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एचएसए-माइक्रोआरएनए -4535-मध्यस्थ टीजीएफ /स्मैड सिग्नलिंग के माध्यम से एच2ओ2/यूवीबी-प्रेरित त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोलेजन गिरावट के खिलाफ सिस्टैंच ट्यूबलोसा के सुरक्षात्मक प्रभाव

May 10, 2023

अमूर्त

इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो और फोटोडैमेज के विवो मॉडल में एच2ओ2/यूवीबी-प्रेरित क्षति के खिलाफ सिस्टैंच के सुरक्षात्मक प्रभावों के अंतर्निहित तंत्र की जांच करना है। इसके अलावा, हमने इस प्रक्रिया में miRNA विनियमन की भागीदारी की पहचान की। H2O2/UVB-उपचारित HS68 मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट और UVB-प्रेरित C57BL/6J नग्न चूहों का उपयोग इन विट्रो और फोटोडैमेज के विवो मॉडल में किया गया था। नतीजों ने दिखाया किसिस्टंच उपचारसेल की व्यवहार्यता में एच2ओ2/यूवीबी-प्रेरित कमी, टीजीएफ/स्मैड सिग्नलिंग हानि, और त्वचीय उम्र बढ़ने को कम किया। माइक्रोआरएनए सरणी विश्लेषण और डेटाबेस खोजों के परिणामों के आधार पर, है-एमआईआर -4535 को एक संभावित उम्मीदवार एमआईआरएनए के रूप में पहचाना गया था जो स्मैड4 को लक्षित करता है। कृत्रिम परिवेशीय,सिस्टंच उपचारH2O2/UVB-उजागर कोशिकाओं में सक्रिय Smad2/3/4 जटिल और बाधित hsa-miR -4535 अभिव्यक्ति। विवो में, C57BL/6J नग्न चूहों की पृष्ठीय त्वचा के लिए कम (12 मिलीग्राम/किग्रा) और उच्च खुराक (24 मिलीग्राम/किग्रा) सिस्टैंच के सामयिक अनुप्रयोग ने टीजीएफ/स्मैड कोलेजन संश्लेषण संकेतन को बढ़ावा देकर यूवीबी-प्रेरित त्वचा फोटोडैमेज को काफी कम कर दिया। कमीएपिडर्मल हाइपरप्लासिया, शिकन गठन, औरत्वचा की जीर्णता, साथ हीhsa-miR -4535 अभिव्यक्ति को रोकना. एक साथ लिया गया, हमारे निष्कर्ष hsa-miR -4535 और TGF /Smad कोलेजन सिंथेसिस सिग्नलिंग के बीच एक लिंक का संकेत देते हैंऔर इन कारकों को शामिल करने का सुझाव देंफोटो-सुरक्षात्मक तंत्रधनियात्वचीय फाइब्रोब्लास्ट मेंएच के खिलाफ2O2/यूवीबी-प्रेरित उम्र बढ़ने। सबूतों ने संकेत दियाधनियासाथएंटी-एजिंग गुणहो सकता हैत्वचा देखभाल उत्पादों में एक पूरक के रूप में माना जाता है।

Cistanche Anti-Aging

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परिचय

मानव त्वचा की उम्र बढ़ने के नैदानिक ​​संकेतों में बढ़ी हुई झुर्रियाँ, ढीलापन और अनियमित रंजकता [1] शामिल हैं। त्वचा की उम्र बढ़ने की प्रक्रिया जटिल है और इसे दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: आंतरिक उम्र बढ़ने और बाहरी उम्र बढ़ने। आंतरिक बुढ़ापा समय बीतने और आनुवंशिक कारकों के कारण होता है, जबकि बाह्य बुढ़ापा, जिसे फोटोएजिंग भी कहा जाता है, मुख्य रूप से पराबैंगनी विकिरण [2, 3] के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप होता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रचुर मात्रा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) दोनों आंतरिक और बाह्य उम्र बढ़ने के दौरान उत्पन्न होती हैं। ROS का संचय माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज (MAPK) सिग्नलिंग को प्रेरित कर सकता है और इसके डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, एक्टिवेटर प्रोटीन -1 (AP -1) को सक्रिय कर सकता है। सक्रिय एपी -1 नाभिक में परिवर्तित हो सकता है और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) [4] के प्रवर्तक क्षेत्रों से जुड़ सकता है। एमएमपी एक बड़ा जिंक-आश्रित एंडोपेप्टिडेज समूह है, जो त्वचा के डर्मिस बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के क्षरण में योगदान देता है। विशेष रूप से, MMP-1, एक कोलेजेनेज़, कोलेजन प्रकार I और III [5] के विदलन में शामिल है। कोलेजन प्रकार I और III, ECM के प्रमुख घटक, त्वचा की डर्मिस को समर्थन और शक्ति प्रदान करने में सक्षम हैं और उनकी अव्यवस्था वृद्ध त्वचा की विशेषता झुर्रियों और शिथिलता की ओर ले जाती है [6]। ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-बीटा (टीजीएफ) तीन अलग-अलग आइसोफॉर्म, टीजीएफ 1, टीजीएफ 2 और टीजीएफ 3 के साथ एक सर्वव्यापी और शक्तिशाली साइटोकिन है, जो मानव त्वचा डर्मिस [2] में कोलेजन संश्लेषण को सकारात्मक रूप से नियंत्रित कर सकता है। टीजीएफ एस टीजीएफ रिसेप्टर प्रकार I (टी आरआई) और II (टी आरआईआई) सहित विशिष्ट सेल सतह सेरीन / थ्रेओनीन किनासे रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स के साथ बातचीत करके अपना संकेत आरंभ करता है। टी आरआई फॉस्फोराइलेशन आर-स्मैड्स (Smad2 और Smad3) के फॉस्फोराइलेशन को ट्रिगर करता है। सक्रिय R-Smads अपने न्यूक्लियस ट्रांसलोकेशन को विनियमित करने के लिए Smad4 के साथ इंटरैक्ट करता है और Smad-बाइंडिंग एलिमेंट्स (SBE) [7, 8] के प्रमोटरों के लिए बाइंडिंग के माध्यम से कोलेजन प्रकार I और III को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय करता है। बढ़ते साक्ष्य इंगित करते हैं कि उन्नत आरओएस पीढ़ी, आंतरिक या फोटोएजिंग से प्रेरित, टीजीएफ / स्मैड सिग्नलिंग पाथवे हानि में योगदान करती है, जिसके परिणामस्वरूप मानव त्वचा त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट [9, 10] में कोलेजन संश्लेषण कम हो जाता है।

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सिस्टैंच (3,5,7-ट्राइहाइड्रॉक्सीफ्लेवोन), फ्लेवोनोइड परिवार का एक प्राकृतिक सदस्य, एल्पिनिया ऑफिसिनारम और प्रोपोलिस में प्रचुर मात्रा में होता है। इस्केमिक स्ट्रोक, मधुमेह और विभिन्न प्रकार के कैंसर [11-13] के इलाज के लिए सिस्टैंच एक संभावित उम्मीदवार है। इसके अलावा, सिस्टैन्श में कट्टरपंथी मैला ढोने और विरोधी भड़काऊ गतिविधियां होती हैं [14, 15]। हमने पहले दिखाया था कि सिस्टैन्च ने H2O 2-प्रेरित सूजन को कम किया और HS68 कोशिकाओं [16, 17] में इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक 1 रिसेप्टर (IGFI-R)/ERK1/2 सिग्नलिंग पाथवे के माध्यम से कोलेजन गठन को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, एक अध्ययन से संकेत मिलता है कि सिस्टैंच की पहचान एल्पिनिया ऑफिसिनारम के यौगिक के रूप में की गई थी और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं [18] में कोलेजेनेज़ निरोधात्मक प्रभाव रखती है। हालांकि, एक अधिक विस्तृत आणविक तंत्र से संबंधित है कि कैसे सिटैश त्वचीय त्वचा की उम्र बढ़ने को नियंत्रित करता है अज्ञात है।

MicroRNAs (miRNAs) 22 न्यूक्लियोटाइड्स की औसत लंबाई वाले छोटे, एकल फंसे हुए, गैर-कोडिंग RNA अणुओं का एक समूह है। परिपक्व miRNAs को डीएनए अनुक्रमों से लिखित किया जाता है। ज्यादातर मामलों में, परिपक्व miRNAs लक्ष्य mRNAs के 3unt-अनियंत्रित क्षेत्रों (UTRs) को मौन mRNA अनुवाद [19] से बाँधते हैं। मानव त्वचा में, miRNAs सेल चयापचय, कैंसर, जीर्णता और कोलेजन गठन [20-23] के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, miR -377 डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1 (DNMT1) अभिव्यक्ति को बाधित करने के माध्यम से त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट सेनेसेंस को प्रेरित कर सकता है, जो बाद में p53 प्रमोटर और डर्मल फ़ाइब्रोब्लास्ट सेनेसेंस [22] में कम मेथिलिकरण की ओर जाता है। मानव त्वचीय में UVB-प्रेरित क्षति में miRNA प्रोफ़ाइल

पैपिला कोशिकाओं (एनएचडीपी) की पहले जांच की गई थी [24]। हालांकि, कैसे यूवीबी-प्रेरित त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट जीर्णता miRNA विनियमन के माध्यम से, विशेष रूप से प्राकृतिक यौगिक की भागीदारी में काफी हद तक अज्ञात है। इस अध्ययन का उद्देश्य H2O2/UVB-प्रेरित त्वचीय क्षति के खिलाफ सिस्टंच के सुरक्षात्मक प्रभावों के साथ-साथ इस प्रक्रिया में माइक्रोआरएनए-मध्यस्थता कोलेजन गिरावट की भूमिका की जांच करना है। हमने आगे कोलेजन संश्लेषण को विनियमित करने में शामिल माइक्रोआरएनए की पहचान करने का लक्ष्य रखा है।

परिणाम

cistanche HS68 मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट में UVB/H2O 2-प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को रोकता है

इन विट्रो में सिस्टैंच (चित्रा 1ए) की साइटोटोक्सिसिटी की जांच करने के लिए, एचएस68 कोशिकाओं को सिस्टेन्च की विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया गया (0, 1 0, 2 0, 30, 40, 50 माइक्रोन) 24 घंटे के लिए। एमटीटी परख के परिणामों से पता चला है कि HS68 कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के लिए साइटोटोक्सिक साइटोटोक्सिक नहीं था। इसके बाद, हमने HS68 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) और UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) की विभिन्न खुराकों से अवगत कराया। H2O2 और UVB उपचार ने खुराक पर निर्भर तरीके से सेल व्यवहार्यता को कम कर दिया (चित्र 1C, 1D)। H2O2 और UVB एक्सपोजर के बाद सिस्टेंश के साइटोप्रोटेक्टिव गुणों का मूल्यांकन करने के लिए, हमने H2O 2- (200 μM) और UVB- प्रेरित (40 mJ/cm²) के बाद सिस्टंच (10, 20, 30 μM) की विभिन्न सांद्रता के साथ HS68 सेल का इलाज किया। ) आघात। H2O2 या UVB उपचार अकेले

HS68 कोशिकाओं की व्यवहार्यता में काफी कमी (40 प्रतिशत)। हालांकि, सिस्टंचे उपचार ने कोशिका मृत्यु को एकाग्रता-निर्भर तरीके से रोका (चित्र 1E, 1F)। धनिया की उच्च सांद्रता (30 μM) ने H2O 2- और UVB- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को प्रमुखता से कम किया। इसलिए, इसकी सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए बाद में इन विट्रो अध्ययनों में 30 μM सिस्टंच की खुराक का उपयोग किया गया था

HS68 कोशिकाओं में प्रभाव।



सिस्टैंच एपोप्टोसिस के बजाय H2O 2- प्रेरित HS68 सेल जीर्णता को क्षीण करता है

यह निर्धारित करने के लिए कि सेल व्यवहार्यता में कमी कोशिका मृत्यु या विकास अवरोध के कारण थी, हमने H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) की विभिन्न खुराकों के संपर्क में आने वाले HS68 कोशिकाओं में पश्चिमी सोख्ता द्वारा कई एपोप्टोसिस और उत्तरजीविता मार्करों की अभिव्यक्ति की जाँच की। 24 घंटे के लिए। हमने पी-एक्ट जैसे उत्तरजीविता मार्करों की अभिव्यक्ति में काफी कमी पाई, और की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई

apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 माइक्रोन एच 2 ओ 2 (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, हमने एनीक्सिन वी और पीआई धुंधला का उपयोग करके एपोप्टोटिक कोशिकाओं का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का प्रदर्शन किया और इसी तरह के परिणाम देखे। एक साथ लिया गया, 200 μM H2O2 ने HS68 सेल एपोप्टोसिस (चित्र 2B) का कारण नहीं बनाया। अगला, हमने कई की अभिव्यक्ति का पता लगाया
बुढ़ापा मार्कर, जैसे p16, p21, और SA- -gal, जीर्ण होने वाली कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए। हमारे परिणामों से पता चला है कि सिस्टंच उपचार ने H2O 2- प्रेरित p16 और p21 प्रोटीन स्तर के साथ-साथ SA - -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्र 2C, 2D) की संख्या में काफी कमी की है।



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चित्र 1. सिस्टेंच HS68 मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट में UVB/H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को रोकता है। (ए) धनिया की रासायनिक संरचना। (बी) HS68 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता सिस्टंच (1 0, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0 μM के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है। ) 24 घंटे के लिए। (सी और डी) 24 घंटे के लिए एच2ओ2 (100, 150, 200, 250, 300 माइक्रोएम) या यूवीबी (25, 30, 40, 50, 60 जे/सेमी2) की विभिन्न खुराक के संपर्क में आने वाले एचएस68 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता। (ई और एफ) एच2ओ2 (200 माइक्रोन) के संपर्क में आने वाले एचएस68 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता या 1 घंटे के लिए यूवीबी (40 जे/सेमी2) के साथ विकिरणित और फिर 23 घंटे के लिए सिस्टंच (10, 20, 30 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया। Cistanche के साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव MTT परख द्वारा निर्धारित किए गए थे। नियंत्रण कक्षों को 100 प्रतिशत व्यवहार्यता सौंपी गई थी। मान ± SE के रूप में दिखाए जाते हैं। परिणामों का परिमाण दिखाया गया है (n=3) * P <0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 बनाम अनुपचारित नियंत्रण कक्ष; ##पी <0.01, ###पी <0.001 बनाम एच2ओ2 या यूवीबी-उपचारित कोशिकाएं।

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cistanche UVB/H2O 2-प्रेरित इंट्रासेल्युलर/माइटोकॉन्ड्रियल ROS उत्पादन और HS68 कोशिकाओं में MMP असंतुलन को कम करता है
ऑक्सीडेटिव तनाव विभिन्न रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और अंतर्जात या बहिर्जात कारकों से प्रेरित हो सकता है। यहां, हमने ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए एक अंतर्जात और यूवीबी के रूप में एक अंतर्जात और यूवीबी के रूप में एच 2 ओ 2 का उपयोग किया और फिर आरओएस की जांच की, जो सिस्टैंच की गतिविधियों को खत्म कर रहा है। ROS के स्रोतों की पहचान करने के लिए, MitoSOX और DCFH-DA का उपयोग इंट्रासेल्युलर और माइटोकॉन्ड्रियल ROS को निर्धारित करने के लिए किया गया था। अभिरंजक परिणामों से पता चला है कि H2O2 और UVB उपचार ने ROS संचय को प्रेरित किया जबकि सिस्टेन्चे उपचार ने ROS पीढ़ी को कम कर दिया (चित्र 3ए, 3बी)। इसके अलावा, जैसा कि असंतुलित एमएमपी कोशिका मृत्यु की शुरुआत कर सकता है, हमने एमएमपी में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए जेसी -1 का उपयोग किया। सामान्य माइटोकॉन्ड्रिया लाल (जेसी -1 डिमर) लाल होता है जबकि बिगड़ा हुआ माइटोकॉन्ड्रिया हरा (जेसी -1 मोनोमर्स) प्रवाहित होता है। यूवीबी और एच2ओ2 जोखिम ने हरे रंग के प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर को प्रेरित किया। विशेष रूप से, सिस्टेन्चे उपचार ने हरे रंग के फ्लोरेसेंस को लाल रंग में स्थानांतरित कर दिया, जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों(चित्रा 3सी)के पुनरुद्धार का संकेत देता है।


cistanche HS68 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित TGF /Smad कोलेजन संश्लेषण मार्ग की हानि को कम करता है

टीजीएफ / स्मॉड सिग्नलिंग मानव त्वचा त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स [25-27] में कोलेजन गठन के लिए अनुकूल है। इसलिए, हमने H2O2 के संपर्क में आने वाली HS68 कोशिकाओं में TGF / Smad पाथवे के माध्यम से कोलेजन संश्लेषण में सिस्टंच की भूमिका की जांच की। वेस्टर्न ब्लॉट के परिणामों ने संकेत दिया कि सिस्टेन्श ने एच2ओ 2-एक्सपोज्ड एचएस68 कोशिकाओं (चित्र 4ए) में टीजीएफ/स्मैड सिग्नलिंग के साथ-साथ कोलेजन संश्लेषण में काफी वृद्धि की है। इसके अलावा, कोलेजन टाइप I और III का अव्यवस्था वृद्ध त्वचा फाइब्रोब्लास्ट [28] की विशिष्ट विशेषताओं में से एक है। चूंकि एमएमपी परिवार को कोलेजन अपचय [29] में फंसाया गया है, इसलिए हमने अगली बार एमएमपी -1 सक्रियण पर सिस्टैंच के प्रभाव की पुष्टि की। हमने पाया कि सिस्टेन्श ने H2O2-वर्धित MMP-1 स्तर (चित्र 4A) को दबा कर HS68 कोशिकाओं में कोलेजन गिरावट को रोका।

इसके अलावा, हमने अकेले H2O2 के साथ इलाज किए गए HS68 कोशिकाओं की तुलना करके या इम्युनोब्लॉटिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके सिस्टैंच के साथ सह-उपचार करके इस सुरक्षात्मक क्रिया को अंतर्निहित उपकोशिकीय आणविक तंत्र की पहचान की। सिस्टैन्च उपचार ने p-smad2/3 और Smad4 के परमाणु संचय को बढ़ाया जो HS68 कोशिकाओं में H2O2 के संपर्क में आने से बाधित हो गया था

(चित्र 4बी, 4सी)। इन निष्कर्षों ने संकेत दिया कि HS68 कोशिकाओं में TGF / Smad मार्ग को सक्रिय करके H2O 2- प्रेरित कोलेजन विखंडन में सुधार कर सकता है।


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चित्र 2. सिस्टैंच एपोप्टोसिस के बजाय H2O 2- प्रेरित HS68 सेल जीर्णता को क्षीण करता है। (ए) एचएस68 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एच2ओ2 (50, 100, 200, 300, 400 माइक्रोन) की विभिन्न खुराकों के संपर्क में लाया गया था। पश्चिमी धब्बा द्वारा एपोप्टोसिस और उत्तरजीविता संबंधी मार्करों का पता लगाया गया। (बी) एनेक्सिन वी और पीआई दाग वाली कोशिकाओं का एच2ओ2 एक्सपोजर के तहत एपोप्टोटिक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। (सी) HS68 सेल थे
1 घंटे के लिए H2O2 (200 µM) के संपर्क में और फिर 23 घंटे के लिए सिस्टंच (30 µM) से उपचारित। पश्चिमी धब्बा द्वारा एजिंग मार्कर जैसे p16 और p21 का पता लगाया गया। जीएपीडीएच को एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था। (डी) जीर्णता से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (एसए {{1 0}} गैल) का पता लगाने वाली किट का उपयोग करके सेन्सेंट कोशिकाओं का पता लगाया गया। SA- -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं को हरे रंग में दिखाया गया है। (सी) मान मतलब ± एसई के रूप में दिखाए जाते हैं। परिणामों की मात्रा दर्शाई गई है (n=3) **P <0.01, ***P <0.001 बनाम अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाएं; ##पी <0.01, ###पी <0.001 बनाम एच2ओ 2-उपचारित कोशिकाएं।


सिस्टैन्च उपचार H2O 2- hsa-miR -4535 की प्रेरित अपरेगुलेटेड अभिव्यक्ति को कम करता है, जो कि Smad4 को लक्षित करने के लिए अनुमानित है
सिस्टैन्च-उपचारित HS68 कोशिकाओं के miRNA सरणी विश्लेषण से पता चला है कि hsa-miR -4535 एक्सप्रेशन को सिस्टंच-उपचारित समूह में नियंत्रण समूह (चित्र 5A) की तुलना में कम किया गया था। इसके अलावा, miRNA डेटाबेस, जैसे कि miRDB और TargetScanHuman का उपयोग करते हुए, हमने Smad 4-3′-UTR (चित्र 5B) में hsa-miR -4535 के लिए एक पुष्ट संरक्षित लक्ष्य साइट की भविष्यवाणी की। लक्ष्य साइट की पुष्टि करने के बाद, Smad 4-3 U-UTR-WT और Smad 4-3 U-UTR MT रिपोर्टर निर्माणों को hsa-miR -4535 के प्रत्यक्ष बंधन को सत्यापित करने के लिए HS68 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। पागल4-
3'-यूटीआर। हमने वाइल्ड टाइप और म्यूटेंट स्मॉड 4-3}-UTR समूहों के बीच hsa-miR -4535 मिमिक ट्रांसफ़ेक्शन (चित्र 5C) के बीच लूसिफ़ेरेज़ गतिविधियों में 50 प्रतिशत की कमी देखी। हमने तब hsa-miR -4535 और HS68 कोशिकाओं में Smad 4 के नियमन पर H2O2 (100,200 μM) के प्रभावों का आकलन किया, और पाया कि H2O2 खुराक पर निर्भर hsa-miR -4535 और Smad4 RNA को दबा दिया व्यंजक (चित्र 6क, 6ख)। इसके अलावा, hsa-miR -4535 और Smad4 एक्सप्रेशन में यह प्रवृत्ति सिस्टेन्च उपचार के बाद उलट गई थी, यह दर्शाता है कि Smad सिग्नलिंग का विनियमन H2O 2- प्रेरित HS68 सेल क्षति के सिस्टेन्चे-मध्यस्थता उन्मूलन में शामिल हो सकता है ( चित्रा 6सी, 6डी)। एक साथ लिया गया, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि मानव त्वचा त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट में hsa-miR -4535 अभिव्यक्ति को कम करके H2O 2- प्रेरित TGF /Smad पाथवे हानि को कम कर देता है।


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चित्र 4. सिस्टैन्च HS68 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित TGF /Smad कोलेजन संश्लेषण मार्ग हानि को कम करता है। (ए) एचएस68 कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए एच2ओ2 (200 माइक्रोन) के संपर्क में लाया गया और फिर 23 घंटे के लिए सिस्टंच (30 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा कोलेजन सिंथेसिस-संबंधित पाथवे घटकों (TGF , p-smad2 / 3, Smad4, COL1A1, COL3A1) और कोलेजन डिग्रेडेशन-संबंधित प्रोटीन (MMP -1) की प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाया गया। (बी) परमाणु और साइटोसोलिक अंशों में p-smad2 / 3, Smad4 की प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा लगाया गया। जीएपीडीएच को एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था। मान ± SE के रूप में दिखाए जाते हैं। परिणामों की मात्रा दर्शाई गई है (n=3) *P <0।05, **P <0.01, ***P <0.001 बनाम। अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाएं; #पी <0.05, ##पी <0.01, ###पी <0.001 बनाम एच2ओ2-उपचारित कोशिकाएं। (सी) एंटी-पी-स्मैड2/3, स्मैड4 एंटीबॉडी और एफआईटीसी/पीई-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग पी-स्मैड2/3 (हरा), स्मैड4 (लाल) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। डीएपीआई ने नाभिक स्थान (नीला) का संकेत दिया। छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (200×) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।


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Hsa-miR -4535 द्वारा Smad4 का मॉड्यूलेशन H2O 2- में कोलेजन संश्लेषण में शामिल है, मानव त्वचा त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट उजागर करता है

आगे उन तंत्रों को निर्धारित करने के लिए जिनके द्वारा hsa-miR -4535 Smad4 की अभिव्यक्ति और HS68 कोशिकाओं में इसके डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग पर अपना प्रभाव डालती है, हमने HS68 कोशिकाओं को hsa-miR -4535 नकल या अवरोधकों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया और Smad4 को मापा और इसकी डाउनस्ट्रीम कोलेजन अभिव्यक्ति। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि hsa-miR -4535 द्वारा hsa-miR -4535 के अवरोधन ने H2O 2- उपचारित HS68 कोशिकाओं (चित्र 7A-7C) में Smad4 mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन को उलट दिया। . इसके अलावा, hsa-miR का दमन -4535 आंशिक रूप से बहाल H2O 2- प्रेरित COL1A1 और COL3A1 हानि H2O 2- में HS68 कोशिकाओं (चित्र 7C) का इलाज करता है।

इसके विपरीत, hsa-miR -4535 के परिणाम के रूप में बढ़ी हुई hsa-miR -4535 अभिव्यक्ति मिमिक ट्रांसफेक्शन ने H2O2 (चित्र 7D-7F) के संपर्क में आने वाले HS68 कोशिकाओं में Smad4 के सिस्टेन्चे-मध्यस्थता अपरेगुलेशन को अवरुद्ध कर दिया। MiR -4535 के ओवरएक्प्रेशन ने आंशिक रूप से सिस्टेन-प्रेरित COL1A1 और COL3A1 स्तरों को कम किया है (चित्र 7F)। Hsa-miR -4535 (चित्र 8A-8C) के अतिअभिव्यक्ति या siRNA द्वारा Smad4 के निषेध (चित्र 8D, 8E) के परिणामस्वरूप H2O2 जोखिम के बाद सिस्टेंच उपचार के तहत कोलेजन संश्लेषण कम हो गया। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि दोनों ही Smad4 को निर्देशित करते हैं

hsa-miR -4535 के साथ साइलेंसिंग और उपचार H2O 2- उपचारित HS68 कोशिकाओं में उत्क्रमित सिस्टैंच-प्रेरित कोलेजन संश्लेषण की नकल करते हैं। एक साथ लिया गया, हमने निष्कर्ष निकाला कि सिस्टेंच ने कोलेजन संश्लेषण को विनियमित किया, संभवतः H2O2 के संपर्क में आने वाले HS68 कोशिकाओं में Smad4 सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए hsa-miR -4535 स्तर को कम करने के माध्यम से।


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चित्र 5. Hsa-miR -4535 Smad4 को लक्षित करता है। ( ए ) एचएस 68 कोशिकाओं में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति को सिस्टैंच के साथ इलाज किया गया था जो माइक्रोएरे का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। (बी) संभावित एमआरएनए उम्मीदवारों को दर्शाने वाला वेन आरेख जिसे एमआईआरडीबी और टारगेटस्कैनह्यूमन डेटाबेस के आधार पर एचएसए-एमआईआर -4535 द्वारा विनियमित किया जा सकता है। स्मॉड 4-3 U-UTR mRNA में hsa-miR -4535 के लिए पुष्ट miRNA- बाध्यकारी साइटों का अनुक्रम विश्लेषण। मिलान सीधी रेखाओं द्वारा दर्शाए जाते हैं। (सी) एचएस68 कोशिकाओं को स्मॉड 4-3'-यूटीआर-डब्ल्यूटी (जंगली-प्रकार; 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल) प्लस एचएसए-एमआईआर -4535 मिमिक (2{) के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। {25}} एनएम) या स्मैड 4-3'-यूटीआर एमटी (म्यूटेंट; 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल) प्लस एचएसए-एमआईआर -4535 मिमिक (20 एनएम) 24 घंटे के लिए। ल्यूसिफरेज गतिविधि निर्धारित की गई और रेनिला की गतिविधि को सामान्य किया गया। परिणामों का परिमाणीकरण दिखाया गया है (n=3); *** पी <0.001, बनाम स्मॉड 4-3 U-यूटीआर-एमटी प्लस एचएसए-एमआईआर -4535 नकल समूह। जी 1=नियंत्रण, जी 2=सिस्टंच (10 माइक्रोन), जी 3=सिस्टंच (30 माइक्रोन)



cistanche TGF /Smad कोलेजन सिंथेसिस पाथवे को बढ़ाता है और UVB-उजागर HS68 कोशिकाओं में hsa-miR -4535 अभिव्यक्ति के निषेध के साथ-साथ त्वचीय जीर्णता को क्षीण करता हैचूंकि यूवी-प्रकाश विभिन्न त्वचा डर्मिस विकारों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें सूजन, इम्यूनोसप्रेशन, कैंसर और समय से पहले बुढ़ापा शामिल है [30-32], हमने यूवीबी विकिरण के संपर्क में आने वाले एचएस68 कोशिकाओं में कोलेजन संश्लेषण से संबंधित संकेतन पर सिस्टैंच के प्रभाव की जांच की। TGF/Smad पाथवे घटकों के प्रोटीन स्तर और डाउनस्ट्रीम COL1A1 और COL3A1 को UVB-उपचारित HS68 कोशिकाओं में घटाया गया था, लेकिन प्रभावी रूप से सिस्टेंच उपचार (चित्र 9A) के बाद अपग्रेड किया गया था।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग के परिणामों ने पुष्टि की कि HS68 कोशिकाओं (चित्रा 9ए) में सिस्टेन्श ने यूवीबी-संवर्धित एमएमपी -1 अभिव्यक्ति को दबा दिया। इसके अलावा, हमने यूवीबी एक्सपोजर के अधीन एचएस68 कोशिकाओं में सिस्टंच के एंटी-एजिंग प्रभाव को स्पष्ट किया, यह प्रदर्शित करते हुए कि सिस्टंच ने यूवीबी-प्रेरित पी16 और पी21 स्तरों (चित्रा 9ए) के उत्थान को कम किया। यह आकलन करने के लिए कि क्या सिस्टेंच, Smad4 को लक्षित करके hsa-miR -4535 के निषेध के माध्यम से UVB- प्रेरित कोलेजन ब्रेकडाउन को क्षीण कर सकता है, हमने qPCR का उपयोग करके UVB और सिस्टेंच सह-उपचारित कोशिकाओं में hsa-miR -4535 और Smad4 स्तरों की जांच की। हमने पाया कि hsa-miR -4535 अभिव्यक्ति को UVB-उजागर कोशिकाओं में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था, लेकिन सिस्टैंच उपचार के बाद कम हो गया। इसके विपरीत, Smad4 अभिव्यक्ति को UVB जोखिम द्वारा दबा दिया गया था और इस दमन को सिस्टंच उपचार (चित्र 9B, 9C) द्वारा स्पष्ट रूप से उलट दिया गया था। सामूहिक रूप से, हमारे निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि HS68 कोशिकाओं में Smad4 सिग्नलिंग को बढ़ावा देने के लिए hsa-miR -4535 स्तरों को दबाकर कोलेजन निर्माण में UVB- प्रेरित कमी को बहाल करने के लिए H2O2 के समान प्रभाव डालती है।



सिस्टैंच का सामयिक अनुप्रयोग यूवीबी-प्रेरित त्वचा हाइपरप्लासिया और कोलेजन क्षरण को कम करता है और साथ ही त्वचा में टीजीएफ / स्मॉड सिग्नलिंग को बढ़ाता है।C57BL6/J नग्न चूहों की पृष्ठीय त्वचाविवो में यूवीबी-प्रेरित त्वचा की चोट पर सिस्टैंच के फोटो-सुरक्षात्मक प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, हमने माइक्रोआरएनए -4535, स्मैड4, और त्वचा के ऊतकों में परिवर्तन के स्तर का मूल्यांकन किया। चित्रा 10A C57BL6/J नग्न चूहों की पृष्ठीय त्वचा पर यूवीबी विकिरण के बाद सिस्टंच के सामयिक अनुप्रयोग के लिए प्रायोगिक डिजाइन और समय-रेखा के लिए योजनाबद्ध दिखाता है। यूवीबी-उजागर समूह में C57BL/6J चूहों के पृष्ठीय त्वचा वर्गों पर झुर्रियों का गठन देखा गया था। सिस्टैंच के सामयिक अनुप्रयोग ने शिकन गठन को काफी कम कर दिया है, जो त्वचा की अखंडता को बनाए रखने के लिए कोलेजन सामग्री में सिस्टंच-मध्यस्थता वृद्धि का संकेत देता है (चित्र 10बी)। इसके अलावा, त्वचीय परत के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि त्वचा में कोलेजन सामग्री और घनत्ववाहन नियंत्रण समूह की तुलना में यूवीबी-विकिरणित समूह में काफी कम थे। हालांकि, Cistanche (12 mg/kg और 24 mg/kg) के सामयिक अनुप्रयोग को बढ़ावा देने से UVB-विकिरण (चित्र 11) के अधीन चूहों की तुलना में खुराक पर निर्भर तरीके से कोलेजन सामग्री और घनत्व में वृद्धि हुई। एच एंड ई धुंधला द्वारा त्वचा आकृति विज्ञान का मूल्यांकन किया गया था। यूवीबीएक्सपोजर ने वाहन नियंत्रण समूह की तुलना में एपिडर्मल मोटाई में वृद्धि की। हालांकि, सिस्टंच के सामयिक अनुप्रयोग ने यूवीबी-प्रेरित एपिडर्मल हाइपरप्लासिया (चित्र 11) को काफी हद तक कम कर दिया। इसके अलावा, -गल के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग ने यूवीबी-विकिरणित त्वचा (चित्रा 11) में उच्च-गल अभिव्यक्ति को कम कर दिया। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या विवो में Smad4 को बढ़ाने के लिए hsa-miR -4535 डाउनरेगुलेशन के माध्यम से यूवीबी-प्रेरित कोलेजन फाइबर हानि को कम कर सकता है, इसकी आरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा उत्पादित पृष्ठीय त्वचा के नमूने में किया गया था। hsa-miR -4535 की अभिव्यक्ति UVB-विकिरणित त्वचा में बढ़ गई थी, लेकिन कम और उच्च दोनों खुराकों में सिस्टैंच-उपचारित त्वचा में काफी दबा दी गई थी। इसके अलावा, यूवीबी-विकिरणित त्वचा में स्मैड4 आरएनए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर को सिस्टंच उपचार द्वारा बहाल किया गया था (चित्र 12ए, 12बी)


इसके अलावा, सिस्टैंच एप्लिकेशन ने यूवीबी-बिगड़े त्वचा के ऊतकों में टीजीएफ, पी स्मैड2/3 और स्मैड4 प्रोटीन एक्सप्रेशन को बचाया (चित्र 12सी)। हमारे निष्कर्षों ने संकेत दिया कि अंत में कोलेजन संश्लेषण (चित्रा 13) को बढ़ावा देने के लिए P- smad2/3 की सक्रियता के लिए Smad4 अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए hsamiR -4535 को रोककर सिस्टंच संभावित रूप से यूवीबी-प्रेरित नुकसान से त्वचा की रक्षा कर सकता है।


Cistanche Anti-Aging

चित्रा 9. सिस्टेंच टीजीएफ / स्माड कोलेजन संश्लेषण मार्ग को बढ़ाता है और यूवीबी-उजागर एचएस68 कोशिकाओं में एचएसए-एमआईआर -4535 अभिव्यक्ति के अवरोध के साथ-साथ त्वचीय जीर्णता को क्षीण करता है। HS68 कोशिकाओं को UVB (40 mJ/cm2) के संपर्क में लाया गया और फिर 23 घंटे के लिए सिस्टंच (30 µM) से उपचारित किया गया। (ए) कोलेजन संश्लेषण से संबंधित पाथवे घटकों (टीजीएफ, पी-स्मैड2/3, स्मैड4, COL1A1, COL3A1) की प्रोटीन अभिव्यक्ति, कोलेजन गिरावट-संबंधित प्रोटीन (एमएमपी {{20}}), और जीर्णता- पश्चिमी धब्बा द्वारा संबद्ध मार्करों (p16 और p21) का पता लगाया गया था। जीएपीडीएच को एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था। (बी और सी) hsa-miR -4535 की आरएनए अभिव्यक्ति और Smad4 का पता qRT-PCR द्वारा लगाया गया था। मान ± SE के रूप में दिखाए जाते हैं। परिणामों की मात्रा दर्शाई गई है (n=3) *P <0.05, **P <0.01, बनाम अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाएं; #P <0.05, ##P <0.01 बनाम UVB-उजागर कोशिकाएं।

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