जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 17 साइलेंसिंग द्वारा प्रेरित ग्लूकोज और लिपिड चयापचय की रीवायरिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनिटर्स के माइलिनेटिंग कोशिकाओं में संक्रमण को सक्षम बनाती है।

अमूर्त:परिपक्व केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओएलएस) माइलिन शीथ के उत्पादन के कारण अक्षतंतु को समर्थन और इन्सुलेशन प्रदान करते हैं। माइलिनेटिंग कोशिकाओं में उनकी परिपक्वता के दौरान, ओ.एल.एसलिपिड के लिए ऊर्जा और बिल्डिंग ब्लॉक्स की आवश्यकता होती है, जिसका तात्पर्य एक बड़े निवेश से हैऊर्जा ईंधनऔरकार्बन के आणविक स्रोत. ऑलिगोडेंड्रोग्लिअल जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 17 (जीपीआर17) ओएल परिपक्वता में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में उभरा है; यह प्री-ओएल में अधिकतम अभिव्यक्ति तक पहुंचता है, लेकिन फिर टर्मिनल परिपक्वता की अनुमति देने के लिए इसे आंतरिक बनाना पड़ता है। इस अध्ययन में, हमारा लक्ष्य शारीरिक GPR17 की भूमिका को स्पष्ट करना हैओएल चयापचय में गिरावटओएलएस को अलग करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स और लिपिडोमिक्स को लागू करके। GPR17 साइलेंसिंग के बाद, हमने परिपक्व OL मार्करों में उल्लेखनीय वृद्धि और इसमें शामिल कई जीनों में परिवर्तन पायाग्लूकोज चयापचयऔरलिपिड जैवसंश्लेषण. हमने भी वृद्धि देखीलैक्टेट का निकलनाजो कि आंशिक रूप से जिम्मेदार हैपरिपक्वता को बढ़ावाप्रेरकGPR17 डाउनरेगुलेशन. इसके परिणामस्वरूप, जीपीआर17 की कमी ने विशिष्ट माइलिन की गतिशीलता को भी बदल दियालिपिड कक्षाएं. विश्व स्तर पर, यह अध्ययन बीच एक कार्यात्मक संबंध का खुलासा करता हैGPR17 अभिव्यक्ति, लैक्टेट रिलीजऔरमाइलिन रचना, और सुझाव देता है कि जीपीआर17 को लक्षित करने वाले अभिनव हस्तक्षेप डिमाइलेटिंग रोगों में अंतर्जात माइलिनेशन को बढ़ावा देने में मदद कर सकते हैं।

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कीवर्ड:ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिका; ऑलिगोडेंड्रोसाइट;ऊर्जा उपापचय; ग्लाइकोलाइसिस; लैक्टेट; माइलिन लिपिड; ट्रांस्क्रिप्टोमिक्स;चयापचय; लिपिडोमिक्स; मेलिनक्रिया

1 परिचय

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओएलएस) माइलिन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं हैं, एक असाधारण उच्च लिपिड सामग्री की विशेषता वाली एक इन्सुलेट संरचना, जो एक्सोनल फ़ंक्शन को संरक्षित करती है और तेजी से न्यूरोनल चालन को सक्षम बनाती है [1]। इन विशिष्ट कार्यों के लिए आवश्यक है कि ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रीकर्सर कोशिकाएं (ओपीसी) एक कसकर व्यवस्थित विभेदन कार्यक्रम से गुजरें, जिसके दौरान वे क्रमिक रूप से अपने चयापचय को बदलते हैं और विशिष्ट माइलिन लिपिड को संश्लेषित करके अपने प्लाज्मा झिल्ली की संरचना को संशोधित करते हैं [2]। एक ओएल 50 अक्षतंतु तक माइलिनेट कर सकता है, प्रति खंड संकुचित माइलिन झिल्ली की 150 परतों के साथ, इस प्रकार पर्याप्त ऊर्जावान मांग की आवश्यकता होती है [3]। इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि ग्लाइकोलाइसिस बनाम ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की दर ओएल भेदभाव चरण [4,5] पर निर्भर करती है, और सुझाव दिया है कि नव निर्मित ओएलएस/देर से ओपीसी जटिल I निषेध के लिए सबसे कमजोर हैं [6]। इष्टतम परिस्थितियों में, सुसंस्कृत प्रसवोत्तर ओपीसी और ओएल एटीपी संश्लेषण के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण पर निर्भर करते हैं, जबकि वयस्क ओएल ग्लाइकोलाइसिस का उपयोग प्राथमिकता से करते हैं [7]। दिलचस्प बात यह है कि कम ग्लूकोज वाले वातावरण की उपस्थिति में, ओएल विकास और माइलिनेशन को कीटोन बॉडी और लैक्टेट जैसे मोनोकार्बोक्सिलेट्स द्वारा समर्थित किया जा सकता है, जिनकी कोशिका में/बाहर तस्करी के लिए मोनोकार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर्स (एमसीटी) की आवश्यकता होती है। ध्यान दें, इचिहारा और सहकर्मियों ने दिखाया कि लैक्टेट कम ग्लूकोज स्थितियों के तहत ओपीसी साइकिलिंग और भेदभाव को बचाने में सक्षम था और यह प्रभाव एक लैक्टेट ट्रांसपोर्टर अवरोधक द्वारा बाधित था, यह सुझाव देते हुए कि लैक्टेट की उपलब्धता ओएलएस को ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और माइलिन लिपिड संश्लेषण को बनाए रखने की अनुमति देती है [4] . ओएल और माइलिन झिल्लियों में लिपिड के विभिन्न वर्ग मौजूद होते हैं, जिनमें कोलेस्ट्रॉल, फॉस्फोलिपिड और ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड शामिल हैं। यद्यपि माइलिन में विशिष्ट रूप से मौजूद कोई लिपिड प्रजाति नहीं है, विभेदन के दौरान ओएल झिल्ली में कई लिपिड प्रजातियों के अनुपात में लगातार परिवर्तन का वर्णन किया गया था [8]।

ओएलएस न्यूरोनल चयापचय में भी सक्रिय और गतिशील भूमिका निभाते हैं [9]। वे रक्तप्रवाह से आने वाले ग्लूकोज को लेते हैं और पाइरूवेट और लैक्टेट का उत्पादन करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस करते हैं, जिसे बाद में एमसीटी के माध्यम से एक्सोनल डिब्बे में पहुंचाया जाता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और एटीपी उत्पादन सक्षम होता है [10]।

अपने विभेदीकरण के दौरान, ओपीसी बाहरी कारकों से प्रभावित होते हैं जो विशिष्ट रिसेप्टर्स के साथ बातचीत के माध्यम से अपने कार्यों को गतिशील रूप से नियंत्रित करते हैं [11]। इनमें से, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 17 (जीपीआर17) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) में एक आशाजनक रीमाइलेटिंग लक्ष्य के रूप में उभरा है। जीपीआर17 ओपीसी में क्षणिक रूप से व्यक्त एक रिसेप्टर है, जो अपरिपक्व ओ4 मार्कर को व्यक्त करते हुए मध्यवर्ती विभेदन चरणों में प्री-ओएल में अपने अधिकतम स्तर तक पहुंचता है। समय पर और शारीरिक ओपीसी परिपक्वता के लिए इसकी क्षणिक अभिव्यक्ति आवश्यक है; वास्तव में, O4-सकारात्मक चरण के बाद, इस रिसेप्टर को टर्मिनल परिपक्वता और माइलिनेशन [12,13] की अनुमति देने के लिए उत्तरोत्तर डाउनरेगुलेट करना पड़ता है। इस समयबद्ध और शारीरिक अभिव्यक्ति में किसी भी हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप शिथिलता होती है और अंततः, माइलिनेशन विफलता होती है। जीपीआर17 की अधिक अभिव्यक्ति का वर्णन रोग के कई मॉडलों में किया गया है जैसे कि मस्तिष्क इस्किमिया [14], क्यूप्रीज़ोन- और लाइसोलेसिथिन-प्रेरित डी माइलिनेशन [15,16], अल्जाइमर जैसी स्थिति [17], एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस [18] और प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) [15,19]। एमएस [19,20], दर्दनाक मस्तिष्क की चोट [21] और जन्मजात ल्यूकोएन्सेफालोपैथी [22] से प्रभावित रोगियों में डीमाइलिनेटेड घावों की सीमा पर चिह्नित जीपीआर17 अपग्रेडेशन और/या जीपीआर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का संचय भी देखा गया है। मजबूत प्रो-इंफ्लेमेटरी स्थितियों की उपस्थिति में, जीपीआर व्यक्त करने वाली कोशिकाएं घाव स्थलों पर जमा हो जाती हैं, मध्यवर्ती चरणों में फंसी रहती हैं और रीमाइलिनेशन में योगदान करने में सक्षम नहीं होती हैं, जिससे पता चलता है कि रिसेप्टर डाउन-रेगुलेशन की गड़बड़ी रीमाइलिनेशन विफलता और बीमारी में योगदान करती है। प्रगति. इन आंकड़ों के बावजूद, जीपीआर17 डाउनरेगुलेशन के परिणामस्वरूप होने वाली आणविक घटनाओं को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। ध्यान दें, ऐसा माना जाता है कि एमएस [24-26] सहित विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों [23] की प्रगति के तंत्र में चयापचय संबंधी विकार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमएस में चयापचय संबंधी शिथिलता की उपस्थिति ओएल फ़ंक्शन को विनियमित करने में बायोएनर्जेटिक मेटाबोलाइट्स और उनके संबंधित तंत्र की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता की मांग करती है। इन विचारों के आधार पर, वर्तमान अध्ययन में, हमारा लक्ष्य यह समझना है कि ट्रांसक्रिप्ट, मेटाबोलाइट और लिपिड प्रोफाइलिंग के माध्यम से भेदभाव के दौरान जीपीआर 17 मॉड्यूलेशन ओएल बायोएनर्जेटिक्स को सीधे प्रभावित करता है या नहीं। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि ओपीसी को विभेदित करने में जीपीआर17 साइलेंसिंग परिपक्व मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है और लिपिड और ग्लूकोज होमियोस्टेसिस के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में शामिल कई जीनों में परिवर्तन लाता है। इसके अलावा, हमारे चयापचय विश्लेषण से पता चला है कि, जीपीआर17 डाउनरेगुलेशन के बाद, ओएलएस अपने चयापचय को फिर से शुरू करते हैं और लैक्टेट की रिहाई को बढ़ाते हैं, जो सीधे ओएल भेदभाव कार्यक्रम को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, लिपिडोमिक विश्लेषण के माध्यम से, हमने यह भी दिखाया कि जीपीआर17 साइलेंसिंग माइलिन विशिष्ट लिपिड की प्रचुरता को बदल देता है। साथ में इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ओएलएस को विभेदित करने में जीपीआर17 का डाउनरेगुलेशन परिपक्व माइलिनेटिंग कोशिकाओं में उनके विभेदन के लिए आवश्यक ऊर्जा चयापचय और झिल्ली लिपिड दोनों में परिवर्तन को प्रेरित करता है और जीपीआर17 लक्ष्यीकरण का उपयोग आम तौर पर डीमाइलेटिंग रोगों से जुड़े चयापचय संबंधी विकारों को बचाने के लिए किया जा सकता है।

2। सामग्री और विधि

2.1. जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनिमल केयर इंटरनेशनल (यूरोपीय कानून डीआईआर. 2010/63/यूई) और राष्ट्रीय (इतालवी कानून डीएल एन. 26, 4 मार्च 2014) दिशानिर्देशों का पालन किया गया। सभी प्रक्रियाओं को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (5247बी.एन.एल2वाई से एमपीए) द्वारा अनुमोदित किया गया था। गर्भवती चूहों को चार्ल्स रिवर इटालिया से खरीदा गया था और उन्हें 21 ◦C तापमान पर 9 घंटे प्रकाश/10 घंटे अंधेरे चक्र में रखा गया था, जिसमें आहार और पानी की उचित व्यवस्था और पर्यावरण संवर्धन शामिल था।

2.2. चूहा ओपीसी अलगाव

प्राथमिक चूहे ओपीसी को प्रसवोत्तर दिन 2 (पी2) स्प्रैग-डावले चूहों के सेरेब्रल कॉर्टिस से प्राप्त किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था [27,28]। ओपीसी को पॉली-डी, एल-ऑर्निथिन-कोटेड (अंतिम सांद्रता 50 माइक्रोग्राम प्रति एमएल; सिग्मा-एल्ड्रिच, मिलान, इटली) 10 सेमी डिश (2-4 × 105 सेल/कवरस्लिप) पर मेटाबोलॉमिक विश्लेषण के लिए पॉली-डी पर चढ़ाया गया था। , इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए एल-ऑर्निथिन लेपित 13-मिमी ग्लास कवरस्लिप्स (1-2 × 104 कोशिकाएं/कवरस्लिप), और पॉली-डी पर, एल-ऑर्निथिन-लेपित 6-वेल प्लेट्स (7 × 104 कोशिकाएं/ कवरस्लिप) लिपिडोमिक और क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए। कोशिकाओं को 2 प्रतिशत बी27 (लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 10 एनजी/एमएल मानव प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक-बीबी (सिग्मा-एल्ड्रिच, मिलान, इटली) के साथ पूरक न्यूरोबैसल माध्यम में चढ़ाया गया था। 3 दिनों के लिए प्रसार को बढ़ावा देने के लिए 10 एनजी/एमएल मानव बुनियादी फ़ाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली)।

2.3. siRNA अभिकर्मक

ओपीसी को प्रोलिफ़ेरेटिंग से विभेदक माध्यम (2 प्रतिशत बी27 (लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 15 एनएम टी 3 हार्मोन के साथ पूरक न्यूरोबैसल माध्यम) पर स्विच करने के तुरंत बाद ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। चूहे GPR17 प्रतिलेख (धर्मकॉन, लाफायेट, सीओ, यूएसए) के लिए विशिष्ट ऑन-टार्गेट प्लस स्मार्टपूल siRNA को निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए लिपोफ़ेक्टामाइन आरएनएआईमैक्स अभिकर्मक (लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली) के साथ 50 एनएम की अंतिम एकाग्रता में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। एक गैर-लक्षित आरएनए पूल के ट्रांसफ़ेक्शन का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।

2.4. ट्रांस्क्रिप्टोम प्रोफाइलिंग और माइक्रोएरे विश्लेषण

प्रकाशित प्रोटोकॉल [27] के अनुसार आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण किया गया है। संक्षेप में, ओपीसी को siRNA अभिकर्मक के 2 दिन बाद आरएलटी बफर (क्यूजेन, मिलान, इटली) के साथ जोड़ा गया था और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए आरनेसी माइक्रो किट (क्यूजेन, मिलान, इटली) के माध्यम से कुल आरएनए निकाला गया था। आरएनए गुणवत्ता का मूल्यांकन एजिलेंट 2100 बायोएनालाइज़र (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, मिलान, इटली) के साथ किया गया था। आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन)> 7 के साथ आरएनए का उपयोग माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए किया गया था। कम इनपुट क्विक-एम्प लेबलिंग किट, एक रंग (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, मिलान, इटली) का उपयोग करके सायनिन 3-सीटीपी की उपस्थिति में कुल आरएनए के 100 एनजी से लेबल किए गए सीआरएनए को संश्लेषित किया गया था। कुल आरएनए को SurePrint G3 रैट जीन एक्सप्रेशन माइक्रोएरे (#G4858A-074036, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, मिलान, इटली) पर संकरणित किया गया था। इस माइक्रोएरे में स्वस्थानी में संश्लेषित मेर डीएनए जांच शामिल है, जो 30,584 चूहे प्रतिलेखों का प्रतिनिधित्व करती है। एक घूर्णन ओवन (माइक्रोएरे सुविधा, लेबोरेटोरियो प्रति ले टेक्नोलोजी डेले टेरापी अवनजेट, एलटीटीए, फेरारा, इटली) में 17 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर संकरण किया गया था। निर्माता की प्रक्रिया के अनुसार एक-रंग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था। माइक्रोएरे कच्चा डेटा प्राप्त करने के लिए फ़ीचर एक्सट्रैक्शन 10.7.3 सॉफ़्टवेयर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज़, मिलान, इटली) का उपयोग किया गया था। दो प्रायोगिक स्थितियों के बीच भिन्न रूप से व्यक्त जीन की सूची प्राप्त करने के लिए ±1.5 के गुना परिवर्तन और एफडीआर-समायोजित पी-वैल्यू <0.07 पर विचार किया गया।

2.5. जैव सूचनात्मक विश्लेषण

सॉफ्टवेयर मेटाकोर™ (क्लैरिवेट एनालिटिक्स, लंदन, यूके) और QIAGEN के Ingenuity® पाथवे एनालिसिस (IPA®, QIAGEN रेडवुड सिटी, www.qiagen.com/ingenuity, 14 मई 2017 को एक्सेस किया गया) का उपयोग पाथवे-आधारित क्लस्टराइजेशन करने के लिए किया गया था। सामान्य जैविक प्रक्रियाओं की पहचान करने के लिए ओपीसी में जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद विभेदित रूप से व्यक्त जीन। टॉपजीन सूट का उपयोग जीन ऑन्टोलॉजी-आधारित संवर्धन विश्लेषण करने के लिए किया गया था [29]।

2.6. लक्षित मेटाबोलॉमिक्स और लिपिडोमिक्स

मेटाबोलॉमिक डेटा तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ प्राप्त किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित है [30,31], नीचे वर्णित कुछ संशोधनों के साथ। हमने एक ExionLC™ AC सिस्टम (AB Sciex) के साथ मिलकर एक एपीआई -3500 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (AB Sciex, Framingham, MA, USA) का उपयोग किया। अलग-अलग समय बिंदुओं से और या siRNA से ट्रांसफ़ेक्ट किए गए OPC कोशिकाओं को 25{48}} μL के बर्फ-ठंडे मेथनॉल/पानी/एसीटोनिट्राइल 55:25:2{{5{{) में अधिकतम गति पर 1 मिनट के लिए एक ऊतक लेजर में तोड़ा गया। 66}}}}. लाइसेट्स को 4 ◦C पर 15 मिनट के लिए 15,000× g पर घुमाया गया। फिर नमूनों को N2 फेलो के तहत 4 0 ◦C पर सुखाया गया और बाद के विश्लेषण के लिए 125 μL बर्फ-ठंडे MeOH/H2 0/ACN 55:25:20 में फिर से निलंबित कर दिया गया। अमीनो एसिड मात्रा का ठहराव पिछले व्युत्पन्नकरण के माध्यम से किया गया था। संक्षेप में, 125 µL नमूनों में से 25 µL को एकत्र किया गया और 4{80}} ◦C पर N2 प्रवाह के तहत अलग से सुखाया गया। सूखे अवशेषों को फिनाइल-आइसोथियोसाइनेट (PITC), EtOH, पाइरीडीन, और पानी 5 प्रतिशत:31.5 प्रतिशत:31.5 प्रतिशत:31.5 प्रतिशत के 5{87}} μL में फिर से निलंबित कर दिया गया, और फिर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। आरटी, एन2 फेलो के तहत 4 {{95 }} ◦C पर 9 {{97 }} मिनट के लिए सुखाया गया और अंत में 1 ‍{1 ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ अधिक ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ य ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ 9}}6}}5}}1}}0 5 mM अमोनियम एसीटेट का µL MeOH/H2O 50:50 में। विभिन्न अमीनो एसिड की मात्रा का निर्धारण C18 कॉलम (बायोक्रेट्स, इंसब्रुक, ऑस्ट्रिया) का उपयोग करके किया गया था, जिसे 5 0 ◦C पर बनाए रखा गया था। सकारात्मक आयन मोड विश्लेषण के लिए मोबाइल चरण थे चरण ए: 0.पानी में 2 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड और चरण बी: 0.एसिटोनिट्राइल में 2 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड। ग्रेडिएंट T0: 100 प्रतिशत A, T5.5: 5 प्रतिशत A, T7: 100 प्रतिशत A था और प्रवाह दर 500 µL/मिनट थी। दो अलग-अलग रन के साथ नकारात्मक आयन मोड में 5.5 मिनट की दौड़ द्वारा साइनो-चरण लूना कॉलम (50 मिमी × 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन; फेनोमेनेक्स) का उपयोग करके ऊर्जा मेटाबोलाइट्स और कॉफ़ैक्टर्स की मात्रा का प्रदर्शन किया गया था। प्रोटोकॉल ए; मोबाइल चरण A पानी था और चरण B, MeOH में 2 mM अमोनियम एसीटेट था और ग्रेडिएंट T0 था: 80 प्रतिशत B 0.5 mL/मिनट; टी1: 80 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी1.01: 20 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी2.0: 20 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी2.01: 80 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी5.5: 80 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट। प्रोटोकॉल बी; मोबाइल चरण A पानी था और चरण B, MeOH में 2 mM अमोनियम एसीटेट था और ग्रेडिएंट T0: 50 प्रतिशत B 0.5 mL/मिनट था; टी1: 50 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी1.01: 0 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी2.0: 0 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी2.01: 50 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट; टी5.5: 50 प्रतिशत बी 0.5 एमएल/मिनट। 50 ◦C पर बनाए गए C18 कॉलम (बायोक्रेट्स, इंसब्रुक, ऑस्ट्रिया) का उपयोग करके समान नमूनों पर एसाइल-कार्निटाइन मात्रा का ठहराव किया गया था। नमूनों का विश्लेषण सकारात्मक आयन मोड में 5.5 मिनट तक चलाया गया। मोबाइल चरण थे A: H20 में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड B: MeOH में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड और ग्रेडिएंट था T0:30 प्रतिशत B, T0.8: 30 प्रतिशत A, T2: 100 प्रतिशत B, T3: 100 प्रतिशत B, T3 .01: 30 प्रतिशत बी, टी5.5: 30 प्रतिशत बी 500 μL/मिनट की प्रवाह दर के साथ।

फॉस्फोलिपिड्स और फैटी एसिड के स्तर का मूल्यांकन नीचे वर्णित कुछ संशोधनों के साथ एक प्रकाशित प्रोटोकॉल [32,33] के अनुसार (एलसी)-एमएस/एमएस के माध्यम से किया गया था। फॉस्फोलिपिड्स का विश्लेषण MeOH/H20/ACN अर्क पर एक एपीआई -4000 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (एबी साइएक्स, फ्रेमिंघम, एमए, यूएसए) के माध्यम से एक एचपीएलसी प्रणाली (एगिलेंट) के साथ मिलकर नकारात्मक और सकारात्मक दोनों आयनीकरण में किया गया था। ) और CTC-PAL HTS ऑटोसैंपलर (PAL सिस्टम)। नकारात्मक आयनीकरण विश्लेषण के लिए, लिपिड को 5 मिनट की अवधि में एक सायनो-चरण LUNA कॉलम (5 {{28%) मिमी × 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन; फेनोमेनेक्स) के माध्यम से अलग किया गया था, और मोबाइल चरण MeOH में 5 मिमी अमोनियम एसीटेट था। सकारात्मक आयनीकरण के लिए, एनालिटिक्स को 8 मिनट की अवधि में एक्सटेर्रा आरपी 18 3.5 माइक्रोन 4.6 मिमी × 100 मिमी कॉलम (वाटर्स) पर अलग किया गया था, और मोबाइल चरण MeOH में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड था। हाइपरसिल गोल्ड C8 कॉलम (लाइफ टेक्नोलॉजीज) पर नकारात्मक आयन मोड में मुक्त फैटी एसिड का विश्लेषण किया गया, जिसमें H2O/MeOH 97:3 में 10 मिमी डायसोप्रोपाइलेथाइलमाइन और 15 मिमी एसिटिक एसिड शामिल थे। वर्णित प्रोटोकॉल में विश्लेषण किए गए सभी मेटाबोलाइट्स को पहले फॉस्फोलिपिड्स को छोड़कर, शुद्ध मानकों के साथ मान्य किया गया था, जहां केवल विभिन्न वर्गों के प्रतिनिधियों को मान्य किया गया था। मल्टीक्वांट™ सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.0.3, एबी साइएक्स) का उपयोग डेटा विश्लेषण और क्रोमैटोग्राम की चरम समीक्षा के लिए किया गया था। डेटा प्रोसेसिंग के लिए, कच्चे क्षेत्रों को एक ही नमूने में सभी मेटाबोलाइट क्षेत्रों के माध्यिका द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। विशेष रूप से, हमने सापेक्ष मेटाबोलाइट प्रचुरता (एमए एन) को इस प्रकार परिभाषित किया है:

जहां Xn नमूने a, b, के लिए मेटाबोलाइट n के चरम क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। . . , z, और Ma n =1 a नमूने a, b, के लिए मेटाबोलाइट n के चरम क्षेत्रों के मध्य का प्रतिनिधित्व करता है। . . , z. प्राप्त डेटा को फिर लॉग ट्रांसफॉर्मेशन द्वारा रूपांतरित किया गया और विषमलैंगिकता को सही करने, डेटा की विषमता को कम करने और मास्क प्रभाव को कम करने के लिए पेरेटो स्केल किया गया। विस्तार से, प्राप्त मूल्यों को लॉग 10 द्वारा रूपांतरित किया गया और फिर पेरेटो की विधि द्वारा निम्नानुसार स्केल किया गया:

जहां xi डेटा मैट्रिक्स (i (मेटाबोलाइट्स), j (नमूने)) में रूपांतरित मान है और si रूपांतरित मेटाबोलाइट मानों का मानक विचलन है [35]। प्राप्त मूल्यों को सापेक्ष मेटाबोलाइट स्तर माना जाता था। डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण MetaboAnalyst 5 द्वारा किया गया। 0 वेब टूल [36]।

2.7. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और सेल काउंटिंग

कोशिकाओं को 4 प्रतिशत सुक्रोज युक्त 4 प्रतिशत पैराफॉर्मल्डिहाइड फॉस्फेट-बफर समाधान में तय किया गया था। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: खरगोश विरोधी GPR17 (1:100; केमैन केमिकल), और चूहा विरोधी MBP (1:200; मर्क मिलिपोर, मिलान, इटली)। प्राथमिक एंटीबॉडी का ऊष्मायन 2.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या रात भर 4 ◦C पर किया गया था। फिर कोशिकाओं को एलेक्साफ्लोर 488 या एलेक्साफ्लोर 555 (1:600; लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली) से संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। सभी एंटीबॉडीज़ को फॉस्फेट-बफ़र्ड अवरोधक समाधान (पीएच 7.4) में पतला किया गया था जिसमें 0.3 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 था। नाभिक को यूवी फ़्लफ़्लोरोसेंट डाई होचस्ट 33258 (1:10, 000; लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली) के साथ लेबल किया गया था। फिर कवरस्लिप्स को फ़्लफ़्लोरोसेंट माउंटिंग माध्यम (डाको) में लगाया गया। चयनित मार्करों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को प्रत्येक कवरस्लिप (0.07 मिमी2/फिफिल्ड) के लिए 20 यादृच्छिक क्षेत्रों से गिना गया था। परिणाम को नाभिकों की संख्या के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया और फिर सामान्यीकृत बनाम नियंत्रण 100 प्रतिशत पर सेट किया गया।

2.8. एआर-सी155858 से उपचार

siRNA अभिकर्मक के एक दिन बाद (विभेदन 1 में दिन), नियंत्रण और GPR 17- मौन ओपीसी को AR-C155858 (टोक्रिस, यूके; अंतिम एकाग्रता: 1 µM) या वाहन (0.04 प्रतिशत) के साथ इलाज किया गया डीएमएसओ)। दो दिनों (विभेदन 3 में दिन) के बाद, ओपीसी को बाद के आरएनए विश्लेषण के लिए तैयार किया गया या फिर से इलाज किया गया और फिर विभेदन 5 में दिन में एकत्र किया गया।

2.9. कुल आरएनए निष्कर्षण, रेट्रोट्रांसक्रिप्शन और क्यूपीसीआर विश्लेषण

अभिकर्मक के 1, 2, 3 या 5 दिन बाद कोशिकाओं को ट्राइज़ोल अभिकर्मक (लाइफ टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली) से मिलाया गया। डायरेक्ट-ज़ोल आरएनए माइक्रो-प्रीप किट (ज़ाइमो रिसर्च, जर्मनी) का उपयोग करके कुल आरएनए निकाला गया था। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, सेंसिफ़ास्ट™ सीडीएनए संश्लेषण किट (बायोलिन, लंदन, यूके) का उपयोग करके कुल आरएनए के 400-800 एनजी से शुरू करके सीडीएनए संश्लेषण किया गया था। सभी जीनों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण SensiFAST™ SYBR सुपरमिक्स (बायोलिन, लंदन, यूके) के साथ किया गया और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए CFX96 वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम (बायो-रेड, मिलान, इटली) का उपयोग करके GAPDH अभिव्यक्ति को सामान्य किया गया।

2.10. सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और ग्राफपैड प्रिज्म 8.0.1 सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जाता है। सामान्य वितरण वाले दो समूहों के बीच सभी तुलनाओं के लिए, दो-पूंछ वाले अयुग्मित छात्र टी-परीक्षण किए गए। मानव नमूनों पर विश्लेषण के लिए दो-पूंछ वाले युग्मित छात्र टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था। सामान्य वितरण वाले समूहों की कई तुलनाओं के लिए, टकी या सिडक के मल्टीपल पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) का एक-तरफ़ा या दो-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, p <{9}}.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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