जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 17 साइलेंसिंग द्वारा प्रेरित ग्लूकोज और लिपिड चयापचय की रीवायरिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनिटर्स के माइलिनेटिंग कोशिकाओं में संक्रमण को सक्षम बनाती है Ⅱ

3। परिणाम

3.1. ओपीसी को अलग करने में जीपीआर17 साइलेंसिंग ने लिपिड और ग्लूकोज चयापचय में शामिल जीन की अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से बदल दिया

ओएल भेदभाव के दौरान जीपीआर17 अभिव्यक्ति से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित जैविक प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए, हमने चूहे जीपीआर17 के लिए विशिष्ट स्मार्ट-पूल सीआरएनए के साथ चूहे ओपीसी को संक्रमित करके इसकी अभिव्यक्ति में हस्तक्षेप किया। क्यूआरटी-पीसीआर (चित्रा एस1) द्वारा सफल जीपीआर17 नॉकडाउन को मान्य करने के बाद, हमने जीपीआर में 30,584 चूहे प्रतिलेखों का माइक्रोएरे विश्लेषण किया, जो नियंत्रण ओपीसी बनाम मौन हैं और विभिन्न जैव सूचना उपकरणों द्वारा विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) का विश्लेषण किया। सबसे पहले, 640 डीईजी का अध्ययन मेटा-कोर द्वारा किया गया है, ताकि मार्ग संवर्धन विश्लेषण किया जा सके और महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित होने की भविष्यवाणी की गई प्रक्रियाओं की पहचान की जा सके। इस विश्लेषण में एमटीओआर सिग्नलिंग में बदलाव का सुझाव दिया गया है, जिसे पहले से ही जीपीआर17 फ़ंक्शन [37] और ओपीसी परिपक्वता के लिए प्रासंगिक मानी जाने वाली अन्य प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ दिखाया गया है, जैसे "साइटोस्केलेटन रीमॉडलिंग" और"लिपिड चयापचय का विनियमन" (तालिका नंबर एक)।

प्लस

हड्डियों के विकास के लिए सिस्टैंच जानने के लिए यहां क्लिक करें

तालिका 1. सॉफ्टवेयर मेटाकोर का उपयोग जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद डीईजी पर पाथवे संवर्धन विश्लेषण करने के लिए किया गया है। तालिका विश्लेषण से उत्पन्न सबसे महत्वपूर्ण रास्ते, संबंधित जीन की संख्या और डेटासेट में शामिल सामान्य जीन दिखाती है

फिर, एक विश्लेषण मिलान करने के लिए इनजेनिटी पाथवे विश्लेषण (आईपीए) उपकरण का उपयोग किया गया था, जो क्वेरी डेटासेट की तुलना में महत्वपूर्ण समानता और अंतर के साथ स्वचालित रूप से क्यूरेटेड आईपीए डेटासेट की पहचान करता है। यह विश्लेषण जीपीआर17 अभिव्यक्ति और लिपिड चयापचय के बीच अनुमानित लिंक को मजबूत करता है, जिससे पता चलता है कि हमारे डेटासेट (तालिका एस1) में 38 जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन परिवर्तित फैटी एसिड संश्लेषण (चित्र 1) से जुड़े हैं। इनमें से, GPR17 साइलेंसिंग ने LXR (चित्र 2 और तालिका S1 में लिवर फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण में प्रमुख खिलाड़ी। हमारे डेटासेट में, हमने यह भी देखा कि PDH (पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज), Ldha (लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज अल्फा), और Pdk1 (पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज किनेज 1) सहित कई परिवर्तित जीन, ग्लूकोज चयापचय और क्रेब्स चक्र से संबंधित हैं, जो संभावित भागीदारी का सुझाव देते हैं। इन चयापचय प्रक्रियाओं के नियमन में GPR17 रिसेप्टर। इसके अनुसार, डीईजी पर एक जीन ऑन्टोलॉजी-आधारित संवर्धन विश्लेषण (टॉपजीन सुइट) ने "मोनोकार्बोक्सिलिक एसिड चयापचय प्रक्रिया" में परिवर्तन का खुलासा किया (जीओ: {{2 0} 0 32787, पी- मान: 0.02), सीएनएस विकास और कोशिका चयापचय से संबंधित अन्य प्रक्रियाओं से परे, जैसे "तंत्रिका तंत्र विकास का विनियमन" (जीओ:0051960, पी-मूल्य: 0.033) और "स्फिंगोलिपिड चयापचय प्रक्रियाएं" (जीओ:0006665, पी-मूल्य) : 0.043) (चित्रा 2; तालिका एस2 में पूरी सूची)।

विश्व स्तर पर, इन परिवर्तनों से पता चलता है कि जीपीआर17 साइलेंसिंग लिपिड और ग्लूकोज होमियोस्टेसिस के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में शामिल कई जीनों को ट्यून करके, साथ ही माइलिन उत्पादन के लिए कोलेस्ट्रॉल और लिपिड का उपयोग करके, माइलिनेशन के लिए कोशिकाओं को संबोधित करने के लिए एक ट्रिगर के रूप में कार्य कर सकता है।

चित्र 1. इनजेन्युटी पाथवे विश्लेषण उपकरण (आईपीए, क्यूजेन) का उपयोग डेटासेट का विश्लेषण करने और उन बीमारियों और जैविक प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए किया गया था, जिनके डेटासेट में अलग-अलग व्यक्त जीन के पैटर्न के आधार पर बढ़ने या घटने की भविष्यवाणी की गई है। इस विश्लेषण से, हमने चित्र में उस योजना को एक्सट्रपलेशन किया जिसमें लिपिड संश्लेषण से संबंधित जीन शामिल हैं जो हमारे डेटासेट में भिन्न रूप से व्यक्त किए गए हैं (पी-वैल्यू=9.67 × 10−4)। इन जीनों का पूरा नाम, सापेक्ष गुना परिवर्तन (लॉग 2 अनुपात) के साथ तालिका एस 1 में बताया गया है। लाल रंग में, अपग्रेडित जीन; हरे, डाउनरेगुलेटेड जीन में

चित्र 2. टॉपजीन सुइट का उपयोग डीईजी पर जीओ-आधारित संवर्धन विश्लेषण के लिए किया गया है। चित्र केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और कोशिका चयापचय से संबंधित कुछ महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को दिखाता है जो संभावित रूप से GPR17 साइलेंसिंग द्वारा बदल दिए गए हैं। नीली पट्टियाँ प्रत्येक पद से जुड़े कुल जीन को दर्शाती हैं; लाल पट्टियाँ प्रत्येक पद के लिए हमारे डेटासेट के साथ समान जीन को दर्शाती हैं। इस विश्लेषण से उत्पन्न जैविक प्रक्रियाओं की पूरी सूची और सापेक्ष पी-मान तालिका एस2 में बताए गए हैं।

3.2. इन विट्रो में ओपीसी विभेदन के दौरान मेटाबोलॉमिक विश्लेषण

जीपीआर17 अभिव्यक्ति और विशिष्ट चयापचय मार्गों की सक्रियता के बीच सहसंबंध का आकलन करने के लिए, हमने उनकी शारीरिक परिपक्वता के दौरान सुसंस्कृत ओपीसी का चयापचय विश्लेषण किया। ओपीसी को एक विभेदन माध्यम में बनाए रखा गया था और फिर चार अलग-अलग समय बिंदुओं (विभेदन में 0, 1, 3, और 5 दिनों के बाद, डीआईडी) पर लिस किया गया था, जो ओएल परिपक्वता के विभिन्न चरणों के अनुरूप था। समानांतर में, यह आकलन करने के लिए कि सभी प्रयोगों में परिपक्वता अपेक्षित समय के साथ हुई, ओपीसी को जीपीआर 17 और एमबीपी के लिए सुसंस्कृत और दाग दिया गया। परिणामों से पता चला कि जीपीआर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या 3 डीआईडी ​​पर अपनी अधिकतम तक पहुंच गई और फिर 5 डीआईडी ​​पर बेसल स्तर की ओर लौट आई, जबकि परिपक्वता के दौरान एमबीपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में उत्तरोत्तर वृद्धि हुई (चित्र 3ए), लगातार पिछले परिणाम [37]। ओपीसी मेटाबॉलिक मूल्यांकन तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) द्वारा किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है [38], ग्लाइकोलाइसिस, पेंटोस फॉस्फेट मार्ग, क्रेब्स चक्र, फैटी एसिड-ऑक्सीकरण, उनके सहकारकों में शामिल ऊर्जावान मेटाबोलाइट्स पर ध्यान केंद्रित किया गया था। एनएडीएच, एनएडी प्लस, एनएडीपीएच, एनएडीपी प्लस, एटीपी, एडीपी, एएमपी, अमीनो एसिड और उनके कुछ डेरिवेटिव। विश्लेषण किए गए चार-समय बिंदुओं के मेटाबॉलिक प्रोफाइल चित्र 3बी में बताए गए हैं। दिन 0 में, क्रेब्स चक्र से संबंधित और/या जुड़े कई मेटाबोलाइट्स का स्तर (उदाहरण के लिए, सक्सिनेट, मैलेट, अल्फा-केटोग्लूटारेट, ग्लूटामेट, एस्पार्टेट, ऐलेनिन और प्रोलाइन) अधिक था, जैसा कि आने वाली कोशिकाओं से अपेक्षित था। अत्यधिक प्रसार वाली अवस्था से (चित्र 3सी)। मध्यवर्ती चरणों में (डीआईडी ​​1 से 3 तक), ओपीसी ने फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण में शामिल अणुओं का एक उल्लेखनीय विनियमन दिखाया। तदनुसार, हमने एसिटाइल-सीओए (चित्रा 3 सी) के बढ़े हुए स्तर को देखा, जो कोलेस्ट्रॉल और फैटी एसिड के अग्रदूत और मैलोनील-सीओए, फैटी एसिड संश्लेषण के एक विशिष्ट मध्यवर्ती का प्रतिनिधित्व करता है। डीआईडी ​​5 पर, हमने मुक्त इंट्रासेल्युलर ग्लूकोज (चित्रा 3 सी) में महत्वपूर्ण वृद्धि के समानांतर कई एसाइल-कार्निटाइन और अमीनो एसिड के स्तर में वृद्धि देखी। हमने दिन 0 से डीआईडी ​​5 तक एएमपी और एडीपी के स्तर में कमी देखी और डीआईडी ​​1 और डीआईडी ​​3 के बीच एटीपी में क्षणिक वृद्धि देखी। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, दिन 0 से डीआईडी ​​3 तक, के अनुरूप अस्थायी खिड़की जिसके दौरान जीपीआर17 अपनी अधिकतम अभिव्यक्ति तक पहुंचता है, ओपीसी मुख्य रूप से कोलेस्ट्रॉल और फैटी एसिड जैवसंश्लेषण को बनाए रखने के लिए ग्लूकोज और अमीनो एसिड का उपयोग करते हैं। डीआईडी ​​5 पर, जैसा कि एसाइल-कार्निटाइन के बढ़े हुए स्तर से उजागर होता है, ओपीसी संभवतः फैटी एसिड के उपयोग पर निर्भर करते हैं। साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि शारीरिक विभेदन के दौरान ओपीसी परिपक्व माइलिनेटिंग ओएल बनने के लिए अपने ऊर्जावान चयापचय को उत्तरोत्तर पुन: व्यवस्थित करते हैं।

3.3. इन विट्रो में ओपीसी परिपक्वता के दौरान जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद मेटाबोलॉमिक विश्लेषण

कोशिका विभेदन के दौरान होने वाले ऊर्जा चयापचय परिवर्तनों को चलाने में जीपीआर17 रिसेप्टर के योगदान का खुलासा करने के लिए, हमने स्क्रैम्बल आरएनए प्राप्त करने वाले नियंत्रण ओपीसी की तुलना में, जीपीआर 17- साइलेंट ओपीसी पर मेटाबोलॉमिक्स का प्रदर्शन किया। हमने सबसे पहले जीपीआर17 और एमबीपी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा ओपीसी परिपक्वता पर जीपीआर17 साइलेंसिंग के प्रभाव की जांच की। जैसा कि अपेक्षित था, रिसेप्टर साइलेंसिंग के बाद, हमें जीपीआर17 स्टेनिंग में कमी मिली, जो 3 डीआईडी ​​पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। हमने 3 डीआईडी ​​(दिखाया नहीं गया) और 5 डीआईडी ​​(चित्र एस2) दोनों पर परिपक्व एमबीपी-पॉजिटिव ओएल की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि देखी। समानांतर में, विस्तृत क्यूपीसीआर विश्लेषण पांच-समय बिंदुओं पर किया गया था (विभेदन में 1, 2, 3 और 5 दिन, डीआईडी), जिससे नियंत्रण ओपीसी में 1 डीआईडी ​​के बाद जीपीआर17 अभिव्यक्ति में मजबूत वृद्धि का पता चला। जो 2 डीआईडी ​​के बाद शुरू होकर महत्वपूर्ण स्तर तक पहुंचता है, एमबीपी अभिव्यक्ति में 5 डीआईडी ​​तक प्रगतिशील वृद्धि और प्रारंभिक मार्कर एनजी 2 (चित्रा 4 ए) में महत्वपूर्ण कमी होती है। इसके विपरीत, GPR17 साइलेंसिंग (चित्रा 4 बी) के बाद, GPR17 mRNA DID1 पर निचले स्तर पर पहुंच गया और फिर लगातार कम रहा, MBP अभिव्यक्ति में और वृद्धि हुई और NG2 में और कमी आई। प्रत्येक समय बिंदु पर जीपीआर में एनजी2 और एमबीपी अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष तुलना बनाम नियंत्रण ओपीसी को चित्र 4सी में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि, इन प्रायोगिक स्थितियों के तहत, ओपीसी में जीपीआर17 को शांत करने से उनकी विभेदन प्रक्रिया तेज हो गई। फिर, पांच चयनित समय बिंदुओं पर एलसी-एमएस/एमएस द्वारा ओपीसी मेटाबोलॉमिक्स का प्रदर्शन किया गया। प्रत्येक समय बिंदु पर जीपीआर साइलेंट और नियंत्रण ओपीसी से प्राप्त मेटाबॉलिक डेटा की तुलना ने हमें उन मेटाबोलाइट्स की पहचान करने की अनुमति दी जो जीपीआर 17 साइलेंसिंग से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित होते हैं

चित्र 3. (ए) ग्राफ विभेदन के दौरान जीपीआर17 प्लस और एमबीपी प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत में परिवर्तन दिखाता है। n=3 प्रति समूह; टुकी के परीक्षण के साथ एक तरफ़ा एनोवा। * पी < 0.05, ** पी < 0.01) (बी) हीटमैप 0, 1 पर रोके गए प्रत्येक एकल नमूने में मेटाबोलाइट प्रचुरता दिखाता है , 3 या 5 डी.आई.डी. विश्लेषण किए गए मेटाबोलाइट्स की प्रचुरता को गहरे नीले (बहुत कम प्रचुरता) से लेकर गहरे भूरे (बहुत अधिक प्रचुरता) तक के रंगीन पैमाने द्वारा दर्शाया जाता है। n=4-5 प्रति समूह। (सी) स्थितियों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न प्रचुरता वाले मेटाबोलाइट्स (0, 1, 3 और 5 दिनों में विभेदन, डीआईडी; फिशर के एलएसडी परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा)।

डीआईडी ​​1 (चित्र 5ए) पर, हमें कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं मिला। डीआईडी ​​2 (चित्रा 5 बी) पर, हमने क्रेब्स चक्र (मैलेट, फ्यूमरेट साइट्रेट) के कुछ मेटाबोलाइट्स में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, मुक्त कार्निटाइन (सीओ), एसिटाइल-कार्निटाइन (सी 2), प्रोपियोनील-कार्निटाइन (सी 3) में मामूली वृद्धि हुई। 0), ब्यूटिरिल-कार्निटाइन (C4:0), वैलेरिल-कार्निटाइन (C5:0), हेक्साडेकेनॉयल-कार्निटाइन (C16:0और ग्लूकोज में उल्लेखनीय कमी , लैक्टेट, क्रिएटिन और ऑर्निथिन। ऑयलएक्टेट और क्रिएटिन में कमी और प्रोपियोनील-कार्निटाइन (सी 3) की वृद्धि भी डीआईडी ​​3 (चित्रा 5 सी) पर देखी गई। डीआईडी ​​5 (चित्रा 5 डी) पर, हमने अभी भी मुक्त कार्निटाइन में वृद्धि देखी ( CO), एसिटाइलकार्निटाइन (C2), प्रोपियोनील-कार्निटाइन (C3:0), ब्यूटिरिल-कार्निटाइन (C4:{{3{33}}}}), वैलेरील-कार्निटाइन (C5:0 )टेट्राडेकेनॉयल-कार्निटाइन (C14:0), हेक्साडेकेनॉयल-कार्निटाइन (C16:0), ऑक्टाडेकेनॉयल-कार्निटाइनC18:0), ऑक्टाडेकेनॉयल-कार्निटाइन (C18:1), उसी के समान जो मूल रूप से अधिक में देखा गया था विभेदित कोशिकाएँ (चित्र 3 देखें), डाइहाइड्रॉक्सीएसीटोन-3-फॉस्फेट/ग्लिसराल्डिहाइड3-फॉस्फेट (डीएचएपी/जीएपी), फ्यूमरेट और साइट्रेट में वृद्धि, और एसिटाइल-सीओए, मेट-एसओक्रिएटिन, टॉरिन और में कमी कार्नोसिन.

चित्र 4. ओपीसी परिपक्वता पर जीपीआर17 साइलेंसिंग का प्रभाव। जीपीआर17 (हरा), एनजी2ब्लू) और एमबीपी (लाल) के अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन वास्तविक समय पीसीआर द्वारा नियंत्रण स्थितियों में विभेदन के दौरान किया गया था (कोशिकाओं को हाथापाई आरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और जीपीआर17 साइलेंसिंग (बी) के बाद, और टी पर सामान्यीकृत बनाम अभिव्यक्ति। 6}} (0 पर सेट)। प्रत्येक समय बिंदु के अनुसार n=6। तुकी के एकाधिक तुलना परीक्षणों के साथ एक-तरफ़ा एनोवा (ए): ** पी < {{10} }.001 बनाम किया 0-2-3-5, @ p < 0.05 बनाम किया 3-5; ## p < 0.01 बनाम दिन 0; एसएसएस पी < {{30}}.{33}}01 बनाम दिन किया{ {21}}; (बी): *** पी < 0। .001 बनाम दिन 0, # पी < 0.05, ### पी < 0.001 बनाम दिन 0.एस पी < 0.05, एसएस पी < 0.01, एसएसएस पी < 0.001 वी. डीआईडी ​​5. (सी) जीपीआर में एनजी2 और एमबीपी अभिव्यक्ति 17- मौन ओपीसी बनाम। प्रत्येक समय बिंदु पर ओपीसी (0 पर सेट) को नियंत्रित करें। गुना परिवर्तन (एफसी) को लॉग, (एफसी) के रूप में रिपोर्ट किया गया है। एक नमूना टी-परीक्षण, * पी < 0.05, * पी <0.01; *** पी <0.001 बनाम नियंत्रण ओपीसी में सापेक्ष डीआईडी।

चित्र 5. ओपीसी में जीपीआर17 साइलेंसिंग से प्रेरित मेटाबॉलिक परिवर्तन। (ए-डी) जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद प्रत्येक मेटाबोलाइट की प्रचुरता को सापेक्ष नियंत्रण नमूने में सामान्य कर दिया गया है। परिणामी तह परिवर्तनों का उपयोग प्रत्येक समय बिंदु (विभेदन में 1, 2, 3, 5 दिन) के लिए ज्वालामुखी प्लॉट उत्पन्न करने के लिए किया गया था। बिंदीदार क्षैतिज रेखा के ऊपर के बिंदु उन मेटाबोलाइट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्होंने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया है (फिशर का एलएसडी एफडीआर द्वारा सही किया गया; p.adj < 0.1)। हरे रंग में, कम अभिव्यक्ति वाले मेटाबोलाइट्स, लाल रंग में, उच्च अभिव्यक्ति वाले, जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद। n=7-9 प्रति समूह। किया: विभेदन में दिन।

3.4. जीपीआर17 ओपीसी परिपक्वता के दौरान लैक्टेट रिलीज को नियंत्रित करता है

ऊपर वर्णित मेटाबोलॉमिक्स परिणामों के आधार पर, जीपीआर17 साइलेंसिंग को लैक्टेट के इंट्रासेल्युलर स्तर को कम करने के लिए पाया गया। यह आकलन करने के लिए कि क्या यह कमी लैक्टेट चयापचय में सामान्य कमी या इस मेटाबोलाइट की बढ़ी हुई रिहाई को दर्शाती है, हमने अलग-अलग समय बिंदुओं पर सेल लाइसेट्स और संबंधित मीडिया में इसके स्तर को मापा। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, नियंत्रण स्थितियों में, इंट्रासेल्युलर लैक्टेट डीआईडी ​​2 (चित्रा 6 ए) (जब जीपीआर 17 रिसेप्टर अभिव्यक्ति भी अधिकतम है) पर उच्चतम प्रचुरता तक पहुंच गया, और फिर जब कोशिकाएं परिपक्व हो गईं तो यह कम हो गया। इसके बजाय, जीपीआर17 को शांत करने के बाद, इंट्रासेल्युलर लैक्टेट की वृद्धि समाप्त हो गई, और इसके स्तर में भेदभाव की ओर और कमी आई। वास्तव में, प्रत्येक समय बिंदु पर जीपीआर 17- मौन ओपीसी बनाम नियंत्रण ओपीसी में लैक्टेट स्तर की तुलना ने डीआईडी ​​2 और 3 (चित्र 6बी) पर इसके स्तर में कमी को उजागर किया। बाह्यकोशिकीय लैक्टेट ने अलग-अलग कैनेटीक्स का पालन किया, जिससे नियंत्रण स्थितियों में डीआईडी ​​1 की तुलना में डीआईडी ​​2-3-5 पर महत्वपूर्ण कमी देखी गई, जबकि जीपीआर 17- मौन ओपीसी में यह स्थिर रूप से उच्च रहा और फिर डीआईडी ​​5 (चित्र 6सी) पर महत्वपूर्ण रूप से कम हो गया। ). हालाँकि, जब दो प्रायोगिक स्थितियों के बीच अलग-अलग समय बिंदुओं पर लैक्टेट के स्तर की तुलना की गई, तो GPR17 साइलेंसिंग ने शारीरिक कमी में बाधा उत्पन्न की,बढ़ती लैक्टेट उपस्थितिDID 2 और 3 पर माध्यम में (चित्र 6d),बढ़ी हुई रिलीज़ का सुझाव.

चित्र 6. ओपीसी में जीपीआर17 साइलेंसिंग लैक्टेट चयापचय को बदल देती है। (ए) नियंत्रण स्थितियों (हरी रेखा) में ओपीसी परिपक्वता के दौरान और जीपीआर17 साइलेंसिंग (नारंगी रेखा) के बाद लैक्टेट प्रचुर मात्रा में। n=7-9 प्रति समूह। टुकी के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा। * पी < 0.05, ** पी < 0.01 बनाम डीआईडी2 सीटीएल; §§ पी < 0। ) जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद लैक्टेट का स्तर प्रत्येक समय बिंदु पर नियंत्रण नमूनों (1 पर सेट) की तुलना में सामान्यीकृत किया गया (एन=7-9)। ** पी <0.01; एक नमूना टी-परीक्षण। जीपीआर से वातानुकूलित मीडिया 17- मौन और नियंत्रण ओपीसी को मेटाबोलॉमिक विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही संस्कृति से एकत्र किया गया था। मीडिया में लैक्टेट स्तर का मूल्यांकन एलसी-एमएस/एमएस द्वारा किया गया था। (सी) नियंत्रण स्थितियों (हरी रेखा) में ओपीसी परिपक्वता के दौरान और जीपीआर17 साइलेंसिंग (नारंगी रेखा) के बाद बाह्यकोशिकीय स्थान में लैक्टेट की प्रचुरता। टुकी के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा। ** पी <0.01, *** पी < 0.001 बनाम डीआईडी1 सीटीएल; § पी <0.05 बनाम डीआईडी5 एसआईजीपीआर17। (डी) जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद एक्स्ट्रासेलुलर लैक्टेट स्तर को प्रत्येक समय बिंदु पर नियंत्रण नमूनों (1 पर सेट) की तुलना में सामान्यीकृत किया गया था। * पी <0.05; ** पी <0.01; एक नमूना टी-परीक्षण। नियंत्रण में एमसीटी1 निषेध के प्रभाव (ई,जी) और जीपीआर 17-साइलेंस्ड (एफ,एच) ओपीसी का मूल्यांकन अवरोधक-उपचारित नमूनों बनाम सापेक्ष नियंत्रण (वाहन-उपचार) में एमबीपी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके किया गया है। , भेदभाव के 3 और 5 दिन पर। n=6 प्रति समूह।

उन तंत्रों में से एक जिसके द्वाराओपीसी लैक्टेट जारी कर सकते हैंमोनोकार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर MCT1 के माध्यम से होता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ओपीसी स्वयं अपने सेल साइक्लिंग और भेदभाव को बढ़ावा देने वाले एमसीटी रिसेप्टर्स के माध्यम से बाह्यकोशिकीय लैक्टेट प्राप्त कर सकते हैं [39]। इस प्रकार, हमने सोचा कि क्या जीपीआर17 साइलेंसिंग से प्रेरित लैक्टेट की बढ़ी हुई रिलीज को एमसीटी1 द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है और क्या यह उन्हीं स्थितियों में ओपीसी परिपक्वता पर देखे गए प्रभाव के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हो सकता है (चित्र 4)। इस उद्देश्य के लिए, हमने सामान्य विभेदन के दौरान और जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद ओपीसी का एआर-सी155858, एमसीटी1 के एक चयनात्मक अवरोधक के साथ इलाज किया। जैसा कि अपेक्षित था, लैक्टेट रिलीज़ को दोनों स्थितियों में सफलतापूर्वक रोक दिया गया था (चित्र S3)। विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों में ओपीसी परिपक्वता पर एमसीटी1 निषेध के प्रभाव का मूल्यांकन एमबीपी के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण करके किया गया था। एमबीपी की जीन अभिव्यक्ति में मामूली कमी, जो सांख्यिकीय महत्व (पी=0.07) के करीब है, केवल जीपीआर17 (चित्रा 6ई-एच) के लिए विशिष्ट सीआरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए नमूनों में पाई गई है; हालाँकि, नियंत्रण आरएनए (siNEG) से ट्रांसफ़ेक्ट किए गए नमूनों में कोई महत्वपूर्ण भिन्नता सामने नहीं आई। इन परिणामों से पता चलता है कि जीपीआर17 डाउनरेगुलेशन द्वारा मध्यस्थ बाह्यकोशिकीय लैक्टेट में वृद्धि ओपीसी की परिपक्वता को बढ़ावा देती है; हालाँकि, एमबीपी में कमी की छोटी सीमा इंगित करती है कि यह मेटाबोलाइट प्रक्रिया में शामिल एकमात्र कारक नहीं है।

3.5. ओपीसी परिपक्वता के दौरान जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद लिपिडोमिक विश्लेषण

जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के परिणामों ने इसके कार्य और लिपिड और कोलेस्ट्रॉल के सिंथेटिक मार्गों के बीच एक संभावित लिंक पर भी प्रकाश डाला, जो माइलिन के मुख्य घटक हैं। लिपिड चयापचय में जीपीआर17 की भूमिका की और जांच करने के लिए, हमने दिन 0 की तुलना में 2, 3 और 5 दिनों के विभेदन के बाद जीपीआर के लिपिडोमिक विश्लेषण में एलसी-एमएस/एमएस को लागू किया। विश्लेषण किए गए लिपिड, सापेक्ष गुना परिवर्तन और पी-मूल्यों की सूची तालिका एस4 में बताई गई है। प्रायोगिक समूहों में दो सबसे प्रचुर लिपिड वर्ग फैटी एसिड और डायसील-फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसीएए) परिवार थे। नियंत्रण ओपीसी के विभेदन के दौरान, हमें किसी भी लिपिड वर्ग की प्रचुरता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं मिला। इसके बजाय, जीपीआर 17- साइलेंट ओपीसी ने नियंत्रण ओपीसी की तुलना में मुक्त फैटी एसिड, सेरामाइड्स, एसाइल-एल्काइल-फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसीए), और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (पीआई) की एक परिवर्तित प्रचुरता की ओर रुझान दिखाया, विशेष रूप से डीआईडी ​​3 और 5 पर। लेकिन केवल डायसील-फॉस्फेटिडाइलथेनॉलमाइन (PEaa) और स्फिंगोमाइलिन (SM) ने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया (चित्र 7)।

चित्र 7. ओपीसी विभेदन के दौरान जीपीआर17 साइलेंसिंग द्वारा प्रेरित लिपिडिक वर्गों की प्रचुरता में परिवर्तन। अलग-अलग समय बिंदुओं पर नियंत्रण स्थितियों में प्रत्येक लिपिड वर्ग की प्रचुरता की सूचना दी गई है (ए) जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद प्रत्येक लिपिड वर्ग की गतिशीलता का विश्लेषण किया गया: (बी) फैटी एसिड, (सी) सेरामाइड्स (डी) लिसोपीसी (लिसोफोस्फेटिडाइल-कोलीन), (ई) लाइसोपीई (लिसोफोस्फेटिडाइलथेनॉलमाइन्स), (एफ) पीसीएए (डायसील-फॉस्फेटिडिल-कोलाइन्स), (जी) पीसीएई (एसाइल-एल्काइल-फॉस्फेटिडिल-कोलाइन्स), (एच) पीईएए (डाई-एसिलफॉस्फेटिडिल-एथेनॉलमाइन्स), (आई) पीईईए (एसिल-एल्काइल-फॉस्फेटिडिल-एथेनॉलमाइन्स), (i) पीआई (फॉस्फेटिडाइलिनोसिटोल्स), (के) पीएस (फॉस्फेटिडिल-सेरीन), (डी एसएम (स्फिंगोमाइलिंस)। प्रत्येक समूह के लिए एन=5। कैनेटीक्स: दो-तरफा एनोवा के बाद टुकी का मल्टीपल तुलना परीक्षण हुआ। siGPR17: दो-तरफा एनोवा के बाद सिडक का मल्टीपल तुलना परीक्षण। * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0.01।

जीपीआर से प्राप्त लिपिडोमिक डेटा की तुलना 17- प्रत्येक समय बिंदु पर साइलेंट और नियंत्रण ने हमें उन लिपिड की पहचान करने की अनुमति दी जो जीपीआर 17 साइलेंसिंग से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित थे। 2 डीआईडी ​​के बाद, कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया)। 3 डीआईडी ​​के बाद, डायसीलफॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसीएए) सी40:4 कम प्रचुर मात्रा में था और डायसील-फॉस्फेटिडाइलथेनॉलमाइनपीईएए) सी34:3 जीपीआर {{9}साइलेंटेड ओपीसी (चित्र 8ए) में अधिक प्रचुर मात्रा में था। भेदभाव के 5 दिनों के बाद, जीपीआर17 साइलेंसिंग से लिपिड प्रचुरता में कई बदलाव हुए: कई डायसील-पीसी और डायसील-पीई में कमी और स्फिंगोमाइलिन (एसएम) सी18:1 और एसएम के साथ-साथ कई प्लास्मलोजेन (एसाइल एल्काइल-पीसी) में सहवर्ती वृद्धि। (ओएच) सी16:1 (चित्र 8बी)। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि जीपीआर17 का डाउनरेगुलेशन पीसी और पीई जैसे माइलिन के मुख्य घटक के लिपिड प्रोफाइल को बदल देता है।

आंकड़ा 8।ओपीसी में जीपीआर17 साइलेंसिंग से प्रेरित लिपिडोमिक परिवर्तन. (ए,बी) जीपीआर17 साइलेंसिंग के बाद प्रत्येक लिपिड की प्रचुरता को सापेक्ष नियंत्रण नमूने में सामान्य कर दिया गया है। परिणामी तह परिवर्तनों का उपयोग प्रत्येक समय बिंदु (विभेदन में 3, 5 दिन) के लिए ज्वालामुखी प्लॉट उत्पन्न करने के लिए किया गया था। बिंदीदार क्षैतिज रेखा के ऊपर के बिंदु उन मेटाबोलाइट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्होंने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया है (फिशर का एलएसडी एफडीआर द्वारा सही किया गया; p.adj < 0.1)। हरे रंग में, कम अभिव्यक्ति वाले लिपिड, लाल रंग में, उच्च अभिव्यक्ति वाले, जीपीआर17 मौन के बाद। n=5 प्रति समूह।

जायदा के लिये पूछो:

ईमेल:wallence.suen@wecistanche.com

व्हाट्सएप/टेलीफोन: प्लस 86 15292862950

दुकान:

https://www.xjcistanche.com/cISTanche-shop