PARTI.: प्रभाव और गुर्दे ischemia Reperfusion चोट पर Pachymic एसिड के आणविक तंत्र

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परिचय

तीव्र गुर्दे की चोट (AKI)एक आम नैदानिक बीमारी है जो कई etiologies के कारण होती है और इसमें एक जटिल pathophysiological प्रक्रिया (1) होती है। एकेआई के लिए रुग्णता और मृत्यु दर वयस्कों और बच्चों के बीच उच्च है, इस प्रकार, जिसके परिणामस्वरूप पर्याप्त अस्पताल में भर्ती होने की लागत (2,3) होती है। AKIrevealed की घटनाओं की वैश्विक घटनाओं का एक मेटा-विश्लेषण वयस्कों में 21.6% और बच्चों में 33.7% था और AKI से संबंधित मृत्यु दर वयस्कों में 23.9% और बच्चों में 13.8% थी (4). एकेआई अस्पताल में भर्ती रोगियों के ~ 20% में होता है, जिनमें से 10% को गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा की आवश्यकता होती है, और गहन देखभाल इकाइयों में 50% रोगियों में, इस प्रकार अस्पताल में भर्ती होने की लंबाई और लागत में काफी वृद्धि होती है (5). एकेआई को अल्पावधि में ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर में तेज कमी की विशेषता है, जो सीरम क्रिएटिनिन, ओलिगुरिया, या दोनों में वृद्धि के साथ है; इन परिवर्तनों से क्रोनिक किडनी रोग या अंत-चरण गुर्दे की बीमारी हो सकती है (6). गुर्दे की चोट की परिवर्तनशीलता, विश्वसनीय शुरुआती बायोमार्कर की कमी, और पैथोफिजियोलॉजी में शामिल मार्गों की विषमता के कारण, वर्तमान में रूढ़िवादी उपचार और गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा को छोड़कर रोकथाम और हस्तक्षेप का कोई प्रभावी साधन नहीं है (7). इस प्रकार, एकेआई के लिए उपन्यास उपचार आहार और दवाओं की पहचान करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। पिछले दशक ने परिगलन के पारंपरिक दृष्टिकोण का विस्तार करने वाले अनुसंधान का खजाना देखा है। हाल के शोध ने उपन्यास मार्गों की पहचान करके सेल की मृत्यु के पारंपरिक विचारों को चुनौती दी है जिसमें कोशिकाएं विनियमित तरीके से मर जाती हैं, लेकिन नेक्रोसिस (7-9) की आकृति विज्ञान विशेषताओं को प्रदर्शित करती हैं। यह विनियमित परिगलन कई रूप लेता है: नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस, पाइरोप्टोसिस, माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण-संचालित नेक्रोसिस, और पार्थानाटोस (10). Necroptosis और ferroptosis गुर्दे में होने वाले विनियमित परिगलन के सबसे अधिक अध्ययन किए गए रूप हैं (11). एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि फेरोप्टोसिस को बाधित करने से एकेआई (12) में प्रभावी ढंग से सुधार होता है।

सिस्तान्च फार्मा विशेषके लिएगुर्दा

फेरोप्टोसिस एक नए प्रकार का नियामक सेल मृत्यु है, जिसे पहली बार 2012 (13) में डिक्सन एट अल द्वारा प्रस्तावित किया गया था। इस प्रकार की कोशिका मृत्यु लोहे पर निर्भर है और कोशिका मृत्यु के दौरान बड़े पैमाने पर लोहे के संचय और लिपिड पेरोक्सीडेशन के साथ होती है (13). फेरोप्टोसिस ट्यूमर, न्यूरोलॉजिकल बीमारियों और एकेआई (14) सहित कई बीमारियों की घटना और विकास में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाता है। विवो के एक अध्ययन में, फेरोस्टैटिन 1 या 16-86 को गंभीर चूहों में इस्केमिया से 15 मिनट पहले प्रशासित किया गया थाइस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट(आईआरआई) - एकेआई, और गुर्दे के ऊतक क्षति, सीरम क्रिएटिनिन, और यूरिया सभी इस्किमिया के बाद चूहों में 48 घंटे कम हो गए, इस प्रकार, यह सुझाव देते हुए कि आईआरआई के रोगजनन में फेरोप्टोसिस की महत्वपूर्ण भूमिका है (इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)(15). इसलिए, लोहे के होमोस्टैसिस को विनियमित करना, लिपिड पेरोक्सीडेशन का विरोध करना, और फेरोप्टोसिस को रोकना एकेआई के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति प्रदान कर सकता है।

पैचीडर्मिक अम्ल(पीए), पोरिया कोकोस से एक लैनोस्टेन-प्रकार के ट्राइटरपेनोइड में कई औषधीय प्रभाव होते हैं, जैसे कि एंटीट्यूमर, एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटीऑक्सीडेटिव, हाइपोग्लाइसेमिक, शामक और कृत्रिम निद्रावस्था की गतिविधियां (16-20). पिछले एक अध्ययन में बताया गया है कि पीए(पेचिमिक अम्ल)भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बाधित करने और एंटीऑक्सिडेंट तनाव (21) के माध्यम से 2 (NRF2)/ हीम oxygenase 1 (HO-1) मार्ग की तरह परमाणु कारक को सक्रिय करके चूहों में सेप्सिस के दौरान गुर्दे की चोट में सुधार कर सकते हैं। इसके अलावा, Poricoic एसिड एक प्रभावी ढंग से गुर्दे ischemia / reperfusion चोट के बाद एकेआई से पुरानी गुर्दे की बीमारी के लिए संक्रमण में मेलाटोनिन के निषेध को बढ़ाता है (22). पीए(पेचिमिक अम्ल)एकेआई के खिलाफ रक्षा करता है, हालांकि, इस सुरक्षात्मक तंत्र की आगे की जांच की जानी बाकी है। पीए(पेचिमिक अम्ल)सेप्सिस (21) में गुर्दे की चोट के एक अध्ययन में NRF2 को सक्रिय करने की सूचना दी गई है। विशेष रूप से, फेरोप्टोसिस अध्ययनों में पहचाने जाने वाले पहले दो फेरोप्टोसिस-उत्प्रेरण एजेंट (आरएसएल -3 और इलास्टिन) क्रमशः ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज 4 (जीपीएक्स 4) और सिस्टीन / ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर सिस्टम (एक्ससी - / एक्ससीटी) के निषेध के माध्यम से फेरोप्टोसिस कैस्केड शुरू करते हैं, जिनमें से दोनों एनआरएफ 2 (23) के डाउनस्ट्रीम लक्ष्य हैं। पीए(पेचिमिक अम्ल)एनआरएफ 2 को सक्रिय करके और एकेआई में फेरोप्टोसिस के साथ हस्तक्षेप करके अपने डाउनस्ट्रीम प्रोटीन, जीपीएक्स 4 और एक्ससीटी को विनियमित करने के लिए माना जाता है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य पीए के प्रभाव की जांच करना है(पेचिमिक अम्ल)ischemia-reperfusion गुर्दे की चोट के साथ चूहों में फेरोप्टोसिस पर और नैदानिक AKI के उपचार के लिए उपन्यास विचारों को प्रदान करने के लिए कार्रवाई के अपने अंतर्निहित आणविक तंत्र का निर्धारण।

सामग्री और तरीके

अभिकर्मकों और जानवरों।

पीए(पेचिमिक अम्ल)(शुद्धता ≥99.9%) के साथ सफेद क्रिस्टलीय पाउडर MedChemExpress (cat.no.HY-N0371) से खरीदा गया था और 4C पर प्रकाश से दूर संग्रहीत किया गया था। कुल 30 C57BL / 6 पुरुष चूहों (8-10 सप्ताह; 20-25g शरीर का वजन) चोंगकिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी (चोंगकिंग, चीन) से खरीदे गए थे। आवास की स्थिति इस प्रकार थी: 12 एच प्रकाश / 12 एच अंधेरा, ~ 60% आर्द्रता, 25 डिग्री सेल्सियस, पीने के पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच, और हर 3 दिन बिस्तर प्रतिस्थापन; पीने के पानी और बिस्तर सामग्री को उपयोग करने से पहले कीटाणुरहित किया गया था। सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था, जो 1996 (24) में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा जारी किया गया था। वर्तमान अध्ययन को चोंगकिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी (चोंगकिंग, चीन; अनुमोदन संख्या 2018-019) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

Ischemia-reperfusion चोट-AKI मॉडल।

चूहों को गुर्दे के मॉडल का उत्पादन करने के लिए 1 सप्ताह के लिए एक ही शर्तों के तहत खिलाया गया थाइस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट, जैसा कि पहले वर्णित है (25)। चूहों को 50-60 मिलीग्राम / किलोग्राम पेंटोबार्बिटल सोडियम (cat.no के साथ एनेस्थेटिक किया गया था। P3761; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क KGaA) इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा; सर्जिकल क्षेत्र में त्वचा को 70% अल्कोहल के साथ मिटा दिया गया था। चीरा रीढ़ की हड्डी (0.5 सेमी) के बाएं और दाएं किनारों पर स्थित था, और चीरा की लंबाई पीठ के साथ 1-1.5 सेमी थी। गुर्दे को बाद में गुर्दे के पेडिकल को उजागर करने के लिए चीरे से बाहर निकाला गया था। एक microaneurysm क्लिप गुर्दे के लिए रक्त के प्रवाह को अवरुद्ध करने और गुर्दे ischemia प्रेरित करने के लिए पेडिकल क्लैंप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पूर्ण ischemia के रूप में कुछ ही सेकंड के भीतर लाल से गहरे बैंगनी करने के लिए गुर्दे के रंग में परिवर्तन से संकेत दिया. ischemia के 40 मिनट के बाद, microaneurysm क्लिप प्रत्येक गुर्दे reperfusion शुरू करने की अनुमति देने के लिए जारी किए गए थे, जो लाल करने के लिए गुर्दे के रंग के परिवर्तन से संकेत दिया गया था। गुर्दे का रंग सामान्य होने के बाद मांसपेशियों की त्वचा को टांका गया था। पूरे गुर्दे ischemia प्रक्रिया एक thermostatic पैड पर पूरा किया गया था, और चूहों के शरीर के तापमान 36.5-37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा गया था। कुल 0.8 मिलीलीटर गर्म बाँझ खारा प्रत्येक माउस को इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था। प्रत्येक जानवर को एक हीटिंग पैड पर रखा गया था जब तक कि यह पूरी तरह से होश में नहीं आ गया और बाद में अपने पिंजरे में वापस आ गया। चूहों को सर्जरी के बाद गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन 24h के माध्यम से बलिदान किया गया था, और रक्त कक्षीय साइनस से एकत्र किया गया था। गुर्दे के ऊतकों का एक तिहाई हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था, और शेष दो-तिहाई को जल्दी से -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।

पशु समूह।

C57BL/6 चूहों को एक यादृच्छिक संख्या तालिका के अनुसार पांच समूहों (n = 6/group) में विभाजित किया गया था, जो इस प्रकार है: Sham group(Sham), model group(IRI), low dose group (IRI+PA)), moderate dose group(IRI+PAW), और high dose group(IRI+PAg)। तीन प्रयोगात्मक उपचार समूहों में जानवरों को पीए के साथ एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्राप्त हुआ(पेचिमिक अम्ल)5, 10, और 20 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर। लेकिन 3 दिनों के लिए, इससे पहले कि मॉडल प्रेरित किया गया था। शाम और IRI(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूहों को मॉडल प्रेरण से पहले 3 दिनों के लिए डाइमिथाइल सल्फोक्साइड की एक ही मात्रा के साथ इंजेक्ट किया गया था। मॉडलिंग विधि पहले वर्णित के रूप में किया गया था (25). शाम समूह में चूहों के द्विपक्षीय गुर्दे के पेडिकल को उजागर किया गया था और उपर्युक्त के रूप में माना जाता था, लेकिन क्लैंप नहीं किया गया था। सर्जिकल चीरा 40min के बाद टांका गया था।

सीरम जैव रासायनिक विश्लेषण।

चूहों को सर्जरी के बाद 24 घंटे की बलि दी गई थी, और कक्षीय साइनस से 0.8-1 मिलीलीटर रक्त एकत्र किया गया था, 30 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दी गई थी, और 4 सी पर 10 मिनट के लिए 900xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। ऊपरी सीरम परत को एकत्र किया गया था, पैक किया गया था, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। सीरम क्रिएटिनिन (Scr; cat.no.c011-2-1) और रक्त यूरिया नाइट्रोजन (BUN: cat.no.cO13-2-1) का मूल्यांकन अभिकर्मक किट का उपयोग करके किया गया था, निर्माता के निर्देशों (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट) के अनुसार।

हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा।

24 घंटे के बाद IRI(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट), गुर्दे के ऊतकों के कुछ हिस्सों को कमरे के तापमान पर 24-48 घंटे के लिए 10% तटस्थ-बफ़र्ड फॉर्मेलिन में तय किया गया था, पैराफिन में एम्बेड करके नियमित रूप से संसाधित किया गया था। पैराफिन-फिक्स्ड ऊतक नमूनों को 4 μm मोटे वर्गों में कटा हुआ था, जिन्हें कांच की स्लाइड पर रखा गया था और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन के साथ दाग दिया गया था और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ईोसिन। एक BX51 प्रकाश माइक्रोस्कोप (ओलंपस कॉर्पोरेशन) का उपयोग गुर्दे के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों (आवर्धन, x200, और x400) का पता लगाने के लिए किया गया था। पैलर स्कोर का उपयोग वृक्क आईआरआई में गुर्दे ट्यूबलर नेक्रोसिस को ग्रेड करने के लिए किया गया था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)(26). ऑप्टिकल लाइट माइक्रोस्कोप (आवर्धन, x400) का उपयोग करके उच्च आवर्धन के तहत कुल 10 गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था, और दृष्टि के प्रत्येक क्षेत्र में 10 गुर्दे की नलिकाओं को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में तीन चूहों के गुर्दे की विकृति वर्गों को अवलोकन के लिए यादृच्छिक रूप से चुना गया था। प्रत्येक पैथोलॉजिकल अनुभाग के लिए कुल 10 दृश्य क्षेत्रों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था, और प्रत्येक दृश्य क्षेत्र में 10 गुर्दे की नलिकाएं बनाई गई थीं। प्रत्येक माउस के लिए कुल 100 नलिकाएं देखी गईं, जिससे प्रत्येक समूह में कुल 300 गुर्दे की नलिकाएं देखी गईं। स्कोर जितना अधिक होगा, गुर्दे की नलिकाओं की क्षति की डिग्री उतनी ही गंभीर होगी।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)।

गुर्दे के ऊतकों को सर्जरी के बाद 24 घंटे एकत्र किया गया था। संज्ञाहरण के बाद, 1 mm²renal ऊतक को विवो में हटा दिया गया था और ऊतक निर्धारण समाधान में भिगोया गया था जो 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड और फॉस्फोरिक एसिड बफर समाधान (cat.no.G7776) से बना था; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क KGaA) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए, क्रमिक इथेनॉल (50-100%) और प्रोपलीन ऑक्साइड में निर्जलित, Epon 812 (बिल्ली) में एम्बेडेड। GP18010; Bejing Zhongjingkeyi प्रौद्योगिकी Co.Ltd. 35 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ठोस हो गया। अल्ट्राथिन वर्गों (मोटाई, 50-70 एनएम) को 200-मेष तांबे के ग्रिड पर रखा गया था और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.04% लीड साइट्रेट के साथ दाग दिया गया था। नमूनों को एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईएम -1400 प्लस, जापान इलेक्ट्रॉन ऑप्टिक्स लेबोरेटरी कं, लिमिटेड; आवर्धन, x5,000 और x10,000) के तहत देखा गया था। छवियों को एक SlowScan चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा और TEM analySIS5.0 सॉफ़्टवेयर (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।

एंटीऑक्सिडेंट ग्लूटाथियोन (जीएसएच) और लिपिड पेरोक्सीडेशन मालोंडिएल्डिहाइड (एमडीए) का पता लगाना।

गुर्दे के ऊतक (50-100mg) एकत्र किए गए थे, और शारीरिक खारा समाधान (cat.no। B020; नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट) को ऊतक में 1: 9 वजन (जी): वॉल्यूम (एमएल) अनुपात में जोड़ा गया था। ऊतक homogenized था, 10% ऊतक homogenate का उत्पादन करने के लिए, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13,800 xg पर centrifuged था। supernatant को हटा दिया गया था और supernatant की कुल प्रोटीन सामग्री bicinchoninic एसिड विधि (21) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। जीएसएच (cat.no.A006-2-1) और MDA (cat.no.A003-2-2) का मूल्यांकन अभिकर्मक किट का उपयोग करके किया गया था, निर्माता के निर्देशों के अनुसार (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट)।

पश्चिमी ब्लोटिंग।

कुल प्रोटीन को माउस किडनी के ऊतकों से RIPA सेल लाइसिस बफर (बिल्ली) का उपयोग करके निकाला गया था। WO62-1-1; नानजिंग Jiancheng Bioengineering संस्थान) और प्रोटीन सांद्रता बीसीए परख (cat.no के माध्यम से निर्धारित किए गए थे। A045-4-2; नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट.समान मात्रा में प्रोटीन (50μug) को एसडीएस-पेज (कॉक्स-2,10.0) के माध्यम से अलग किया गया था; NRF2,10.0;xCT,12.5; HO-1, 12.5; GPx4.15.0% और PVDF झिल्ली (GE Healthcare Life Sciences) पर स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को बाद में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% स्किम्ड दूध पाउडर के साथ अवरुद्ध किया गया था, और निम्नलिखित के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था: साइक्लोऑक्सीजेनेस 2 (COX-2; 1: 1,000; बिल्ली no.ab179800; Abcam), GPX4 (1:5,000;cat.no.ab125066; Abcam), xCT(1:2,000;cat.no.ab175186; Abcam), HO-1 (1:1,000 cat.no.101147; Gentex) और NRF2 (1:1,000; cat.no.D1Z9C; सीएसटी) 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में झिल्ली को बाद में टीबीएसटी (0.1% ट्वीन -20) के साथ तीन बार धोया गया था। प्राथमिक इनक्यूबेशन के बाद, झिल्ली को हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 10,000; 40295 जी) के साथ इनक्यूबेट किया गया था; BIOSS) कमरे के तापमान पर 1h के लिए। झिल्ली को TBST के साथ तीन बार फिर से धोया गया था और BeyoECLPlus (बिल्ली। P00185; जैव प्रौद्योगिकी के Beyotime संस्थान), एक Chemi डॉक्टर इमेजिंग प्रणाली (बायो-रेड लैबोरेटरीज, इंक) का उपयोग कर। प्रोटीन बैंड की तीव्रता ImageJ v1.8.0 सॉफ्टवेयर (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सभी प्रयोगों को तीन प्रतियों में किया गया था।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक (आरटी-जी) पीसीआर।

कुल आरएनए को TRIzol अभिकर्मक (Takara Bio, Inc.) का उपयोग करके विभिन्न समूहों में चूहों के गुर्दे से निकाला गया था और cDNA को gDNA इरेज़र (cat.no.RR047A) के साथ प्राइमस्क्रिप्ट आरटी अभिकर्मक किट का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था; Takara जैव प्रौद्योगिकी कं, लिमिटेड). लक्ष्य जीन के सापेक्ष स्तर ों को अल्ट्रा SYBR मिश्रण (Takara Biotechnology Co., Ltd.) का उपयोग करके qPCR के माध्यम से निर्धारित किया गया था। RT-qPCR 2 μl cDNA, 400 nM प्रत्येक भावना और antisense प्राइमर, और 12.5 μl ब्रिलियंट SYBR ग्रीन QPCR मास्टर मिक्स (Takara Bio, Inc. एक ABI प्रिज्म 7000 प्रणाली (एप्लाइड Biosystems) पर के साथ एक 25 उल मात्रा में प्रदर्शन किया गया था; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक)। प्रतिक्रिया 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्रों के लिए की गई थी, 30 सेकंड के लिए 53 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 10 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार। निम्नलिखित प्राइमर अनुक्रमों का उपयोग qPCR के लिए किया गया था: GPX4 आगे, 5'-GCCTGGGATAAGTACA GGGGTT-3' और रिवर्स, 5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3'; NRF2 आगे, 5'-TCTTGGAGTAAGTCGAAAGGT-3' और रिवर्स, 5'-GTTGAAACTGAGAAAAAAA AGGC-3'; xCT आगे, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' और रिवर्स, 5-CTCCACAGGCAAGACAAAA-3'; COX-2 आगे, 5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3'और रिवर्स, 5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTCACTATC-3'; HO-1 forward.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' और रिवर्स, 5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; और β-एक्टिन फॉरवर्ड, 5'-GGCTGTATTCCCCCCTCCATCG-3' और रिवर्स, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'।

β-एक्टिन सामान्यीकरण के बाद जीन अभिव्यक्ति का एक औसत मूल्य लक्ष्य जीन के सापेक्ष स्तर को निर्धारित करने के लिए एक कैलिब्रेटर के रूप में उपयोग किया गया था। लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों की गणना 2-सी विधि (27) का उपयोग करके की गई थी।

सांख्यिकीय विश्लेषण।

सांख्यिकीय विश्लेषण GraphPad प्रिज्म 7.0 (GraphPad Software, Inc.) और SPSS 23 सॉफ़्टवेयर (IBM Corp. ) का उपयोग करके किया गया था। डेटा को तीन स्वतंत्र दोहरावों के माध्य± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। एक तरफा एनोवा के बाद टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग कई समूहों के बीच मतभेदों की तुलना करने के लिए किया गया था। P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

परिणाम

पीए(पेचिमिक अम्ल)IRI के साथ चूहों में गुर्दे की चोट को कम करता है(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट). एससीआर और बीयूएन गुर्दे के कार्य के दो महत्वपूर्ण संकेतक हैं (5). IRI में Scr और BUN का स्तर काफी अधिक था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह (पी) में उन लोगों की तुलना में समूह<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(पेचिमिक अम्ल)आईआरआई की तुलना में सीरम क्रिएटिनिन और यूरिया में वृद्धि को काफी कम कर दिया(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह(P)<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(पेचिमिक अम्ल)उपचार समूह और IRI(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह (P>0.05; चित्र 1A और B)।

जैसा कि चित्र 1 डी में प्रस्तुत किया गया है, शाम समूह में गुर्दे के ऊतकों के एच एंड ई धुंधला होने से गुर्दे के ऊतक संरचना में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ। इसके विपरीत, IRI(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह ने गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं, ट्यूबलर फैलाव, अंतरालीय सूजन, भड़काऊ कोशिका घुसपैठ, कोलेजन जमाव, और निक्षेपण ट्यूब परिगलन सामग्री (चित्र 1 डी) के एडिमा और नुकसान का प्रदर्शन किया। पैलर स्कोर, गुर्दे के ऊतक चोट (26) का एक संकेतक, आईआरआई में काफी अधिक था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह (पी) के साथ तुलना में समूह<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(पेचिमिक अम्ल)थेरेपी ने इन घावों में काफी सुधार किया, और पैलर स्कोर आईआरआई की तुलना में काफी कम था।(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह (P)<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)मॉडल समूह और कम खुराक समूह (P>0.05; चित्र 1C)।

चित्र 1. पीए(पेचिमिक अम्ल)ischemia-reperfusion के बाद गुर्दे की चोट को कम करता है।(ए) BUN और (B) सीरम क्रिएटिनिन को शाम, IRI में चूहों में मापा गया था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट), IRI + PAL, IRI + PAM, और IRI + PAH समूहों (40 मिनट के गुर्दे ischemia reperfusion के 24 ज द्वारा पीछा; n = 6 / समूह)। (सी) पल्लर स्कोर का उपयोग शाम, आईआरआई, आईआरआई + पाल, आईआरआई + पीएएम, और आईआरआई + पीएएच समूहों (एन = 3 / समूह) में गुर्दे की ट्यूबलर चोट को ग्रेड करने के लिए किया गया था। (डी) हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन शाम, आईआरआई में चूहों से गुर्दे की छवियां(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट), IRI + PAL, IRI + PAM, और IRI + PAH समूह। स्केल बार, 50 μm. डेटा को मानक विचलन के माध्य ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(पेचिमिक अम्ल),पेचिडर्मिक अम्ल; BUN, रक्त यूरिया नाइट्रोजन; IRI,इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; एल, कम खुराक समूह; एम, मध्यम खुराक समूह; एच, उच्च खुराक समूह।

PA के प्रभाव(पेचिमिक अम्ल)वृक्क IRI के बाद चूहों के गुर्दे के ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया में रूपात्मक परिवर्तनों पर(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट). टीईएम ने शाम समूह में गुर्दे के ऊतकों की माइटोकॉन्ड्रियल संरचना में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं किया। मॉडल समूह में, फेरोप्टोसिस से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा में कमी, झिल्ली घनत्व में वृद्धि, और कम या अनुपस्थित माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे, गुर्दे के ऊतकों में देखे गए थे (चित्र 2 ए)। मॉडल समूह में उन लोगों की तुलना में, मध्यम-खुराक समूह के माइटोकॉन्ड्रिया ने मुख्य रूप से एडिमा का प्रदर्शन किया, और फेरोप्टोसिस की विशेषता वाले विशिष्ट परिवर्तन दुर्लभ थे (चित्र 2 ए)। हालांकि, उच्च खुराक पीए में(पेचिमिक अम्ल)समूह, गुर्दे के ऊतकों के माइटोकॉन्ड्रिया में फेरोप्टोसिस का कोई विशिष्ट परिवर्तन नहीं देखा गया था, और केवल हल्के एडिमा को प्रदर्शित किया गया था (चित्र 2 ए)। कम खुराक समूह में माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तन मॉडल समूह (चित्र 2 ए) में उन लोगों के समान थे।

PA के प्रभाव(पेचिमिक अम्ल)गुर्दे IRI में जीएसएच और एमडीए अभिव्यक्ति पर(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट). GSH GPX4 फ़ंक्शन के लिए एक आवश्यक cofactor है। जीएसएच संश्लेषण सीधे GPX4 गतिविधि को प्रभावित करता है। एमडीए लिपिड ऑक्सीकरण का एक उत्पाद है, जो इंट्रासेल्युलर लिपिड पेरोक्सीडेशन की डिग्री को दर्शाता है और अप्रत्यक्ष रूप से फेरोप्टोसिस (28,29) की घटना को दर्शाता है। जैसा कि चित्र 2B में प्रस्तुत किया गया है, गुर्दे के ऊतकों में IRI में GSH का स्तर काफी कम था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह के साथ तुलना में समूह. दवा उपचार समूहों में, जीएसएच अभिव्यक्ति आईआरआई की तुलना में आईआरआई + पीए और आईआरआई + पीएएन समूहों में काफी अधिक थी।(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)मॉडल समूह (P)<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). इसके विपरीत, जैसा कि चित्र 2C में प्रस्तुत किया गया है, IRI में ऊतक लिपिड पेरोक्सीडेशन अधिक (एमडीए स्तरों के आधार पर) था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह के साथ तुलना में समूह. दवा उपचार समूहों में, आईआरआई की तुलना में आईआरआई + पीए और आईआरआई + पीएयू समूहों में एमडीए का स्तर काफी कम था।(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह (P)<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).

चित्र 2. पीए(पेचिमिक अम्ल)IRI में फेरोप्टोसिस को कम करता है(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)-तीव्र गुर्दे की चोट।(ए) शाम, आईआरआई में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट), IRI + PAL, IRI + PAM, और IRI + PAH समूहों (40 मिनट गुर्दे ischemia reperfusion के 24 ज द्वारा पीछा). आवर्धन, x20,000; स्केल बार, 1 μm. काले तीरों से संकेत मिलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा में कमी आई, झिल्ली घनत्व में वृद्धि हुई और कमी आई, या गायब हो गए माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे को गुर्दे के ऊतकों में देखा गया। नीले तीर माइटोकॉन्ड्रियल एडिमा का संकेत देते हैं। गुर्दे के ऊतकों में (बी) जीएसएच और (सी) एमडीए के स्तर का मूल्यांकन किया गया था (एन = 6 / समूह)। डेटा को मानक विचलन के माध्य ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह। पीए(पेचिमिक अम्ल),पेचिडर्मिक अम्ल; IRI,इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; एल, कम खुराक समूह; एम, मध्यम खुराक समूह; एच, उच्च खुराक समूह; जीएसएच, ग्लूटाथियोन; एमडीए, मालोन्डिएल्डिहाइड।

पीए(पेचिमिक अम्ल)वृक्क IRI में फेरोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट). वर्तमान अध्ययन में, फेरोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन GPX4, xCT, और HO-1 के अभिव्यक्ति स्तरों को पश्चिमी ब्लोटिंग (चित्र 3A और B) और RT-qPCR (चित्र 3C) विश्लेषणों के माध्यम से पाया गया था। परिणामों से पता चला है कि GPX4, xCT, और HO-1 के प्रोटीन के स्तर को IRI में काफी कम कर दिया गया था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह के साथ तुलना में समूह (पी<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(पेचिमिक अम्ल)आईआरआई की तुलना में GPX4, xCT, और HO-1 के प्रोटीन और mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में काफी वृद्धि हुई(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह(P)<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)और कम खुराक पीए(पेचिमिक अम्ल)उपचार समूह (पी>0.05; चित्र 3B और C)।

चित्र 3. पीए(पेचिमिक अम्ल)अभिव्यक्ति के स्तर ferroptosis से संबंधित प्रोटीन, GPX4, xCT, और HO-1 बढ़ जाती है.(ए) पश्चिमी ब्लोटिंग आईआरआई में फेरोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन, जीपीएक्स 4, एक्ससीटी और एचओ -1 के अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाने के लिए किया गया था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)तीव्र गुर्दे की चोट चूहों (एन = 3). (बी) GPX4, xCT, और HO-1 के लिए ग्रे मानों की सापेक्ष अभिव्यक्ति। (सी) फेरोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन (एन = 3) के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण किया गया था। डेटा को मानक विचलन के माध्य ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह। पीए(पेचिमिक अम्ल),पचीडर्मिक एसीआइd; GPX4, ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज 4; xCT, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर प्रणाली; HO-1, हीम ऑक्सीजनेज 1; IRI,इस्किमिया-रिपरफ्यूजन घायलy; एल, कम खुराक समूह; एम, मध्यम खुराक समूह; एच, उच्च खुराक समूह।

परिणामों से पता चला है कि फेरोप्टोसिस से जुड़े लिपिड पेरोक्सीडेशन प्रोटीन, COX-2 के प्रोटीन और एमआरएनए स्तर आईआरआई के दौरान काफी ऊपर थे(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)(चित्र 4). मध्यम खुराक और उच्च खुराक पीए के साथ उपचार(पेचिमिक अम्ल)IRI की तुलना में COX-2 अभिव्यक्ति में काफी कमी आई(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह (P)<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)और कम खुराक पीए(पेचिमिक अम्ल)उपचार समूह (पी>0.05; चित्र 4)।

चित्र 4. पीए(पेचिमिक अम्ल)फेरोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन, COX-2 की अभिव्यक्ति के स्तर को कम करता है।(ए) पश्चिमी ब्लोटिंग को आईआरआई-तीव्र गुर्दे की चोट चूहों में फेरोप्टोसिस लिपिड पेरोक्सीडेशन मार्कर प्रोटीन, कॉक्स -2 की अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए किया गया था। (बी) COX-2 के लिए ग्रे मानों की सापेक्ष अभिव्यक्ति। (सी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण एमआरएनए कॉक्स -2 अभिव्यक्ति (एन = 3) का पता लगाने के लिए किया गया था। डेटा को मानक विचलन के माध्य ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह। पीए(पेचिमिक अम्ल),पेचिडर्मिक अम्ल; COX-2, cyclooxygenase 2; IRI,इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; एल, कम खुराक समूह; एम, मध्यम खुराक समूह; एच, उच्च खुराक समूह।

पीए(पेचिमिक अम्ल)गुर्दे IRI में NRF2 सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण को बढ़ावा देता है(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट). पीए के प्रभाव की जांच करने के लिए(पेचिमिक अम्ल)NRF2 सिग्नलिंग मार्ग पर, NRF2 के प्रोटीन और mRNA स्तरों का मूल्यांकन किया गया था (चित्र 5)। परिणामों से पता चला कि NRF2 अभिव्यक्ति IRI में काफी कम थी(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)शाम समूह के साथ तुलना में समूह. इसके अलावा, NRF2 अभिव्यक्ति IRI + PAw और IRI + PAH समूहों में IRI की तुलना में काफी अधिक थी(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह (P)<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). इसके अलावा, पीए के साथ उपचार(पेचिमिक अम्ल)इसके अलावा एक खुराक-निर्भर तरीके से NRF2 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (चित्र 5)।

चित्र 5. पीए(पेचिमिक अम्ल)NRF2 सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करता है।(ए) आईआरआई में एनआरएफ 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए पश्चिमी ब्लोटिंग किया गया था(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)तीव्र गुर्दे की चोट चूहों। (बी) एनआरएफ 2 (एन = 3) के लिए ग्रे मानों की सापेक्ष अभिव्यक्ति। (सी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण एमआरएनए एनआरएफ 2 अभिव्यक्ति (एन = 3) का पता लगाने के लिए किया गया था। डेटा को मानक विचलन के माध्य ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट)समूह। पीए(पेचिमिक अम्ल),पेचिडर्मिक अम्ल; NRF2, परमाणु कारक 2 की तरह 2 व्युत्पन्न 2; IRI,इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; एल, कम खुराक समूह; एम, मध्यम खुराक समूह; एच, उच्च खुराक समूह।

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