लिंगोनबेरी (वैक्सीनियम विटिस-आइडिया एल।) पॉलीफेनोल्स के मोटापे से ग्रस्त एडिपोसाइट हाइपरट्रॉफी और संवहनी एंडोथेलियल डिसफंक्शन भाग 1 के आरओएस मॉड्यूलेटिंग प्रभाव

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सार:हाइपरट्रॉफाइड वसा ऊतक के साथ ऑक्सीडेटिव तनाव और विकृत एडिपोसाइटोकाइन स्राव पुरानी सूजन को प्रेरित करता है, जो संवहनी एंडोथेलियल डिसफंक्शन की ओर जाता है। वर्तमान अध्ययन ने 3T 3- L1 एडिपोसाइट्स और मानव गर्भनाल एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) का उपयोग करके वसा ऊतक अतिवृद्धि और एंडोथेलियल डिसफंक्शन को कम करने के लिए लिंगोनबेरी फल से एंथोसायनिन (ACN) और गैर-एंथोसायनिन पॉलीफेनोल (पीपी) अंशों की क्षमता की जांच की। इस अध्ययन से पता चला है कि पीपी अंश ने एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम अभिव्यक्ति (एसओडी 2) को बढ़ाकर और ऑक्सीडेंट एंजाइम अभिव्यक्ति (एनओएक्स 4, आईएनओएस) को रोककर हाइपरट्रॉफाइड एडिपोसाइट्स में इंट्रासेल्युलर आरओएस पीढ़ी को कम कर दिया। इसके अलावा, पीपी और एसीएन अंशों ने एपी 2, एफएएस और डीएजीटी 1 जैसे लिपोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति के डाउन-रेगुलेशन के साथ एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड सामग्री को कम कर दिया। दोनों अंशों के साथ उपचार ने एमआरएनए अभिव्यक्ति और हाइपरट्रॉफाइड एडिपोसाइट्स में प्रमुख एडिपोकिंस के प्रोटीन स्राव को नियंत्रित किया। लेप्टिन और एडिपोनेक्टिन की अभिव्यक्ति और स्राव क्रमशः, डाउन- और अपग्रेडेड थे। इसके अलावा, पीपी और एसीएन अंशों ने प्रो-भड़काऊ जीन (आईएल -6, आईएल -1) और आसंजन अणुओं (वीसीएएम {{) की अभिव्यक्ति को रोककर टीएनएफ - - प्रेरित एचयूवीईसी में भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम किया। 14}}, आईसीएएम-1, SELE)। प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि पॉलीफेनोल से भरपूर लिंगोनबेरी फल का सेवन उनके एंटीऑक्सिडेंट और विरोधी भड़काऊ कार्यों के कारण मोटापे और एंडोथेलियल डिसफंक्शन को रोकने और उनका इलाज करने में मदद कर सकता है।

कीवर्ड:पॉलीफेनोल्स; एंथोसायनिन;lingonberry; एंटीऑक्सीडेंट क्षमता; मोटापा विरोधी; सूजनरोधी;सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क;3T3-एल एडिपोसाइट्स; अतिवृद्धि;एडिपोकिंस; एंडोथेलियल डिसफंक्शन

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1 परिचय

मोटापा हृदय रोग के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक है और वयस्कों और बच्चों दोनों में डिस्लिपिडेमिया, इंसुलिन प्रतिरोध, उच्च रक्तचाप और एथेरोस्क्लेरोसिस के बढ़ते जोखिम के प्रमुख कारणों में से एक है। मोटापे में, हाइपरट्रॉफाइड एडिपोसाइट्स में अत्यधिक वसा जमा होने से सफेद वसा ऊतक (वाट) निष्क्रिय हो जाता है, जो पुरानी सूजन, ऑक्सीडेटिव तनाव और विकृत एडिपोकाइन स्राव की ओर जाता है जो टाइप 2 मधुमेह मेलेटस में योगदान देता है और स्वतंत्र रूप से कोरोनरी एंडोथेलियल डिसफंक्शन से जुड़ा होता है [2] ,3]। हाइपरट्रॉफिक एडिपोसाइट्स सकारात्मक ऊर्जा संतुलन, मधुमेह और कार्डियोमेटाबोलिक रोगों को जोड़ने वाले आवश्यक कारक हैं [2]। वाट एक अंतःस्रावी अंग के रूप में कार्य करता है और स्रावित एडिपोकिंस और साइटोकिन्स के माध्यम से आंत या चमड़े के नीचे के वाट और हृदय के ऊतकों के बीच क्रॉस-टॉक की मध्यस्थता करता है।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा रेडिटलेप्टिन, एडिपोनेक्टिन और रेसिस्टिन, साइटोकिन्स, टीएनएफ-, आईएल -1, आईएल -6, आईएल -8, और एमसीपी -1, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों जैसे एडिपोकाइन्स ( आरओएस और आरएनएस) प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तंत्र [4] के माध्यम से एंडोथेलियल डिसफंक्शन विकास को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, पेरिवास्कुलर वसा ऊतक (पीवीएटी), मुख्य रूप से मोटे व्यक्तियों से, स्थानीय सूजन और एंडोथेलियल फ़ंक्शन हानि को बढ़ावा देता है।

पीवीएटी एडिपोकिंस, आरओएस और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) जैसे वासोएक्टिव यौगिकों का उत्पादन करके संवहनी होमियोस्टेसिस में योगदान देता है। जैव सक्रिय अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को स्रावित करके, PVAT संवहनी चिकनी पेशी कोशिका संकुचन, प्रसार और प्रवासन [4] को प्रभावित करता है।

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

एंडोथेलियल कोशिकाएं जो वास्कुलचर की आंतरिक दीवार को लाइन करती हैं, होमोस्टैटिक कार्यों को नियंत्रित करती हैं, और उनकी शिथिलता एथेरोस्क्लेरोसिस और हृदय रोगों का प्रारंभिक भविष्यवक्ता है [5]। ऑक्सीडेटिव तनाव एंडोथेलियल सेल सक्रियण में योगदान देता है, इसे आसंजन, घुसपैठ और प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के लिए भड़काता है, जिससे वास्कुलचर [5,6] में निम्न-श्रेणी के भड़काऊ फेनोटाइप होते हैं। आरओएस NO [6] के बढ़े हुए क्षरण के माध्यम से एंडोथेलियम-आश्रित संवहनी पुन: शिथिलता को बदल सकता है। एंडोथेलियल डिसफंक्शन को उलटा किया जा सकता है, जो एथेरोस्क्लेरोसिस की प्रगति में देरी या यहां तक ​​कि रोक सकता है और धमनी समारोह में सुधार कर सकता है और कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं की घटनाओं को कम कर सकता है I5]। हाल के नैदानिक ​​अध्ययनों से पता चला है कि मोटापे और इंसुलिन प्रतिरोध को लक्षित करने वाले गैर-औषधीय और औषधीय उपचार एंडोथेलियल फ़ंक्शन को बेहतर बनाते हैं और निम्न-श्रेणी की सूजन को कम करते हैं [7]। इन निष्कर्षों ने मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध और एंडोथेलियल डिसफंक्शन के बीच संबंध दिखाया है; इसलिए, मोटापे में पैथोलॉजिकल एडिपोसाइट फ़ंक्शन को कम करना हृदय रोग की रोकथाम का लक्ष्य होना चाहिए। चिकित्सीय और पोषण संबंधी रणनीतियाँ जो हाइपरट्रॉफाइड वसा ऊतक में ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम करती हैं, हृदय रोग [7] को रोकने के लिए एक प्रमुख लक्ष्य बन सकती हैं।

जामुन पॉलीफेनोल्स के समृद्ध स्रोत हैं, जैसे कि फ्लेवोनोल्स, फेनोलिक एसिड और एंथोसायनिन, और महामारी विज्ञान के अध्ययनों ने मोटापे और हृदय रोग में कमी के साथ बेरी फलों के सेवन में वृद्धि के बीच एक संबंध की सूचना दी है] 8]। बेरी फलों को प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट के रूप में जाना जाता है, और उनकी उच्च एंटीऑक्सीडेंट क्षमता के कारण, उन्हें अक्सर प्राकृतिक कार्यात्मक खाद्य पदार्थ [9] के रूप में जाना जाता है। लिंगोनबेरी को "सुपरफ्रूट" के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो विशेष रूप से विटामिन सी, ए, और ई (टोकोफेरोल) और पॉलीफेनोल्स [10] जैसे एंटीऑक्सिडेंट से भरपूर होते हैं। इन विट्रो और इन विवो अध्ययनों ने लिंगोनबेरी के विभिन्न स्वास्थ्य लाभकारी प्रभावों जैसे कि विरोधी भड़काऊ [11], एंटीऑक्सिडेंट [11], और एंटीप्रोलिफेरेटिव गतिविधियों [8,9] का संकेत दिया है। इसके अलावा, डायबिटिक जानवरों [12] में आहार-प्रेरित मोटापे और निम्न-श्रेणी की सूजन को रोकने के लिए लिंगोनबेरी को दिखाया गया है। हमारे पिछले अध्ययन ने लिंगोनबेरी फल को फ्रीज करने के जलीय अर्क की विरोधी भड़काऊ क्षमता को दिखाया [11]। एक्सट्रैक्ट ने प्रो-इंफ्लेमेटरी (IL-6, MCP-1, और IL-1) और सूजन वाले TNF{{20} में एंटी-इंफ्लेमेटरी (IL-10) जीन एक्सप्रेशन को रेगुलेट किया। } ने 3T को प्रेरित किया 3-L1 एडिपोसाइट्स और सक्रिय रॉ 264.7 मैक्रोफेज में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रिनफ्लेमेटरी मध्यस्थों (TNF-, IL -1, IL -6, MCP {{30) की डाउन-रेगुलेटिंग अभिव्यक्ति द्वारा दबा दिया। }}, आईएनओएस, सीओएक्स-2)। इसके अलावा, लिंगोनबेरी फलों के अर्क से उपचारित सूजन वाले एडिपोसाइट्स में महत्वपूर्ण एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव देखे गए। एंटीऑक्सिडेंट रक्षा एंजाइमों (एसओडी, कैटलस, जीपीएक्स) और बाधित प्रो-ऑक्सीडेंट एंजाइम (एनएडीपीएच ऑक्सीडेज 4) [11] की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय में कमी आई है।

वर्तमान अध्ययन ने इन विट्रो मॉडल में नकल किए गए हाइपरट्रॉफिक मोटापे और एंडोथेलियल डिसफंक्शन को रोकने और इलाज करने के लिए लिंगोनबेरी फल एंथोसायनिन (एसीएन) अंश और गैर-एंथोसायनिन पॉलीफेनोल (पीपी) अंश क्षमता की जांच की। ऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन, और विकृत एडिपोकाइन स्राव में आणविक मार्गों पर एसीएन और पीपी अंशों के प्रभाव का विश्लेषण मोटे हाइपरट्रॉफाइड 3T 3- L1 एडिपोसाइट्स में किया गया था। एंडोथेलियल डिसफंक्शन के खिलाफ सुरक्षात्मक क्षमता का मूल्यांकन टीएनएफ-एक्स-प्रेरित मानव गर्भनाल एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) का उपयोग करके किया गया था।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. एंथोसायनिन और गैर-एंथोसायनिन पॉलीफेनोल अंशों की तैयारी

DANEX कंपनी (PHU"DANEX", Wielen, पोलैंड) से प्राप्त जमे हुए लिंगोनबेरी (Vaccinium Vitis-idea L.) फल को फलों के गूदे के लिए समरूप बनाया गया था, जिसे बाद में -80 डिग्री पर जमे हुए और फ्रीज-सुखाने के अधीन किया गया था। पहले वर्णित प्रक्रिया के अनुसार [11]। फलों के पाउडर को 0.75 प्रतिशत (v/v) एसिटिक एसिड के पानी के घोल में निलंबित कर दिया गया था। ठोस (जी) और एक्सट्रैक्टेंट (एमएल) का अनुपात 1:10 था। 30 के दशक के लिए भंवर मिक्सर में मिलाने के बाद, निलंबन को ध्वनि स्नान (5 मिनट, 20 डिग्री) में रखा गया था। फिर से, निष्कर्षण मिश्रण को भंवर मिक्सर में 30 के लिए उभारा गया और 20 डिग्री पर खड़े रहने के लिए छोड़ दिया गया।

10 मिनट के बाद, नमूना 3600 × g (10 मिनट, 20 डिग्री) पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और प्राप्त सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। दूसरा निष्कर्षण चरण शुरू करने के लिए ताजा निकालने वाले को शेष ठोस पदार्थों में डाला गया था। दूसरे चरण की प्रक्रिया पहले चरण की तरह ही थी। छोटे फलों के अवशेषों को हटाने के लिए दोनों चरणों के अर्क को 12, 000 × g पर संयुक्त और सेंट्रीफ्यूज किया गया।

अंश तैयार करने के अगले चरण में, अर्क से शर्करा और कार्बनिक अम्लों को हटाने का प्रदर्शन किया गया। पृथक्करण को AKTA एक्सप्लोरर 1 0 0 एयर (GE हेल्थकेयर, शिकागो, IL, USA) क्रोमैटोग्राफी सिस्टम के साथ XK 26/20 ग्लास कॉलम (GE हेल्थकेयर, शिकागो, IL, USA) से लैस किया गया था। ) स्तंभ 40 एमएल एम्बरलाइट एक्सएडी -7 एचपी मैक्रोपोरस सोखना राल (ड्यूपॉन्ट, विलमिंगटन, डीई, यूएसए) से भरा था। स्तंभ में संक्रमण से पहले, समाधान (निष्कर्षण चरण में प्राप्त अर्क का 50 मिलीलीटर) को 0.45-उम छिद्र आकार सिरिंज फिल्टर (मिलेक्स-एचवी ड्यूरापुर पीवीडीएफ) ग्लास फाइबर प्रीफिल्टर (मर्क) के साथ झिल्ली का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था। मिलिपोर, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए)। तीन एलुएंट्स लागू किए गए थे: ए -5 प्रतिशत (वी / ओ) फॉर्मिक एसिड, बी-मेथनॉल, और सी -0.1 प्रतिशत (यू / ओ) फॉर्मिक एसिड। फॉर्मिक एसिड के घोल को विआयनीकृत पानी के साथ उचित मात्रा में फॉर्मिक एसिड मिलाकर तैयार किया गया था। एलुएंट प्रवाह दर को 5 एमएल / मिनट पर समायोजित किया गया था। पृथक्करण के दौरान, निम्नलिखित क्रोमैटोग्राफिक कार्यक्रम नियोजित किया गया था: कॉलम संतुलन: 95 प्रतिशत ए, 5 प्रतिशत बी, 3 सीवी (कॉलम वॉल्यूम); नमूना इंजेक्शन -50 निकालने का एमएल; अनबाउंड पदार्थों को धोना -1: 100 प्रतिशत सी, 6 सीवी; अनबाउंड पदार्थों को धोना -2: 100 प्रतिशत ए, 1 सीवी; रेफरेंस: 20 प्रतिशत ए, 80 प्रतिशत बी, 5 सीवी; कॉलम वॉश: 100 प्रतिशत बी, 2.5 सीवी।

रेफरेंस स्टेज का पूरा प्रवाह जिसमें अवशोषण दिखाया गया था (λ {0}}, 320, और 520 एनएम） पर निगरानी एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता (लेबोरोटा 4003 एचबी नियंत्रण, हीडॉल्फ,) का उपयोग करके 30 डिग्री पर सूखने के लिए वाष्पित हो गया था। जर्मनी)। ठोस को 0.75 प्रतिशत (ओ/ओ) एसिटिक एसिड के पानी के घोल में घोल दिया गया था। घोल को कांच की शीशियों में स्थानांतरित कर दिया गया था और -85 डिग्री पर जमे हुए थे, और फिर फ्रीज ड्रायर बीटा में रखा गया था {{8 }}(मार्टिन क्राइस्ट, जर्मनी)। फ्रीज-सुखाने 48 घंटे के लिए किया गया था। वास्तविक सुखाने 10 पा के दबाव में 40 घंटे (20 घंटे -15 डिग्री और 20 घंटे के शेल्फ तापमान पर हुआ था। 15 डिग्री)। अंतिम सुखाने को दबाव नियंत्रण के बिना 8 घंटे के लिए 22 डिग्री के तापमान पर किया गया था। ठोस तैयारी को नाइट्रोजन वातावरण के तहत -85 C पर भली भांति बंद करके सील शीशियों में संग्रहित किया गया था।

शीशी की ठोस सामग्री को 5 प्रतिशत (ओ/ओ) फॉर्मिक एसिड के पानी के घोल में घोल दिया गया और एक 0.45-माइक्रोन छिद्र आकार के फिल्टर 'मर्क मिलिपोर' का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया। नमूनों में अन्य पॉलीफेनोल यौगिकों से एंथोसायनिन का पृथक्करण एक AKTA एक्सप्लोरर 100 एयर क्रोमैटोग्राफ का उपयोग करके किया गया था, जो एक UV / VIS डिटेक्टर और एक Agilent Zorbax SB C18 कॉलम (250 × 21.2 मिमी) से सुसज्जित है। अलगाव 20 डिग्री पर किया गया था। तरल चरण की प्रवाह दर 21 एमएल/मिनट थी । दो एलुएंट्स लागू किए गए: ए -5 प्रतिशत (v/v) पानी में फार्मिक एसिड और बी-मेथनॉल। स्तंभ संतुलन (95 प्रतिशत ए, 5 प्रतिशत बी, 3 सीवी) और 2 एमएल की मात्रा में नमूना इंजेक्शन के बाद, पृथक्करण एक जटिल ढाल में किया गया था। ग्रेडिएंट प्रोग्राम इस प्रकार था: 5 प्रतिशत बी-0.5 सीवी;20 प्रतिशत बी-2 सीवी;20 प्रतिशत बी-1.2 सीवी;30 प्रतिशत बी-3। 5 सीवी;30 प्रतिशत बी-1.2सीवी;45 प्रतिशत बी-3.5 सीवी;45 प्रतिशत बी-1.2सीवी;100 प्रतिशत बी-2.5 सीवी;100 प्रतिशत बी -2.5 सीवी। =520 एनएम पर अवशोषण के साथ प्रवाह को एंथोसायनिन ACN） अंश के रूप में एकत्र और निरूपित किया गया था। =320 एनएम पर अवशोषण दिखाने वाले बहिर्वाह को भी इकट्ठा किया गया और गैर-एंथोसायनिन पॉलीफेनोल अंश (पीपी) के रूप में दर्शाया गया। दोनों अंशों को वाष्पित किया गया, एसिटिक एसिड के पानी के घोल में घोलकर, फ्रीज में सुखाया गया, और ऊपर वर्णित अनुसार संग्रहीत किया गया। ACN और PP अंशों को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच (मर्क ग्रुप, पॉज़्नान, पोलैंड) से खरीदे गए थे।

2.2. एसीएन और पीपी अंशों में पॉलीफेनॉल पहचान और मात्रा का ठहराव

एसीएन और पीपी अंशों की पॉलीफेनॉल संरचना का विश्लेषण एचपीएलसी-डीएडी-ईएसआई-एमएस विधि द्वारा एक एगिलेंट 1200 श्रृंखला एचपीएलसी सिस्टम (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, इंक, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) पर किया गया था, जो G1315D फोटोडायोड सरणी डिटेक्टर से लैस है और ऑनलाइन युग्मित है। एगिलेंट 6224 टाइम-ऑफ-फ्लाइट एमएस सिस्टम के साथ। क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण 150 × 2.1 मिमी, 3- माइक्रोन C18 कॉलम (उन्नत क्रोमैटोग्राफी टेक्नोलॉजीज, एबरडीन, स्कॉटलैंड) पर किए गए थे। पहले प्रकाशित एक अध्ययन में पृथक्करण की स्थिति (मोबाइल चरण, ग्रेडिएंट रेफरेंस प्रोग्राम, प्रवाह दर, नमूना इंजेक्शन मात्रा) का विवरण दिया गया है [11]।

एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम को क्रमशः 280,325,355 और 520 एनएम पर दर्ज किया गया था, जो क्रमशः फ्लेवन -3- ओएलएस, हाइड्रोक्सीसिनैमिक एसिड डेरिवेटिव, फ्लेवोनोल्स और एंथोसायनिन का पता लगाने के लिए अनुशंसित था।

एसीएन और पीपी अंशों में पॉलीफेनोल यौगिकों को साइनाइडिन के समकक्ष के रूप में निर्धारित किया गया था -3-ओ-ग्लूकोसाइड (एंथोसायनिन), कैटेचिन ((एपीआई) कैटेचिन और प्रोजेनिडिन), 4-हाइड्रॉक्सीबेन्जोइक एसिड (हाइड्रॉक्सीबेन्जोइक एसिड डेरिवेटिव), फेरुलिक एसिड (फेरुलिक एसिड व्युत्पन्न), क्लोरोजेनिक एसिड (3- O-caffeoylquinic एसिड), p-कौमरिक एसिड (कौमरिक एसिड व्युत्पन्न), ट्राइहाइड्रॉक्सी बेंजोइक एसिड-गैलिक एसिड (बेंजोइक एसिड और अर्बुटिन डेरिवेटिव), और क्वेरसेटिन (क्वेरसेटिन ग्लाइकोसाइड) . सभी नमूनों को एसीएन और पीपी अंशों के स्वतंत्र रूप से तैयार समाधानों से तीन प्रतियों में इंजेक्ट किया गया था।

डीएडी डिटेक्टर से गुजरने के बाद, कॉलम एलुएट को सकारात्मक आयन और नकारात्मक आयन मोड में संचालित इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत से सुसज्जित एमएस सिस्टम के लिए निर्देशित किया गया था। एक पहले प्रकाशित लेख एसीएन और पीपी अंशों [11] में फेनोलिक यौगिकों की पहचान के लिए नियोजित ईएसआई-एमएस पैरामीटर प्रस्तुत करता है। MassHunter B.04.00 सॉफ्टवेयर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, इंक।, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) के साथ साधन नियंत्रण, डेटा संग्रह और विश्लेषण हासिल किया गया था। सिग्मा-एल्ड्रिच ने एचपीएलसी/डीएडी/एमएस विश्लेषण के लिए फेनोलिक मानकों और अन्य अभिकर्मकों की आपूर्ति की।

2.3. 3T3-L1 एडिपोसाइट संस्कृति और उपचार

माउस पेरीडिपोसाइट 3T3-L1 कोशिकाओं को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, CL-173) से प्राप्त किया गया था। कोशिकाओं को 5% CO के तहत 37 डिग्री पर सुसंस्कृत किया गया था, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) में वातावरण 1 0 प्रतिशत (o/o) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ। (गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक पोल्स्का, वारसॉ, पोलैंड) अनुपूरण। 3टी3-एल1 पेरीडिपोसाइट्स पहले वर्णित प्रोटोकॉल के बाद भेदभाव प्रक्रिया के अधीन थे [11]। पेरीडिपोसाइट्स को 2.5 × 1 0 4 कोशिकाओं/सेमी² के घनत्व पर 12- अच्छी तरह से प्लेटों में डाला गया और संगम तक पहुंचने तक सुसंस्कृत किया गया। फिर उन्हें 2 दिनों के लिए एक विभेदन मिश्रण द्वारा उत्तेजित किया गया जिसमें 0.25 μM डेक्सामेथासोन (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड), 0.5 मिमी 3-आइसोबुटिल -1-मिथाइलक्सैन्थिन सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड） शामिल थे। और डीएमईएम में 10 प्रतिशत एफबीएस के साथ इंसुलिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) का 1 माइक्रोन। माध्यम को 10 प्रतिशत FBS और 1 μM इंसुलिन के साथ पूरक DMEM से बदल दिया गया था। 2 दिनों के बाद, संस्कृति माध्यम को DMEM के साथ 10 प्रतिशत FBS जोड़ के साथ बदल दिया गया और 2-दिन के अंतराल पर ताज़ा किया गया जब तक कि दिन 12.3T पर विश्लेषण नहीं किया गया 3- L1 एडिपोसाइट्स को 24 घंटे के लिए ACN और PP अंशों के साथ इलाज किया गया। 5, 10, और 20 ug/mL की सांद्रता।

2.4.एचयूवीईसी संस्कृति और उपचार

मानव गर्भनाल एंडोथेलियल कोशिकाएं (HUVECs) ATCC (CRL {0}}) से प्राप्त की गईं। एचयूवीईसी की खेती एफ-12केमीडियम (एटीसीसी)में 10 प्रतिशत एफबीएस (गिब्को), गोजातीय तंत्रिका ऊतक (30 यूजी/एमएल) (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) और हेपरिन ( 100ug/mL) (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड)। HUVECs को 6 × 103 कोशिकाओं/सेमी² के घनत्व पर 24- पर अच्छी तरह से प्लेटों पर रखा गया था जो चूहे की पूंछ वाले कोलेजन समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) के साथ लेपित थे। फिर 24-एचयूवीईसी की एच संस्कृतियों को 3 घंटे के लिए एसीएन और पीपी अंशों के लिए 0.1,1, और 10 कुरूप/एमएल की सांद्रता में उजागर किया गया और बाद में टीएनएफ- (10एनजी/एमएल)(सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान के साथ इलाज किया गया। , पोलैंड) एक अतिरिक्त 3 घंटे के लिए सूजन को प्रेरित करने के लिए।

2.5. सेल व्यवहार्यता परख

हाइपरट्रॉफाइड 3T3-L1 एडिपोसाइट्स और TNF- -प्रेरित HUVECs की व्यवहार्यता, गैर-इलाज और ACN और PP अंशों के साथ इलाज किया गया, MTT (3-(4,{{7) को लागू करने का विश्लेषण किया गया। }}डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-25-डिपेनहिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड) परख (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) पहले वर्णित प्रक्रिया के बाद [13]। सेल उपचार के लिए लागू एसीएन और पीपी अंशों की कम सांद्रता ने एमटीटी परीक्षण में माध्यम के रंग और अवशोषण पढ़ने को प्रभावित नहीं किया।

2.6. इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन का निर्धारण

3T3-L1 एडिपोसाइट्स में ROS पीढ़ी को पहले वर्णित प्रक्रिया के आधार पर नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम (NBT) परख का उपयोग करके मापा गया था [14]। 90- मिनट ऊष्मायन के बाद 0 .2 प्रतिशत एनबीटी (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) समाधान, कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा से धोया गया और मेथनॉल के साथ तय किया गया। KOH और DMSO का उपयोग करके फॉर्मेज़न के निष्कर्षण के बाद, अवशोषण को 620 nm（Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland में पढ़ा गया)।

2.7. इंट्रासेल्युलर लिपिड सामग्री का मापन

हाइपरट्रॉफाइड एडिपोसाइट्स में लिपिड सामग्री पर पीपी और एसीएन अंशों का प्रभाव ऑयल रेड ओ (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) द्वारा निर्धारित किया गया था, जो पहले वर्णित [13] धुंधला विधि और एडिपोजेनेसिस परख किट का उपयोग करके कुल ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) माप द्वारा निर्धारित किया गया था। सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड)निर्माता के निर्देशों के अनुसार। इंट्रासेल्युलर टीजी सामग्री एक एंजाइम परख द्वारा निर्धारित की गई थी। TG के अनुरूप एक वर्णमिति उत्पाद 570nm पर मापा गया था। टीजी एकाग्रता की गणना टीजी मानक के लिए प्लॉट किए गए वक्र के आधार पर की गई थी।

2.8.आरएनए निष्कर्षण और रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण

3T3-L1 एडिपोसाइट्स और HUVECs को कुल RNA अलगाव के लिए TRI-अभिकर्मक (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) से उपचारित किया गया। निर्माता के निर्देश के आधार पर एक ट्रांसक्रिप्टर फर्स्ट स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (रोच डायग्नोस्टिक्स, पोलैंड) का उपयोग करके कुल आरएनए के 1 कुरूप के साथ प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किया गया था। वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली (स्मार्टसाइक्लर डीएक्स रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम सेफिड, सनीवेल, सीए, यूएसए）.पीसीआर मिश्रण का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव 25 μL की अंतिम मात्रा में एक सीडीएनए नमूना （1 μL）, विशिष्ट आगे और शामिल था। रिवर्स प्राइमर्स（5 μM/1 μL）, और SYBR⑧ सेलेक्ट मास्टर मिक्स （12.5 μL-लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए）। प्राइमर सीक्वेंस को टेबल S1 में दिखाया गया है। पीसीआर साइकलिंग स्थितियों में 94 डिग्री पर प्रारंभिक विकृतीकरण शामिल है। 10 मिनट, उसके बाद 40 पीसीआर चक्र: 40 से 95 डिग्री, 30 से 59 डिग्री सेल्सियस, और 30 एस पर 72 डिग्री। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-△ACT विधि का उपयोग करके की गई थी। प्रतिलेख स्तर को -एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था HUVECs के लिए 3T3-L1 एडिपोसाइट्स और GAPDH के लिए। सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति को नियंत्रण (अनुपचारित) कोशिकाओं की तुलना में गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया गया था। सभी प्रतिक्रियाओं को तीन प्रतियों में किया गया था।

2.9. एडिपोकाइन उत्पादन का निर्धारण

लेप्टिन और एडिपोनेक्टिन सांद्रता को निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एलिसा किट (सिग्मा-एल्ड्रिच, पॉज़्नान, पोलैंड) से मापा गया। मानकों के अंशांकन का उपयोग करके मात्रा का प्रदर्शन किया गया था। प्रत्येक मानक और नमूने की तीन प्रतियों में परख की गई। परिवर्तनशीलता के अंतर-परख और अंतर-परख गुणांक की गणना क्रमशः 12.5 प्रतिशत और लेप्टिन के लिए 9.3 प्रतिशत और एडिपोनेक्टिन के लिए 11.2 प्रतिशत और 7.9 प्रतिशत की गई।

2.10.सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय विश्लेषण STATISTICA संस्करण 13.3 सॉफ्टवेयर (स्टेट-सॉफ्ट, इंक।, तुलसा, ओके, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। कई समूहों के माध्य मानों के बीच अंतर का अनुमान लगाने के लिए विचरण (ANOVA) और तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट का एक-तरफ़ा विश्लेषण लागू किया गया था। लेवेन के परीक्षण ने प्रसरण धारणा की समानता को सत्यापित किया। सांख्यिकीय महत्व p . पर निर्धारित किया गया था<>

3) परिणाम और चर्चा

3.1. लिंगोनबेरी एसीएन और पीपी अंशों में पॉलीफेनॉल संरचना

अध्ययन ने लिंगोनबेरी फल से अलग किए गए दो पॉलीफेनोलिक तैयारियों पर ध्यान केंद्रित किया: एंथोसायनिन एसीएन अंश और गैर-एंथोसायनिन पीपी अंश। एचपीएलसी-डीएडी-ईएसआई-एमएस विश्लेषण के आधार पर निर्धारित एसीएन और पीपी अंशों में पॉलीफेनोल प्रोफाइल तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। एसीएन अंश में तीन मुख्य एंथोसायनिन यौगिक शामिल हैं, जो लिंगोनबेरी फलों के अर्क [11] में निहित हैं, जो साइनाइडिन-आधारित डेरिवेटिव हैं, 3-ओ-गैलेक्टोसाइड (82.5 प्रतिशत),3-ओ-अरबिनोसाइड (13.0 प्रतिशत), और 3-ओ-ग्लूकोसाइड (4.5 प्रतिशत) (तालिका 1ए) सहित .

तालिका 1. एंथोसायनिन (एसीएन) अंश (ए) और गैर-एंथोसायनिन पॉलीफेनोल (पीपी) अंश (बी) में पहचाने गए यौगिकों को लिंगोनबेरी फल से प्राप्त किया गया था।

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 प्रतिशत ): ए- और बी-टाइप प्रोसायनिडिन्स, कैटेचिन, 3-ओ-कैफॉयलक्विनिक एसिड, फेरुलिक एसिड-हेक्सोसाइड, क्वेरसेटिन और इसके डेरिवेटिव (3-ओ-गैलेक्टोसाइड,3-ओ- अरेबिनोफ्यूरानोसाइड,3-ओ-रमनोसाइड)। तालिका 1बी लिंगोनबेरी फल के पीपी अंश में अस्थायी रूप से पहचाने गए सभी पॉलीफेनोलिक यौगिकों के बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय डेटा दिखाती है।

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