भाग एक डीएसबीए-एल माइटोकॉन्ड्रियनमध्यस्थ ट्यूबलर सेल एपोप्टोसिस में वीडीएसी1 के साथ बातचीत करता है और तीव्र गुर्दे की बीमारी की प्रगति में योगदान देता है

सारांश

1। पृष्ठभूमि

हमने प्रदर्शित किया कि डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड ए ऑक्सीडोरडक्टेस-जैसे प्रोटीन (डीएसबीए-एल) गुर्दे की फाइब्रोसिस की प्रगति में शामिल था। हालाँकि, तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई) में डीएसबीए-एल का सटीक कार्य और इसमें शामिल तंत्र को अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है।

2. तरीके

हम इन विट्रो और विव में सह-आईपी (सह-इम्यूनोप्रेसिपिटेशन) द्वारा VDAC1 के साथ इंटरैक्ट किए गए DsbA-L का वर्णन करते हैं और उत्परिवर्तन प्रयोग द्वारा उनके इंटरेक्शन भागों को ढूंढते हैं। उपरोक्त निष्कर्षों को उनके सह-स्थानीयकरण द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, हमने VAN, CL, P और I/R-प्रेरित AKI के मॉडल में DsbAL और VDAC1 के कार्य को सत्यापित करने के लिए PT-DsbA-L और VDAC1 KO चूहों के दो मॉडल बनाए।

3. निष्कर्ष

PT-DsbA-L-KO चूहों ने VDAC1 के डाउनरेगुलेशन के माध्यम से I/R, VAN- और CLP-प्रेरित AKI प्रगति में सुधार दिखाया। अंत में, हमने इस्केमिक या एक्यूट इंटरस्टिशियल नेफ्रैटिस (एआईएन) से प्रेरित एकेआई वाले रोगियों से ली गई एचके -2 कोशिकाओं और किडनी बायोप्सी की जांच करके सिग्नल अणुओं में इन परिवर्तनों की पुष्टि की। यांत्रिक रूप से, DsbA-L ने गुर्दे की कोशिका एपोप्टोसिस और माइटोकॉन्ड्रियल चोट को प्रेरित करने के लिए BUMPT कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया में VDAC1 के अमीनो एसिड 9-13 और 22-27 के साथ बातचीत की।

4. व्याख्या

इस कार्य ने सुझाव दिया कि समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में स्थित DsbA-L, VDAC1 के स्तर को सीधे बढ़ाकर, AKI की प्रगति को संचालित करता है। रनिंग शीर्षक: AKI में DsbA-L की भूमिका।

5. फंडिंग

चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, हुनान प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार की प्रमुख परियोजना से अनुदान, हुनान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग, अंतर्राष्ट्रीय सहयोग और आदान-प्रदान परियोजना, चांग्शा विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो परियोजना, हुनान प्रांत का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, मौलिक सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी के केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए अनुसंधान निधि, स्नातकोत्तर चीन हुनान प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग के लिए हुनान प्रांतीय इनोवेशन फाउंडेशन।

कीवर्ड

डीएसबीए-एल; वीडीएसी_I; बाक्स; साइट-सी; अकी

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परिचय

तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई), रुग्णता और मृत्यु दर की उच्च दर के साथ एक विनाशकारी नैदानिक ​​जटिलता, पूरी दुनिया में लाखों रोगियों को प्रभावित करती है(1)। AKI आमतौर पर सेप्सिस, नेफ्रोटॉक्सिक एजेंटों और इस्केमिया-रीपरफ्यूजन इंजरी (IRI)(2) से प्रेरित होता है। अभी तक, AKI के अंतर्निहित आणविक तंत्र को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया जा सका है। परिणामस्वरूप, AKI के लिए कोई प्रभावी उपचार रणनीतियाँ उपलब्ध नहीं हैं।

ट्यूबलर सेल की चोट को दशकों से AKI.3 के एक महत्वपूर्ण चालक के रूप में मान्यता दी गई है। जैसे-जैसे अनुसंधान आगे बढ़ा है, शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या ने पहचान की है कि माइटोकॉन्ड्रियल क्षति ट्यूबलर सेल की चोट में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है और यह प्रारंभिक क्षति संचय के कारण होती है। आरओएस, साइटोकिन्स का उत्पादन, और सेलुलर मृत्यु (नेक्रोसिस और एपोप्टोसिस दोनों सहित); सामूहिक रूप से, ये सभी प्रक्रियाएँ AKI में योगदान करती हैं। 4-6 हालाँकि अनुसंधान के बढ़ते समूह ने AKI में माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के अंतर्निहित तंत्र पर ध्यान केंद्रित किया है, 7- 12 माइटोकॉन्ड्रियल चोट के लिए जिम्मेदार सटीक तंत्र की अभी तक पहचान नहीं की जा सकी है।

डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड ए ऑक्सीडोरडक्टेज़-जैसे प्रोटीन (डीएसबीएएल) को पहली बार चूहे के जिगर की कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था।13 पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डीएसबीए-एल ने आहार या मधुमेह नेफ्रोपैथी (डीएन) को रोका - प्रेरित मोटापा, सूजन, इंसुलिन प्रतिरोध, या गुर्दे की चोट। 14-18 दिलचस्प बात यह है कि हमारे हालिया अध्ययन में पाया गया कि डीएसबीए-एल ने एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट (यूयूओ)-प्रेरित गुर्दे की फाइब्रोसिस की मध्यस्थता की। हालाँकि, AKI में ट्यूबलर DsbA-L की भूमिका और तंत्र अभी भी पूरी तरह से अज्ञात है।

वर्तमान अध्ययन में, एक माउस मॉडल में डीएसबीए-एल (पीटी-डीएसबीए-एल-केओ) के समीपस्थ ट्यूबलर विलोपन के परिणामस्वरूप वैनकोमाइसिन (वीएएन) - और सेकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) के साथ-साथ आई/आर में उल्लेखनीय क्षीणन हुआ। )-प्रेरित एकेआई। लगातार, डीएसबीए-एल ने माउस रीनल प्रॉक्सिमल ट्यूबलर एपिथेलियल (बीयूएमपीटी) कोशिकाओं में आई/आर, वैन- और एलपीएस-प्रेरित एपोप्टोसिस की भी मध्यस्थता की। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि DsbA-L ने वोल्टेज-निर्भर आयन चैनल 1 (VDAC1) के 9-13 और 22 27 क्षेत्रों के साथ बातचीत की, जो कि प्रोटीन19 21 के VDAC परिवार का एक प्रमुख सदस्य है; ये प्रभाव विवो और इन विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों और मानव AKI नमूनों दोनों में देखे गए। इसके अलावा, हमने दिखाया कि PTVDAC1-KO ने AKI के इन विट्रो और इन विवो मॉडल दोनों में रीनल सेल एपोप्टोसिस में भी सुधार किया है। सामूहिक रूप से, हमने प्रदर्शित किया कि DsbA-L ने माइटोकॉन्ड्रियन-मध्यस्थता ट्यूबलर सेल एपोप्टोसिस में VDAC1 के साथ बातचीत की और इसलिए AKI की प्रगति का कारण बना।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा

सामग्री और तरीके

1. नीति कथन

अध्ययन को दूसरे जियानग्या अस्पताल, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना (नंबर 2018065) ​​के समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और इस अध्ययन में 18 रोगियों को भर्ती किया गया था। अध्ययन में शामिल करने से पहले सभी प्रतिभागियों को लिखित सूचित सहमति के साथ भर्ती किया गया था। सभी पशु प्रयोग द्वितीय जियानग्या अस्पताल, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना (सं. 2020310) की पशु देखभाल आचार समिति द्वारा अनुमोदित मार्गदर्शक सिद्धांतों का अनुपालन करते हैं।

2. एंटीबॉडी और अभिकर्मक

Anti-COXIV (ab33985, RRID: AB_879754), VDAC1 (ab14734, RRID: AB_443084), and PGC-1a (ab191838, RRID: AB_2721267) antibodies were obtained from Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, UK). Anti-Caspase3 (9662, RRID: AB_331439) and cleavedcapase3 (9664, RRID: AB_2070042) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-Bax (50599-2-Ig, RRID: AB_2061561), Cyt-c (10993-1-AP, RRID: AB_2090467), NRF1 (12482- 1-AP, RRID: AB_2282876), GAPDH (60004-1-Ig, RRID: AB_2107436), and b-tubulin (10094-1-AP, RRID: AB_2210695) antibodies were obtained from Proteintech (Rosemont, IL, USA). The anti-DsbA-L antibody was provided by Dr. Feng Liu(14). All secondary antibodies (MitoTracker Green FM and MitoTracker Red CMXRos) were obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). The calcium ionophore was purchased from Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Antimycin A (>95 प्रतिशत शुद्ध, ab141904) और एक माइटोकॉन्ड्रिया/साइटोसोल फ्रैक्शनेशन किट (ab65320) Abcam (कैम्ब्रिज साइंस पार्क, कैम्ब्रिज, यूके) से खरीदे गए थे। माउस DsbAL के लिए लक्ष्य अनुक्रम का वर्णन पहले किया जा चुका है।22

3. इस्केमिक रीपरफ्यूजन, सीएलपी और वैन द्वारा एकेआई मॉडल का निर्माण

C57BL/6J नर चूहों (RRID: MGI:5657312) की आयु {{3%) सप्ताह हुनान SJA प्रयोगशाला पशु कंपनी लिमिटेड से खरीदी गई थी। समीपस्थ नलिका-विशिष्ट DsbA-L या VDAC1 विलोपन प्रदर्शित करने वाले चूहों को DsbA-L को पार करके उत्पादित किया गया था। (फ्लॉक्स/फ्लोक्स) चूहे (डॉ. फेंग लियू द्वारा प्रदान किए गए) या वीडीएसी1 (फ्लोक्स/फ्लोक्स) चूहे (शंघाई मॉडल जीवों से प्राप्त) पीईपीसीके-क्रे चूहों के साथ (डॉ. वोल्कर हास (पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय, फिलाडेल्फिया, पीए) द्वारा प्रदान किए गए ) जैसा कि पहले वर्णित है। 22,23 नर चूहों ({{12 }} सप्ताह की आयु) को इस्केमिया, सीएलपी और वैन नेफ्रोटॉक्सिक एकेआई के अधीन किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया है। 23 27 इस्केमिक एकेआई के लिए, द्विपक्षीय गुर्दे की धमनी को लगातार क्लिप किया गया था 28 मिनट के बाद 24 घंटे या 48 घंटे तक पुनर्संयोजन किया गया। चूहों के शरीर का तापमान लगभग 37 डिग्री पर बनाए रखा गया था। सीएलपी-प्रेरित एकेआई के लिए, सीकुम को सिरे से 1.5 सेमी की स्थिति में कसकर बांधा गया था। इसके बाद एक 18 घंटे के लिए पंचर। वैन की चोट के लिए, चूहों को लगातार 7 दिनों तक 600 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर वैन की एक खुराक के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन लगाया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था।28,29 इसके अलावा, C57BL/6 चूहों को इंजेक्शन लगाया गया था DsbA-L या VDAC1 प्लास्मिड, या VDAC1 siRNA (15 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर) पूंछ नस के माध्यम से सप्ताह में दो बार22; सलाइन का उपयोग नियंत्रण इंजेक्शन के रूप में किया गया था। प्रत्येक अध्ययन के लिए, हमने पिछले अध्ययनों के आधार पर पूर्वाग्रह से बचने के लिए नमूनों का एक साथ विश्लेषण किया, और नमूना आकार (n=6) निर्धारित करने के लिए PASS सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया। हमने उस नमूने को बाहर कर दिया जो अंतिम बिंदु से पहले मॉडल स्थापना में विफल हो गया या विफल हो गया। प्रायोगिक चूहों को यादृच्छिक संख्या तालिका के अनुसार समूहीकृत किया गया था। जांचकर्ताओं को प्रयोग के दौरान नहीं बल्कि आवंटन, नमूना संग्रह और डेटा विश्लेषण के दौरान अंधा कर दिया गया था। सभी पशु प्रयोग द्वितीय जियानग्या अस्पताल, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना की पशु देखभाल आचार समिति द्वारा अनुमोदित मार्गदर्शक सिद्धांतों का अनुपालन करते हैं। चूहों को मानक कृंतक आहार और पानी तक निःशुल्क पहुंच के साथ 36 घंटे प्रकाश/अंधेरे वातावरण में रखा गया था।

हर्बा सिस्टान्चे

4. सेल कल्चर और एक इस्केमिया-रीपरफ्यूजन मॉडल

डॉ. विल्फ्रेड लिबरथल (बोस्टन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन) से प्राप्त BUMPT कोशिकाएँ या शंघाई Zhongqiaoxinzhou बायोटेक से प्राप्त HK {{0}} कोशिकाओं को DMEM (गिब्को, 11965092) के साथ 10 प्रतिशत FBS (गिब्को, 10100147) जोड़कर सुसंस्कृत किया गया था। और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को, 15140163) 5 प्रतिशत CO2 में 37 डिग्री पर। इस्केमिक सेल मॉडल के लिए, BUMPTs कोशिकाओं को हैंक्स बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (Hyclone, SH30030.02) में 10mM एंटीमाइसिन A (माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III, Abcam, ab141904 का अवरोधक) और 1.5mM कैल्शियम आयनोफोर (सिग्मा, A23187) के साथ इलाज किया गया था। 2 घंटे 30 फिर हमने पुनर्संयोजन चरण के लिए 0, 2 और 4 घंटे के लिए एचबीएसएस को डीएमईएम माध्यम से बदल दिया। सेल एपोप्टोसिस का पता एपोप्टोटिक संकेतकों के लिए आकृति विज्ञान और इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा लगाया गया था, जिसमें क्लीवेड-कैस्पेज़ 3, बैक्स और साइट-सी शामिल थे। लिपोफ़ेक्शन द्वारा कई प्लास्मिड बनाए गए और कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किए गए: DsbA-L, HA-VDAC1-1-25, HA-VDAC1-26-366, HA-VDAC1-पूरी लंबाई, HA- VDAC{{33 }}D9-13,22-27, HAVDAC1-D39-45,{38}}, और HA- VDAC1-D9-13, DsbA-L और VDAC1 के लिए 22-27 D39-45,55-57, और siRNA। अभिकर्मक के छह से आठ घंटे बाद, संस्कृति माध्यम को डीएमईएम से बदल दिया गया। चूहों के लिए DsbA-L siRNA और VDAC1 siRNA का क्रम क्रमशः 50 - GCAUGGAGCAACCAGAGAUTT -30 और 50 - CCAGAGCAACTTCGCAGTT -30 था; स्क्रैम्बल NC siRNA के अनुक्रम 50 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-30 थे। मनुष्यों के लिए DsbA-L siRNA और VDAC1 siRNA का क्रम क्रमशः 50 - UCAUUUGCCAUGUAUAGUCCU-30 और 50 -UAUUAAGCCAAAUCCAUAGCC -30 था; स्क्रैम्बल एनसी siRNA के अनुक्रम 50 -AACCACUCAACUUUUUCC CAA -30 थे। आईआर का मॉडल तब प्रेरित किया गया जब सेल घनत्व 90 प्रतिशत तक पहुंच गया।

5. फ्लो साइटोमेट्री

फ्लो साइटोमेट्री को एफआईटीसी एनेक्सिन वी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (बीडी, 556547) के निर्देश के अनुसार संचालित किया गया था। BUMPT या HK -2 अलग-अलग उपचार वाली कोशिकाओं को EDTA के बिना ट्रिप्सिन का उपयोग करके एकत्र किया गया और पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया, इसके बाद कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए FITC और 5 मिनट के लिए PI किया गया, और अंत में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जांच की गई।

6. एकेआई रोगी और नमूना संग्रह

प्रोटोकॉल को पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना के दूसरे जियानग्या अस्पताल के समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में 18 मरीजों को भर्ती किया गया, जिनमें 12 पुरुष और 6 महिलाएं शामिल थीं। भर्ती सिद्धांत किडनी बायोप्सी पर आधारित था। रोगी की जानकारी तालिका 1 में दी गई है। किडनी बायोप्सी नमूने न्यूनतम परिवर्तन वाली बीमारियों (एमसीडी) (एन=6) और इस्केमिक या एक्यूट इंटरस्टिशियल नेफ्रैटिस (एआईएन) से प्रेरित एकेआई (एन{{6}) से पीड़ित रोगियों से प्राप्त किए गए थे। }). हम घोषणा करते हैं कि सभी अध्ययन मानव प्रतिभागियों के साथ अनुसंधान के लिए सभी प्रासंगिक नैतिक नियमों का अनुपालन करते हैं और हेलसिंकी सिद्धांतों की घोषणा के अनुपालन में किए गए थे और यह अध्ययन समीक्षा और अनुमोदन के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय के मार्गदर्शन के अनुरूप है। मानव आनुवंशिक संसाधन. एमसीडी के समावेशन और बहिष्करण मानदंडों का वर्णन हमारे पिछले अध्ययन में किया गया था। 23 आईआर के लिए: समावेशन मानदंड: 1 इस्केमिया-रीपरफ्यूजन रोगियों के लिए बायोप्सी, 2 75 वर्ष से कम आयु; बहिष्करण मानदंड1: पश्चात चिकित्सा परीक्षाओं में पाए गए ट्यूमर वाले रोगियों को बाहर रखें, 2 क्रमशः मधुमेह, गठिया, उच्च रक्तचाप, मूत्र तपेदिक या संक्रमण के इतिहास वाले रोगियों को बाहर करें। एआईएन के लिए: समावेशन मानदंड 1: नैदानिक ​​रूप से तीव्र अंतरालीय नेफ्रैटिस के रूप में निदान किया गया 2 बायोप्सी ने एआईएन रोगियों की पुष्टि की, 3 जिनकी आयु 75 वर्ष से कम है; बहिष्करण मानदंड1: प्रवेश से पहले असामान्य रक्त क्रिएटिनिन वाले रोगियों को बाहर करें, 2 मधुमेह, गठिया, उच्च रक्तचाप, मूत्र तपेदिक या संक्रमण के इतिहास वाले रोगियों को बाहर करें। फिर इन नमूनों का उपयोग HE, TUNEL, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ-साथ इम्यूनोप्रेजर्वेशन (IP) और इम्यूनोब्लॉटिंग के धुंधलापन के लिए किया गया।

7. इम्यूनोअवक्षेपण

BUMPT कोशिकाओं से साइटोप्लाज्म और माइटोकॉन्ड्रिया और चूहों और AKI रोगियों से गुर्दे के ऊतकों को माइटोकॉन्ड्रिया/साइटोसोल फ्रैक्शनेशन किट (एबीकैम, एबी65320) का उपयोग करके अलग किया गया था; किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था। एंटीबॉडी (DsbA-L, VDAC1, HA, या IgG) चुंबकीय मोतियों पर बंधे थे। इसके बाद, हमने माइटोकॉन्ड्रिया/साइटोप्लाज्म लाइसेट मिलाया और इसे तीन घंटे तक इनक्यूबेट किया। इसके बाद, मिश्रण को छान लिया गया और इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा संबंधित मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई।

8. सापेक्ष मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)

ट्राइज़ोल अभिकर्मक (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) द्वारा आरएनए को BUMPT कोशिकाओं या किडनी ऊतक से निकाला गया था। जैसा कि पहले बताया गया है, आरएनए को प्राइम स्क्रिप्ट आरटी रिएजेंट किट और जीडीएनए इरेज़र (टाकरा, आरआर037ए) का उपयोग करके पहले-स्ट्रैंड सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया गया था।31'34 इसके बाद, हमने सीडीएनए को टीबी ग्रीन (टाकरा, आरआर820ए) और एक लाइट साइक्लर 96 (रोश) के साथ निम्नलिखित प्राइमर जोड़े के साथ एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया: डीएसबीए-एल: 5 - AAATATGGGGCCTT TGGGCT-3'(आगे) और 5'- TAGCAACTCCAAGCGGTCA जी-3'(रिवर्स); और GAPDH: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCACA-3'(आगे) और 5'-GTGAGGGTC TCTCTCTTCCT-3'(रिवर्स); पीजीसी{{0}a: 5'-ATGTGTCGCCTTCTTGCTCTTCC-3 (आगे) और 5'-CTCCCGCTTCTCGTGCTCTTTG-3'(रिवर्स); NrF1:5'-TCTGCTGTGGCTGATGGAGA GG-3'(आगे) और NrF1:5'-GATGCTTGCGTCGTCTGGATGG-3 (रिवर्स);

9. BUN और क्रिएटिनिन का पता लगाना

BUN और क्रिएटिनिन का पता BUN (यूरिया नाइट्रोजन सामग्री परख किट बीजिंग बॉक्सबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड) और क्रिएटिनिन परख किट (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट, नानजिंग, चीन) के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

10. एचई स्टेनिंग, ट्यूनेल स्टेनिंग, इम्यूनोकैमिस्ट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोब्लॉटिंग

वृक्क ऊतक को पैराफिन में एम्बेड किया गया था और फिर विभिन्न प्रकार के धुंधलापन के लिए वर्गों में काटा गया था, जैसा कि पहले बताया गया था। 26,35 ऊतक विज्ञान का मूल्यांकन हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधलापन द्वारा किया गया था। गुर्दे की ट्यूबलर चोट को स्कोर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानदंड पहले वर्णित किए गए थे। 23 ट्यूनेल स्टेनिंग का उपयोग गुर्दे की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। प्रति ऊतक अनुभाग में 10-20 सूक्ष्म क्षेत्रों में TUNEL-पॉजिटिव कोशिकाओं का अनुपात (प्रतिशत) एपोप्टोसिस के मात्रात्मक संकेतक के रूप में उपयोग किया गया था। 26 इम्यूनोकैमिस्ट्री स्टेनिंग के लिए, ऊतक अनुभागों को एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में ऊष्मायन किया गया था ( डीएसबीए-एल 1:200 या वीडीएसी1 1:100)। अगली सुबह, अनुभागों को 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया और फिर 5-10 मिनट के लिए डीएबी के साथ प्रतिक्रिया की गई। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए, अनुभागों को एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (डीएसबीए-एल 1: 200, वीडीएसी {{18 }}: 100) के साथ रात भर 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया और इसके बाद अंधेरे में 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए एक माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी दिया गया। फिर डीएपीआई को 3-5 मिनट के लिए जोड़ा गया और अनुभागों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया। माइटोकॉन्ड्रियल धुंधलापन एक मानक प्रोटोकॉल द्वारा किया गया था। BUMPT कोशिकाओं या किडनी से प्रोटीन लाइसेट्स को काटा गया और फिर प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला को एसडीएस-पेज के अधीन किया गया और फिर पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। फिर झिल्लियों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया और उसके बाद कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। एंटीCOXIV, VDAC1, PGC-1a, Bax, Cyt-c, NRF1, GAPDH, और b-ट्यूबुलिन की सांद्रता 1:1000 है। एंटी-कैस्पेज़3 और क्लीवेड-कैपेज़3 की सांद्रता 1:2000 है।

सिस्टैंच अनुपूरक

11. सांख्यिकी

सभी डेटा को साधन § एसडी के रूप में प्रस्तुत किया गया था। दो समूह तुलनाओं के लिए दो-पूंछ वाले छात्र टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। टुकी के पोस्ट हॉक विश्लेषण के बाद वनवे एनोवा का उपयोग कई तुलनाओं के लिए किया गया था। क्रुस्कल वॉल्स परीक्षण का उपयोग गैर-सामान्य वितरण वाले डेटा के लिए किया गया था। डेटा और पी का विश्लेषण करने के लिए ग्राफ़ पैड सॉफ़्टवेयर 8.0 का उपयोग किया गया था<0.05 was considered statistically significant.

12. वित्त पोषण स्रोत की भूमिका

फंडर्स अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, विश्लेषण, व्याख्या या पांडुलिपि के लेखन में शामिल नहीं थे।

संदर्भ

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ज़ियाओझोउ ली, ए, बी, 1 जियान पैन, ए, बी, 1 हुइलिंग ली, सी गुआंग्डी ली, जी बोहाओ लियू, ए, बी जियानमिंग तांग, ए, बी जियांगफेंग लियू, एफ झिबियाओ हे, ए, बी झेंयु पेंग, ए ,बी होंगलियांग झांग, ए, बी लक्सियांग वांग, ए, बी यिजियन ली, डी ज़ुडोंग जियांग, ए, बी जियांगपिंग चाई, ए, बी युनचांग युआन, ई पेइलिन झेंग, एच और डोंगशान झांग ए, बी *

आपातकालीन चिकित्सा विभाग, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

बी आपातकालीन चिकित्सा और कठिन रोग संस्थान, दूसरा जियानग्या अस्पताल, सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी, चांग्शा, हुनान 410011, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

सी नेत्र विज्ञान विभाग, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

डी मूत्र शल्य चिकित्सा विभाग, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

ई डिपार्टमेंट ऑफ चेस्ट सर्जरी, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

एफ जनरल सर्जरी विभाग, दूसरा जियानग्या अस्पताल, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

जी सार्वजनिक स्वास्थ्य विभाग, सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी, चांग्शा, हुनान, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

एच एंडोक्रिनोलॉजी विभाग, शेन्ज़ेन पीपुल्स हॉस्पिटल, जिनान विश्वविद्यालय का दूसरा क्लिनिकल मेडिकल कॉलेज, दक्षिणी विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय का पहला संबद्ध अस्पताल, शेन्ज़ेन, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना

1 ज़ियाओझोउ ली और जियान पैन ने इस अध्ययन में समान रूप से योगदान दिया