpureXP मोती, बेकमैन कल्टर, A63880) का उपयोग करके साफ और शुद्ध किया गया था। पुस्तकालय के आकार और वितरण के लिए बायोएनलाइजर क्यूसी के बाद, एमआईटी बायोमाइक्रो सेंटर में इलुमिना नेक्स्टसेक 550 प्लेटफॉर्म पर पुस्तकालयों का अनुक्रम किया गया। सिस्टैंच याददाश्त में सुधार कर सकता है.

ATAC-seq विश्लेषण- 40-bp पेयर-एंड सीक्वेंसिंग रीड्स के कच्चे फास्टक डेटा को बॉटी 2 का उपयोग करके माउस mm9 रेफरेंस जीनोम से जोड़ा गया था।0 पेयर-एंड मोड50 में। Samtools संग्रह 51 का उपयोग पीसीआर डुप्लिकेट (रेड अप), इंडेक्स बीएएम फाइलों (इंडेक्स) को हटाने, और पुस्तकालय के आंकड़ों की गणना करने के लिए किया गया था (फ्लैगस्टैट, अनुपूरक तालिका 13 देखें)। BAM फ़ाइलों को ठीक से संरेखित, युग्मित, और अद्वितीय रीड्स से 50M तक डाउनसैंपल किया गया था। खुले क्रोमेटिन चोटियों का विश्लेषण MACS252 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था डिफबाइंड v1.16.353 द्वारा डिफबाइंड v1.16.353 द्वारा डिफेंशियली एक्सेसिबल रीजन (DARs) की पहचान की गई थी, जो DESeq2 (कटऑफ; FDR <0.01; फोल्ड="" चेंजेस=""> 1.5) का उपयोग करने के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों और सेटिंग्स के साथ था। सामान्यीकृत गणना (RPKM54) का पूर्ण मैट्रिक्स DiffBind पैकेज द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया था। बिगविग ट्रैक्स की एक पीढ़ी के लिए, जीवनी प्रारूप में पाइलअप सिग्नल फाइल्स (फ्रैगमेंट पाइलअप प्रति मिलियन रीड्स) का निर्माण MACS2 कॉल पीक फंक्शन का उपयोग करके -B -SPMR फ्लैग्स के साथ किया गया था। फिर, इनपुट लैम्ब्डा ट्रैक्स पर सामान्यीकृत गुना संवर्धन (FE) सेटिंग - m FE के साथ MACS2 के bdgcmp फ़ंक्शन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। फिर बेडग्राफ फाइलों को बिगविग फॉर्मेट में बदल दिया गया। सिस्टैंच मेमोरी में सुधार कर सकता है

IGV55 टूल का इस्तेमाल बिगविग फाइलों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया गया था। ChromHMM56 का उपयोग दो स्वतंत्र अध्ययनों से एक क्रोमैटिन राज्य मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया था जो पैर के झटके से पहले और बाद में बल्क हिप्पोकैम्पस ऊतक का उपयोग करता था और राज्य मॉडल पर गुना संवर्धन प्रस्तावों को निर्धारित करता था। HOMER59 टूल द्वारा मोटिफ संवर्धन विश्लेषण 57, 58 और चोटियों का एनोटेशन किया गया। सभी कोड एक पूरक सॉफ़्टवेयर फ़ाइल में उपलब्ध हैं