भाग Ⅱ एक यूरोपियम नैनोकणों का विकास मूत्र में एनजीएएल जांच और तीव्र गुर्दे की चोट के निदान के लिए पार्श्व प्रवाह प्रतिरक्षण

May 09, 2023


परिणाम

1. पुनः संयोजक एनजीएएल प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

PSecTag2A-NGAL पुनः संयोजक प्लास्मिड को CHO कोशिकाओं में बदल दिया गया। एनजीएएल -6 × उसका प्रोटीन मुख्य रूप से सेल सुपरनेटेंट में व्यक्त किया जाता है और बाद में नी सेफ़रोज़ द्वारा शुद्ध किया जाता है। शुद्ध पुनः संयोजक एनजीएएल प्रोटीन लगभग 95 प्रतिशत शुद्धता पर प्राप्त किया गया था और एसडीएस-पेज द्वारा 23.7 केडीए (छवि 1 ए) के आणविक अनुमानित वजन के साथ विश्लेषण किया गया था। पश्चिमी धब्बा ने पुनः संयोजक प्रोटीन एनजीएएल अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण (छवि 1 बी) की भी पुष्टि की।

Figure 1

2. MAbs की पीढ़ी

सबसे पहले, हमने विभिन्न विद्युत क्षेत्र तीव्रताओं के तहत कोशिका झिल्ली वेध पर डीसी वोल्टेज के प्रभावों की तुलना की, और विद्युत संलयन योजना को अनुकूलित करने के लिए पल्स आयाम क्रमशः 400 V, 450 V, 500, और 550 V था। पिछली रिपोर्टों के अनुसार, सेल की सघनता का संलयन दक्षता [16] पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। पृथक तिल्ली कोशिकाओं और SP2/0 मायलोमा कोशिकाओं के मिश्रित निलंबन को लगभग 2 × 106, 2 × 107, और 2 × 108 कोशिकाओं / एमएल के विभिन्न सांद्रणों पर संलयन कक्ष में स्थानांतरित किया गया था। संलयन दक्षता 450 वी डीसी पर सबसे अधिक थी, और इष्टतम सेल एकाग्रता 2 × 107 सेल/एमएल (चित्र 2) थी।

Figure 2

3. एमएबीएस की विशेषता

MAbs को प्रोटीन A कॉलम द्वारा शुद्ध किया गया था। शुद्ध MAbs को 12 प्रतिशत SDS-PAGE द्वारा अलग किया गया था, और आणविक भार 55 kDa और 25 kDa के साथ दो बैंड कम करने की स्थिति में देखे गए थे। 17 0 केडीए के स्पष्ट बैंड गैर-कम करने वाली स्थितियों के तहत नोट किए गए थे, जो 2F4 और 1G1 (चित्र 3 ए) का बरकरार प्रोटीन है। वेस्टर्न ब्लॉट ने संकेत दिया कि सभी MAbs विशेष रूप से मानव NGAL प्रोटीन (चित्र 3B) से जुड़ते हैं। सेल इलेक्ट्रोफ्यूजन और उप-क्लोनिंग के बाद, एनजीएएल -6 × हिज़ एंड पीसीटी - 6 × हिज़ के साथ अप्रत्यक्ष एलिसा द्वारा एनजीएएल के लिए एंटीबॉडी विशिष्ट बंधन सुनिश्चित करने के लिए हाइब्रिडोमा के सुपरनैटेंट्स का पता लगाया गया। PCT -6× पर क्रॉस-रिएक्शन के बिना विशिष्ट NGAL बाइंडिंग के साथ दो अत्यधिक सकारात्मक हाइब्रिडोमा (1G1, 2F4) MAbs (चित्र 3C) के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए सफलतापूर्वक चुने गए थे। दो MAbs की आत्मीयता का पता लगाने के लिए, BIAcore T200 प्रणाली द्वारा विभिन्न सांद्रता वाले एंटीबॉडी और NGAL प्रोटीन के बीच की बातचीत का विश्लेषण किया गया था। काइनेटिक आरेख ने दिखाया कि 2F4 और 1G1 की आत्मीयता क्रमशः 4.5 × 10−7 और 6.0 × 10−7 थी (चित्र 3D)। उन दो एमएबी के समप्ररूप जो वाणिज्यिक किट द्वारा खोजे गए थे IgG1 थे। 2F4 और 1G1-HRP पेयरिंग की ब्लॉकिंग दर cELISA डिटेक्शन द्वारा 63 प्रतिशत थी, यह दर्शाता है कि उन्होंने अलग-अलग एपिटोप्स को पहचाना।

Figure 3

4. ईयू-एनपीएस-एलएफआईए प्रक्रियाएं

ईयू-एनपीएस के लेबल और सैंडविच-प्रकार इम्यूनोसे के आधार पर, एनजीएएल का पता लगाने के लिए एलएफआईए की स्थापना की गई थी। MAb 2F4 को एक नाइट्रोसेल्युलोज झिल्ली पर लेपित किया गया था और ईयू-एनपीएस -1G1 के साथ युग्मित किया गया था जो पार्श्व प्रवाह इम्युनोक्रोमैटोग्राफी प्लेटफॉर्म में एंटीबॉडी युग्मन पर आधारित था। जैसा कि योजनाबद्ध रूप से चित्रित किया गया है (चित्र। 4), नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के टीएल और सीएल को MAbs 2F4 और बकरी विरोधी माउस IgG के साथ लेपित किया गया था। EU-NPS-1G1 को कंजुगेट पैड पर लेबल किया गया था। एनजीएएल एंटीजन युक्त नमूना ईयू-एनपीएस -1जी1 के साथ संयोजन करने और एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए संयुग्म पैड की ओर चला गया। इसके बाद, सैंडविच कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए माइग्रेट करते समय टी-लाइन में mAb 2F4 द्वारा परिसरों पर कब्जा कर लिया गया। अतिरिक्त परिसर को बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ जोड़ा गया था। टेस्ट स्ट्रिप्स को 15 मिनट के बाद एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर से मापा गया।

Figure 4

5. प्रदर्शन मूल्यांकन

डिटेक्टर और कैप्चर एंटीबॉडी के रूप में एंटीबॉडी जोड़े (2F 4- लेबल 1G1) का उपयोग फ्लोरोसेंट इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक स्थापित करने के लिए किया गया था, और मानक वक्र का निर्माण करके EU-NPS-LFIA के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था। सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात (HT/HC) को NGAL सांद्रता के साथ बढ़ाया गया था। EU-NPS-1G1 ने mAb 2F4 (चित्र 5 A) पर प्रतिक्रिया दिखाई। एंटीजन की सांद्रता 3000 एनजी/एमएल तक पहुंचने पर उच्च-खुराक हुक प्रभाव का पता नहीं चला। प्रतिगमन समीकरण निम्नानुसार प्रदर्शित किया गया था: y=0.0012 x प्लस 0.0059 (R2=0.99), जहां y HT/HC के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है, और x NGAL की सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है (अंजीर। 5बी)। नैदानिक ​​प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) दिशानिर्देश EP17-A2, NGAL एकाग्रता द्वारा गणना की गई पहचान सीमा (LOD) 0.36 ng/mL (रिक्त के मानक विचलन का 3 गुना, n=20) थी 1-1500 एनजी/एमएल[17] की सीमा में एक रैखिक संबंध था।

Figure 5

6. प्रेसिजन

इम्यूनोलॉजिकल विधि की सटीकता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता का मूल्यांकन करने के लिए इंट्रा-परख और इंटरसे के रिकवरी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया। एनजीएएल मानक पदार्थ के विभिन्न सांद्रता (50, 200, और 800 एनजी/एमएल) नकारात्मक मूत्र के नमूनों में जोड़े गए थे। अंतर-परख परिशुद्धता की गणना 1 दिन में प्रत्येक नुकीली सांद्रता पर तीन प्रतिकृति के साथ की गई थी, और अंतर-परख परिशुद्धता की गणना प्रत्येक तीन दिनों में तीन प्रतिकृति के साथ लगातार पंद्रह दिनों के लिए की गई थी [18]। परिणाम तालिका 1 में दिखाए गए थे, भिन्नता (सीवी) की गणना इंट्रासे गुणांक 2.57 से 4.98 प्रतिशत (एन=10), 10 प्रतिशत से कम थी। अंतर-परख सीवी 4.11 से 7.83 प्रतिशत (एन=15) के बीच थी, 10 प्रतिशत से भी कम।

Table 1

अंतर-परख और अंतर-परख परिशुद्धता दो मूल्यांकनकर्ता उपकरणों (गुआंगज़ौ वोंडो बायोटेक कं, लिमिटेड और गुआंगज़ौ लैब्सिम बायोटेक कं, लिमिटेड) द्वारा सत्यापित की गई थी, और परिणाम अंततः सुसंगत है। इन परिणामों ने समझाया कि विकसित एलएफआईए की शुद्धता उच्च स्तर पर थी, और पुनरुत्पादन स्वीकार्य स्तर पर था।

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7. विशिष्टता

क्रिएटिनिन, ग्लूकोज और यूरिया नाइट्रोजन सहित मूत्र के नमूनों की सामान्य और विभिन्न सांद्रता में अंतर्जात पदार्थों को जोड़कर परीक्षण स्ट्रिप्स की विशिष्टता का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है, परिणामों ने संकेत दिया कि सभी सापेक्ष विचलन (आरडी) ± 10 प्रतिशत की सीमा में थे, एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन का सुझाव स्थिर था और परीक्षण स्ट्रिप्स की विशिष्टता को दर्शाता हुआ एनजीएएल की ओर स्वीकार्य था।

Table 2

8. नैदानिक ​​नमूने परीक्षण

क्लिनिकल नमूनों के निर्धारण के लिए EU-NPS-LFIA पर आधारित NGAL की अनुप्रयोग क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कुल 83 मूत्र के नमूने जिनमें 26 निम्न-मूल्य के नमूने (11–70 ng/mL), 19 मीडियन शामिल हैं वैल्यू सैंपल (110-800 एनजी/एमएल), 38 हाई-वैल्यू सैंपल (800-1740 एनजी/एमएल), आर्किटेक्ट यूरिन एनजीएएल परख पर मापे गए थे। प्रतिगमन वक्र के सहसंबंध गुणांक (R2 ) के परिणाम 0.9829 (p <0.01) थे, यह दर्शाता है कि दो पता लगाने के तरीकों में एक महत्वपूर्ण रैखिक संबंध था (जहाँ x ARCHITECT विश्लेषक द्वारा प्राप्त NGAL की सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है, y द्वारा मापे गए मानों का प्रतिनिधित्व करता है) विकसित टेस्ट स्ट्रिप्स) (चित्र 6)। इस प्रकार, एनजीएएल के निर्धारण के लिए विकसित ईयू-एनपीएस-एलएफआईए नैदानिक ​​परीक्षण में बहुत सटीक था।

Figure 6

बहस

मानव मूत्र में एनजीएएल का पता लगाने और एकेआई के निदान के लिए ईयू-एनपीएस-एलएफआईए हमारे अध्ययन में विकसित किया गया है। AKI के वर्तमान निदान की पुष्टि सीरम क्रिएटिनिन (sCr) की सांद्रता से होती है, जो किडनी के कम से कम 50 प्रतिशत क्षतिग्रस्त होने तक स्थिर रहता है [19]। AKI COVID -19 के 89 प्रतिशत गंभीर रोगियों में विकसित हुआ, और अधिकांश रोगियों में प्लाज्मा क्रिएटिनिन [20] से पहले प्रकट होने पर मुख्य रूप से ओलिगुरिया था। बायोमाकर्स ने प्रवेश पर ऊंचा स्तर बढ़ाया, जो मृत्यु दर में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है। एनजीएएल इन बायोमार्करों में से एक है, जिसका स्तर कोविड -19 अस्पताल में भर्ती मरीजों[21] में मृत्यु दर के जोखिम के साथ सकारात्मक सहसंबंध हो सकता है। AKI में, कई अध्ययनों से पता चला है कि मूत्र में NGAL की सघनता महत्वपूर्ण रूप से sCr सघनता से जुड़ी हुई है [22]। हाल के वर्षों में, एनजीएएल का पता लगाने के लिए विभिन्न इलेक्ट्रोकेमिकल और इम्यूनोलॉजिकल तरीके विकसित किए गए हैं, इलेक्ट्रोकेमिकल निर्धारण के उदाहरण, सॉलिड-फेज प्रॉक्सिमिटी लिगेशन एसे, और एंजाइम-फ्री इलेक्ट्रोकेमिकल इम्यूनोएसे [23, 24]। हालांकि, इन तकनीकों के लिए सटीक उपकरण, विशेष कर्मियों और परिणामों की पेशेवर व्याख्या की आवश्यकता होती है। इसलिए, इस विकार की निगरानी के लिए मूत्र में एनजीएएल एकाग्रता के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक पहचान परख विकसित करना महत्वपूर्ण है। कार्यात्मक एंटीबॉडी प्राप्त करने में कठिनाइयों का कारण बनने के लिए पारंपरिक तरीकों में पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) संलयन की कम दक्षता, हमने विद्युत संलयन पैरामीटर को अनुकूलित किया जो व्यवहार्य हाइब्रिडोमा तैयार करने के लिए संलयन दक्षता में वृद्धि को सक्षम बनाता है और दो एंटी-एनजीएएल एमएबीएस प्राप्त करता है। MAbs न केवल उच्च आत्मीयता हैं, बल्कि विभिन्न एपिटोप्स की ओर भी निर्देशित हैं, जिनका उपयोग उच्च-गुणवत्ता वाले नैदानिक ​​​​परख स्थापित करने के लिए किया जाता है।

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हर्बा सिस्टैंच

हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों में कई एनजीएएल रैपिड डायग्नोस्टिक इम्यूनोसेज़ विकसित करने की सूचना दी गई है, जिसमें फोटोइलेक्ट्रोकेमिकल इम्यूनोसेंसर और तीन इलेक्ट्रोकेमिकल इम्यूनोसेंसर, सॉलिड-फेज प्रॉक्सिमिटी लिगेशन एसे और लेटरल फ्लो एसे [25] शामिल हैं। एक अध्ययन में, एनजीएएल कैप्चर एंटीबॉडी द्वारा स्क्रीन-प्रिंटेड-संशोधित कार्बन इलेक्ट्रोड को स्थिर किया गया है और एसपीसीई [24] पर एक सैंडविच बनाने वाले पीबी-एनपी-सजाए गए जी-सी3एन4 नैनोशीट्स के लिए एनजीए के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी के लेबल के अलावा इम्यूनोसेंसर बनाया गया है। अन्य अध्ययन ने एनजीएएल के खिलाफ एक एंटीबॉडी विकसित की जो एक इलेक्ट्रोस्प्रे ग्राफीन/पॉली-एनिलिन (जी/पैनआई) [25] के शीर्ष पर जमा इलेक्ट्रोपॉलीमराइज़्ड एनिलिन के साथ संशोधित एक स्क्रीन-प्रिंटेड इलेक्ट्रोड (एसपीसीई) पर स्थिर था। दो रिपोर्टों ने LOD को 0.6 pg/mL से 21.1 ng/mL तक व्यापक रूप से भिन्न दिखाया, जो N तत्व के साथ g-C3N4 नैनोशीट पर निर्भर करता है, जो ग्राफीन नैनोशीट की तुलना में नैनोहाइब्रिड की इलेक्ट्रोकैटलिटिक दक्षता को बढ़ाता है, और NGAL का LOD परख इम्यूनोसेंसर, संयुग्मित-जटिल, और एंटीबॉडी [26] के आधार पर भिन्न होती है। उन अध्ययनों के अनुसार, हमने बताया कि प्रस्तावना खंड में उल्लिखित विभिन्न प्रतिदीप्ति नैनोकणों के आधार पर LFIA की संवेदनशीलता में सुधार किया जा सकता है। एलएफआईए में फ्लोरोसेंट जांच के रूप में लेबल किए गए उच्च-संवेदनशीलता नैनोकणों पर पिछले दशकों में लगातार शोध किया गया है, सोने के नैनोकणों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, लेकिन पारंपरिक लेबल पर आधारित पार्श्व प्रवाह परीक्षणों का अनुप्रयोग उनकी खराब पहचान और कमजोर संकेत तक सीमित है। 27]। वर्तमान में, एनजीएएल के विकास के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी को एनजीएएल का पता लगाने के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों पर लागू किया गया है, लेकिन ईयू-एनपीएस लेबल पर आधारित एलएफआईए में उपलब्ध नहीं है, यूसीपी प्रौद्योगिकी-आधारित पार्श्व प्रवाह परख के अलावा एनजीएएल का पता लगाने पर प्रयोग किया गया [28 , 29]।

फ्लोरेसेंस इम्यूनोएसेज़ का पता लगाने के विभिन्न क्षेत्रों में लाभ है, विशेष रूप से परिपक्व क्वांटम डॉट्स में, उनकी संवेदनशीलता MAbs और फ्लोरोसेंट सामग्री से प्रभावित थी, और फ्लोरोसेंट जांच [30 का उपयोग करने के लिए EU-NPS और विशिष्ट MAbs द्वारा बहुत सुधार कर सकती है। ]। ईयू-एनपीएस को प्रतिदीप्ति एलएफआईए स्ट्रिप्स पर लागू किया गया था जो पता लगाने के क्षेत्र में परिपक्व हो गया था और परख संवेदनशीलता, विशिष्टता और स्थिरता के लिए एलएफआईए के कई फायदे बढ़ाए थे [31]। ईयू-एनपीएस के उत्कृष्ट गुणों के कारण कि इस पद्धति में एनजीएएल के लिए पता लगाने की सीमा 0.36 एनजी/एमएल थी, जबकि स्वस्थ व्यक्तियों में औसत मूत्र एनजीएएल का स्तर लगभग 7.0 एनजी/एमएल था [32] . एनजीएएल के ईयू-एनपीएस-एलएफआईए के विकास और अनुप्रयोग अभी भी प्रारंभिक चरण में हैं, इस जांच के लिए कोविड -19 रोगियों के साथ सीरम और मूत्र के नमूनों के एनजीएएल का परीक्षण करने की आवश्यकता है, जिसके लिए भविष्य के कार्यों में उपचार में सुधार होगा। .

निष्कर्ष

अध्ययन में, हमें सफलतापूर्वक दो माउस एंटी-एनजीएएल एमएबीएस (2एफ4, 1जी1) मिले और लेटरल फ्लो इम्यून तकनीक स्थापित करने के लिए ईयू-एनपीएस के साथ लेबल किया गया। EU-NPSLFIA को 15 मिनट के भीतर 1- 3000 ng/mL की एक विस्तृत श्रृंखला में NGAL का पता चला, पता लगाने की संवेदनशीलता 0.36 ng/mL तक पहुंच गई। इन एंटी-एनजीएएल एमएबीएस को मूत्र के नमूनों में एनजीएएल पहचान के फ्लोरेसेंस एलएफआईए में भरोसेमंद रूप से उपयोग किया जा सकता है, इसलिए यह एकेआई निदान में लागू होना चाहिए।

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सिस्टैंच ट्यूबलोसा

एक्यूट किडनी इंजरी पर सिस्टैंच एक्सट्रेक्ट की प्रभावशीलता

तीव्र गुर्दे की चोट (AKI), जिसे तीव्र गुर्दे की विफलता के रूप में भी जाना जाता है, गुर्दे की कार्यक्षमता में अचानक गिरावट से जुड़ी एक सामान्य चिकित्सा स्थिति है। AKI महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर का कारण बन सकता है, खासकर अगर अनुपचारित छोड़ दिया जाए। जैसे, रोगी के परिणामों में सुधार के लिए शीघ्र निदान और शीघ्र उपचार आवश्यक है।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला पौधे से प्राप्त सिस्टैंच अर्क का उपयोग पारंपरिक चीनी चिकित्सा में विभिन्न स्वास्थ्य स्थितियों के इलाज के लिए किया जाता रहा है। हाल के शोध से पता चला है कि एकेआई के इलाज में सिस्टैंच के अर्क का असर हो सकता है।

अध्ययनों ने संभावित तंत्रों की पहचान की है जिसके द्वारा सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट एकेआई पर अपने उपचारात्मक प्रभाव डालता है। इनमें सूजन का दमन, ऑक्सीडेटिव तनाव में कमी, एपोप्टोटिक मार्गों का डाउनरेगुलेशन और ऊतक पुनर्जनन को बढ़ावा देना शामिल है। इसके अतिरिक्त, Cistanche निकालने को गुर्दे की फाइब्रोसिस की प्रगति को रोकने के लिए दिखाया गया है, जो AKI के परिणामस्वरूप हो सकता है।

पशु अध्ययनों से पता चलता है कि एकेआई के मॉडल में सिस्टैंच के अर्क के प्रशासन का गुर्दे के कार्य पर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है, जिससे ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर में सुधार होता है, ट्यूबलर कोशिकाओं को कम नुकसान होता है, और रक्त यूरिया नाइट्रोजन और सीरम क्रिएटिनिन के स्तर में कमी आती है। मानव विषयों पर नैदानिक ​​​​अभ्यास में आगे के अध्ययन से मूत्र उत्पादन और ग्लोमेरुलर फिल्ट्रेशन रेट (जीएफआर) में वृद्धि का संकेत मिलता है जबकि कार्डियक सर्जरी से जुड़े एकेआई वाले रोगियों में यूरिया नाइट्रोजन और क्रिएटिन के सीरम स्तर में और वृद्धि को रोका जा सकता है।

हालांकि, आदर्श खुराक, दीर्घकालिक सुरक्षा प्रोफाइल और तैयारियों के मानकीकरण के संबंध में कई सवाल बने हुए हैं। अतिरिक्त उच्च-गुणवत्ता वाले यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षणों के लिए सिस्टंच निष्कर्षण की इष्टतम खुराक और प्रशासन के नियम का मूल्यांकन करना आवश्यक है।

कुल मिलाकर, सबूत बताते हैं कि सिस्टैंच का अर्क एकेआई के लिए एक प्रभावी उपचार हो सकता है, हालांकि अधिक निश्चित सिफारिशों के लिए और व्यापक शोध और परीक्षण की आवश्यकता है। अंत में, कुछ सीमाओं के बावजूद, Cistanche अर्क AKI की गंभीरता को कम करने की क्षमता दर्शाता है। शीघ्र पहचान और शीघ्र उपचार रोगी के परिणामों और जीवन की गुणवत्ता में सुधार कर सकता है। सुरक्षा सुनिश्चित करने और किसी भी प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए मरीजों को वैकल्पिक उपचारों में संलग्न होने से पहले स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं से परामर्श करना चाहिए।

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सिस्टैंच का प्रभाव



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मोली यिन 1, युआनवांग नी 2, हाओ लियू 2, लेई लियू 1, लू तांग 1, युआन डोंग 2, चुआनमिन हू 1 और हुइयां वांग 1

एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के लिए 1 जिलिन कोलैबोरेटिव इनोवेशन सेंटर, जिलिन मेडिकल यूनिवर्सिटी, 132013 जिलिन, पीआर चीन।

2 एकेडमी ऑफ लेबोरेटरी, जिलिन मेडिकल यूनिवर्सिटी, 132013 जिलिन, पीआर चीन।

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