सिस्टैंच डेजर्टिकोला के फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स: न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का तंत्र

माईकान ली, एट अल

सार:परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (Nrf2) ऑक्सीडेटिव तनाव और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के खिलाफ एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है।फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स(पीएचजी; सालिड्रोसाइड,एक्टोसाइड, आइसोएक्टोसाइड, औरइचिनाकोसाइड) एंटीऑक्सीडेंट प्रदर्शित करते हैं औरनयूरोप्रोटेक्टिवजैव क्रियाएँ। की जांच के लिए यह अध्ययन किया गया थानयूरोप्रोटेक्टिवप्रभाव और आणविक तंत्रपीएचजी. पीएचजीप्रीट्रीटमेंट ने Nrf2 के न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन को ट्रिगर करके और हीम ऑक्सीजनेज़ 1 (HO -1), NAD (P) H क्विनोन ऑक्सीडोरक्टेज़ 1 (NQO1) के डाउनग्रेड किए गए प्रोटीन एक्सप्रेशन को उलटकर PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को काफी हद तक दबा दिया। ), ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज-उत्प्रेरक सबयूनिट (जीसीएलसी), और ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज संशोधक सबयूनिट (जीसीएलएम)। Nrf2 siRNA या HO -1 अवरोधक जिंक प्रोटोपोर्फिरिन (ZnPP) ने कम कियानयूरोप्रोटेक्टिवप्रभाव। PhGs ने Kelch- जैसे ECH- एसोसिएशन प्रोटीन 1 (Keap1) में Nrf2 बाइंडिंग साइट के साथ संभावित इंटरैक्शन दिखाया। यह परिणाम इस परिकल्पना का समर्थन कर सकता है कि PhGs Nrf2 के सक्रियकर्ता हैं। हमने PhGs और Keapl- सक्रिय Nrf2 / ARE पाथवे के बीच संभावित बंधन का प्रदर्शन किया, और अधिक ग्लाइकोसाइड वाले PhG ने प्रभाव बढ़ाया था।

कीवर्ड:कीप1; एनआरएफ2;नयूरोप्रोटेक्टिव; पीसी12 कोशिकाएं;पीएचजी(NQO1), दूसरों के बीच [5-7]। यह प्रक्रिया कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है और न्यूरोप्रोटेक्शन [8] के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभर रही है। गैया ने बताया कि Nrf2 सेल-स्वायत्त और समय-निर्भर तरीके से न्यूरोनल प्रोटीन होमियोस्टेसिस को संभावित रूप से बढ़ावा देकर LRRK 2- और एक-सिन्यूक्लिन-प्रेरित न्यूरोडीजेनेरेशन को कम करता है [9]।

फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (पीएचजी) क्रमशः एस्टर और ग्लाइकोसिडिक लिंकेज के माध्यम से एपी-ग्लूकोपाइरानोज से जुड़े सिनामिक एसिड और हाइड्रॉक्सिल फिनाइल एथिल मोएट्स की विशेषता है। ये अणु पानी में घुलनशील प्राकृतिक उत्पादों के एक समूह के सदस्य हैं जो व्यापक रूप से पादप साम्राज्य [10] में वितरित किए जाते हैं। इन विट्रो और इन विवो अध्ययनों से पता चला है कि इन यौगिकों में एंटीऑक्सीडेंट [11] होता है,नयूरोप्रोटेक्टिव[12], जीवाणुरोधी,

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1 परिचय

ऑक्सीडेटिव तनाव, जो एंटीऑक्सिडेंट होमियोस्टेसिस का असंतुलन है, लिपिड पेरोक्सीडेशन, प्रोटीन और डीएनए की चोट, कोशिका उम्र बढ़ने और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। यह प्रक्रिया कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान करती है, जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), और इस्किमिया / रीपरफ्यूजन [1]। हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2), जो मुख्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में से एक है, लिपिड पेरोक्सीडेशन और डीएनए क्षति का कारण बनता है [2]। इसके अलावा, H2O2 हाइड्रॉक्सिल मुक्त कणों का एक अंतर्जात स्रोत है जो सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव [3,4] की पृष्ठभूमि के स्तर में योगदान देता है। इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस को रोकने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार की क्षमता हो सकती है।

परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (Nrf2), एक प्रतिलेखन कारक है जो दृढ़ता से ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ा होता है। Nrf2 का सक्रियण हीम ऑक्सीजनेज़ -1 (HO -1), NAD (P) H क्विनोन ऑक्सीडोरक्टेज़ 1 सहित कई एंटीऑक्सिडेंट और डिटॉक्सिफिकेशन जीन के प्रतिलेखन को प्रेरित करता है।

विरोधी भड़काऊ [13], और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी [14] जैव सक्रियता। Osmanthusfragrans कई एशियाई खाद्य पदार्थों में एक सामान्य घटक है और लंबे समय से इसका सेवन किया जाता है। हमने पहले दिखाया था कि O.fragrans फूल के अर्क ने स्थानिक सीखने और स्मृति को बढ़ाया, ऑक्सीडेटिव क्षति को रोक दिया, और ICR माउस मॉडल [15] में d-galactose- प्रेरित उम्र बढ़ने में न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियों का प्रदर्शन किया। O.fragrans फूलों के अर्क [16] की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों के लिए Salidroside, Acteoside, और isoacteoside प्रमुख PhGs प्रतिक्रिया हैं।

PhGs के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव पर अध्ययन ने वांछनीय परिणाम प्राप्त किए हैं। सालिड्रोसाइड ने पीसी 12 कोशिकाओं के सेल एपोप्टोसिस को काफी कम कर दिया जो एमपीपी प्लस [17,18] में उजागर हुए थे। Acteoside ने PC12 कोशिकाओं [19] और A p 25-35- प्रेरित SH-SY5Y सेल की चोट [20] में MPP प्लस-प्रेरित एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव को भी कम किया।इचिनाकोसाइडSH-SY5Y कोशिकाओं [21] में ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए (TNFa)-प्रेरित एपोप्टोसिस पर जांच की गई थी, चूहों में MPTP- प्रेरित डोपामिनर्जिक विषाक्तता [22], चूहे के कोर्टिकल कोशिकाओं की ग्लूटामेट-घायल प्राथमिक संस्कृतियों [23], और {{ 9}}PC12 कोशिकाओं में ओएचडीए-प्रेरित क्षति [24]। परिणामों ने संकेत दिया कि PhG ने एक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रदर्शित किया और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के इलाज के लिए संभावित एजेंट हैं। अध्ययनों से पता चला है कि PhGs के एंटीऑक्सीडेंट गुण इन यौगिकों के लिए कई अन्य बायोएक्टीविटी हैं [25]। हालांकि, कुछ अध्ययनों ने ऑक्सीडेटिव विषाक्तता के खिलाफ PhGs के आणविक तंत्र की जांच की है।

हमारे अध्ययन में, हमने निम्नानुसार चार विशिष्ट PhG का चयन किया: सैलिड्रोसाइड (फेनिलेथेनॉइड मोनोसेकेराइड्स), एक्टोसाइड (फेनिलेथेनॉइड डिसैकराइड्स), आइसोएक्टोसाइड (फेनिलेथेनॉइड डिसैकराइड्स), औरइचिनाकोसाइड(फेनिलेथेनॉइड ट्राइसेकेराइड्स)। हमने H2O 2- प्रेरित PC12 सेल मॉडल पर PhG के सुरक्षात्मक प्रभाव और आणविक तंत्र की जांच के लिए विभेदित PC12 कोशिकाओं [26] का उपयोग करते हुए न्यूरोनल डेथ के एक मॉडल को नियोजित किया। हमने प्रदर्शित किया कि PhGs ने Kelch- जैसे ECH से जुड़े प्रोटीन 1 (Keap1) से जुड़कर Nrf2 / ARE पाथवे को सक्रिय कर दिया। इस प्रक्रिया ने एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों को अपग्रेड किया और पीसी 12 कोशिकाओं के प्रतिरोध को ऑक्सीडेटिव तनाव में बढ़ा दिया।

2. परिणाम

2.1. PhGs ने H2O को दबा दिया2-PC12 कोशिकाओं में प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी

PC12 कोशिकाओं पर H2O2 और PhGs (0.1,1,5, और 10 g/mL) के साइटोटोक्सिक प्रभावों का परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि H2O2 ने एकाग्रता-निर्भर और समय-निर्भर शिष्टाचार (चित्रा 1 ए) में पीसी 12 सेल व्यवहार्यता के नुकसान को प्रेरित किया। 2 घंटे के लिए PC12 कोशिकाओं के 200 H2O2 के संपर्क में आने से सेल की व्यवहार्यता 57.4 प्रतिशत हो गई। 0.1,1, 5, और 10 -/एमएल पर पीएचजी के साथ कोशिकाओं के प्रीट्रीटमेंट का सेल व्यवहार्यता (चित्रा 1बी) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और एच2ओ से स्पष्ट रूप से संरक्षित पीसी12 कोशिकाओं को सेल व्यवहार्यता में सुधार करके क्षति को प्रेरित किया। 9.549-22.141 प्रतिशत, 12.092-25.289 प्रतिशत, 1.470-9.289 प्रतिशत, और 3.411-11.441 प्रतिशत, क्रमशः (चित्र 1सी) . हालांकि, सालिड्रोसाइड (0.1 ^g/mL), आइसोएक्टोसाइड (0.1, 1, 5, और 10 ^g/mL),इचिनाकोसाइड(0.1,1, और 5 ^g/mL) प्रीट्रीटमेंट ने HzOz-प्रेरित कोशिका क्षति पर कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। PhGs के साथ कोशिकाओं के प्रीट्रीटमेंट ने H2O2 (चित्र 1D) द्वारा प्रेरित रूपात्मक विशेषता को भी संशोधित किया।

चित्र 1. PhGs ने PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को दबा दिया। एमटीटी परख द्वारा सेल व्यवहार्यता का पता लगाया गया था। PC12 कोशिकाओं पर विभिन्न सांद्रता में H2O2 (A) और PhGs (B) का साइटोटोक्सिक प्रभाव। (सी) PhGs ने सेल व्यवहार्यता में H2O 2- प्रेरित कमी को देखा। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs ({{10}}.1, और 10 wg/mL) के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर दूसरे के लिए 200 pM H2O2 के साथ इनक्यूबेट किया गया। 2 घंटे बाद PhG को हटा दिया गया। (डी) रूपात्मक अवलोकन। उपचार के बाद कोशिकाओं को एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप (x100), CK: सामान्य समूह, H2O2: H2O2 उपचारित समूह, HL: सालिड्रोसाइड कम खुराक उपचारित समूह, HH: सालिड्रोसाइड उच्च खुराक उपचारित समूह, ML: एक्टोसाइड कम खुराक उपचारित समूह द्वारा देखा गया। एमएच: एक्टियोसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप, आईएल: आइसोएक्टोसाइड लो डोज ट्रीटेड ग्रुप, आईएच: आइसोएक्टेओसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप, एसएल: इचिनाकोसाइड लो डोज ट्रीटेड ग्रुप, एसएच: इचिनाकोसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप। ** पी <0.01 बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" #="" पी=""><0.05, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह;="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.2. PhGs ने H2O को दबा दिया2-PC12 कोशिकाओं में ROS, लिपिड पेरोक्सीडेशन (MDA), और बढ़ी हुई सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (SOD) गतिविधियों के प्रेरित इंट्रासेल्युलर संचय

2 घंटे के लिए PC12 कोशिकाओं का 200 pM H2O2 तक एक्सपोजर ROS स्तर, MDA सामग्री में वृद्धि, और SOD गतिविधि में कमी (चित्र 2)। PhGs प्रीट्रीटमेंट ने ROS स्तर, सालिड्रोसाइड और एक्टोसाइड को क्षीण कर दिया, और आइसोएक्टोसाइड और इचिनाकोसाइड प्रीट्रीटमेंट की उच्च खुराक ने ROS स्तर (p <0.01) को="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" क्षीण="" कर="" दिया।="" सालिड्रोसाइड="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" एमडीए="" सामग्री="" पर="" कोई="" प्रभाव="" नहीं="" दिखाया,="">एक्टोसाइडपूर्व-उपचार ने एमडीए सामग्री को महत्वपूर्ण रूप से क्षीण कर दिया (पी < 0.05)।="" आइसोएक्टोसाइड="" और="" इचिनाकोसाइड="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" एमडीए="" सामग्री="" को="" काफी="" हद="" तक="" कम="" कर="">

चित्रा 2. PhGs ने ROS और MDA संचय को अवरुद्ध कर दिया और PC12 कोशिकाओं में SOD की गतिविधियों को बढ़ा दिया। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1, और 10 4g/mL) के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर 200 |^M H2O2 के साथ दूसरे के लिए इनक्यूबेट किया गया। 2 घंटे बाद PhG को हटा दिया गया। (ए) पीएचजी ने आरओएस और एमडीए संचय को अवरुद्ध कर दिया। (बी) पीएचजी ने एमडीए संचय को अवरुद्ध कर दिया। (सी) पीएचजी ने एसओडी की गतिविधियों में वृद्धि की। CK: सामान्य समूह, मॉडल: H2O2 उपचारित समूह, सालिड्रोसाइड: सालिड्रोसाइड उपचारित समूह, एक्टोसाइड: एक्टोसाइड उपचारित समूह, आइसोएक्टोसाइड: आइसोएक्टोसाइड उपचारित समूह, इचिनाकोसाइड: इचिनाकोसाइड उपचारित समूह। ** पी < 0.01="" बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" #="" p=""><0.05, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह,="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.3.PhGs उलट H2O2-PC12 कोशिकाओं में प्रेरित अपोप्टोसिस

2 घंटे के लिए H2O2 उपचार (200 |1M) PC12 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को काफी बढ़ा देता है, जिसमें कुल एपोप्टोटिक दर 16.02 प्रतिशत (चित्र 3) तक होती है। हालांकि, 24 घंटे के लिए पीएचजी (0.1 और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दिखावा करने से एकाग्रता-निर्भर तरीके से एपोप्टोसिस दर में कमी आई (पी <0.01)।>एक्टोसाइड, आइसोएक्टोसाइड, औरइचिनाकोसाइडसेल एपोप्टोसिस के प्रतिशत में 4.750-6.627 प्रतिशत, 4.413-5.800 प्रतिशत, 6.593-10.047 प्रतिशत, और 1.530-7 की उल्लेखनीय कमी आई है। क्रमशः 510 प्रतिशत।

चित्रा 3. PhGs ने PC12 कोशिकाओं में H2O को उलट दिया 2- प्रेरित एपोप्टोसिस। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs ({5}}.1, और 10 g/mL) के साथ ऊष्मायन किया गया था, और फिर PhG को हटा दिए जाने के बाद 200 pM H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। फिर, एपोप्टोसिस को पीआई / एफआईटीसी फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके एक प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा गया।

CK: सामान्य समूह, मॉडल: H2O2 उपचारित समूह, सालिड्रोसाइड: सालिड्रोसाइड उपचारित समूह, एक्टोसाइड: एक्टोसाइड उपचारित समूह, आइसोएक्टोसाइड: आइसोएक्टोसाइड उपचारित समूह,इचिनाकोसाइड: इचिनाकोसाइडउपचारित समूह। ** पी < {{0}}.01="" बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.4. PhGs ने H2O को कम किया2-Nrf के प्रेरित विकार2-PC12 कोशिकाओं में मार्ग हैं

एनआरएफ {0}} मार्ग हैं, अधिकांश सेल प्रकारों में प्रमुख एंटीऑक्सीडेंट मार्गों में से एक के रूप में, कोशिका वृद्धि और कोशिका मृत्यु को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है। इसलिए, हमने जांच की कि क्या Nrf 2- ARE पाथवे H2O में शामिल है 2- इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रेरित एपोप्टोसिस और विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख ने दिखाया कि PhGs (0.1 और 10 pg/mL) ने Nrf2 (चित्र 4) के परमाणु अनुवाद को प्रेरित किया। PhGs के उपचार के बाद, isoacteoside, औरइचिनाकोसाइडजिसके परिणामस्वरूप कोशिका की सामान्य आकृति विज्ञान आंशिक रूप से ठीक हो गया। पश्चिमी सोख्ता और धूसर घनत्व विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि PhGs ({0}}.1 और 10 pg/mL) का कोशिका द्रव्य में Nrf2 की अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था (चित्र 5ए, बी) (पी> {{20}}.05) लेकिन न्यूक्लियस में अपग्रेडेड एनआरएफएक्सएनएक्सएक्स अभिव्यक्ति (चित्रा 5सी, डी) (पी <0.01)। फिर,="" हमने="" nrf2="" sirna="" को="" आयात="" करके="" h2o="" 2-="" प्रेरित="" एपोप्टोसिस="" में="" nrf2="" की="" भूमिका="" का="" अध्ययन="" किया।="" nrf2="" की="" प्रोटीन="" और="" mrna="" अभिव्यक्ति="" को="" सभी="" nrf2="" sirna-="" उपचारित="" समूहों="" (चित्र="" 5e-h)="" में="" काफी="" कम="" विनियमित="" किया="" गया="" था।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" pg/ml)="" ने="" nrf2="" sirna="" उपचार="" (p=""><0.01) के="" बिना="" समूहों="" में="" h2o="" 2-="" प्रेरित="" साइटोटोक्सिसिटी="" को="" रोका,="" लेकिन="" nrf2="" sirna="" द्वारा="" इस="" तरह="" की="" सुरक्षा="" को="" उलट="" दिया="" गया।="" nrf2="" sirna="" उपचार="" के="" बाद,="" phgs="" उपचार="" (चित्र="" 5i)="" के="" साथ="" भी="" सेल="" व्यवहार्यता="" में="" काफी="" कमी="" आई="">

चित्र 5. H2O 2- उपचारित PC12 कोशिकाओं में Nrf2 पर PhG का सुरक्षात्मक प्रभाव। (ए) एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा साइटोप्लाज्म में एनआरएफ 2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था। पी-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (बी) कोशिका द्रव्य में Nrf2 प्रोटीन का मात्रात्मक घनत्वमितीय विश्लेषण। (सी) एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा नाभिक में एनआरएफएक्सएनएक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था। हिस्टोन एच 3 का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (डी) नाभिक में Nrf2 प्रोटीन का मात्रात्मक घनत्वमितीय विश्लेषण। (ई, एफ) पीसी12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए बिना (ई) या (एफ) एनआरएफ2 सीआरएनए के साथ प्रीइंक्यूबेट किया गया, फिर पीएचजी ({14}}.1 और 1 0 /एमएल) के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे के लिए, और PhGs को हटा दिए जाने के बाद एक और 2 घंटे के लिए H2O2 के साथ इनक्यूबेट किया गया। एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा कुल Nrf2 प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, और पी-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (छ) कुल एनआरएफ2 प्रोटीन का मात्रात्मक घनत्वमितीय विश्लेषण। (एच) एनआरएफएक्सएनएक्स एमआरएनए का मात्रात्मक विश्लेषण। (I) PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए या बिना siRNA के साथ पूर्वनिर्मित किया गया था, फिर 24 घंटे के लिए PhGs (0.1 और 10 -/एमएल) के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया था, और PhGs को हटा दिए जाने के बाद H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। उपचार के बाद, जीवित कोशिकाओं को एमटीटी परख द्वारा निर्धारित किया गया था। CK: सामान्य समूह, मॉडल: H2O2 उपचारित समूह, नियंत्रण Si: siRNA उपचारित समूह को नियंत्रित करें, SiRNA नकारात्मक: बिना siRNA उपचारित समूह के, SiRNA पॉजिटिव: SiRNA उपचारित समूह, सालिड्रोसाइड: सालिड्रोसाइड उपचारित समूह, एक्टोसाइड: एक्टोसाइड उपचारित समूह, आइसोएक्टोसाइड: आइसोएक्टोसाइड उपचार समूह,इचिनाकोसाइड: इचिनाकोसाइड उपचारित समूह। ** पी < {{0}}.01="" बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" #="" p="">< 0.05,="" बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह="" (nrf2="" sirna="" इलाज="" के="" बिना),="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह="" (nrf2="" sirna="" इलाज="" के="" बिना);="" &="" p=""><0.05 बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह="" (nrf2="" sirna="" उपचारित="" समूह="" के="" साथ),="" और="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह="" (nrf2="" sirna="" उपचार="" के="">

2.4. PhGs उलट H2O2-HO के प्रोटीन एक्सप्रेशन का प्रेरित डाउनरेगुलेशन-1, NQO1, GCLC, और GCLM

HO {0}}, NQO1, और ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज (GCL) महत्वपूर्ण सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम हैं, और HO -1, NQO1, और GCL (GCLC या GCLM) के उत्प्रेरक या संशोधित सबयूनिट हैं। Nrf2-नियंत्रक डाउनस्ट्रीम जीन [27]। उपचार के बाद HO -1, NQO1, GCLC, और GCLM की प्रोटीन अभिव्यक्ति देखी गई। H2O2 के साथ या बिना H2O2 (चित्र 6A-C) (p <0.01) के="" ho-1="" और="" nqo1="" की="" प्रोटीन="" अभिव्यक्ति="" के="" बीच="" एक="" स्पष्ट="" अंतर="" पाया="" गया।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" p^g/ml)="" ने="" h2o="" को="" उलट="" दिया2-ho-1="" के="" प्रोटीन="" एक्सप्रेशन="" के="" डाउनरेगुलेशन="" को="" प्रेरित="" किया="" ({{32}="" पर="" सैलिड्रोसाइड="" को="" छोड़कर)="" }.1="" पीजी/एमएल),="" एनक्यूओ1="" (एक्टोसाइड="" को="" छोड़कर="" 0.1="" पीजी/एमएल)="" (पी=""><0.01)। h2o2="" ने="" gclc="" और="" gclm="" प्रोटीन="" एक्सप्रेशन="" (p=""><0.05) (चित्र="" 6a,d,e)="" को="" भी="" डाउनग्रेड="" किया।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" pg/ml)="" रिवर्स="" h2o2-जीसीएलसी="" के="" प्रोटीन="" एक्सप्रेशन="" के="" डाउनरेगुलेशन="" को="" प्रेरित="" करता="" है="" (सिवाय="">इचिनाकोसाइड{{0}}.1 पीजी/एमएल) (पी < 0.01)="" और="" जीसीएलएम="" ({11}}.1="" पीजी/एमएल="" पर="" सैलिड्रोसाइड="" को="" छोड़कर)="" (="" पी="">< 0.01)।="" फिर,="" एच="" ओ="" -1="" के="" लिए="" रासायनिक="" अवरोधकों="" का="" उपयोग="" एच="" 2="" ओ="" 2-="" प्रेरित="" साइटोटोक्सिसिटी="" के="" खिलाफ="" पीएचजी="" के="" संरक्षण="" को="" विनियमित="" करने="" में="" एंटीऑक्सिडेंट="" एंजाइमों="" की="" भूमिकाओं="" का="" मूल्यांकन="" करने="" के="" लिए="" किया="" गया="" था।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" pg/ml)="" ने="" h2o="" 2-="" प्रेरित="" साइटोटोक्सिसिटी="" को="" रोका,="" लेकिन="" इस="" तरह="" के="" सुरक्षात्मक="" प्रभाव="" को="" ho="" -1="" अवरोधक="" znpp="" (p=""><0.01) द्वारा="" 20="" pm="" (चित्र="" 6f,="" p=""><0.01) पर="" उलट="" दिया="" गया।="">

2.5. Keap1 अभिव्यक्ति और आणविक डॉकिंग विश्लेषण

शारीरिक स्थितियों के तहत, Keap1 Nrf2 के Neh2 डोमेन से जुड़कर Nrf2 के एक दमनकारी प्रोटीन के रूप में कार्य करता है और Nrf2 को एक Cul 3- पर आधारित E3 ubiquitin ligase को ubiquitination और 26S प्रोटीसम [28] द्वारा बाद में गिरावट के लिए लक्षित करता है। PhGs के Keap1 के लिए बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन आणविक डॉकिंग विश्लेषण द्वारा उनके एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव के तहत तंत्र की जांच के लिए किया गया था।

3. चर्चा

हमने PC12 कोशिकाओं में H2O2 प्रेरित-साइटोटॉक्सिसिटी पर PhGs के न्यूरोप्रोटेक्शन की जांच की। परिणाम बताते हैं कि PhGs ढोंग ने HzOz- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को काफी हद तक दबा दिया, इंट्रासेल्युलर ROS स्तर को देखा, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों के स्तर में सुधार किया, और अंततः PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को उलट दिया। इसके अलावा, PhGs ने Nrf2 के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को बढ़ा दिया, HO -1, NQO1, GCLC, और GCLM की प्रोटीन अभिव्यक्ति के HzOz- प्रेरित डाउनरेगुलेशन को उलट दिया। इसके अलावा, PhGs ने Keap1 प्रोटीन में Nrf2 बाइंडिंग साइट के साथ संभावित इंटरैक्शन दिखाया।

H2O2- प्रेरित PC12 सेल की चोट में, लिपिड पेरोक्सीडेशन, जो लिपिड के ऑक्सीडेटिव क्षरण को संदर्भित करता है, झिल्ली की पारगम्यता में वृद्धि करता है, जिससे कोशिका क्षति होती है [29]। एमडीए गठन व्यापक रूप से लिपिड पेरोक्सीडेशन [30] के सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है। H2O2 ने ROS उत्पादन को बढ़ाया और SOD, केटेलेस और GPx जैसे एंटीऑक्सीडेंट रक्षा एंजाइमों को समाप्त कर दिया। यह प्रक्रिया ऑक्सीडेटिव तनाव [31] की ओर ले जाती है, जो अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के कारण और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पिछले अध्ययनों अनुरूप, हमने H2O2 उपचार के बाद ROS के बढ़े हुए स्तर, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों को कम किया और PC12 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को बढ़ाया। PhGs प्रीट्रीटमेंट ने इंट्रासेल्युलर ROS में HzOz- प्रेरित वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से देखा, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों में सुधार किया, और अंततः PC12 कोशिकाओं में HzOz- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को उलट दिया।

कुआंग एट अल। [32] ने बताया किइचिनाकोसाइडने माइटोकॉन्ड्रियल एपोप्टोटिक मार्ग के माध्यम से PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी पर एक महत्वपूर्ण न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया। इस अध्ययन में, हमने पाया कि इचिनाकोसाइड, सालिड्रोसाइड, एक्टोसाइड और आइसोएक्टोसाइड ने PC12 कोशिकाओं की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को बढ़ाकर न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया क्योंकि उन्होंने Nrf2 की ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियता को बढ़ाया और HO -1, NQO1 की डाउनस्ट्रीम प्रोटीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया। जीसीएलसी, और जीसीएलएम। कई अध्ययनों ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया है कि Nrf2 लक्ष्य जीन की सक्रियता, विशेष रूप से HO -1, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में सूजन, ऑक्सीडेटिव क्षति और कोशिका मृत्यु से दृढ़ता से रक्षा करती है। एचओ -1 प्रणाली को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बहुत सक्रिय बताया गया है, और इसका मॉड्यूलेशन स्पष्ट रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [33]। हाल के अध्ययनों ने AD [34] में Nrf2 के पुनर्सक्रियन के लिए एक कुशल लक्ष्य के रूप में PD [9] और Keap1 की प्रगति और जोखिम में Nrf2 की भूमिका को भी स्पष्ट किया है। परिणाम न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में Nrf2 के लिए नए साक्ष्य का समर्थन करते हैं।

आणविक डॉकिंग विश्लेषण से पता चला है कि PhGs निम्नलिखित बाध्यकारी क्षमताओं के साथ Keap1 से जुड़ सकते हैं:इचिनाकोसाइड>आइसोएक्टोसाइड> एक्टोसाइड> सालिड्रोसाइड। इन परिणामों के अनुरूप, PhGs दिखावा Nrf2 परमाणु अनुवाद के लिए नेतृत्व किया, नाभिक में निम्नलिखित Nrf2 अभिव्यक्ति के साथ:इचिनाकोसाइड>आइसोएक्टोसाइड * एक्टोसाइड> सालिड्रोसाइड। हमने माना कि ग्लाइकोसाइड्स की संख्या ने PhGs और Keap1 के संभावित बाइंडिंग मोड को प्रभावित किया है, और बाइंडिंग मोड ने आगे Keap1 से Nrf2 की रिहाई का कारण बना। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप Nrf2 और डाउनस्ट्रीम जीन की सक्रियता हुई और अंततः PC12 कोशिकाओं को H2 O 2 - प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है।

4. सामग्री और तरीके

4.1. रासायनिक यौगिक और अभिकर्मक

सालिड्रोसाइड (सीएएस नंबर 10338-51-9), एक्टियोसाइड (सीएएस नंबर 61276-17-3), आइसोएक्टोसाइड (सीएएस नंबर 61303-13-7), औरइचिनाकोसाइड(CAS नंबर {0}}) YYuanye बायोटेक्नोलॉजी कंपनी (शंघाई, चीन) से खरीदे गए थे। पीएचजी को पीबीएस में भंग कर 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार किया गया था, जिसे -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। H2O2 को अलादीन® (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। RPMI -1640 मध्यम और भ्रूण गोजातीय सीरम Hyclone (लोगान, UT, USA) से खरीदे गए थे, और 0.5 प्रतिशत ट्रिप्सिन EDTA, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Keyi (हांग्जो, चीन) से खरीदे गए थे। एमडीए, एसओडी डायग्नोस्टिक किट, एमटीटी, और डीसीएफएच-डीए बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (नानजिंग, जिआंगसु, चीन) से खरीदे गए थे। एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई डबल स्टेनिंग किट सोलरबायो लाइफ साइंसेज (बीजिंग, चीन) से खरीदी गई थी। Nrf2, Histone H3, Keap1, HO -1, NQO1, GCLC, GCLM, और p-actin, एंटी-माउस-हॉर्सरैडिश पेरोक्साइड (HRP) IgG, और एंटी-खरगोश-HRP-IgG के एंटीबॉडी Abcam से खरीदे गए थे। (लंदन, यूके)। एच ओ -1 और जेडएनपीपी के अवरोधक सिग्मा केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए थे। RNAiso Plus, GDNA इरेज़र के साथ प्राइमस्क्रिप्ट ™ RT अभिकर्मक किट, और SYBR® Premix Ex Taq ™ II तकरा (शिगा, जापान) से खरीदे गए थे। Lipofectamine® RNAiMAX अभिकर्मक अभिकर्मक थर्मो फिशर साइंटिफिक (वॉलथम, यूके) से खरीदा गया था। Nrf2 siRNA अनुक्रम इस प्रकार थे: आगे, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; और उल्टा, UUAAGACACUGUAAUUCGG। इस बीच, नियंत्रण siRNA अनुक्रम इस प्रकार थे: आगे, UUCUCCGAACGUGUCACGU; और उल्टा, ACGUGACACGUUCGGAGAA।

4.2. कोश पालन

माउस अधिवृक्क फियोक्रोमोसाइटोमा लाइन (PC12 कोशिकाएं) जैव रसायन और कोशिका जीव विज्ञान संस्थान, SIBS, (CAS, शंघाई, चीन) से प्राप्त की गई थी। कोशिकाओं को RPMI -1640 (Hyclone) में बनाए रखा गया था जिसमें 1 0 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone), 100 U/mL पेनिसिलिन, और 0.1 mg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 के साथ था। माध्यम हर दूसरे दिन बदला गया था।

4.3. सेल व्यवहार्यता परख

PC12 कोशिकाओं को 2 x 104 कोशिकाओं/वेल पर 96-वेल प्लेट्स में वरीयता दी गई थी। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए अवरोधक के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया, 24 घंटे के लिए PhGs के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया, और फिर PhG को हटा दिए जाने के बाद H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 5 मिलीग्राम / एमएल एमटीटी के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इलाज किया गया था, और मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया था। जीवित कोशिकाओं द्वारा बनाए गए फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को नीला रंग [35] उत्पन्न करने के लिए डीएमएसओ के 150 आरएल में भंग कर दिया गया था, और एक प्लेट रीडर पर अवशोषण को 570 एनएम पर मापा गया था। नियंत्रणों ने अकेले डीएमएसओ के साथ माध्यम की समान सांद्रता का उपयोग किया। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में सामान्यीकृत किया गया था।

PhGs की सांद्रता (0.1,1,5, और 10 Rg/mL) को PhGs के साइटोटोक्सिसिटी विश्लेषण और इचिनाकोसाइड [32] के रिपोर्ट किए गए साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव के आधार पर चुना गया था। रिपोर्ट के अनुसार, 10 Rg/mL से नीचे कोई साइटोटोक्सिसिटी प्रभाव नहीं दिखाया गया था, और इचिनाकोसाइड को HzOz-घायल सेल मॉडल में साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाने के लिए सूचित किया गया था।

4.4. एपोप्टोसिस परख

एपोप्टोसिस का पता एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई डबल स्टेनिंग किट (सोलरबायो) से लगाया गया था। PC12 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में 2 x 105 सेल्स/वेल में सीड किया गया। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1 और 10 Rg / mL) के साथ इलाज किया गया और PhG को हटा दिए जाने के बाद एक और 2 घंटे के लिए H2O2 के साथ ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस में धोया गया, 10 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर दो बार सेंट्रीफ्यूज किया गया, और बाध्यकारी बफर के 500 आरएल में फिर से जोड़ा गया। एफआईटीसी-लेबल एनेक्सिन वी (5 आरएल) और प्रोपीडियम आयोडाइड।

4.5. इंट्रासेल्युलर आरओएस, एमडीए प्रोडक्शन और एसओडी का मापन

इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर एक आरओएस-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच, अर्थात् 2, 7- डाइक्लोरोडिहाइड्रो फ्लोरोसेंट डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। PC12 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में 2 x 105 सेल/वेल में वरीयता दी गई। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1 और 10 g / mL) के साथ इलाज किया गया था और PhG को हटा दिए जाने के बाद H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को तीन बार पीबीएस से धोया गया और बाद में 10 M DCFH-DA के साथ ऊष्मायन किया गया। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और कोमल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया। इंट्रासेल्युलर आरओएस को गैलियोस ™ फ्लो साइटोमीटर (बेकमैन कल्टर, ब्रे, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था।

एमडीए और एसओडी को परख किट (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी, नानजिंग, जिआंगसु, चीन) द्वारा मापा गया। सभी प्रक्रियाएं पूरी तरह से निर्माताओं के निर्देशों का पालन करती हैं। एमडीए और एसओडी की सामग्री को संबंधित कुल प्रोटीन सामग्री के साथ सामान्यीकृत किया गया था।

4.6. Nrf2 न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन इम्यूनोफ्लोरेसेंस

PC12 कोशिकाओं को 6-वेल ग्लास स्लाइड्स में 2 x 105 प्रति कुएं के घनत्व पर वरीयता दी गई थी। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs ({13}}.1 और 10 g / mL) के साथ इलाज किया गया था और PhG को हटा दिए जाने के बाद H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस में धोया गया और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया, इसके बाद 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 का उपयोग करके झिल्ली पारगम्य किया गया। कोशिकाओं को एनआरएफ2 रैबिट आईजीजी (एबीकैम) के साथ रातोंरात 5 प्रतिशत एफबीएस के साथ 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। फिर, FITC के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटी-खरगोश एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं पर लागू किया गया। अंतिम तैयारी चरण में नाभिक को 4z, 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के साथ दाग दिया गया था। स्लाइड्स को पीबीएस के साथ संक्षेप में रिंस किया गया, हवा में सुखाया गया, और लुप्त होती माध्यम में एक एंटी-फ्लोरेसेंस में लगाया गया। स्लाइड्स की कल्पना एक लेज़र कन्फ़ोकल माइक्रोस्कोप (LMS780, Zeiss, जर्मनी) के तहत की गई थी।

4.7. प्रोटीन निष्कर्षण

PC12 कोशिकाओं को 1 0 0 मिमी व्यंजन में 1 x 107 कोशिकाओं/डिश में वरीयता दी गई थी। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1 और 10 g / mL) के साथ इलाज किया गया और फिर PhGs हटाने के साथ एक और 2 घंटे के लिए H2O2 के साथ ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को दो बार ठंडे पीबीएस से धोया गया और पीबीएस के 1000 L के साथ व्यंजन से स्क्रैप किया गया। सेल समरूपों को 10 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। उपचार के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 मिमी PMSF के साथ एक Beyotime RIPA सेल lysis बफर का उपयोग करके सेलुलर प्रोटीन निकाला गया। इसके अलावा, बायोटाइम परमाणु और साइटोप्लाज्मिक निष्कर्षण किट में वर्णित के रूप में साइटोप्लाज्मिक और परमाणु प्रोटीन को अलग किया गया था। नमूनों की प्रोटीन सांद्रता का पता बायोटाइम बीसीए प्रोटीन परख किट द्वारा लगाया गया था, और सभी नमूनों को पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था।

4.8. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

पश्चिमी धब्बा विश्लेषण मानक विधियों का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, प्रोटीन के नमूने (20 या 30 g) को SDS-PAGE द्वारा अलग किया गया और PVDF झिल्लियों में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को 5 प्रतिशत दूध-टीबीएसटी में अवरुद्ध कर दिया गया और प्राथमिक एंटीबॉडी में रातोंरात 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। इस्तेमाल की जाने वाली एंटीबॉडी में Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO -1 (Abcam), NQO -1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), हिस्टोन H3 (Abcam), और पी-एक्टिन (Abcam)। पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-माउस IgG (Abcam) या एंटी-खरगोश IgG (Abcam) को द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था। केमीस्कोप श्रृंखला (क्लिंक्स साइंस इंस्ट्रूमेंट्स, शंघाई, चीन) का उपयोग करके प्रोटीन बैंड की कल्पना की गई थी। ImageJ (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके प्रोटीन बैंड का ग्रे मूल्य निर्धारित किया गया था।

4.9. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर

निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan) का उपयोग करके कुल RNA निकाला गया। निर्माता के निर्देश के अनुसार कुल आरएनए नमूनों को जीडीएनए इरेज़र (तकरा, शिगा, जापान) के साथ प्राइमस्क्रिप्ट ™ आरटी अभिकर्मक किट के साथ उलट दिया गया। एप्लाइड बायोसिस्टम्स ViiA™ 7 रीयल-टाइम PCR सिस्टम में SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japan) का उपयोग करके मात्रात्मक रीयल-टाइम PCR का प्रदर्शन किया गया। लक्ष्य जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को p-एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया और 2-AACt विधि द्वारा विश्लेषण किया गया। Nrf2 के लिए प्राइमरी सीक्वेंस इस प्रकार थे: फॉरवर्ड, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA और रिवर्स, TCTGGGCGGCGACTTTAT। पी-एक्टिन के लिए प्राइमरी सीक्वेंस इस प्रकार थे: फॉरवर्ड, जीसीटीजीटीसीसीटीजीटीएटीजीसीसीसीटी; और उल्टा, TTGATGTCACGCACGATTT।

4.10. siRNA अभिकर्मक

PC12 कोशिकाओं को 6-वेल ग्लास स्लाइड्स में 2 x 105 प्रति वेल (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए) के घनत्व पर या 96-वेल ग्लास स्लाइड्स में 2 x 104 प्रति वेल (सेल के लिए) के घनत्व पर सुसंस्कृत किया गया था। व्यवहार्यता विश्लेषण)। नियंत्रण siRNA और Nrf2 siRNA को निर्माता के निर्देशों के अनुसार Lipofectamine RNAiMAX (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA, यूएसए) का उपयोग करके कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को संकेत समय के लिए PhGs और H2O2 के साथ या बिना इलाज किया गया था और फिर ऊपर वर्णित पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, qRT-PCR, या सेल व्यवहार्यता विश्लेषण में उपयोग किया गया था।

4.11. आणविक डॉकिंग विश्लेषण

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. सांख्यिकीय विश्लेषण

एसपीएसएस का उपयोग करते हुए एलएसडी विश्लेषण के साथ एकतरफा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से सभी परिणामों की पुष्टि की गई। डेटा को मतलब एसडी के रूप में व्यक्त किया गया था। p < 0.05="" पर="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" अंतरों="" पर="" विचार="" किया="">

अभिस्वीकृति: इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (नंबर 2017YFD0400200), चीन के झेजियांग प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर R15C200002), और कृषि उत्पाद गुणवत्ता सुरक्षा जोखिम मूल्यांकन की विशेष परियोजना (नं।) द्वारा समर्थित किया गया था। GJFP2018015), चीन के कृषि और ग्रामीण मामलों के मंत्रालय।

लेखक योगदान:बैयी लू और माईकान ली ने अध्ययन की रूपरेखा तैयार की। माईक्वान ली ने प्रयोगशाला का काम, डेटा विश्लेषण किया और पेपर लिखा। माईक्वान ली, ताओ जू, फी झोउ, मेंगमेंग वांग, हुआक्सिन सोंग, जिंग जिओ और बाई लू ने पांडुलिपि को संशोधित किया।

1 बुद्धिमान खाद्य प्रौद्योगिकी और उपकरण की राष्ट्रीय इंजीनियरिंग प्रयोगशाला,

कृषि और ग्रामीण मामलों के मंत्रालय के कृषि उत्पादों के लिए प्रमुख प्रयोगशाला, कृषि उत्पादों के लिए प्रमुख प्रयोगशाला कृषि और ग्रामीण मामलों के मंत्रालय के पोषण मूल्यांकन, कृषि-खाद्य प्रसंस्करण के लिए झेजियांग प्रमुख प्रयोगशाला, फुली खाद्य विज्ञान संस्थान, बायोसिस्टम कॉलेज इंजीनियरिंग और खाद्य विज्ञान, झेजियांग विश्वविद्यालय, हांग्जो 310058, चीन;

2 कॉलेज ऑफ द फर्स्ट क्लिनिकल मेडिकल, गुआंगझोउ यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन,

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