भाग 6: हिप्पोकैम्पस एनग्राम एनसेम्बल में मेमोरी फॉर्मेशन और रिकॉल के दौरान एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक इंटरप्ले का मानचित्रण

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संदर्भ

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याददाश्त में सुधार कर सकता है सिस्टैन्च

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अंजीर। 1. सक्रिय और पुन: सक्रिय एनग्राम कोशिकाओं की अस्थायी और स्थानिक पहचान।

(ए) प्रयोगात्मक डिजाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। टीआरएपी चूहों को शुरू में प्रशिक्षण से अवगत कराया गया था जिसमें एक वातानुकूलित (संदर्भ) और बिना शर्त (पैर का झटका, एफएस) उत्तेजना को 4-हाइड्रोक्सीटामॉक्सिफेन (टीएएम) जोखिम की एक संक्षिप्त खिड़की के भीतर एक साथ जोड़ा गया था। चार अलग-अलग न्यूरोनल पॉपुलेशन (बेसल, एक्टिवेटेड-अर्ली, एक्टिवेटेड-लेट और रिएक्टिवेटेड) को फ्लो साइटोमीटर द्वारा सॉर्ट किया गया और nRNA-seq, ATAC-seq, Hi-C और pc-HiC के लिए लाइब्रेरी की तैयारी के अधीन किया गया।

(बी) घर के पिंजरे में टैम उपचार के बाद ईवाईएफपी प्लस न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि चित्र (डीजी) और पूरे हिप्पोकैम्पस मात्रा का ठहराव (भोले, एन=4 चूहों / प्रति जानवर / 6 स्लाइस), 1.5 एच (सक्रिय - जल्दी, एन {{4 }} चूहे/4 स्लाइस प्रति जानवर) और 5 दिन (सक्रिय-लेट, एन=4 चूहों/8 स्लाइस प्रति जानवर) एफएस के बाद एक्सपोजर के बाद। स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। डॉट-प्लॉट माध्य और त्रुटि बार (SEM), वन-वे एनोवा (पैरामीट्रिक, अयुग्मित), F (2, 70)=240.3, P को इंगित करता है।<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test;="" hc="" vs.="" early="" ***p="0.0007," hc="" vs.="" late****p="" <="" 0.0001,="" early="" vs.="" late="" ****p="" <="">

(सी) दो प्रयोगात्मक समूहों में हिप्पोकैम्पस में सक्रिय-देर से और पुन: सक्रिय न्यूरॉन्स की मात्रा; सीएफ़सी (सीएफसी प्लस टैम, एन {{0}} चूहों / 8 स्लाइस प्रति जानवर) या बिना (सीएफसी नो-टैम, एन=4 चूहों / 6 स्लाइस प्रति जानवर) टैमोक्सीफेन प्रशासन। डॉट-प्लॉट माध्य और त्रुटि सलाखों (SEM) को इंगित करता है, दो तरफा अप्रकाशित छात्र का t -est, सक्रिय - देर से; टी=25.65, डीएफ=47, पुन: सक्रिय; टी=11.00, डीएफ=52, ****पी <>

(डी) हिप्पोकैम्पस के विभिन्न क्षेत्रों से प्रतिनिधि चित्र और मात्रा का ठहराव। DG, CA1 और CA3 से IMARIS (तरीके देखें) का उपयोग करके सकारात्मक नाभिकों की संख्या का विश्लेषण किया गया। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। n=5 चूहों/ सक्रिय-प्रारंभिक: प्रति पशु 6 स्लाइस, n=6 चूहे/ सक्रिय-लेट: 6 पुन: सक्रिय: प्रति पशु 6 स्लाइस। डॉट-प्लॉट माध्य और त्रुटि बार (SEM), वन-वे एनोवा (पैरामीट्रिक, अनपेयर), अर्ली को इंगित करता है; एफ (2, 42)=13.46. स्वर्गीय; एफ (2, 95)=556.3। पुन: सक्रिय; एफ (2, 89)=83.53। सभी पीएस <0.0001। बोनफेरोनी="" का="" बहु="" तुलना="" परीक्षण,="" *p="0.029," **p="0.0075," ***p="0.0009,">< 0.0001.="" (e)="" valuation="" of="" context="" effects="" on="" the="" number="" and="" the="" distribution="" of="" hippocampal="">स्मृतिनिशान।

(च) एए (एन=5 चूहों/6 स्लाइस प्रति जानवर) समूह की तुलना में एबी (एन=6 चूहों / प्रति जानवर 6 स्लाइस) में सक्रिय-लेट और रिएक्टिवेटेड न्यूरॉन्स की मात्रा। डॉट-प्लॉट माध्य और त्रुटि सलाखों (SEM) को इंगित करता है, दो तरफा अप्रकाशित छात्र का t-परीक्षण, सक्रिय-लेट; टी=0.08292, डीएफ=59, पी=0.9342. पुन: सक्रिय; टी=8.385, डीएफ=57, ****पी< 0.0001.n.s="">

अंजीर। 2. स्मृति निर्माण और स्मरण के दौरान क्रोमैटिन अभिगम्यता परिदृश्य।

(ए) डिफरेंशियल एक्सेसिबल रीजन (डीएआर) को ज्वालामुखी प्लॉट (जोड़ीवार तुलना, एफडीआर <0.01; गुना="" परिवर्तन=""> 1.5), एन=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों में दिखाया गया है। (बी) सामान्य प्राप्त-सुलभ क्षेत्र (स्थिर) का विश्लेषण, एफएस (सक्रिय-प्रारंभिक) के बाद 90 मिनट का अधिग्रहण किया, जो समेकन (सक्रिय-देरी) और याद (पुन: सक्रिय) की देर से स्थिति में पहुंच योग्य रहता है। ओवरलैपिंग स्थिर डीएआर को केवल तभी माना जाता था जब वे किसी दी गई स्थिति में कम से कम 2 जैविक प्रतिकृति में दिखाई देते थे।

(c) आर्क लोकस के प्रतिनिधि IGV जीनोम ब्राउज़र ट्रैक।

(डी) सभी डीएआर के लिए एनोटेशन विश्लेषण (एचओएमईआर टूल्स)। वाई-अक्ष पर संख्याएं टीटीएस, एक्सॉन, इंट्रोन्स, इंटरजेनिक और प्रमोटरों के अपेक्षित (कुल आकार (बीपी)) से अधिक देखे गए लोकी (डीएआर की संख्या) के लॉग 2 अनुपात मूल्यों को दर्शाती हैं। P -value की गणना HOMER . द्वारा की गई थी

औजार; बेसल बनाम एक्टिवेटेड - अर्ली (इंटरजेनिक *P=1.73 × 10−103), एक्टिवेटेड - अर्ली बनाम एक्टिवेटेड -लेट (TTS *P=0.0339, प्रमोटर *P {{9} }.48 × 10−39), सक्रिय-देर से बनाम पुन: सक्रिय (प्रमोटर *P=2.48 × 10−6), स्थिर (इंटरजेनिक *P=0.0358)।

(ई) हिस्टोन संशोधन उत्सर्जन राज्य (बाएं) और संवर्धन विश्लेषण क्रोमएचएमएम का उपयोग करके उत्सर्जन पर प्रदान करता है। गुना संवर्धन स्केल (FE) {{0}}–30. और p-मान z-स्कोर मान द्वारा निर्धारित किया गया था (जैसा कि विस्तारित डेटा चित्र 2c में परिकलित किया गया है), पूर्ण विश्लेषण पूरक तालिका 3 में सूचित किया गया है। *P <0.00001, केवल="" समृद्ध="" मूल्यों="" के="" लिए="" रिपोर्ट="" किया="" गया="" (अपूर्ण="">

(च) चिप-क्यूपीसीआर। नमूने H3K27ac या H3K4me1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षित किए गए थे और पहचाने गए पुटीय बढ़ाने के लिए प्राइमरों के दो सेटों के साथ वास्तविक समय पीसीआर के अधीन थे। H3K27ac: n=4, H3K4me1 n=3, डॉट-प्लॉट माध्य और त्रुटि बार (SEM), एकतरफा एनोवा (पैरामीट्रिक, अयुग्मित) को डननेट के बहु तुलना परीक्षण, एन्हांसर 1 के साथ इंगित करता है; H3K27ac - F (3, 12)=4.664, P=0.02, (बेसल बनाम सक्रिय-देर से *P=0.0246, बेसल बनाम पुन: सक्रिय * P=0.0232), H3K4me1 - F (3, 8)=0.845, P=0.506. बढ़ाने वाला 2; H3K27ac - F (3, 12)=5.221, P=0.0155, (बेसल बनाम सक्रिय -लेट **P=0.0059), H3K4me1 - एफ (3, 8)=1.719, पी=0.24। बढ़ाने वाला 3; H3K27ac - F (3, 12)=29.91, P <0.0001, h3k4me1="" -="" f="" (3,="" 8)="10.39," p="0.0039," (="" बेसल="" बनाम="" सक्रिय-प्रारंभिक="" *पी="0.0298," बेसल="" बनाम="" सक्रिय-लेट="" **पी="0.0021," बेसल="" बनाम="" पुन:="" सक्रिय="" **पी="0.0063)।" बढ़ाने="" वाला="" 4;="" h3k27ac="" -="" f="" (3,="" 12)="6.273," p="0.0083," (बेसल="" बनाम="" सक्रिय="" -लेट="" **p="0.007," बेसल="" बनाम="" पुन:="" सक्रिय="" *p="" {="" {102}}.0152),="" h3k4me1="" -="" f="" (3,="" 8)="9.901," p="0.0045," (बेसल="" बनाम="" पुन:="" सक्रिय="" **p="0">

अंजीर। 3. उप-कम्पार्टमेंट . के विभिन्न चरणों में स्विचिंगस्मृतिगठन और स्मरण।

(ए) हाय-सी सहसंबंध हीटमैप बेसल, सक्रिय - प्रारंभिक और सक्रिय -लेट कोशिकाओं के लिए chr6 के कंपार्टमेंटलाइज़ेशन का प्रतिनिधित्व करता है। जूसर द्वारा 500 kb रिज़ॉल्यूशन पर गणना किए गए डिब्बे (देखा-अपेक्षित सामान्यीकृत)।

सक्रिय - देर से)। कम्पार्टमेंट स्विच को केवल तभी माना जाता था जब एक नकारात्मक मान को सकारात्मक मान में बदल दिया जाता था और इसके विपरीत।

(सी) आईजीवी ब्राउज़र से प्रतिनिधि छवियां जो ए से बी (ऊपरी पैनल) और बी से ए (निचले पैनल) में स्थिर डिब्बे स्विच दिखाती हैंस्मृतिचरण

(डी) प्रारंभिक चरण में डीएआर के बीच ओवरलैप विश्लेषण (बेसल बनाम सक्रिय-प्रारंभिक) और स्थिर स्विच्ड डिब्बे। लेफ्ट वेन डायग्राम शो ने प्राप्त डीएआर और स्थिर कम्पार्टमेंट को बी से ए में बदल दिया। राइट, वेन डायग्राम में खोए हुए डीएआर और ए से बी में स्विच किए गए स्थिर कम्पार्टमेंट को दिखाया गया है।

(ई) गतिविधि-प्रेरित कम्पार्टमेंट स्विच और विशिष्ट प्रमोटर-एन्हांसर्स इंटरैक्शन का चित्रण।

अंजीर। 4. प्रमोटर प्रत्येक के दौरान एन्हांसर्स के एक अलग सबसेट के साथ अधिक बार बातचीत करते हैं

(ए) हीटमैप प्रत्येक आबादी के लिए शिकागो द्वारा परिभाषित इंटरैक्शन स्कोर का प्रतिनिधित्व करता है। बेसल: n=3, सक्रिय-प्रारंभिक, सक्रिय-देर से और पुन: सक्रिय: n=4 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने।

(बी) वायलिन प्लॉट इंटरैक्शन के वितरण और तीव्रता (लॉग 1 0 स्केल) को दिखाते हैं जो या तो अद्वितीय थे या कम से कम 3 आबादी (सामान्य) द्वारा साझा किए गए थे। वन-वे एनोवा (पैरामीट्रिक, अनपेयर्ड), एफ (4, 57922)=2364, पी < 0.0001।="" बोनफेरोनी="" की="" बहु="" तुलना="" परीक्षण,="" एनएस="गैर-महत्वपूर्ण" (पी="0.7659)," *पी=""><>

(सी) चयनित लोकी के लिए 3C-qPCR द्वारा मापी गई प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन की आवृत्ति। प्राइमर के चार सेट प्रमोटर-एन्हांसर (पी/ई), और लूप के अंदर तीन रैंडम लोकी (पी/ईन), लूप के बाहर (पी/ईआउट), और प्रमोटर (पी/पिन) के बीच बातचीत को शामिल करते हैं।

हाउसकीपिंग जीन एक्टिन के प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन वैल्यू के लिए रीड्स को सामान्य किया गया। n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य मान के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जिसमें त्रुटि पट्टियाँ SEM, दो-तरफ़ा एनोवा को दर्शाती हैं। ईआईएफ3डी; जनसंख्या × अंतःक्रिया स्थान (F

(9, 32)=1.917, पी=0.0851), केवल इंटरैक्शन स्थान का प्रभाव (एफ (3, 32)=22.64, पी < 0.0001)।="" ग्रिक3;="" जनसंख्या="" ×="" संपर्क="" स्थान="" f="" (9,="" 32)="0.1716।" बोनफेरोनी="" का="" बहु="" तुलना="" परीक्षण,="" पी/ई="" बेसल="" बनाम="" पुन:="" सक्रिय="" **पी="">

( d ) Eif5a ठिकाने के प्रतिनिधि प्राइमिंग इवेंट। IGV जीनोम ब्राउज़र प्रमोटर (ग्रे आयत) और एन्हांसर्स (नीला आयत) पर क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी डायनेमिक्स (रंगीन ट्रैक) पेश करता है। वाशू ब्राउज़र ट्रैक आर्क्स (बैंगनी - बेसल, हल्का हरा - सक्रिय - प्रारंभिक, गहरा हरा - सक्रिय - देर से, और नारंगी - पुन: सक्रिय) के माध्यम से महत्वपूर्ण प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन प्रस्तुत करता है।

अंजीर। 5. पुन: सक्रिय एनग्राम न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल हस्ताक्षर

(ए) सीएफ़सी के संपर्क में आने वाले हिप्पोकैम्पस ट्रैप चूहों से डीईजी का जोड़ीदार विश्लेषण एक ज्वालामुखी भूखंड (एफडीआर) में दिखाया गया है<0.01; log2fc="" >="" 2).="" n="3" biologically="" independent="">

unpaired), इसके बाद बोनफेरोनी का बहु-तुलना परीक्षण। डीडब्ल्यू-देर से; एफ (3, 1032)=42.19, अप-लेट; एफ (3, 280)=752.5, स्थिर; एफ (3, 764)=92.28, पुनर्सक्रियन; एफ (3, 1744) =597.4. सभी पीएस <0.0001। एकाधिक="" तुलना="" परीक्षण,="" एनएस="गैर-महत्वपूर्ण," ***="" पी=""><0.0001। (डी)="" प्रत्येक="" क्लस्टर="" में="" पहचाने="" गए="" डीईजी="" के="" लिए="" जीन="" ऑन्कोलॉजी="" (जीओ)="" विश्लेषण="" (टॉपफुन)।="" (ई)="" प्रत्येक="" क्लस्टर="" से="" प्रतिनिधि="" डीईजी।="" log2fc="" को="" बेसल-स्टेट="" से="" तीन="" जैविक="" प्रतिकृति="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" है।="" रेखा="" परिकलित="" औसत="" का="" प्रतिनिधित्व="" करती="" है।="" n="3" जैविक="" रूप="" से="" स्वतंत्र="" नमूने,="" डननेट="" के="" बहु="" तुलना="" परीक्षण="" के="" साथ="" एकतरफा="" एनोवा="" (पैरामीट्रिक,="" अयुग्मित),="" एनएस="गैर-महत्वपूर्ण।" गैड1;="" एफ="" (3,="" 8)="4.387," पी="0.04।" *पी="0.0268." गैब्रब3;="" एफ="" (3,="" 8)="6.184," पी="0.0177।" *पी="0.0441." विश्राम;="" एफ="" (3,="" 8)="23.23," पी="0.0003।" ***पी="0.0268." मैप4के4;="" एफ="" (3,="" 8)="6.244," पी="0.0172।" *पी="0.0151." नेफ्ल;="" एफ="" (3,="" 8)="12.06," पी="0.0024।" **पी="0.0059," **पी="0.0014." नेफ;="" एफ="" (3,="" 8)="21.50," पी="0.0003।" *पी="0.016," ***पी="0.0008," ***पी="0.0002." ईआईएफ5ए;="" एफ="" (3,="" 8)="8.482," पी="0.0072." **पी="0.004." ईआईएफ4एच;="" एफ="" (3,="" 8)="26.58," पी="0.0002।" ***पी="">

याददाश्त में सुधार कर सकता है सिस्टैन्च

(च) सक्रिय-प्रारंभिक, सक्रिय-देर से, और पुन: सक्रिय से Eif4e प्रोटीन के स्तर की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का ठहराव। परिमाणीकरण के लिए, IMARIS पर दो अलग-अलग सतहों का निर्माण किया गया; सेल सोमा और वृक्ष के समान शाफ्ट। Eif4e puncta की संख्या केवल उन सतहों की सीमाओं में मापी गई थी। वृक्ष के समान शाफ्ट के लिए डेटा संख्या और लंबाई (μM) के बीच अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। n=4 चूहों /5 खंड प्रति जानवर, बॉक्सप्लॉट माध्य, इंटरक्वेर्टाइल रेंज और न्यूनतम और अधिकतम, एकतरफा एनोवा (पैरामीट्रिक, अयुग्मित), दस्ता को इंगित करता है; एफ (2, 28)=5.113, पी=0.0128। सोमा; एफ (2, 43)=3.026, पी=0.0589। बोनफेरोनी की बहु तुलना परीक्षण; दस्ता; सक्रिय-प्रारंभिक बनाम पुन: सक्रिय *P=0.0324, सक्रिय-देर बनाम पुन: सक्रिय *P=0.0324

(छ) विभिन्न चरणों के दौरान, ग्रिआ1 प्रोटीन स्तरों के प्रतिनिधि चित्र (बाएं पैनल) और परिमाणीकरण (दायां पैनल)स्मृति. eYFP और अंतर्जात आर्क की प्रतिरक्षण क्षमता के आधार पर न्यूरॉन्स की तीन आबादी (सक्रिय-प्रारंभिक, सक्रिय-लेट, और पुन: सक्रिय) का विश्लेषण किया गया था। परिमाणीकरण के लिए, MARIS सतहों को डेंड्रिटिक शाफ्ट पर बनाया गया था और GRIA1 पंक्टा की संख्या केवल सतह की सीमाओं में मापी गई थी (<1μm threshold).="" data="" is="" presented="" as="" a="" ratio="" between="" several="" puncta="" and="" the="" shaft="" length.="" the="" scale="" bar="" represents="" 10="" μm.="" n="4" mice="" section="" per="" animal,="" boxplot="" indicates="" the="" mean,="" interquartile="" range,="" and="" the="" minimum="" and="" maximum,="" one-way="" anova,="" f="" (2,="" 16)="15.22," p="0.0002." bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" **p="0.002," ***p="">

अंजीर। 6. क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी, प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन और की अनुक्रमिक रिप्रोग्रामिंग

प्रत्येक K- साधन क्लस्टर के लिए रेखा रेखांकन (ए) ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन (छवि 5c में रिपोर्ट किए गए पी-मान, n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का मतलब) का औसत (लॉग 2 स्केल) दिखाते हैं (बी) क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी ( सामान्यीकृत RPKM मान, n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों का माध्य) और (c) प्रमोटर-एन्हांसर इंटरेक्शन स्कोर (शिकागो द्वारा परिकलित, माध्य बेसल: n=3, सक्रिय-प्रारंभिक, सक्रिय-लेट और पुन: सक्रिय : n=4 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने) दोहराए गए उपाय एकतरफा एनोवा (समूहों के बीच)।

638.7. स्थिर; एफ (2.437, 4504)=717.9. पुनर्सक्रियन; एफ (2.434, 8481) {{10}}। सभी पीएस < 0.0001।="" इंटरेक्शन="" स्कोर;="" द्वि-देर="" से;="" एफ="" (2.833,="" 7054)="46।86।" ऊपर="" देर;="" एफ="" (2.94,="" 5442)="14.87." स्थिर;="" एफ="" (2.91,="" 5702)="21.5." पुनर्सक्रियन;="" एफ="" (2.86,="" 11188)="44.94." सभी="" पीएस=""><0.0001। बोनफेरोनी="" की="" बहु="" तुलना="" परीक्षण,="" ***="" पी=""><>

(डी) प्रत्येक क्लस्टर में इंटरैक्टिंग एन्हांसर पर मोटिफ संवर्धन की विशेषता। ChromHMM का उपयोग HOEMR मोटिफ डेटाबेस (Egr1, Ap1, Slug, Plagl1, Hic2, Rest, CTCF, Yy1, Mecp2) और पहले प्रकाशित चिप-सीक्यू डेटा (एपी 1- Junb12, CTCF47, का उपयोग करके उत्सर्जन राज्यों के निर्माण के लिए किया गया था। मेकप248)। चार राज्यों की पहचान i) नियंत्रण - यादृच्छिक जीनोम नमूनाकरण, ii) मजबूत दमनकर्ता iii) द्विसंयोजक iv) मजबूत उत्प्रेरक के रूप में की गई थी। गुना संवर्धन स्केल (एफई)

0.15–20.