फॉर्मोनोनेटिन जेएके/एसटीएटी मॉड्यूलेशन और प्रतिरक्षा पुनर्संतुलन के माध्यम से ऑटोइम्यून प्रोस्टेटाइटिस को कम करता है: सीपी/सीपीपीएस और टीसीएम सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट एडजंक्ट्स के लिए निहितार्थ

उद्देश्य:यह जांचने के लिए कि प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून प्रोस्टेटाइटिस (ईएपी) के माउस मॉडल में जेएके/एसटीएटी सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से फॉर्मोनोनेटिन (एफएन) टी हेल्पर टाइप 1 (टीएच1) सेल भेदभाव और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को कैसे नियंत्रित करता है।
तरीके:चालीस पुरुष गैर-मोटे मधुमेह (एनओडी) चूहों को यादृच्छिक रूप से चार समूहों में बांटा गया था: सामान्य नियंत्रण, ईएपी मॉडल नियंत्रण, कम खुराक एफएन (एलएफएन, 50 मिलीग्राम / किग्रा), और उच्च खुराक एफएन (एचएफएन, 100 मिलीग्राम / किग्रा)। ईएपी को बाद के तीन समूहों में पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में पायसीकृत प्रोस्टेट एंटीजन (पीएजीएस) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था। मॉडलिंग के बाद, एलएफएन और एचएफएन समूहों को क्रमशः 50 या 100 मिलीग्राम/किग्रा/दिन पर इंट्रागैस्ट्रिक एफएन प्राप्त हुआ; सामान्य और मॉडल नियंत्रणों को कार्बोक्सिमिथाइलसेलुलोज सोडियम (सीएमसी-ना) प्राप्त हुआ। उपचार शुरू होने के 42वें दिन, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और ऊतक एकत्र किए गए। प्रोस्टेट विकृति का मूल्यांकन एचई स्टेनिंग द्वारा किया गया था; प्रोस्टेट में Th1 कोशिका विभेदन और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का मूल्यांकन इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल स्टेनिंग (इंटरफेरॉन- [IFN-] के साथ CD4; इंड्यूसेबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ [iNOS] और CD206) द्वारा किया गया था। प्लीहा में Th1 सेल और मैक्रोफेज अनुपात को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था, और सीरम IFN- और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर- (TNF-) स्तर को एलिसा द्वारा मापा गया था। प्रोस्टेट ऊतक में फॉस्फोराइलेटेड (p)-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 और STAT1 को वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा निर्धारित किया गया था।
परिणाम: मॉडल नियंत्रणों की तुलना में, दोनों एफएन खुराक से ग्रंथि उपकला कोशिकाओं की अधिक व्यवस्थित व्यवस्था हुई, प्रोस्टेट सूजन स्कोर (पी <0.05) में काफी कमी आई, टीएच1 कोशिकाओं और एम1 मैक्रोफेज मार्करों (पी <0.05) के अनुपात में कमी आई, और प्रोस्टेट और प्लीहा ऊतकों में एम2 मैक्रोफेज मार्करों में वृद्धि हुई (पी <0.05)। एलएफएन और एचएफएन समूहों (पी <0.05) में सीरम आईएफएन- और टीएनएफ- का स्तर स्पष्ट रूप से कम हो गया था। आणविक स्तर पर, प्रोस्टेट ऊतक में अनुपात p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2, और p-STAT1/STAT1 सभी में काफी कमी आई (P <0.05), यह दर्शाता है कि FN JAK/STAT सिग्नलिंग को संशोधित करके, सूजन के समाधान को बढ़ावा देने और प्रतिरक्षा संतुलन को बहाल करके ईएपी में चिकित्सीय प्रभाव डालता है।
निष्कर्ष:FN JAK/STAT सिग्नलिंग मार्गों को बाधित करके और Th1 विभेदन और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को विनियमित करके EAP को कम करता है। ये निष्कर्ष, प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन और पैल्विक दर्द सहायता के लिए सिस्टैंच अर्क की खुराक जैसे पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) सहायकों में बढ़ती रुचि के साथ, एक बहु-लक्ष्य रणनीति का सुझाव देते हैं जो कठोर, सहकर्मी-समीक्षित सेटिंग्स में आगे सत्यापन के योग्य है।

कीवर्ड:फॉर्मोनोनेटिन;ऑटोइम्यून प्रोस्टेटाइटिस; ज्वलनशील उत्तर; JAK/STAT सिग्नलिंग मार्ग; चूहों;टीसीएम जड़ी बूटी सिस्टैंच अर्क अनुपूरक; इम्युनोमोड्यूलेशन

 

 

टीसीएम जड़ी बूटी सिस्टैंच अर्क अनुपूरक

 

 

 

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परिचय

क्रोनिक प्रोस्टेटाइटिस/क्रोनिक पेल्विक दर्द सिंड्रोम (सीपी/सीपीपीएस) 5%-10% पुरुषों को प्रभावित करता है और सभी प्रोस्टेटाइटिस मामलों में से लगभग 90% मामलों का यही कारण है। यह विशेष रूप से युवा और मध्यम आयु वर्ग के पुरुषों में प्रचलित है, जो मुख्य रूप से निचले पेट, पेरिनेम और श्रोणि क्षेत्र में दर्द के साथ होता है, अक्सर निचले मूत्र पथ के लक्षणों और कभी-कभी स्तंभन दोष के साथ होता है। वर्तमान प्रथम-पंक्ति उपचारों में नॉनस्टेरॉइडल एंटी-इंफ्लेमेटरी ड्रग्स (एनएसएआईडी), एंटीबायोटिक्स और -एड्रीनर्जिक रिसेप्टर ब्लॉकर्स शामिल हैं, या तो अकेले या संयोजन में। हालाँकि, उच्च पुनरावृत्ति दर के कारण कई मरीज़ इन आहारों से असंतुष्ट हो जाते हैं। इसलिए, नए चिकित्सीय हस्तक्षेप और सीपी/सीपीपीएस रोगजनन में गहरी अंतर्दृष्टि की तत्काल आवश्यकता है।

 

सीएम हर्ब सिस्टैंच अर्क अनुपूरक लाभ

सबूतों के बढ़ते समूह से संकेत मिलता है कि प्रतिरक्षा विकृति सीपी/सीपीपीएस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। मरीजों में आमतौर पर प्रोस्टेट ऊतक में टी लिम्फोसाइट्स और मोनोसाइट्स की व्यापक घुसपैठ और व्यक्त प्रोस्टेटिक स्राव में ऊंचे ल्यूकोसाइट्स दिखाई देते हैं, जिसमें सीडी 4+ टी लिम्फोसाइट्स और मैक्रोफेज का प्रभुत्व होता है। प्रीक्लिनिकल डेटा आगे सुझाव देता है कि इम्यूनोसप्रेसिव रणनीतियाँ सीपी/सीपीपीएस में सूजन और दर्द को कम कर सकती हैं। इस प्रकार, ल्यूकोसाइट घुसपैठ और सूजन प्रतिक्रिया को लक्षित करना लक्षण राहत के लिए प्रभावी हो सकता है। कई टीसीएम जड़ी-बूटियों में एक प्रमुख बायोएक्टिव आइसोफ्लेवोन, फॉर्मोनोनेटिन (एफएन) में एंटीऑक्सीडेंट और सूजन-रोधी गुण होते हैं। क्या एफएन सीपी/सीपीपीएस में सुधार कर सकता है या नहीं यह अस्पष्ट बना हुआ है। यहां, हमने माउस ईएपी मॉडल में एफएन के चिकित्सीय प्रभाव का मूल्यांकन किया। एकीकृत दृष्टिकोण में बढ़ती नैदानिक ​​रुचि के समानांतर, हम ध्यान दें कि पेल्विक दर्द सिंड्रोम में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और एंटी-इंफ्लेमेटरी समर्थन के लिए टीसीएम जड़ी बूटी सिस्टैंच अर्क की खुराक की खोज की जा रही है; हालांकि इस अध्ययन का फोकस नहीं है, फिर भी वे व्यापक टीसीएम-आधारित चिकित्सीय परिदृश्य के भीतर एफएन को प्रासंगिक बनाते हैं।

 

सामग्री और तरीके

 

पशु

6-7 सप्ताह की आयु के नर एनओडी चूहों को शंघाई यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (एसयूटीसीएम) के प्रायोगिक पशु केंद्र (लाइसेंस एसवाईएक्सके [एचयू] 2020-0009; प्रमाणपत्र एससीएक्सके [जिंग] 2021-0006) से प्राप्त किया गया था। जानवरों को भोजन और पानी तक पहुंच की सुविधा के साथ 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे चक्र के तहत रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं को SUTCM की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन संख्या PZSHUTCM2301040003) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

अभिकर्मक और औषधियाँ
फॉर्मोनोनेटिन (मेडकेमएक्सप्रेस, HY‑N0183); संपूर्ण फ्रायंड का सहायक (सीएफए; सिग्मा-एल्ड्रिच, F5881); फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस); गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए); अति संवेदनशील ईसीएल किट (शंघाई यायम बायोटेक, सीबी012, पीएस113, एसक्यू201); p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH, और DAPI के प्रति एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #5174, #8961); आरआईपीए बफर और बीसीए प्रोटीन परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक, 89901, ए55866); एचई स्टेनिंग किट (सर्विसेबियो, जीपी1031); iNOS और CD206 (Abcam, ab178945, ab125028); APC एंटी-माउस CD3, FITC एंटी-माउस CD4, PE एंटी-माउस IFN‑ (BioLegend, 100235, 100405, 505807)।

 

उपकरण
वैद्युतकणसंचलन उपकरण (ई11001, बायो-रेड); लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएसएम 780, ज़ीस); साइटोफ्लेक्स प्रवाह साइटोमीटर (बेकमैन कल्टर)।

ईएपी मॉडल स्थापना
अनुकूलन के एक सप्ताह के बाद, चूहों को चार समूहों (एन=10) में यादृच्छिक किया गया: नियंत्रण, मॉडल, एफएन कम खुराक (50 मिलीग्राम/किग्रा), और एफएन उच्च खुराक (100 मिलीग्राम/किग्रा)। ईएपी को पूर्व विधियों के अनुसार प्रेरित किया गया था। प्रोस्टेट एंटीजन (पीएजी) युक्त सुपरनैटेंट को स्प्रैग-डावले चूहे प्रोस्टेट होमोजेनेट से तैयार किया गया था और सीएफए के साथ 1: 1 मिलाया गया था। 0 और 28वें दिन, चूहों को सीएफए (150 μL/माउस) के साथ पायसीकृत पीएजी (300 यूजी/माउस; ईएपी समूह) या पीबीएस (नियंत्रण) के दोनों पिछले पैरों के पैड, पीठ के निचले हिस्से और पूंछ के आधार में चमड़े के नीचे के इंजेक्शन प्राप्त हुए। एफएन समूहों को दैनिक इंट्रागैस्ट्रिक एफएन (50 या 100 मिलीग्राम/किग्रा) प्राप्त हुआ; नियंत्रण और मॉडल समूहों को वॉल्यूम-मिलान CMC-Na प्राप्त हुआ। प्रयोग 42वें दिन समाप्त हुआ और उसके बाद मानवीय इच्छामृत्यु हुई।

वह प्रोस्टेट ऊतक का धुंधलापन
प्रोस्टेट को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में स्थिर किया गया, निर्जलित किया गया, पैराफिन में एम्बेडेड किया गया और 5 माइक्रोन पर विभाजित किया गया। अनुभागों को एचई किट का उपयोग करके दाग दिया गया और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया। स्थापित मानदंडों के आधार पर सूजन को 0-3 अंक दिए गए, जिसमें 0 कोई सूजन न होने का संकेत देता है और 3 चिह्नित सूजन कोशिका घुसपैठ का संकेत देता है।

Th1 कोशिकाओं और मैक्रोफेज के लिए फ्लो साइटोमेट्री
एकल-कोशिका निलंबन 0.5% बीएसए के साथ पीबीएस में तैयार और बनाए रखा गया था। सतह और इंट्रासेल्युलर धुंधलापन एपीसी एंटी-सीडी 3, एफआईटीसी एंटी-सीडी 4, और पीई एंटी-आईएफएन- का उपयोग करके मानक प्रोटोकॉल का पालन करता है। कोशिकाओं को 50 एनजी/एमएल पीएमए, 1 यूजी/एमएल आयनोमाइसिन, और 5 यूजी/एमएल ब्रेफेल्डिन ए के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर उत्तेजित किया गया, फिर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री पर इंट्रासेल्युलर रूप से दाग दिया गया। डेटा को CytoFLEX पर प्राप्त किया गया और FlowJo के साथ विश्लेषण किया गया।

मैक्रोफेज के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन
स्थिर प्रोस्टेट खंडों को डीपराफिनाइज़ किया गया, एंटीजन पुनर्प्राप्ति से गुज़रा, और 30 मिनट के लिए 10% बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी (आईएनओएस, सीडी206) को 4 डिग्री पर रात भर लगाया गया। पीबीएस धोने के बाद, फ्लोरोफोर-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी को अंधेरे में 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए लगाया गया था। नाभिक को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ प्रतिरंजित किया गया, इसके बाद पीबीएस धोया गया और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लगाया गया।

साइटोकाइन मापन

निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एलिसा किट का उपयोग करके सीरम आईएफएन‑ और टीएनएफ‑ की मात्रा निर्धारित की गई।

 

पश्चिमी ब्लॉट

प्रोस्टेट ऊतकों को आरआईपीए बफर (प्रोटीज़ और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ) में लाइज़ किया गया था। प्रोटीन सांद्रता को बीसीए परख द्वारा मापा गया था। उचित प्रतिशत जैल तैयार किए गए; प्रोटीन की समान मात्रा को इलेक्ट्रोफोरेस किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी (p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH; सभी 1:1000) को रात भर 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद 1.5 घंटे के लिए HRP‑संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:5000) के साथ धुलाई और इनक्यूबेशन किया गया। बैंडों को संवर्धित केमिलुमिनसेंस द्वारा देखा गया और चित्रित किया गया। सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति की गणना डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा की गई थी।

 

सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म 9.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। एकाधिक समूह तुलनाओं के लिए एकतरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; पी 0.05 से कम या उसके बराबर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

 

बहस

यह अध्ययन दर्शाता है कि फॉर्मोनोनेटिन हिस्टोपैथोलॉजिकल सूजन को कम करता है, Th1 ध्रुवीकरण को दबाता है, मैक्रोफेज फेनोटाइप को प्रो-इंफ्लेमेटरी M1 से प्रो-रिज़ॉल्यूशन M2 में स्थानांतरित करता है, और EAP माउस मॉडल में प्रोस्टेट ऊतक में JAK1/2-STAT1 फॉस्फोराइलेशन को डाउनरेगुलेट करता है। कम प्रणालीगत आईएफएन‑ और टीएनएफ‑ एफएन के विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोरेगुलेटरी प्रभावों को और अधिक पुष्ट करता है। ये परिणाम इस्केमिया-रीपरफ्यूजन और एथेरोस्क्लेरोसिस मॉडल में एफएन मॉड्यूलेटिंग जेएके/एसटीएटी मार्गों की पूर्व रिपोर्टों के साथ संरेखित होते हैं, जो संरक्षित एंटी-इंफ्लेमेटरी तंत्र को रेखांकित करते हैं। टीसीएम के व्यापक संदर्भ में, एकीकृत देखभाल मार्गों में कभी-कभी सिस्टैंच (रौ कांग रोंग) निकालने की खुराक जैसे वनस्पति विज्ञान शामिल होते हैं, जिनकी इम्यूनोमॉड्यूलेशन, थकान और मूत्रजननांगी सहायता के लिए जांच की गई है। हालांकि यहां सिस्टैंच अर्क का परीक्षण नहीं किया गया था, भविष्य में नियंत्रित अध्ययन जेएके/एसटीएटी से जुड़ी सूजन और पेल्विक दर्द के परिणामों पर संभावित तालमेल का पता लगाने के लिए मानकीकृत टीसीएम जड़ी बूटी सिस्टैंच अर्क की खुराक के साथ एफएन की तुलना या संयोजन कर सकते हैं। किसी भी नैदानिक ​​अनुवाद को साक्ष्य-आधारित मानकों, गुणवत्ता-नियंत्रित सोर्सिंग और सुरक्षा निगरानी का पालन करना चाहिए।

निष्कर्ष
फॉर्मोनोनेटिन JAK/STAT सिग्नलिंग को बाधित करके और Th1 भेदभाव और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को विनियमित करके प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून प्रोस्टेटाइटिस को कम करता है। ये निष्कर्ष एफएन-और संभावित सहायक टीसीएम रणनीतियों जैसे सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट सप्लीमेंट्स के आगे के विकास के लिए एक यंत्रवत तर्क प्रदान करते हैं - सीपी/सीपीपीएस के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी हस्तक्षेप के रूप में, कठोर, सहकर्मी-समीक्षित प्रीक्लिनिकल और नैदानिक ​​​​अध्ययनों में सत्यापन लंबित है।

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