भाग1: वृक्क एचएसए-एमआईआर का डाउनरेगुलेशन-127-3पी ल्यूपस नेफ्रैटिस की किडनी में टाइप I इंटरफेरॉन सिग्नलिंग मार्ग के अतिसक्रियण में योगदान देता है
May 07, 2022
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माइक्रोआरएनए सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) के रोगजनन में शामिल होते हैं और इसमें विकृत होते हैंगुर्देल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) के रोगियों में, लेकिन एलएन में उनकी रोगजनक भूमिकाएं काफी हद तक अज्ञात हैं। जानूस किनसे 1 (JAK1) कई के डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण की मध्यस्थता करता हैभड़काऊसाइटोकिन्स, जिसमें I इंटरफेरॉन (IFN-I) सिग्नलिंग मार्ग शामिल है, जो SLE और LN के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, JAK1 इनके लिए एक शक्तिशाली चिकित्सीय लक्ष्य हैस्व - प्रतिरक्षित रोग. हालांकि, ऑटोइम्यून बीमारियों और इसके पीछे आणविक तंत्र में JAK1 की विकृति का प्रदर्शन करने वाले कुछ अध्ययन हैं। इस संक्षिप्त रिपोर्ट में, हम hsa-miR-127-3p का एक निरोधात्मक प्रभाव दिखाते हैं, एक माइक्रोआरएनए जो LN रोगियों के गुर्दे के ऊतकों में डाउनग्रेड किया जाता है, onIFN-I सिग्नलिंग। हमने पाया कि hsa-miR का ओवरएक्प्रेशन -127-3 p ISRE और GAS मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति, STAT1 और STAT2 के फॉस्फोराइलेशन और IFN-I द्वारा उत्तेजित IFN उत्तेजित जीन (ISGs) के अपगमन को रोक सकता है। जबकि hsa-miR-127-3p प्रतिपक्षी ने प्राथमिक रीनल मेसेंजियल कोशिकाओं में IFN-I सिग्नलिंग की सक्रियता को बढ़ाया। इसके बाद, हमने JAK1 को hsa-miR-127-3p के एक वास्तविक लक्ष्य जीन के रूप में पहचाना और hsa-miR-127-3p लक्षित JAK1 को इसके 3'UTR और कोडिंग क्षेत्र से जोड़कर दिखाया। लगातार, हमने पाया कि hsa-miR -127-3 p का डाउनरेगुलेशन LN रोगियों के गुर्दे के ऊतकों में JAK1 और ISG के अपग्रेडेशन से जुड़ा था। हमारा डेटा एचएसए-एमआईआर -127-3 पी के गुर्दे की गिरावट को इंगित करता है, जेएके 1 की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देकर एलएन रोगियों के गुर्दे में आईएफएन-आई सिग्नलिंग मार्ग के अतिसक्रियण में योगदान देता है, एचएसए-एमआईआर -127-3 पी मिमिक का सुझाव देता है। LN में JAK1 और IFN-I सिग्नलिंग मार्ग को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कीवर्ड: माइक्रोआरएनए, एचएसए-एमआईआर-127-3p, टाइप I इंटरफेरॉन, जानूस किनेज 1, सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, ल्यूपस नेफ्रैटिस
संलग्न जानकारी:
अकादमिक में मौजूदा शोध आंकड़ों के मुताबिक, यह माना जा सकता है कि पारंपरिक चीनी दवा के इम्यूनोरेगुलेटरी फ़ंक्शन और रेचक कार्यसिस्टांचेशरीर की प्रतिरोधक क्षमता को बढ़ाने और COVID-19 के रोगियों के ठीक होने के लिए इसका बहुत नैदानिक महत्व है। सिस्टैंच द्वारा प्रतिरक्षा क्रिया का नियमन मुख्य रूप से निम्नलिखित बिंदुओं के माध्यम से होता है:
शरीर की प्रतिरक्षा कोशिकाओं (मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारे (एनके) कोशिकाओं, आदि) की कार्यात्मक गतिविधि में वृद्धि;
प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिजन प्रसंस्करण, फागोसाइटोसिस और हत्या कार्यों को बढ़ाएं; प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन्स और एंटीबॉडी के स्राव को विनियमित करें;
कुछ विद्वानों ने सिस्टांचे पर शोध किया हैपॉलीसैकराइडएक वैक्सीन सहायक के रूप में, और पाया गया कि सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड इन्फ्लूएंजा वायरस वैक्सीन की ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सुधार कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि सिस्टांच पॉलीसेकेराइड शरीर की वृद्धि कर सकते हैंप्रतिरक्षा कार्य; विशेषज्ञों ने सत्यापित किया है कि इसका प्रतिरक्षा विनियमन पर भी सकारात्मक प्रभाव पड़ता है।
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परिचय
सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) के विकास के लिए महत्वपूर्ण कुछ भड़काऊ साइटोकिनेसिस का अनुचित और अत्यधिक उत्पादन। उन रोगजनक साइटोकिन्स के डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता को अवरुद्ध करना SLE (1) के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति हो सकती है। इस धारणा के अनुसार, एंटीफ्रोलुमैब, टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I) रिसेप्टर सबयूनिट 1 (IFNARl) टाइप करने के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, IFN-I सिग्नलिंग पाथवे (2) के सक्रियण को अवरुद्ध करके SLE के उपचार में आशाजनक दिखाया गया है। , जो एसएलई और ल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) (3) के रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है।
Janus Kinases (JAKs) tyrosine kinases हैं, जो साइटोकाइन रिसेप्टर्स के इंट्रासेल्युलर डोमेन के लिए बाध्य हैं, और फॉस्फोराइलेटिंग सिग्नल ट्रांसडक्शन और ट्रांसक्रिप्शन (STAT) ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर्स (TFs) के एक्टिवेटर द्वारा सक्रियण संकेत प्रेषित करते हैं। एक JAK-STAT सिग्नलिंग मार्ग का उपयोग कई साइटोकिन्स द्वारा किया जाता है, जैसे कि IFN-I, IL6, और IL10, जो SLE सहित ऑटोइम्यून बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं। ऑटोइम्यून बीमारियों (4) के इलाज के लिए एक साथ कई साइटोकाइन सिग्नलिंग मार्ग को बाधित करने की क्षमता वाले छोटे अणु JAK अवरोधक विकसित किए गए हैं। ध्यान दें, पहली पीढ़ी के पैन-जेएके अवरोधकों की तुलना में, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि अत्यधिक चयनात्मक जेएकेआई अवरोधक प्रतिकूल प्रभाव पैदा करने के कम जोखिम के साथ कई ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए संतोषजनक चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त कर सकते हैं, जो जेएके 1 की आवश्यक भूमिका को दर्शाता है। ऑटोइम्यून बीमारियों का विकास। हालांकि, कम अध्ययनों ने ऑटोइम्यून बीमारियों के विकास के दौरान JAK1 के नियमन पर ध्यान केंद्रित किया है, जैसे कि SLE या LN में।
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) एक प्रकार का छोटा गैर-कोडिंग आरएनए है। अपने बीज क्षेत्र के 3'UTR या लक्ष्य mRNA के कोडिंग क्षेत्र के पूरक आधार युग्मन द्वारा, miRNAs अपने लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को पहचानते हैं और रोकते हैं, और इसलिए विविध जैविक कार्यों को विनियमित करते हैं (6)। MiRNAs को प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में मान्यता दी गई है, और miRNAs की विकृति SLE (7) के रोगजनन में शामिल है। हमारे पिछले वृक्क miRNA प्रोफाइल ने LN रोगियों (8) के गुर्दे के ऊतकों में कई विकृत miRNAs की खोज की। हालाँकि, इन विकृत miRNAs के कार्य काफी हद तक अज्ञात हैं।
यहां, हमने IFN-I सिग्नलिंग मार्ग में उनकी नियामक भूमिकाओं के लिए LN रोगियों के गुर्दे में 9 संरक्षित डाउनग्रेड किए गए miRNAs की जांच की और IFN-I सिग्नलिंग मार्ग के नकारात्मक नियामक के रूप में hsa-miR -127-3 p की पहचान की, और वृक्क मेसेंजियल कोशिकाओं में इस भूमिका को सत्यापित किया। हमने साबित किया कि JAK1 hsa-miR-127-3p का एक वास्तविक लक्ष्य है। हमारा डेटा एचएसए-एमआईआर -127-3 पी के डाउनरेगुलेशन का सुझाव देता है, एलएन रोगियों के गुर्दे के ऊतकों में आईएफएन-आई सिग्नलिंग मार्ग के अतिसक्रियण में योगदान देता है, और एचएसए-एमआईआर -127-3 पी मिमिक एक जेएकेएल विकल्प के रूप में काम कर सकता है। एलएन के इलाज में अवरोधक।
सामग्री और तरीके
अभिकर्मकों
यूनिवर्सल टाइप I इंटरफेरॉन आर एंड डी सिस्टम्स (कैट। 11200-1) से था। miRNA मिमिक, मिमिक कंट्रोल, और म्यूटेंट hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3')जीन से थे-
Pharma.Hsa-miR-127-3p प्रतिपक्षी ReboBio से था। प्लास्मिड का विवरण इस प्रकार है:
pISRE- और pGAS-luciferase रिपोर्टर प्लास्मिड Clontech Laboratories से थे। psiCHECK2 और pRL-TK वैक्टर Promega Biotech के थे। और PCDNA3.1 वैक्टर इंविट्रोजन से थे।
psiCHECK2-JAK1-3'UTR रिपोर्टर प्लास्मिड के निर्माण के लिए, मानव JAK1 3'UTR का टुकड़ा (पूर्वानुमानित hsa-miR-127-3p बाइंडिंग साइट वाला) था मानक पीसीआर तकनीकों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया (प्राइमर तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं) और बाद में psiCHECK2 वेक्टर में डाला गया।
psiCHECK2-JAK1-3'UTR-म्यूटेंट रिपोर्टर प्लास्मिड के निर्माण के लिए, psiCHECK पर अनुमानित hsa-miR-127-3p बाइंडिंग साइट (5'GATCTGA3')2-JAK 1-3'UTR रिपोर्टर प्लास्मिड को KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) का उपयोग करके (5'CTAGACT3') में उत्परिवर्तित किया गया था (प्राइमर्स तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं)।
PCDNA3 के निर्माण के लिए।1-JAKlt प्लास्मिड, मानव JAK1 कोडिंग क्षेत्र के खंड (पूर्वानुमानित hsa-miR-127-3p बाइंडिंग साइट) को मानक PCR तकनीकों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था (प्राइमर्स तालिका में सूचीबद्ध हैं। S1) और बाद में PCDNA3.1(plus)-5'HA वेक्टर में डाला गया।
PCDNA3.1-JAKlt-उत्परिवर्ती प्लास्मिड के निर्माण के लिए, PCDNA3 पर अनुमानित hsa-miR-127-3p बाइंडिंग साइट्स (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3')।1-JAKlt प्लास्मिड को उत्परिवर्तित किया गया था (5 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3) KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) का उपयोग करके (प्राइमर्स तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं)।
सभी प्लास्मिडों को अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया था।
कोश पालन
हेला कोशिकाएँ, HepG2 कोशिकाएँ और K562 कोशिकाएँ सेल बैंक, शंघाई इंस्टीट्यूट फॉर बायोलॉजिकल साइंसेज, शंघाई, चीन से थीं। उत्परिवर्तित JAK1 (9) के साथ U4A सेल सूचो विश्वविद्यालय में Y. यूजीन चिन की ओर से एक उपहार थे। अनुयाई कोशिकाओं (हेला, हेपजी2, और यू4ए) को डीएमईएम (गिब्को) में 10 प्रतिशत एफबीएस (गिब्को) और 100 कुरूप/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को) के साथ सुसंस्कृत किया गया। निलंबन कोशिकाओं (K562) को RPMI 1640-गिब्को में 10 प्रतिशत FBS-गिब्को और 100 ug/ml पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को) के साथ संवर्धित किया गया था। निर्माता के निर्देश के अनुसार मेसेंजियल सेल मीडियम (Cat.4201, ScienCellTM रिसर्च लेबोरेटरीज) में प्राथमिक मानव रीनल मेसेंजियल सेल्स (HRMCs)(Cat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) का संवर्धन किया गया। 5 प्रतिशत CO2 में सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री पर बनाए रखा गया था।
अभिकर्मक और उत्तेजना
लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख के लिए, हेला कोशिकाओं या एचआरएमसी को एक 96-वेल प्लेट में रखा गया और ISRE-या GAS-luciferase रिपोर्टर (100ng/well), pRL-TK प्लास्मिड (10ng/well) के साथ संकेतित miRNA मिमिक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। (100 एनएम) या एंटागोमिर (500 एनएम) लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इनविट्रोजन) का उपयोग करते हुए। 12 घंटे बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को माप से पहले 8 घंटे के लिए यूनिवर्सल टाइप I इंटरफेरॉन (1000यू/एमएल) से प्रेरित किया गया।
JAK1 mRNA के 3'UTR में hsa-miR-127-3p के लक्ष्य स्थलों के सत्यापन के लिए, हेला कोशिकाओं को एक 96-वेल प्लेट में रखा गया और psiCHECK2-JAK1-3 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। 'UTR(या psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant या psiCHECK2) प्लास्मिड (20ng/well) एक साथ संकेतित miRNA मिमिक (100nM) का उपयोग करके
लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इंविट्रोजन)। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को माप से पहले 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था।
लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को निर्देश के अनुसार डुअल-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख प्रणाली (Promega Biotech) से मापा गया था।
JAK1 mRNA के कोडिंग क्षेत्र में hsa-miR-127-3p के लक्ष्य स्थलों के सत्यापन के लिए, U4A कोशिकाओं को एक 6-वेल प्लेट में रखा गया और PCDNA3 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया।1-JAKlt (या PCDNA3. 1-JAK1t-म्यूटेंट) प्लास्मिड (लूग/वेल) एक साथ संकेतित miRNA मिमिक (100nM) के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (Invitrogen) का उपयोग करते हुए।
अन्य उद्देश्यों के लिए, हेला कोशिकाओं या एचआरएमसी को miRNA मिमिक (100nM) या एंटागोमिर (500nM) के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन RNAiMax (Invitrogen) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। 24 घंटे बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को यूनिवर्सल टाइप I इंटरफेरॉन (1000U / ml) से 6 घंटे के लिए प्रेरित किया गया था। (एमआरएनए मात्रा का ठहराव या माइक्रोएरे के लिए) या 10 मिनट या 15 मिनट (पश्चिमी धब्बा के लिए) के लिए।
जीन अभिव्यक्ति की मात्रा
TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen) के साथ कुल RNA निकाला गया। सीडीएनए को प्राइमस्क्रिप्ट आरटी अभिकर्मक किट (तकरा) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। SYBR Premix ExTaq किट (Takara) का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की गई थी। RPL13a का उपयोग mRNA परिमाणीकरण के लिए एक संदर्भ जीन के रूप में किया गया था। hsa-miR-127-3p की अभिव्यक्ति TaqMan MicroRNA परख किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। RNU48 का उपयोग miRNA परिमाणीकरण के लिए एक संदर्भ जीन के रूप में किया गया था। एबीआई vii7 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर प्रवर्धन किया गया था। सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना 2-विधि का उपयोग करके की गई थी। इंडक्शन फोल्ड की गणना प्रायोगिक समूहों (miRNA मिमिक या एंटीगोमिर ट्रांसफेक्शन ग्रुप्स विद IFN-I स्टिमुलेशन) में एक नमूने के जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को एक अस्थिर नियंत्रण नमूने के एक ही जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति द्वारा विभाजित करके की गई थी (कोई ट्रांसफेक्शन नहीं, नहीं IFN-I उत्तेजना)। प्राइमरों को तालिका S2 में सूचीबद्ध किया गया है।
पश्चिमी धब्बा
पूरे सेल lysates का उपयोग किया गया था। प्रोटीन को 10 प्रतिशत एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया, विद्युत रूप से पीवीडीएफ झिल्ली (ईएमडी मिलिपोर) में स्थानांतरित किया गया, और संकेतित एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। बैंड की कल्पना पियर्स ईसीएल वेस्टर्न ब्लॉटिंग सबस्ट्रेट (थर्मो साइंटिफिकटीएम) के साथ की गई थी। तालिका S3 में एंटीबॉडी की जानकारी थी।
माइक्रोएरे
टोटल RNA को TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen) के साथ RESULTS सेक्शन में संकेतित नमूनों से निकाला गया और माइक्रोएरे विश्लेषण के अधीन किया गया। शंघाई बायोटेक्नोलॉजी कॉर्पोरेशन द्वारा एफिमेट्रिक्स यू133 प्लस 2.0 सरणी का उपयोग करके सभी माइक्रोएरे प्रयोग किए गए थे। संक्षेप में, Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US) द्वारा RNA अखंडता का निरीक्षण करने के लिए RIN नंबर के लिए कुल RNA की जाँच की गई। क्वालिफाइड टोटल RNA को RNeasy माइक्रो किट (कैट # 74004, QIAGEN, GmBH, जर्मनी) और RNase-फ्री DNase सेट (कैट # 79254, QIAGEN, GmBH, जर्मनी) द्वारा शुद्ध किया गया था। फिर, बायोटिन-लेबल वाले सीआरएनए प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए आरएनए नमूनों को जीनशिप 3'आईवीटी एक्सप्रेस किट (कैट # 901229, एफिमेट्रिक्स, सांता क्लारा, सीए, यूएस) द्वारा प्रवर्धित, लेबल और शुद्ध किया गया। हाइब्रिडाइजेशन में जीनशिप-हाइब्रिडाइजेशन, वॉश एंड स्टेन किट (कैट # 900720, एफिमेट्रिक्स, सांता क्लारा, सीए, यूएस) का उपयोग करके ऐरे हाइब्रिडाइजेशन और वॉश का प्रदर्शन किया गया।
ओवन 645(कैट#00-0331-220वी, एफिमेट्रिक्स, सांता क्लारा, सीए, यूएस) और फ्लूइडिक्स स्टेशन 450(कैट#00-0079, एफिमेट्रिक्स, सांता क्लारा, सीए, यूएस) ने इसका अनुसरण किया। निर्माता के निर्देशों। स्लाइड्स को GeneChipScanner 3 000(Cat#00-00212, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) और Command Console Software 3.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, US) द्वारा डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ स्कैन किया गया था। MAS5.0 एल्गोरिथ्म द्वारा कच्चे डेटा को सामान्य किया गया और जीन स्प्रिंग सॉफ्टवेयर 11.0 (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएस) में आयात किया गया। बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार के साथ अयुग्मित-परीक्षण विश्लेषण का उपयोग समायोजित पी-मान के साथ विभेदित रूप से व्यक्त जीन प्राप्त करने के लिए किया गया था।<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">
Ago2 बाइंडिंग RNA इम्यूनोप्रेजर्वेशन हेला कोशिकाओं को 10cm डिश में डाला गया और hsa-miR-127-3p या hsa-miR-127-3p उत्परिवर्ती के साथ 100nM की सांद्रता में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को रातोंरात सुसंस्कृत किया गया था। फिर कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस में धोया गया और स्क्रैप किया गया। EZ-Magna RIPRNA- बाइंडिंग प्रोटीन इम्यूनोप्रूवेरेशन किट (कैट। 17-701, मिलिपोर) और RIPAb प्लस Ago2 (कैट। 03-110, मिलिपोर) का उपयोग करके इम्यूनोप्रेजर्वेशन को संसाधित किया गया था। कुल लाइसेट का 10 प्रतिशत इस्तेमाल किया गया था। इनपुट और शेष 90 प्रतिशत कुल लाइसेट का उपयोग इम्यूनोप्रेजर्वेशन के लिए किया गया था। प्राइमस्क्रिप्ट आरटी अभिकर्मक किट (तकरा) के साथ पूरक डीएनए को संश्लेषित करने के लिए प्रत्येक समूह के आरएनए नमूनों का उपयोग किया गया था। JAK1 की अभिव्यक्ति SYBR Premix ExTag किट (Takara) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। hsa-miR-127-3p की अभिव्यक्ति TaqMan MicroRNA परख किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। एबीआई vii7 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर प्रवर्धन किया गया था। प्राइमरी सीक्वेंस टेबल S2 में हैं।
गुर्दे के नमूने
किडनी की बायोप्सी (n=14) शंघाई रेन जी अस्पताल के बायोबैंक से प्राप्त की गई थी। सभी मरीजों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई। अध्ययन को शंघाई रेन जी अस्पताल के रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी एलएन रोगियों (कक्षा IV-V) ने एलएन (11) के लिए अमेरिकन कॉलेज ऑफ रुमेटोलॉजी मानदंड को पूरा किया। सामान्य नियंत्रण समूह (n =11) में नमूने गुर्दे के कैंसर के रोगियों (चरण I-II) के सामान्य पैरा-कार्सिनोमा गुर्दे के ऊतकों से थे, जिनका ऑटोइम्यून रोगों का कोई इतिहास नहीं था। हमारे पिछले पेपर (8) में सभी विषयों पर नैदानिक जानकारी का वर्णन किया गया था।
आंकड़े
डेटा का विश्लेषण किया गया और ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 6.02) के साथ प्लॉट किया गया। दो या दो से अधिक स्वतंत्र समूहों की तुलना के लिए मान-व्हिटनी यू -टेस्ट और विचरण (एनोवा) के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। सहसंबंध अध्ययन के लिए स्पीयरमैन के सहसंबंध परीक्षण का उपयोग किया गया था। 0.05 से कम के P मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
