मानव गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के सिस्प्लैटिन-प्रेरित एपोप्टोसिस और चूहों में तीव्र गुर्दे की चोट पर पांडुरटिन ए का सुरक्षात्मक प्रभाव
Mar 18, 2022
पार्श्वभूमि:सिस्प्लैटिन प्रभावी कीमोथेरेपी है लेकिन इसका मुख्य दुष्प्रभाव, तीव्रगुर्दे की चोट, इसके उपयोग को सीमित करता है। पांडुरेट ए, बोसेनबर्गिया रोटुंडा से निकाला गया एक बायोएक्टिव यौगिक, कई जैविक गतिविधियों जैसे कि एंटी-ऑक्सीडेटिव प्रभाव दिखाता है। वर्तमान अध्ययन ने सिस्प्लैटिन-प्रेरित . पर पंडुरेट ए के नेफ्रोप्रोटेक्टिव प्रभाव की जांच कीगुर्दे की चोट।तरीके: हमने RPTEC / TERT1 कोशिकाओं का उपयोग करके चूहों और मानव वृक्क कोशिका संस्कृतियों दोनों में सिस्प्लैटिन की विषाक्तता पर पंडुरेट ए के प्रभाव की जांच की। परिणाम: परिणामों ने प्रदर्शित किया कि पंडुरेट ए एपोप्टोसिस को कम करके चूहों और आरपीटीईसी / टीईआरटी1 कोशिकाओं दोनों में सिस्प्लैटिन-प्रेरित गुर्दे की विषाक्तता को कम करता है। सिस्प्लैटिन (20 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन (बीडब्ल्यू)) के एकल इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के साथ चूहों का इलाज किया गयागुर्देनलिका की चोट और बिगड़ा हुआगुर्दा कार्यजैसा कि हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और बढ़ी हुई सीरम क्रिएटिनिन द्वारा दिखाया गया है। पांडुरेट ए (50 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) के सह-प्रशासन में मौखिक रूप से सुधार हुआगुर्दा कार्यऔर सुधारा गयागुर्देबाह्य संकेत-विनियमित किनासे (ईआरके) 1/2 और कस्पासे 3 की सक्रियता को रोककर सिस्प्लैटिन की ट्यूबल चोट। मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में, प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन (ईआरके 1/2 और कैस्पेज़ 3) को सक्रिय करके सिस्प्लैटिन-प्रेरित सेल एपोप्टोसिस, और एपोप्टोटिक रोधी प्रोटीन (बीसीएल-2) को कम करना। इन प्रभावों को पंडुरेट ए के साथ सह-उपचार द्वारा काफी हद तक सुधारा गया था। दिलचस्प बात यह है कि पांडुरेट ए ने सिस्प्लैटिन के इंट्रासेल्युलर संचय को नहीं बदला। इसने मानव बृहदान्त्र या गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन की कैंसर-विरोधी प्रभावकारिता को नहीं बदला। निष्कर्ष: वर्तमान अध्ययन पर प्रकाश डाला गया है कि पैंड्यूरेट ए का सिस्प्लैटिन की नेफ्रोटॉक्सिसिटी पर संभावित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है।
कीवर्ड:कीमोथेरेपी; तीक्ष्ण गुर्दे की चोट; पांडुराटिन ए; मानव गुर्दे समीपस्थ नलिका; एंटी-एपोप्टोसिस; गुर्दे; गुर्दा
सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के डायलिसिस में सुधार होगा
परिचय
दवाओं से प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी नैदानिक सेटिंग में एक बड़ी समस्या है क्योंकि नेफ्रोटॉक्सिक दवाओं का उपयोग अक्सर अपरिहार्य होता है। नेफ्रोटोक्सिसिटी को गुर्दे की चोटों से परिभाषित किया जा सकता है जिसमें ग्लोमेरुलर क्षति और ट्यूबलर चोट शामिल है जिससे गुर्दे की क्रिया में कमी आती है। 1) से जुड़ी सामान्य दवाएंगुर्दे की चोटएंटी-इन्फ्लैमेटरीज, एंटीबायोटिक्स और कीमोथेराप्यूटिक एजेंट हैं, जैसे कि सिस्प्लैटिन। 2-4) सिस्प्लैटिन एक व्यापक-स्पेक्ट्रम, उच्च शक्ति वाली कीमोथेरेपी दवा है। 5) हालांकि, सिस्प्लैटिन उपचार प्राप्त करने वाले तीन में से लगभग एक मरीज नेफ्रोटॉक्सिसिटी से पीड़ित होता है।6,7) और इलेक्ट्रोलाइट असंतुलन। 8,9) सिस्प्लैटिन-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी समीपस्थ नलिका की चोट, संवहनी चोट और सूजन की विशेषता है। 4) गुर्दे की कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन का संचय कई मार्गों को प्रेरित करता है जो कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देते हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को सिस्प्लैटिन नेफ्रोटॉक्सिसिटी में एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में पहचाना गया है। 10,11) इसके अतिरिक्त, आरओएस माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस (एमएपीके) के सक्रियण के माध्यम से नेफ्रोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करता है। 10,12,13) कई अध्ययनों ने बताया है कि सिस्प्लैटिन स्वयं इन विट्रो और विवो दोनों में बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेज (ईआरके) 1/2 (एमएपीके का एक सदस्य) को सीधे उत्तेजित कर सकता है। 14,15)
कुछ फाइटोकेमिकल्स आरओएस संचय और एपोप्टोसिस को रोककर सिस्प्लैटिन-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी में सुधार करते हैं। 16-18) हालांकि इन फाइटोकेमिकल्स के नेफ्रोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में बताए गए हैं, फिर भी सिस्प्लैटिन की नेफ्रोटॉक्सिसिटी के लिए फाइटोकेमिकल्स से कोई अनुमोदित दवा नहीं है (समीक्षा में विवरण देखें)।19 ) वर्तमान नैदानिक अभ्यास केवल गुर्दे के कार्य को ठीक करने के लिए सहायक उपचार प्रदान करता है। इसलिए, सिस्प्लैटिन-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी को रोकने या उसका इलाज करने के लिए प्रभावी एजेंटों की खोज करना अभी भी महत्वपूर्ण है। पांडुरेट ए एक दिलचस्प फाइटोकेमिकल है। यह बोसेनबर्गिया रोटुंडा से अलग किया गया एक साइक्लोहेक्सानॉल चेल्कोन है, जो पारंपरिक चिकित्सा और भोजन में इस्तेमाल किया जाने वाला पौधा है। 21) पांडुरटिन ए को ऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन और चयापचय रोग को रोकने या उसका इलाज करने के लिए दिखाया गया है। 22,23) गुर्दे के समीपस्थ नलिकाओं की चोट के कारण सिस्प्लैटिन की मध्यस्थता की जाती है, कम से कम भाग में, बढ़े हुए ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन के माध्यम से। 11) इसलिए, हमने RPTEC / TERT1 कोशिकाओं का उपयोग करके जानवरों और सेल संस्कृतियों दोनों में सिस्प्लैटिन की विषाक्तता पर पंडुरेट ए के प्रभाव की जांच की। हमने यह भी परीक्षण किया कि क्या पंडुरेट ए के साथ सह-उपचार मानव कैंसर सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन की एंटीकैंसर गतिविधि को प्रभावित करता है।
सामग्री और तरीके
रसायन Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), cisplatin, and compound C (AMP-activated protein kinase (AMPK) inhibitor) were purchased from Sigma-Aldrich (MO, U.S.A.). 3 H-1-Methyl-4-phenylpyridinium (3 H-MPP+) was purchased from PerkinElmer, Inc. (Bangkok, Thailand). Annexin V- fluorescein isothiocyanate (FITC) apoptosis detection kit was purchased from BD Biosciences (CA, U.S.A.). Primary antibodies for p-ERK1/2 (Cat. No. 9102S), ERK1/2 (Cat. No. 9101S), Bcl-2 (Cat. No. 2872T), caspase-3 (Cat. No. 9662S), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Cat. No. 2118S), p-AMPKα (Cat. No.2531S), AMPKα (Cat. No. 5832S), Bax (Cat. No. 5023) and β-actin (Cat. No. 4970T) antibodies were obtained from Cell Signaling (MA, U.S.A.) and anti-neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) antibody (Cat. No. STCSC-515876) was purchased from Santa Cruz Biotechnology (CA, U.S.A.). Pandurate A >एचपीएलसी द्वारा निर्धारित 98 प्रतिशत शुद्धता को बोसेनबर्गिया रोटुंडा से अलग किया गया था जैसा कि पहले हमारे समूह द्वारा वर्णित किया गया था। 24) बोसेनबर्गिया रोटुंडा के प्रकंद कंचनबुरी, थाईलैंड से एकत्र किए गए थे। संयंत्र की पहचान तुआंटा सेमाटोंग ने की थी। वाउचर नमूना (नंबर बीकेएफ 68909) वन हर्बेरियम, रॉयल वानिकी विभाग, बैंकॉक में जमा कर दिया गया है।
सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार होगा
जानवरोंनर C57BL/6 चूहों (8-सप्ताह पुराने) को नोमुरा सियाम इंटरनेशनल कं, लिमिटेड (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। पशु देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल नंबर MUSC61-063-464 को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, MUSC-IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया है। चूहों को स्वतंत्र रूप से भोजन और पानी तक पहुंचने की इजाजत थी। अनुकूलन के एक सप्ताह के बाद, चूहों को बेतरतीब ढंग से विभाजित किया गया और उपचार निम्नानुसार प्रशासित किया गया: दिन 4 (नियंत्रण समूह) पर एकल इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा सामान्य खारा; पांडुरेट ए (50 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन (बीडब्ल्यू)) 7 डी के लिए मौखिक गावेज द्वारा (पांडुरेट ए समूह); सिस्प्लैटिन (20 मिलीग्राम/किलो बीडब्ल्यू) दिन 4 (सिस्प्लैटिन समूह) पर एक एकल आईपी इंजेक्शन द्वारा; पांडुरेट ए (50 मिलीग्राम/किलो बीडब्ल्यू/डी) मौखिक गावेज द्वारा 7 डी और सिस्प्लैटिन (20 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू) के लिए दिन 4 (सह-उपचार समूह) पर एक एकल आईपी इंजेक्शन द्वारा। 7 दिन, चूहों को थायोपेंटल सोडियम द्वारा गहराई से संवेदनाहारी किया गया था। 3000 बजे 10 मिनट के लिए रक्त खींचा और सेंट्रीफ्यूज किया गया। एकत्रित सतह पर तैरनेवाला −80 डिग्री पर तक रखा गया थागुर्दे समारोहनापा था।गुर्देप्रोटीन अभिव्यक्तियों और हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों की माप के लिए एकत्र किए गए थे।
गुर्दे के कार्य और ऊतकीय परीक्षा का निर्धारणस्टैनबियो क्रिएटिनिन लिक्विकलर (एनवाई, यूएसए) और रक्त रसायन विश्लेषक, लाइसेंसेंज़ा (रोम, इटली) का उपयोग करके सीरम क्रिएटिनिन को मापकर गुर्दे का कार्य निर्धारित किया गया था। सिस्प्लैटिन-प्रेरित वृक्क ट्यूबलर क्षति की जांच करने के लिए, माउसगुर्दे4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किए गए थे।गुर्दास्लाइस को हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा चित्रित किया गया था। ट्यूबलर चोट का प्रतिशत गुर्दे की ट्यूबलर चोट का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था: 0=कोई ट्यूबलर चोट नहीं 1=<10%; 2="10–25%;" 3="26–50%;" 4="51–75%;" 5="">75 प्रतिशत। स्लाइड्स को एक रोगविज्ञानी द्वारा आँख बंद करके स्कोर किया गया था। जानवरों के प्रत्येक समूह के लिए औसत स्कोर की गणना स्लाइड के 10 अलग-अलग क्षेत्रों की गणना करके की गई थी।
सेल लाइनोंRPTEC / TERT1 सेल, कोलन कैंसर सेल्स (HCT116) और नॉन-स्मॉल सेल लंग कैंसर सेल्स (A549) अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (VA, USA) से खरीदे गए थे। संक्षेप में, RPTEC/TERT1 कोशिकाओं को पूर्ण Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम/F-12 माध्यम (DMEM/F12) में सुसंस्कृत किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है। 25) HCT116 और A549 कोशिकाओं को क्रमशः DMEM/F12 और RPMI1640 माध्यम में संवर्धित किया गया था, पूरक पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक्स और 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ। 5 प्रतिशत CO2 और 95 प्रतिशत O2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री पर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था।
सेल व्यवहार्यता परख और सेल एपोप्टोसिस विश्लेषणसेल व्यवहार्यता का निर्धारण RPTEC/TERT1 कोशिकाओं को 0.5mg/mL MTT अभिकर्मक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए उजागर करके किया गया था। अभिकर्मकों को हटा दिया गया था, गठित फॉर्मेज़ान नमक को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) में भंग कर दिया गया था और इसका पता लगाया गया था 570एनएम अवशोषण पर एनविज़न माइक्रोप्लेट रीडर। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में सूचित किया गया था। एनेक्सिन वी और प्रोपीडियम आयोडाइड (सेल एपोप्टोसिस को निर्धारित करने के लिए पीआईस्टेनिंग विश्लेषण का उपयोग किया गया था। संक्षेप में, आरपीटीईसी / टीईआरटी 1 कोशिकाओं को 0.25 प्रतिशत ट्रिप्सिन-एथिलीन-एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) द्वारा अलग किया गया था। सेल निलंबन को एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और पीआई के साथ अंधेरे में ऊष्मायन किया गया था। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री और उसके बाद बाध्यकारी बफर के साथ दो बार धुलाई। एपोप्टोटिक कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमीटर द्वारा गिना गया और कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया।
इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय का आकलनROS का स्तर DCFH-DA परख द्वारा निर्धारित किया गया था। RPTEC / TERT1 कोशिकाओं को 10uM DCFH-DA के साथ ऊष्मायन किया गया और 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। इसके बाद, डीसीएफएच-डीए डाई को हटा दिया गया और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से धोया गया। उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर क्रमशः 485 और 530 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर मापा गया था। इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय को कोशिकाओं को नियंत्रित करने के सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता के प्रतिशत के रूप में सूचित किया जाता है।
किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टांचे
प्लेटिनम संचय विश्लेषणसंचित प्लैटिनम को पचाए गए RPTEC/TERT1 कोशिकाओं और माउस दोनों में मापा गयागुर्देUNICAM 989 QZ AA स्पेक्ट्रोमीटर (जेलीन, नीदरलैंड्स) द्वारा। प्रत्येक 100μL नमूने में 1 प्रतिशत ट्राइटन X-100 के दस माइक्रोलीटर और 1 प्रतिशत नाइट्रिक एसिड के 400uL जोड़े गए। नमूने तब कम से कम 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किए गए थे। प्लेटिनम का पता लगाने से पहले, प्रत्येक नमूने को 1 प्रतिशत नाइट्रिक एसिड के साथ 10:1 पतला किया गया था। प्लैटिनम सांद्रता की गणना 1 प्रतिशत नाइट्रिक एसिड में पतला सिस्प्लैटिन के 2.5 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करके तैयार प्लैटिनम मानक वक्र के रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके की गई थी। प्लेटिनम की गणना एनजी/सेल नंबर या एनजी/गुर्दावजन।
3H-एमएमपी* तेज परखRPTEC / TERT1 कोशिकाओं में 3H-MPP प्लस को हमारी पिछली विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। 25) संक्षेप में, कोशिकाओं को गर्म परिवहन बफर से धोया गया था और आगे 20 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। सेल मोनोलयर्स को एच-एमपीपी प्लस (10 एनएम) के साथ जोड़ा गया और इसके बाद बर्फ-ठंडे परिवहन बफर से धोया गया। नमूने एकत्र किए गए और एच-एमपीपी प्लस की रेडियोधर्मी गतिविधि को तरल जगमगाहट काउंटर का उपयोग करके मापा गया।
पश्चिमी सोख्ता विश्लेषणप्रोटीन के भाव हमारे पिछले अध्ययन अनुसार संसाधित किए गए थे। 26) माउस से निकाले गए प्रोटीनगुर्दाऔर RPTEC/TERT1 कोशिकाओं को 12000rpm पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। कोशिकाओं और ऊतक से पृथक प्रोटीन की समान मात्रा को 10-12 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा विकृत और अलग किया गया। नमूने नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किए गए थे, इसके बाद नॉनफैट सूखे दूध (5 प्रतिशत) का उपयोग करके 1 एच गैर-विशिष्ट प्रोटीन अवरुद्ध किया गया था। झिल्ली को 24 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था और फिर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। प्रोटीन अभिव्यक्ति की तीव्रता का पता केमिलुमिनसेंट एचआरपी सब्सट्रेट का उपयोग करके लगाया गया और इमेजजे सॉफ्टवेयर द्वारा इसकी मात्रा निर्धारित की गई।
सांख्यिकीय विश्लेषणडेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। डेटा का विश्लेषण एकतरफा एनोवा द्वारा तुकी के पोस्टहॉक परीक्षणों (ग्राफपैड प्रिज्म 8.0) का उपयोग करके किया गया था। एक महत्व तब माना जाता है जब p-मान 0.05 से कम हो।
परिणाम पांडुरटिन ए सिस्प्लैटिन-प्रेरित तीव्र किडनी को ठीक करता हैचोट हमने पंडुरेट ए के प्रभाव की जांच कीगुर्दे की चोटचूहों में सिस्प्लैटिन के कारण। हमने सबसे पहले सामान्य खारा, पांडुरेट ए (50 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू), सिस्प्लैटिन (20 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू), और दोनों सिस्प्लैटिन (20 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू) के साथ उपचार के बाद चूहों में शरीर के वजन में परिवर्तन को मापकर सामान्य विषाक्तता का अवलोकन किया। ए (50 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू)। सिस्प्लैटिन-उपचारित चूहों में शरीर के वजन में कमी का संकेत मिला। पांडुरेट ए (छवि 1 ए) के साथ सह-उपचार द्वारा शरीर के वजन में कमी को कम किया गया था। नियंत्रण की तुलना में,गुर्दा कार्यजिसे सीरम क्रिएटिनिन स्तर द्वारा मापा गया था, यह दर्शाता है कि चूहों द्वारा उपचारित पांडुरेट ए अकेले सीरम क्रिएटिनिन स्तर को नहीं बदलता है; जबकि सिस्प्लैटिन-उपचारित चूहों ने सीरम क्रिएटिनिन के स्तर में काफी वृद्धि की थी, जो बिगड़ा हुआ गुर्दा समारोह दर्शाता है। पैंड्यूरेट ए के सह-प्रशासन में सीरम क्रिएटिनिन का स्तर सिस्प्लैटिन-उपचारित चूहों (छवि 1 बी) की तुलना में काफी कम हो गया था। इसके अलावा, प्लेटिनम का संचयगुर्दासिस्प्लैटिन और पैंड्यूरेट ए (छवि 1 सी) के साथ सह-उपचार किए गए चूहों की तुलना में अकेले सिस्प्लैटिन के साथ इलाज किए गए चूहों में ऊतक महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थे। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि पंडुरेट ए गुर्दे के ऊतकों में सिस्प्लैटिन सामग्री को प्रभावित नहीं करता है।गुर्देअकेले वाहन या पांडुरेट ए के साथ इलाज किए गए चूहों से प्राप्त कोई भी रोग संबंधी परिवर्तन नहीं दिखा। हालांकि, सिस्प्लैटिन-उपचारित चूहों ने वाहन-उपचार वाले चूहों की तुलना में अधिक ट्यूबलर क्षति दिखाई, जैसा कि अध: पतन और विलुप्त होने में वृद्धि, ल्यूमिनल कास्ट्स के गठन, मोनोन्यूक्लियर सेल घुसपैठ, कैरियोमेगाली, इंटर-ट्यूबलर हैमोरेजिया और फैलाव द्वारा दिखाया गया है। इन रोग परिवर्तनों को पंडुरेट ए (छवि 2 ए, तालिका 1) के सह-प्रशासन द्वारा महत्वपूर्ण रूप से देखा गया था। एनजीएएल (एक नेफ्रोटॉक्सिसिटी बायोमार्कर), और ईआरके 1/2 और क्लीवेड कास्पेज़ 3 (प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन) के अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किए गए थे। हमारे अध्ययन से पता चला है कि सिस्प्लैटिन के साथ इलाज किए गए चूहों ने वाहन-उपचार वाले चूहों की तुलना में NGAL, p-ERK1 / 2, और cleaved caspase 3 की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि की है। पंडुरेट ए के साथ सह-उपचार ने सिस्प्लैटिन उपचार (छवि 2 बी) से प्रेरित इन प्रोटीनों को काफी कम कर दिया।
पंडुरेट ए एपोप्टोटिक सिग्नलिंग पाथवे को रोककर मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन-प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को रोकता हैसिस्प्लैटिन (50 µm) 72 घंटे के ऊष्मायन के बाद RPTEC/TERT1 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को दर्शाता है। दिलचस्प बात यह है कि पंडुरेट ए (1 और 5 माइक्रोन) के साथ सह-उपचार ने सेल व्यवहार्यता (छवि 1 ए) में काफी वृद्धि की है।
3ए)। सिस्प्लैटिन की साइटोटोक्सिसिटी के खिलाफ पांडुरटिन ए के सुरक्षात्मक प्रभाव की पुष्टि सेल एपोप्टोसिस के माप से की गई थी। जैसा कि अपेक्षित था, 48 घंटे के लिए 50 माइक्रोन सिस्प्लैटिन के लिए कोशिकाओं के संपर्क में आरपीटीईसी / टीईआरटी1 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस में काफी वृद्धि हुई है। इस प्रभाव को पांडुरेट ए (छवि 3 बी) द्वारा देखा गया था। हमने जांच की कि क्या सिस्प्लैटिन की विषाक्तता पर पंडुरेट ए के प्रभाव को एएमपीके की सक्रियता की आवश्यकता है। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 3C, एएमपीके के एक सक्रिय रूप, पी-एएमपीके की प्रोटीन अभिव्यक्ति, पांडुरेट ए द्वारा बढ़ाई गई थी, जबकि इसे सिस्प्लैटिन द्वारा कम किया गया था। इसके अलावा, एएमपीके निषेध के तहत पांडुरेट ए का सुरक्षात्मक प्रभाव निर्धारित किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि एएमपीके के अवरोधक 10 माइक्रोन यौगिक सी के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन ने सेल व्यवहार्यता (छवि 3 डी) पर पांडुरेट ए के सुरक्षात्मक प्रभाव को कम नहीं किया। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एएमपीके-स्वतंत्र तंत्र द्वारा पंडुरेट ए के सुरक्षात्मक प्रभाव की मध्यस्थता की जा सकती है। हमने अगली बार सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित सेल एपोप्टोसिस में शामिल कुछ प्रोटीनों पर पंडुरेट ए के प्रभाव की जांच की। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 4, सिस्प्लैटिन ने प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन पी-ईआरके 1/2 और क्लीवेड कास्पेज़ 3 में काफी वृद्धि की। सिस्प्लैटिन ने एपोप्टोटिक विरोधी प्रोटीन बीसीएल -2 की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। पांडुरेट ए के साथ सह-उपचार ने इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति को उलट दिया। चूंकि आरओएस सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित वृक्क कोशिका एपोप्टोसिस में शामिल एक प्रमुख कारक है, 11, 27) हमने सिस्प्लैटिन के कारण आरओएस संचय पर पांडुरटिन ए के प्रभाव को निर्धारित किया। सिस्प्लैटिन ने आरओएस के इंट्रासेल्युलर स्तर में काफी वृद्धि की। दिलचस्प बात यह है कि पांडुरटिन ए ने सिस्प्लैटिन-प्रेरित आरओएस संचय को काफी कम कर दिया है।
पांडुरटिन ए सिस्प्लैटिन के सेलुलर संचय को प्रभावित नहीं करता है OCT2मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन परिवहन की मध्यस्थता करता है। 289 पांडुरटिन ए को कम करने वाले सिस्प्लैटिन संचय की संभावना की जांच करने के लिए, हमने OCT2 के परिवहन कार्य को मापा। परिणामों से पता चला कि 10 मिनट और 24 घंटे के लिए 5uM पांडुरटिन ए के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन का H -1- मिथाइल -4- के सेलुलर संचय पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जो OCT2 का एक सब्सट्रेट है। इसके बाद, सिस्प्लैटिन सेलुलर संचय पर पांडुरटिन ए के प्रभाव की पुष्टि की गई। पांडुरटिन ए का मानव वृक्क कोशिकाओं में प्लैटिनम संचय पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 5)।
पांडुरटिन ए का सुरक्षात्मक प्रभाव सिस्प्लैटिन की कैंसर विरोधी गतिविधि को प्रभावित नहीं करता हैकैंसर सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन की विषाक्तता पर पांडुरटिन ए का प्रभाव निर्धारित किया गया था। HCT116 और A549 कोशिकाओं की वी-क्षमता, जो क्रमशः बृहदान्त्र और फेफड़े के कैंसर कोशिका रेखाएं हैं, सिस्प्लैटिन 50μuM） के साथ उपचार के बाद 72 घंटे में काफी कम हो गई थी। पांडुरटिन A（5μM） के साथ सह-उपचार ने सिस्प्लैटिन की साइटोटोक्सिसिटी को कम नहीं किया। दिलचस्प बात यह है कि पांडुरटिन ए ने भी खुद को कम कर दिया
बहस
वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि पांडुरटिन ए बृहदान्त्र और गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन की एंटीकैंसर गतिविधि को प्रभावित किए बिना सीआईएस-प्लैटिन नेफ्रोटॉक्सिसिटी को कम करता है। हमने दिखाया कि पांडुरटिन ए के साथ सह-उपचार तीव्र होता हैगुर्दे की चोटसिस्प्लैटिन के कारण चूहों में। हालांकि वर्तमान अध्ययन सिस्प्लैटिन-प्रेरित पर सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाता हैगुर्दे की चोट,पांडुरटिन ए के प्राथमिक लक्ष्य की पहचान नहीं की गई है। पांडुरटिन ए एएमपीके को वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं (चित्र 3) और अन्य प्रकार की कोशिकाओं में सक्रिय कर सकता है। 30-2) ऐसा लगता नहीं है कि पांडुरटिन ए के सुरक्षात्मक प्रभाव के लिए एएमपीके की सक्रियता की आवश्यकता है क्योंकि सबूत से पता चला है कि रासायनिक अवरोधकों का उपयोग करके एएमपीके का निषेध पांडु-रेटिंग ए के सुरक्षात्मक प्रभाव को नहीं बदला। पांडुरटिन ए में सुधार हुआ गुर्दे का कार्य जैसा कि कम सीरम क्रिएटिनिन द्वारा दिखाया गया है। सिस्प्लैटिन-बिगड़ा हुआ गुर्दे का कार्य गुर्दे की नलिका की चोटों जैसे कि अध: पतन, ल्यूमिनल कास्ट गठन, रक्तस्राव और फैलाव के साथ सहसंबद्ध है। गुर्दे की नलिका की चोट के परिणाम हमारे डेटा के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध होते हैं, जो एनजीएएल अभिव्यक्ति को शामिल करते हैंगुर्दासिस्प्लैटिन के साथ इलाज किए गए चूहों के ऊतक। इसके अलावा, इस सबूत को पिछले अध्ययन द्वारा समर्थित किया गया है जिसमें दिखाया गया है कि एनजीएएल को गुर्दे की नलिकाओं में तीव्र के बाद स्पष्ट रूप से व्यक्त किया गया हैगुर्दे की चोटसिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित। 3) दिलचस्प रूप से, पांडुरटिन ए के साथ चूहों का सह-उपचार, सिस्प्लैटिन-प्रेरित गुर्दे की नलिका की चोट। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि सिस्प्लैटिन ने मोनोन्यूक्लियर सेल घुसपैठ में वृद्धि की और इस प्रभाव को पांडुरटिन ए द्वारा समाप्त कर दिया गया। इन परिणामों का अर्थ है कि पांडुरटिन ए, जिसे पहले एक विरोधी सूजन दिखाया गया है, 24.3435) गुर्दे के ऊतकों में सिस्प्लैटिन के भड़काऊ प्रभाव को कम कर सकता है। MAPK सक्रियण कोशिका मृत्यु को प्रेरित कर सकता है। 2415) हमारे परिणामों से पता चला है कि सिस्प्लैटिन ने ERK1 / 2 और caspase 3 की सक्रियता को प्रेरित किया। इन प्रोटीनों की अभिव्यक्तियों को पांडुरटिन ए द्वारा देखा गया था।
सिस्प्लैटिन-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी (एपोप्टोसिस, ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन सहित) में योगदान देने वाले कई रास्ते बताए गए हैं। हमने पांडुरटिन के तंत्र की पहचान करने के लिए RPTEC / TERT1 सेल लाइन का उपयोग किया है जो मानव गुर्दे के समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन के कारण होने वाली विषाक्तता को कम करता है। RPTEC / TERT1 कोशिकाओं को xenobiotic- प्रेरित विषाक्तता के लिए एक वृक्क कोशिका मॉडल के रूप में सुझाया गया है। 36Panduratin A सिस्प्लैटिन साइटोटोक्सिसिटी के संबंध में एक सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदर्शित करता है जैसा कि RPTEC / TERT1 सेल एपोप्टोसिस में कमी से दिखाया गया है। गुर्दे के समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन की विषाक्तता के तंत्र जटिल हैं। ERK1 / 2 और caspase 3 सक्रियण और Bcl -2 कमी को सिस्प्लैटिन के कारण वृक्क कोशिका एपोप्टोसिस में फंसाया गया है। 373) पिछले अध्ययनों के अनुरूप, वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि सिस्प्लैटिन p-ERK1 / 2 और cleaved caspase की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है। 3 और Bcl-2 व्यंजक घटाता है। हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि पांडुरटिन ए सिस्प्लैटिन-प्रेरित एपोप्टोटिक सिग्नलिंग प्रोटीन, पी-ईआरके 1/2 और क्लीवेड कास्पेज़ 3 को दबा देता है, और एपोप्टोटिक विरोधी प्रोटीन को बनाए रखता है। बीसीएल-2. ERK1 / 2 और caspase 3 की सक्रियता के अलावा, बढ़ा हुआ इंट्रासेल्युलर ROS संचय सिस्प्लैटिन के कारण वृक्क कोशिका एपोप्टोसिस का एक महत्वपूर्ण कारक है। 139A पिछले अध्ययन में बताया गया है कि पांडुरटिन ए प्रतिक्रियाशील के कारण इंट्रासेल्युलर आरओएस गठन को कम करके हेपेटोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाता है। मध्यवर्ती.4 पांडुरटिन ए के साथ उपचार के बाद आरओएस संचय में कमी को आरओएस उत्पादन के निषेध या आरओएस मैला ढोने की प्रतिक्रिया में वृद्धि द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। हमने बताया कि पांडुरटिन ए बढ़ा हुआ ग्लूटाथियोन स्तर, एक आरओएस मैला ढोने वाला अणु है, जो गुर्दे के ऊतकों में आरओएस संचय को कम कर सकता है (पूरक सामग्री देखें)। हालाँकि, हम इस बात से इंकार नहीं करते हैं कि अन्य तंत्र ROS में कमी में शामिल हैं। हमारे परिणामों से पता चला है कि पांडुरटिन ए इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय को कम करता है, जो पांडुराटिन ए के सुरक्षात्मक प्रभाव में योगदान देता है। सिस्प्लैटिन का इंट्रासेल्युलर स्तर सिस्प्लैटिन-प्रेरित विषाक्तता की गंभीरता को प्रभावित करने वाला प्राथमिक कारक है। OCT2, कॉपर ट्रांसपोर्टर और मल्टीड्रग और टॉक्सिन एक्सट्रूज़न ट्रांसपोर्टर -1 (MATE1) जैसे रेनल ट्रांसपोर्टर्स को सिस्प्लैटिन ट्रांसपोर्ट में योगदान करने के लिए सूचित किया गया है। 4) हालांकि, सिस्प्लैटिन का रीनल समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में परिवहन मुख्य रूप से OCT2 द्वारा मध्यस्थता है। ओसीटी के निषेध को सुसंस्कृत गुर्दे की कोशिकाओं और जानवरों दोनों में सिस्प्लैटिन-प्रेरित गुर्दे की विषाक्तता को कम करने के लिए दिखाया गया है। 9,42） हालांकि, ऐसा लगता है कि पांडुराटिन ए ओसीटी 2 परिवहन कार्य या सिस्प्लैटिन के संचय को प्रभावित नहीं करता है, जो पांडुरटिन ए के सुरक्षात्मक प्रभाव का सुझाव देता है। सिस्प्लैटिन के परिवहन या संचय को कम करके सिस्प्लैटिन की विषाक्तता की मध्यस्थता नहीं की जाती है।
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पांडुरटिन ए रीनल सेल एपोप्टोसिस के निषेध के माध्यम से रीनोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रदर्शित करता है। यदि पांडुरटिन ए भी कैंसर कोशिका एपोप्टोसिस को रोकता है, तो यह कीमोथेरेपी प्रभावकारिता को कम करेगा। इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या पांडुरटिन ए सिस्प्लैटिन की एंटीकैंसर गतिविधि को कम करता है। गौरतलब है कि पांडु-रेटिंग ए के साथ सह-उपचार से कोलन या नॉन-स्मॉल लंग सेल कैंसर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन की कैंसर-विरोधी गतिविधि में कोई बदलाव नहीं आता है। इसके अलावा, पांडुरटिन ए ही दोनों कैंसर सेल लाइनों के लिए विषाक्त है। परिणाम बताते हैं कि पांडुरटिन ए का प्रभाव चयनात्मक है, सामान्य वृक्क कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं को अलग तरह से प्रभावित करता है। हालांकि पैन-अवधि ए सिस्प्लैटिन-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए एक अच्छा एजेंट हो सकता है, भविष्य में एक्सनोग्राफ़्ट मॉडल में नैदानिक रूप से प्रासंगिक पांडुरटिन ए के औषधीय प्रभावों से संबंधित जानकारी की जांच की जानी चाहिए।
निष्कर्ष
हमारे वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि पांडुरटिन ए ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और ईआरके 1/2 और कैस्पेज़ 3 सक्रियणों को रोककर सिस्प्लैटिन की नेफ्रोटॉक्सिसिटी पर एक उल्लेखनीय सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान करता है। पांडुरटिन ए के सुरक्षात्मक प्रभाव ने कैंसर कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन की कैंसर-विरोधी गतिविधि को नहीं बदला। भले ही कुछ हानिकारक घटनाओं को अवरुद्ध करने से केवल आंशिक रीनोप्रोटेक्टिव प्रभाव हो सकते हैं, पांडुरटिन ए सिस्प्लैटिन की नेफ्रोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार एजेंट हो सकता है क्योंकि यह कई तंत्रों के माध्यम से सिस्प्लैटिन की विषाक्तता को कम करता है।
