भाग 1: गेरानियोल एंटीऑक्सिडेंट स्थिति, सूजन, और एपोप्टोसिस के परिवर्तन के माध्यम से डॉक्सोरूबिसिन-मध्यस्थ गुर्दे की चोट को ठीक करता है: एनएफ-केबी और एनआरएफ 2 / एचओ की संभावित भूमिकाएं -1

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सार: डॉक्सोरूबिसिन-मध्यस्थतागुर्दे की दुर्बलताकैंसर के इलाज में एक गंभीर समस्या है। तदनुसार, इस काम ने डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित को संशोधित करने के लिए गेरानियोल की क्षमता की जांच कीगुर्दे खराबचूहे के मॉडल का उपयोग करना। चूहों को बेतरतीब ढंग से चार समूहों को सौंपा गया था: नियंत्रण, डॉक्सोरूबिसिन (20 मिलीग्राम / किग्रा, इंट्रापेरिटोनियल, आईपी), डॉक्सोरूबिसिन प्लस 100 मिलीग्राम / किग्रा गेरानियोल, और डॉक्सोरूबिसिन प्लस 200 मिलीग्राम / किग्रा गेरानियोल। एक एकल डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन ने गुर्दे की दुर्बलता को ट्रिगर किया, जैसा कि परिवर्तित सीरम क्रिएटिनिन, रक्त यूरिया नाइट्रोजन और एल्ब्यूमिन मूल्यों द्वारा दर्शाया गया है; इसने गुर्दे की वास्तुकला में ऊतकीय परिवर्तन भी किए। इसके अतिरिक्त, डॉक्सोरूबिसिन ने ग्लूटाथियोन, उत्प्रेरित गतिविधि और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज की अभिव्यक्ति को कम करते हुए लिपिड पेरोक्सीडेशन को बढ़ाया। दिलचस्प बात यह है कि गेरानियोल के साथ पूर्व-उपचार ने गुर्दे के एंटीऑक्सिडेंट मापदंडों, एंजाइमी गतिविधि और भड़काऊ और एपोप्टोसिस-मध्यस्थता जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित परिवर्तनों को बचाया। इसके अलावा, geraniol के साथ रोगनिरोधी उपचार ने खुराक पर निर्भर तरीके से अधिकांश किडनी हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को संरक्षित किया। ये निष्कर्ष इस बात का समर्थन करते हैं कि गेरानियोल डॉक्सोरूबिसिन-मध्यस्थता से रक्षा कर सकता हैगुर्दा रोग. हालांकि, डॉक्सोरूबिसिन-मध्यस्थता गुर्दे की शिथिलता के खिलाफ गेरानियोल के सुरक्षात्मक प्रभावों के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है।

कीवर्ड: डॉक्सोरूबिसिन; सूजन और जलन; ऑक्सीडेटिव तनाव; एपोप्टोसिस; गुर्दे की चोट; गेरानियोल

1 परिचय

इसकी खोज के बाद से, एन्थ्रासाइक्लिन एंटी-कैंसर दवा डॉक्सोरूबिसिन (डॉक्स) का व्यापक रूप से ठोस ट्यूमर और हेमटोलॉजिकल विकृतियों के खिलाफ उपयोग किया गया है। इसके सबसे आम दुष्प्रभावों में नेफ्रोटॉक्सिसिटी है, जिसे कम निस्पंदन, पुन: अवशोषण और उत्सर्जन के साथ गुर्दे की शिथिलता के रूप में वर्णित किया गया है, जो रुग्णता और मृत्यु दर के एक महत्वपूर्ण जोखिम से जुड़ा है। केमोथेरेपी प्राप्त करने वाले लगभग 60 प्रतिशत कैंसर रोगी नेफ्रोटॉक्सिसिटी विकसित करते हैं, जिससे डॉक्स की चिकित्सीय प्रभावशीलता सीमित हो जाती है [5,6]। जबकि मौलिक प्रक्रियाएं जो डॉक्स-मध्यस्थता नेफ्रोटॉक्सिसिटी का कारण बनती हैं, अज्ञात रहती हैं, साहित्य से पता चलता है कि संभावित योगदानकर्ताओं में शामिल हैंऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन और जलन, तथाapoptosis. विशेष रूप से, साक्ष्य इंगित करता है कि Dox-संबद्ध को कम करनाऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन और जलन, और एपोप्टोटिक घटनाएं दवा के गुर्दे की विषाक्तता को कम करने में मदद कर सकती हैं।

न्यूक्लियर फैक्टर (एरिथ्रोइड-व्युत्पन्न 2) -लाइक 2 (Nrf2) एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और साइटोप्रोटेक्टिव क्षमताओं के साथ एक रेडॉक्स-सेंसिटिव ट्रांसक्रिप्शनल फैक्टर है जो सेलुलर डिफेंस सिस्टम को बनाए रखता है। ऑक्सीडेटिव तनाव पर, Nrf2 अपने साइटोप्लाज्मिक अवरोधक प्रोटीन को छोड़ता है, जो नाभिक में प्रवेश करता है और एंटीऑक्सिडेंट रक्षा में शामिल कई जीनों को सक्रिय करता है, जैसे कि हीम ऑक्सीजनेज -1 (हो -1), ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (GPx), उत्प्रेरित ( कैट), और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) [14-19]। डॉक्स के साथ उपचार से एनआरएफएक्सएनएक्स के एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों को कम करने के लिए दिखाया गया है और इसलिए, डाउनस्ट्रीम एंटीऑक्सीडेंट जीन और प्रोटीन, जिससे गुर्दे की विषाक्तता हो जाती है।

परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) एक ट्रांसक्रिप्शनल कारक है जो कई सूजन जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है; एनएफ-केबी मार्ग के केंद्रीय आंकड़े के रूप में, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा सक्रिय होता है, यह एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और परिणामी ऊतक चोट [8,22,23] को ट्रिगर कर सकता है। कई अध्ययनों ने डॉक्स को सूजन पैदा करने और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स जैसे इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरल्यूकिन -1 बीटा (एल -1) के उत्पादन में वृद्धि करने की सूचना दी है। और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNF-) [11,13]। इसके अलावा, डॉक्स-मध्यस्थता वाले गुर्दे की क्षति के बाद बढ़े हुए आरओएस उत्पादन को माइटोकॉन्ड्रियल अस्थिरता के माध्यम से आंतरिक एपोप्टोटिक मार्ग को सक्रिय करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। इस मार्ग के प्रमुख निर्धारक माइटोकॉन्ड्रियल-जुड़े प्रोटीन बैक्स और बीसीएल हैं -2; Bcl -2 से Bax का संतुलित अनुपात एपोप्टोसिस को रोकता है, जबकि असंतुलन से झिल्ली पारगम्यता में वृद्धि होती है और साइटोसोल में साइटोक्रोम c का रिसाव होता है, जो कस्पासे को सक्रिय करता है-9(Casp-9) और caspase{ {21}} (कैस्प-3)। इस तरह की सक्रियता आम तौर पर डीएनए विखंडन और कोशिका मृत्यु की ओर ले जाती है।

कीमोथेरेपी दवाओं के नैदानिक ​​उपयोग को अधिकतम करने के साथ-साथ उनके नकारात्मक प्रभावों को कम करना भी बहुत रुचिकर है। तदनुसार, इसके प्रतिकूल प्रभावों को कम करने के लिए डॉक्स के संयोजन में विभिन्न एजेंटों के उपयोग की जांच के लिए अनुसंधान प्रयास किए गए हैं [13,30,31]। हर्बल अर्क और उनके बायोएक्टिव अवयवों को लंबे समय से दवा-मध्यस्थता विषाक्तता को कम करने की उनकी क्षमता के लिए मान्यता दी गई है। गेरानियोल एसाइक्लिक मोनोटेरपीन अल्कोहल है जो लगभग सभी आवश्यक तेलों में पाया जाता है, जैसे कि अदरक, गुलाब, नारंगी, लैवेंडर और नींबू [32,33]। कई अध्ययनों में बताया गया है कि गेरानियोल में विभिन्न लाभकारी गुण होते हैं, जैसे कि अल्सर-रोधी, कैंसर-रोधी [35], अवसाद-रोधी [36], सूजन-रोधी [33], और, इसके अलावा, यह मधुमेह अपवृक्कता को कम कर सकता है [37] .

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वर्तमान में डॉक्स-मध्यस्थता नेफ्रोटॉक्सिसिटी के खिलाफ गेरानियोल के निवारक प्रभावों के बारे में कोई विशेष जानकारी नहीं है। इसलिए, हमने Wistar चूहों के गुर्दे में NF-kB और Nrf2/Ho -1 सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से Dox के कारण होने वाली चोट पर geraniol की कार्रवाई के प्रभावों और संभावित तंत्र का अध्ययन किया।

2. सामग्री और तरीके

2.1.पशु

नर विस्टार चूहों को सऊदी अरब के रियाद में किंग सऊद विश्वविद्यालय (केएसयू) पशु देखभाल केंद्र से खरीदा गया था। जानवरों को नियंत्रित परिस्थितियों में रखा गया था, जैसे कि उन्हें कमरे के तापमान (25 ± 1 डिग्री) पर 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ रखा गया था और पानी के लिए अप्रतिबंधित पहुंच और केएसयू स्थानीय संस्थागत अध्ययन आचार समिति द्वारा अधिकृत एक मानक आहार था। (आरईसी) प्राधिकरण संख्या केएसयू-एसई-19-122 के तहत।

2.2. प्रयोगात्मक परिरूप

इस जांच ने कुल 32 नर विस्टार चूहों की जांच की, जिनका वजन 190-210 ग्राम था, जिन्हें चार समूहों में आवंटित किया गया था। अध्ययन से पहले चूहों को पर्यावरण के अनुकूल होने के लिए एक सप्ताह का समय दिया गया था। वाहन समूह, जिसे नियंत्रण समूह के रूप में भी जाना जाता है, में चूहे शामिल थे जिन्हें सामान्य खारा का मौखिक रूप दिया गया था। समूह II में दिन 17 [11] पर डॉक्स (20 मिलीग्राम / किग्रा आईपी एकल खुराक) दिए गए चूहे शामिल थे। समूह I और IV चूहों को 18 दिनों के लिए क्रमशः 100 और 200 मिलीग्राम / किग्रा पर गेरानियोल (मौखिक रूप से) की रोगनिरोधी खुराक दी गई थी, और 17 वें दिन, इसी तरह, डॉक्स (20 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के अधीन थे। 18 वें दिन, चूहों को एक नियंत्रित वातावरण में केटामाइन / xylazine संयोजन का उपयोग करके इच्छामृत्यु दी गई। रक्त एकत्र किया गया और सीरम अलग किया गया, और दोनों गुर्दे हटा दिए गए और तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रोजन हो गए। जमे हुए ऊतकों पर जैव रासायनिक, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति परख की गई। हिस्टोलॉजिकल जांच के लिए, गुर्दे के ऊतकों के नमूनों को पीबीएस में धोया गया और फिर 4 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड घोल में संरक्षित किया गया। जांच के दौरान प्रायोगिक पशु में संकट या मृत्यु का कोई संकेत नहीं मिला।

2.3. गुर्दा समारोह मार्करों का निर्धारण

बलिदान के समय एकत्र किए गए रक्त से सीरम को अलग करने के लिए, रक्त के नमूनों को 10 मिनट के लिए 2000 × g पर प्री-कूल्ड सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्राप्त सीरम का विश्लेषण एल्ब्यूमिन, रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन), और क्रिएटिनिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। के मानगुर्दा कार्यमार्करों की गणना सीमेंस ऑटोएनालिज़र डायमेंशन RXL MAXTM, सीमेंस, वाशिंगटन, डीसी, यूएसए का उपयोग करके की गई थी।

2.4. लिपिड पेरोक्सीडेशन का मूल्यांकन

लिपिड पेरोक्सीडेशन का मूल्यांकन गुर्दे के ऊतकों में किया गया था जैसा कि पहले ओहकावा एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। , मामूली संशोधनों के साथ।

2.5. कम ग्लूटाथियोन की मात्रा का ठहराव

वृक्क पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सतह पर तैरनेवाला (पीएमएस) में कम ग्लूटाथियोन (जीएसएच) के स्तर को मामूली संशोधनों के साथ सेडलाक और लिंडसे द्वारा वर्णित विधि के अनुसार मापा गया था।

2.6. Catalase की गतिविधि की मात्रा का ठहराव

गुर्दे पीएमएस में कैट की गतिविधि को क्लेबोर्न द्वारा वर्णित विधि के अनुसार मामूली संशोधन के साथ निर्धारित किया गया था।

2.7. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (RT-qPCR)

TRIzolTMreagent (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार गुर्दे के ऊतकों से कुल आरएनए निकालने के लिए किया गया था। निकाले गए RNA नमूनों की शुद्धता और मात्रा को NanoDropTM 8000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो साइंटिफिक, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। पृथक आरएनए को तब सीडीएनए सिंथेसिस सुपरमिक्स (बिमाके, ह्यूस्टन, TX, यूएसए) का उपयोग करके सीडीएनए में उलट दिया गया था, और एप्लाइड बायोसिस्टम्स 7500 फास्ट रियल पर SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स (Bimake, ह्यूस्टन, TX, यूएसए) के साथ जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की गई थी। टाइम पीसीआर सिस्टम। AACt दृष्टिकोण का उपयोग तब समूहों के बीच विभिन्न जीनों की सापेक्ष अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें GAPDH को हाउसकीपिंग जीन के रूप में नियोजित किया गया था। तालिका 1 इस अध्ययन (आईडीटी, ल्यूवेन, बेल्जियम) में उपयोग किए गए प्राइमरी अनुक्रमों को सूचीबद्ध करती है।

2.8. इम्युनोब्लॉट विश्लेषण

अलसमारी एट अल द्वारा वर्णित के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था । [41]. संक्षेप में, पृथक प्रोटीन (30-50 कुरूप) को एसडीएस-पेज जैल पर वैद्युतकणसंचलन किया गया और फिर पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया। 60 मिनट के लिए 5 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध के साथ अवरुद्ध होने के बाद, चयनात्मक प्राथमिक एंटीबॉडी (हो -1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, cleaved-caspase {{ के खिलाफ) के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर धब्बों की जांच की गई। 14}}, बीसीएल-2, बैक्स, और जीएपीडीएच, कमजोर पड़ने 1:1000)। झिल्ली को बाद में धोया गया, फिर उपयुक्त एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने: 1: 5000) के साथ कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। झिल्ली पर प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए ईसीएल अभिकर्मक किट और जेल इमेजिंग उपकरण (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग किया गया था।

2.9.हिस्टोपैथोलॉजी अध्ययन

गुर्दे के ऊतकों को 4 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड में पोस्ट-फिक्स्ड किया गया, फिर पैराफिन सेक्शनिंग और धुंधला होने के लिए संसाधित किया गया। पैराफिन वर्गों को 3 माइक्रोन की मोटाई में काटने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग किया गया था। कटे हुए वर्गों को तब मोम को हटाने के लिए इलाज किया गया था, और हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए हेमटॉक्सिलिन प्लस ईओसिन (एच एंड ई) डाई का उपयोग करके दाग दिया गया था। एक ओलिंप बीएक्स माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित DP72 कैमरे का उपयोग करके किडनी हिस्टोलॉजी छवियों का अधिग्रहण किया गया था।

2.10.डेटा विश्लेषण

डेटा का विश्लेषण कंप्यूटर आधारित प्रोग्राम ग्राफ पैड प्रिज्म 5 (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के साथ किया गया था, और परिणाम माध्य और मानक विचलन (मतलब ± एसडी) के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। बीच-बीच में अंतर का मूल्यांकन एकतरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया, जिसके बाद तुकी की तुलना परीक्षण, 0.05 से कम के पी-मूल्य के साथ सांख्यिकीय महत्व (पी) का संकेत दिया गया।<>