गैलिक एसिड के साथ संयुग्मित एक पेप्टाइड फॉर्मूलेशन (Gal2-Pep) की एंटीऑक्सिडेंट और एंटी-एजिंग क्षमता

त्वचा समय से पहले बूढ़ा होने के लिए अत्यधिक संवेदनशील होती हैबाहरी तनाव के कारण, इसलिए, इस अध्ययन में, एक पेप्टाइड सूत्रीकरण, (गैलॉयल)2–केटीपीपीटीटीपी (गैल2–Pep) को TPPTTP पेप्टाइड और गैलिक के संयोजन से संश्लेषित किया गया थाएसिड (जीए)। सभी पेप्टाइड्स ठोस-चरण पेप्टाइड का उपयोग करके 2-क्लोरोट्रिटिल क्लोराइड राल पर संश्लेषित किए गए थेसंश्लेषण (SPPS), और एक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) / क्वाड्रुपोल-टाइम-ऑफ- पर विश्लेषण किया गयाflflआठ (क्यू-टीओएफ) अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमएस) प्रणाली। प्रारंभ में, गल2–पेप ने 100 सांद्रता से नीचे कोई विषाक्तता नहीं दिखाईmएम केराटिनोसाइट्स के लिए 88 प्रतिशत की सेल जीवित रहने की दर के साथ औरfibroblasts.प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों(आरओएस) गैल की मैला ढोने की गतिविधि2–पेप अकेले जीए की तुलना में अधिक स्थिर था; और चार सप्ताह के बाद कमरे मेंतापमान, इसकाआरओएस मैला ढोने की गतिविधि50 प्रतिशत से अधिक रहा। इसके अलावा, पेप्टाइड सूत्रीकरण,लड़की2–Pep ने CCD-1064Sk में इलास्टेज निरोधात्मक प्रभाव भी प्रदर्शित कियातंतुकोशिकाकोशिकाओं। RT-qPCR के नतीजों के आधार पर इस अध्ययन में यह साबित हुआ कि Gal2–Pep ने PGC-1 की अभिव्यक्ति बढ़ाईa कोरोकनाऑक्सीडेटिव तनाव, और एक के रूप में इसकी क्षमता को मान्य कियाएंटी-एजिंग एजेंटद्वाराकी अभिव्यक्ति में वृद्धिटाइप I कोलेजनऔर तकमैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज -1 (MMP1) की अभिव्यक्ति को कम करना.जाँच - परिणाम प्राप्त सुझाव को पुष्ट करता है कि इस अध्ययन में संश्लेषित पेप्टाइड सूत्रीकरण का उपयोग एक के रूप में किया जा सकता हैप्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंटऔरएंटी-एजिंग एजेंटइसके कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों के लिए।

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1 परिचय

त्वचा की उम्र बढ़नाकेराटिनोसाइट्स और बीआरओ के कोशिका विभाजन में धीरे-धीरे कमी और अंततः रुकने के परिणामस्वरूप होता हैत्वचा के भीतर विस्फोट। त्वचा पर झुर्रियां विकसित होती हैं क्योंकि कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप बाह्य मैट्रिक्स का विकृतीकरण होता है जिससे सूखापन और इलास का नुकसान होता हैत्वचा में चिपचिपापन।1 इंट्रासेल्युलर माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को नुकसानऔर प्रोटीन संश्लेषण की दर में कमी भी होती हैत्वचा की उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान।2 त्वचा की उम्र बढ़ने के दो मुख्य रास्ते हैंतरीके, आंतरिक और बाह्य, पराबैंगनी (यूवी) जोखिम के साथ

का एक प्रमुख चालक हैबाहरी उम्र बढ़ने. यूवी प्रकाश प्रमुख त्वचा घटकों के साथ प्रतिक्रिया करता है, लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करने के लिए जो सेल का नेतृत्व करते हैंमौत।3–5 अत्यधिक आरओएस स्तर भी दरार की ओर ले जाते हैं औरकोलेजन या इलास्टिन जंजीरों का असामान्य बंधन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है, जैसे कि एमएमपी -1, जो कोलेजन को तोड़ देता है, जिससे त्वचा में झुर्रियां पड़ जाती हैं औरत्वचा की उम्र बढ़ने में तेजी लाना।6,7 इसलिए, एंटीऑक्सीडेंट थेरेपी को दूर करने के लिएआरओएस और माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता को सक्रिय करने के लिए त्वचा को उम्र बढ़ने से बचाने के गुण हैं।

आरओएस के अलावा, इलास्टेज की हानि में महत्वपूर्ण भूमिका हैत्वचा की लोच, जो इलास्टिन को तोड़ती है, त्वचा का एक महत्वपूर्ण प्रोटीनकोशिकी साँचा।8 इलास्टिन, इसकी महत्वपूर्ण लोचदार पुनरावृत्ति के कारणविशेषताएं, त्वचा को लोच प्रदान करती हैं, जबकि इलास्टेज में हैइलास्टिन और अन्य प्रोटीन को तोड़ने की क्षमता।8 इसलिए, निरोधात्मकइलास्टेज एंजाइम का सेवन त्वचा की शिथिलता के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति हो सकती है त्वचा लोच के नुकसान को रोकना।

इस अध्ययन में, हमने एक नई सामग्री तैयार की है जो जोड़ती हैपेरॉक्सिसोम प्रोलिफ़रेटर-सक्रिय रिसेप्टर गामा कोएक्टीवेटर1-अल्फ़ा (PGC-1a)-व्युत्पन्न पेप्टाइड टीपीपीटीटीपी और गैलिक एसिड (जीए)एंटी-एजिंग सौंदर्य प्रसाधनों में उपयोग के लिए। GA अंगूर, टमाटर और हरी चाय सहित विभिन्न फलों और सब्जियों में पाया जाने वाला एक फाइटोकेमिकल है, जो उच्च एंटीऑक्सीडेंट और जीवाणुरोधी होने के लिए जाना जाता है। eसीमांत बलआदि।9 हालांकि इन लाभकारी ई के कारण जीए का उपयोग सौंदर्य प्रसाधन और खाद्य उद्योगों में किया जाता हैसीमांत बलects, इसका सूत्रीकरण अस्थिर हो जाता है।10 हमने इस प्रकार विकसित किया (गैलॉयल)2–केटीपीपीटीटीपी (गैल2–Pep) इसे PGC-1 से बाइंड करके GA की स्थिरता बढ़ाने के लिएa-व्युत्पन्न पेप्टाइड TTPTTP।

इस अध्ययन में, हमने एक (गैलॉयल) संश्लेषित किया2–केटीपीपीटीटीपी (गैल2– Pep) गैलिक एसिड के साथ संयुग्मन में पेप्टाइड सूत्रीकरण और पुष्टि की गईएक एंटीऑक्सिडेंट और एंटीएजिंग एजेंट के रूप में इसकी क्षमता।

2। सामग्री और विधि

2.1। सामग्री

डल्बेको का संशोधितईगल्स मीडियम (DMEM), पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), फॉस्फेट-बूसीमांत बलजुटीखारा (पीबीएस), और ट्रिप्सिन गिब्को (कार्ल्स

खराब, सीए)। हाइड्रॉक्सीबेंज़ोट्रीज़ोल (HOBt), डायसोप्रोपिल कार्बोडाइमाइड (DIC), 1,8-डायज़ाबिसाइक्लो[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-डायसोप्रोपाइलथाइलामाइन (DIEA), गैलिक एसिड औरN-succinyl-त्रि-अलनील-pनाइट्रोएनिलाइड सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ) से प्राप्त किए गए थे।L-फॉर्म अमीनो एसिड (Fmoc-Lys (Boc)–ओह, एफएमओसी-थ्र (tबू)–ओह, और एफएमओसी-प्रो–OH) बीड-टेक (सियोल,कोरिया)।

2.2। पेप्टाइड्स और गैलिक एसिड-युग्मित पेप्टाइड्स का संश्लेषण

सभी पेप्टाइड 2-क्लोरोट्रिटिल क्लोराइड राल (200mमोल स्केल, प्रतिस्थापन मूल्य¼ 1.46 एमएमओएल जी 1) एचओबीटी का उपयोग करना–डीआईसी मध्यस्थता ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस)।

एसपीपीएस पद्धति का उपयोग करते हुए पेप्टाइड संश्लेषण मामूली मोदी के साथ किया गया थापिछले अध्ययनों का जिक्र करते हुए उद्धरण।11–13 2-डाइक्लोरो में क्लोरोट्रिटाइल क्लोराइड (CTC) रेजिन को प्रफुल्लित किया गया

मीथेन (डीसीएम, 8 एमएल) 30 मिनट के लिए। राल से धोया गया थाडाइमिथाइलफॉर्मैमाइड (DMF)। सभी प्रतिक्रियाएं कमरे के तापमान पर की गईं। Fmoc संरक्षित अमीनो एसिड डेरिवेटिव (2 समतुल्य(इक्विव।), के लिएफाईपहले संलग्न अमीनो एसिड या 5 इक्विव।, अन्य अमीनो एसिड के लिए) डीएमएफ ए में या तो डीआईईए (5 इक्विवि।, एक संलग्न अमीनो एसिड के लिए) या एचओबीटी / डीआईसी (6 इक्विव। / 5 इक्विव।) के साथ युग्मित किया गया था।फुटएरडीएमएफ में 2 प्रतिशत (वी/वी) डीबीयू (2 बार, 2 मिनट एक बार, 8 एमएल) का उपयोग करके एफएमओसी का डीप्रोटेक्शन करना। और सभी चरणों को डीएमएफ से 5 बार धोया गया। अंतिम गैलिक एसिड को लाइसिन से जुड़े पेप्टाइड्स के साथ जोड़ा गया था।गैलिक एसिड के युग्मन के बाद, राल थाaबदला हुआ, धोया हुआ,और एक उच्च निर्वात के तहत सूख गया। दरार समाधान (TFA:विआयनीकृत [DI] पानी: TIS¼ 95 : 2.5 : 2.5, वी/वी/वी प्रतिशत) 2 घंटे के लिए उपचारित किया गयाकच्चे पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए। कच्चे पेप्टाइड्स अवक्षेपित थे और तीन बार ठंडे डायथाइल ईथर से धोए गए थे।

विश्लेषणात्मक रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी(आरपी-एचपीएलसी) वाटर्स 2695 पृथक्करणों पर आयोजित किया गया थाकैपसेल पाक C18 कॉलम के साथ मॉड्यूल (4.6 मिमी 250 मिमी, 5mमी, शिसीडो)। मोबाइल चरण में H में 0.05 प्रतिशत TFA शामिल था2O (मोबाइल फेज ए) और 0. एसीटोनिट्राइल (मोबाइल फेज बी) में .05 प्रतिशत टीएफए।

मोबाइल के लिए एक रेखीय ढाल को नियोजित करके सावधानी हासिल की गईएक पर 30 मिनट से अधिक के चरण बी 5 प्रतिशत से 65 प्रतिशत1. 0 एमएल मिनट की ओउ दर 1. 230 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर पेप्टाइड चोटियों का पता चला था। जेमिनी RP-C18 के साथ वाटर्स HPLC सिस्टम (पंप 600E, डिटेक्टर यूवी-484) पर अर्ध-तैयारी आरपी-एचपीएलसी आयोजित की गई थीस्तंभ (21.2 मिमी 250 मिमी, 5mमी, फेनोमेनेक्स)। मोबाइल चरण में H में 0.05 प्रतिशत TFA शामिल था2हे (मोबाइल चरण ए)और 0.05 प्रतिशत टीएफए एसीटोनिट्राइल (मोबाइल चरण बी) में। के मोबाइल चरण बी के लिए एक रेखीय ढाल को नियोजित करके क्षालन प्राप्त किया गया था15 मिनट में 7 प्रतिशत से 22 प्रतिशतl10 एमएल मिन की ओउ दर 1.पेप्टाइड चोटियों को 230 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकल रूप से पाया गया।

संश्लेषित पेप्टाइड्स को पानी में 5 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड में घोल दिया गया और एक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) / पर विश्लेषण किया गया।चतुर्ध्रुव-समय-का-lआठ (क्यू-टीओएफ) अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोस्कोपी(एमएस) प्रणाली (ट्रिपल टीओएफ 6600, एबीएससीएक्स, फोस्टर सिटी, सीए)। नमूनों को Q-TOF सिस्टम से लैस किया गया थाएक पर एक नैनो-स्प्रे स्रोतl1 की दरmएल मिनट 1. ईएसआई आयनस्रोत पैरामीटर निम्नानुसार थे: 1.5 केवी का आयन स्प्रे वोल्टेज, 10 पीएसआई पर पर्दे की गैस, और 5 पीएसआई पर शीथ गैस। में स्पेक्ट्रापूर्ण-स्कैन मोड और MS/MS की सीमा में एकत्र किए गए थेm/z

100–प्रति स्पेक्ट्रम 25 एमएस के संचय समय पर 1200 डीए।टक्कर की ऊर्जा 10 से 80 तक बढ़ गई थी। परिणामीविश्लेषक TF का उपयोग करके डेटा प्राप्त किया गया थाबर्तन और स्वचालित रूप सेन्यूनतम चोटी के साथ 80 प्रतिशत केन्द्रक द्वारा निर्दिष्ट, 10 प्रतिशत की शोर में कमी, 3 प्रतिशत की सीमा के साथ मध्यम डीआइसोटोपिंग, कोई शोर में कमी नहीं, और कोई चौरसाई नहीं। संश्लेषित पेप्टाइड्स की पहचान की गईबड़े पैमाने पर सहिष्णुता के साथ 0.05 Da और MS/MS की सहनशीलता का उपयोग करके मैन्युअल रूप से अनुक्रमित किया गया 0.01 द.

2.3। सेल संस्कृतियों और व्यवहार्यता परख

मानव, वयस्क, कम कैल्शियम, उच्च तापमान (HaCaT) कोशिकाएंऔर CCD-1064Sk (सामान्य मानव त्वचाफाइब्रोब्लास्ट) कोशिकाएं थींDMEM में 10 प्रतिशत FBS और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन। कोशिकाओं को 37 पर ऊष्मायन किया गया था C 5 प्रतिशत CO2 के साथ आर्द्रीकृत वायु कक्ष में2.व्यवहार्यता परख के लिए, सेल काउंटिंग किट -8 (CCK -8, Dojindo Co. Ltd. बीजिंग, चीन) का उपयोग किया गया था। HaCaT और CCD-1064Sk सेलअच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स में 96-सीड किए गए थे (5 103 प्रति कुएं में कोशिकाएं) और 37 पर इनक्यूबेट किया गया 5 प्रतिशत CO में C2 24 घंटे के लिए। संस्कृतियों को तब संश्लेषित पेप्टाइड्स या जीए के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया गया और 37 पर ऊष्मायन किया गया 5 प्रतिशत CO में C2 24 घंटे के लिए। सेल व्यवहार्यताबाद में निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए CCK-8 का उपयोग करके मापा गया।

2.4। एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का निर्धारण

2.4.1। डीपीपीएच परख।संश्लेषित की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधिपेप्टाइड्स और जीए का डीपीपीएच परख का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था। DPPH assays पहले की रिपोर्ट बाद किए गए थे

माइनर मोदी के साथ कार्यप्रणालीधनायन।12,14–16 सबसे पहले, एक 0.12 मिलीग्राम एमएल 1 DPPH समाधान मेथनॉल में तैयार किया गया था, फिर 100mएल डीपीपीएच समाधान और 100mसंश्लेषित पेप्टाइड्स या जीए के एल को अलग-अलग सांद्रता ({{0}}.1 मिमी, 0.05 मिमी, 0.01 मिमी, और 1) में मिलाया गया था।mM) 96-वेल माइक्रोप्लेट्स में। एक कक्षीय हिलाने वाले इनक्यूबेटर में,मिश्रणों को 30 मिनट के लिए 37 पर प्रतिक्रिया दी गई सी और 100 आरपीएम बिनारोशनी। अवशोषण तब 517 एनएम पर मापा गया था और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता की गणना की गई थी।

2.4.2। आरओएस मैला ढोने की गतिविधि।

इंट्रासेल्युलर आरओएस स्कैवेंजिंग गतिविधि का मूल्यांकन 20, 70-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट किट का उपयोग करके किया गया था(डीसीएफ-डीए, एबीकैम, यूएसए)। HaCaT कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स (5 103 प्रति कुएं में कोशिकाएं) और 37 पर इनक्यूबेट किया गया 24 घंटे के लिए सी.Aफुटऊष्मायन के बाद, संस्कृतियों को संश्लेषित पेप्टाइड्स या जीए (100mएम) और 37 पर ऊष्मायन किया गया 24 घंटे के लिए सी. कोशिकाओं को तब 10 के संपर्क में लाया गया थाmएम डीसीएफ-डीए समाधान और 30 मिनट के लिए ऊष्मायन। एफुटऊष्मायन, समाधान पीबीएस के साथ धोया गया था।उत्तेजना पर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया और

क्रमशः 485 एनएम और 530 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य।

चित्र .1क्वाड्रुपोल-टाइम का उपयोग करके पेप्टाइड्स के सिंथेटिक चरण और अनुक्रम की पुष्टिउड़ान(क्यू-टीओएफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री: (ए) विस्तृत सिंथेटिक प्रक्रिया (बी) टीपीपीटीटीपी, (सी) गैलॉयल–टीपीपीटीटीपी, और (डी) (गैलॉयल)2–केटीपीपीटीटीपी।

2.5। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित परख

माइटोकॉन्ड्रियल के लिए जेसी -1 डाई (थर्मो फिशर, यूएसए) का उपयोग किया गया थाझिल्ली क्षमता (एमएमपी) परख। CCD-1064Sk और HaCaT कोशिकाओं को 96-वेल माइक्रोप्लेट्स (5 10 3कोशिकाएं प्रति कुएं)

और 37 पर ऊष्मायन किया गया सी और 5 प्रतिशत सीओ में2 24 घंटे के लिए। पिछाड़ीएर ऊष्मायन,संस्कृतियों को संश्लेषित पेप्टाइड्स के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया गया और 37 पर ऊष्मायन किया गया 5 प्रतिशत CO में C2 24 घंटे के लिए।JC-1 डाई को CCD-1064Sk और HaCaT कोशिकाओं में जोड़ा गयाउत्पादन ए 10 की अंतिम एकाग्रताmM. Aफुटऊष्मायन के 10 मिनट के बाद, कोशिकाओं को 37 के साथ दो बार धोया गया सी पीबीएस। हरा और लालरोशनीVarioskan LUX का उपयोग करके मापा गयाएक एक्सी पर मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (थर्मोफिशर, यूएसए)।टेशन (lपूर्व)/उत्सर्जन (lएम) 475/530 एनएम और एlपूर्व/lएम475/क्रमशः 590 एनएम।

2.6। इलास्टेज निरोधात्मक गतिविधि परख

CCD-1064Sk कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में सीड किया गया और 37 पर इनक्यूबेट किया गया 5 प्रतिशत CO में C2 24 घंटे के लिए। संस्कृतियों को तब 100 की एकाग्रता के संपर्क में लाया गया थाmसंश्लेषित पेप्टाइड्स या जीए का एम और 37 पर इनक्यूबेट किया गया 5 प्रतिशत CO में C2 24 घंटे के लिए। सेल को दो बार dPBS से धोया गया और हमने सेल स्क्रैपर का उपयोग करके प्रत्येक सेल को एकत्र किया। ए0.2 एम ट्रिस जोड़ रहे हैं–एकत्र किए गए 0.1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स के साथ एचसीएल (पीएच 8.0)कोशिकाओं, कोशिकाओं को अल्ट्रासोनिकेटर द्वारा समरूप बनाया गया था। समरूप समाधान को 3000 आरपीएम पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया थाऔर 4 सी। फिर, एफुटसुपरनेटेंट, प्रोटीन क्वांटी ले रहे हैं-बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग करके कटियन का प्रदर्शन किया गया। प्रत्येक के लिए प्रोटीनमें नमूना वितरित किया गयाफाई100 की नाल एकाग्रताmजीएमएल 1, औरN-succinyl-त्रि-अलनील-p-nitroanilide में जोड़ा गया था1.6 एमएम की अंतिम एकाग्रता और 36 पर प्रतिक्रिया व्यक्त की सी 1 घंटे के लिए।फिर, माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 405 एनएम पर मापा गया।

2.7। आरटी-क्यूपीसीआर

CCK -1064Sk कोशिकाओं में एंटी-एजिंग मार्करों का mRNA स्तरRT-qPCR का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया। TRIzol अभिकर्मक (Life Technologies, Carlsbad, CA) और रिवर्स का उपयोग करके कुल RNA एकत्र किया गया था

प्राइमस्क्रिप्ट आरटी अभिकर्मक किट (तकरा बायोइंक।, कुसात्सू, जापान)। एक CFX96 सिस्टम (बायो-रेड लेबोरेटरीज, हरक्यूलिस, CA) और iQ SYBR ग्रीन सुपरमिक्स (बायो-रेड लेबोरा)

टोरीज़) का उपयोग RT-qPCR के लिए किया गया था।b-एक्टिन का उपयोग टाइप I कोलेजन, एमएमपी -1, और पीजीसी -1 के एमआरएनए स्तरों को सामान्य करने के लिए किया गया था।a. 

2.8। सांख्यिकीय विश्लेषण

 डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है से मानक विचलनतीन स्वतंत्र माप और छात्र का उपयोग करके विश्लेषण किया गयाt-टेस्ट, ए के साथp < 0.05 considered to be a signiअंतर नहीं कर सकता।

जायदा के लिये पूछो:

ईमेल:wallence.suen@wecistanche.com व्हाट्सएप: प्लस 86 15292862950