स्कैनिंग आयन चालकता माइक्रोस्कोपी लाइव मानव ग्लोमेरुलस की

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Ruslan Bohovyk1,2 | Mykhailo Fedoriuk1,2 | ऐलेना Isaeva1,2 | एंड्रयू Shevchuk3 | ओलेग Palygin1 | अलेक्जेंडर Staruschenko1,4

1 फिजियोलॉजी विभाग, मेडिकल कॉलेज विस्कॉन्सिन, मिल्वौकी, WI, संयुक्त राज्य अमेरिका के 2 सेलुलर झिल्ली विज्ञान विभाग, Bogomoletz फिजियोलॉजी के संस्थान, कीव, यूक्रेन 3 चिकित्सा विभाग, इंपीरियल कॉलेज लंदन, लंदन, ब्रिटेन 4 क्लेमेंट जे Zablocki वीए मेडिकल सेंटर, मिल्वौकी, WI, संयुक्त राज्य अमरीका

पत्राचार अलेक्जेंडर Staruschenko और Ruslan बोहोविक, फिजियोलॉजी विभाग, विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज, 8701 वाटरटाउन प्लैंक रोड, मिल्वौकी, WI 53226, संयुक्त राज्य अमेरिका। ईमेल: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@ gmail.com

वित्त पोषण की जानकारी वयोवृद्ध मामलों के विभाग, अनुदान / पुरस्कार संख्या: I01 BX004024; राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान, अनुदान / पुरस्कार संख्या: P01 HL116264 और R35 HL135749; अमेरिकन फिजियोलॉजिकल सोसाइटी, अनुदान / पुरस्कार संख्या: अनुसंधान कैरियर संवर्द्धन पुरस्कार; राष्ट्रीय संस्थान मधुमेह और पाचन औरगुर्दारोगों, अनुदान / पुरस्कार संख्या: DK126720

सारांश

पोडोसाइट क्षति ग्लोमेरुलर रोगों की एक पहचान है, जैसे कि फोकल सेगमेंटल ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस, आमतौर पर चिह्नित एल्बुमिनुरिया और प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है। वृक्क विकृति। पोडोसाइट संरचनात्मक असामान्यताएं और हानि भी न्यूनतम से जुड़ी हुई हैं परिवर्तन रोग और अधिक सामान्यमधुमेह गुर्दा रोग. यहां हमने ताजा आकलन करने के लिए पहली बार आयन चालकता माइक्रोस्कोपी (एसआईसीएम) तकनीक को स्कैन करने के लिए लागू किया पृथक मानवग्लोमेरुलससांस्थिति। SICM मूल्यांकन करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता हैग्लोमेरुलसपोडोसाइट्स के साथ-साथ इलेक्ट्रॉन के साथ अन्य नेफ्रॉन संरचनात्मक खंड माइक्रोस्कोपी संकल्प लेकिन जीवित नमूनों में। यहाँ दिखाया गया है SICM का अनुप्रयोग है जीवित मानव में विधिग्लोमेरुलस, जो भविष्य के लिए सिद्धांत का प्रमाण प्रदान करता है झिल्ली आकृति विज्ञान और जीवित कोशिकाओं में विभिन्न कार्यात्मक मापदंडों का गतिशील विश्लेषण।

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1. परिचय

ग्लोमेरुलसनेफ्रॉन के प्रवेश भाग में स्थित केशिकाओं के एक टफ्ट का प्रतिनिधित्व करता है, जहां रक्त को चुनिंदा रूप से फ़िल्टर किया जाता है। ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली और पोडोसाइट्स शामिल हैं। प्राथमिक और द्वितीयक आसन्न पोडोसाइट्स की प्रक्रियाएं आपस में जुड़ी हुई हैं, जो एक भट्ठा डायाफ्राम बनाती हैं जो ग्लोमेरुली केशिकाओं को कसकर कवर करती हैं। इस डायाफ्राम है एक जटिल आकृति विज्ञान और रक्त निस्पंदन के लिए अंतिम बाधा बनाता है आकार चयनात्मकता में योगदान और एल्ब्यूमिन से छोटे अणुओं के लिए पारगम्यता की अनुमति देना। पोडोसाइट संख्या में कमी और फोकल सेगमेंटल ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस, न्यूनतम परिवर्तन रोग, और मधुमेह नेफ्रोपैथी में पैर की प्रक्रिया effacement की सूचना दी गई थी। इसके अलावा, पोडोसाइट्स के नुकसान और उनकी वास्तुकला का संशोधन कर सकते हैं के बहुत शुरुआती चरणों में स्पष्ट होनागुर्दारोग जो उनकी प्रगति को रेखांकित / बढ़ा सकते हैं। सेल की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग आकारिकी अध्ययन के लिए एक आवश्यक और उपयोगी उपकरण बन रही है सेलुलर संरचनाएं और वे कोशिका समारोह और रोग प्रगति में भूमिका निभाते हैं।4 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक व्यापक रूप से है इस तरह के अध्ययन ों के संचालन के लिए उपयोग की जाने वाली विधि। फिर भी, यह एकाधिक की आवश्यकता है नमूना तैयारी के लिए जटिल प्रक्रियाएं, जिससे जीवित नमूने का विश्लेषण करना असंभव हो जाता है। इसलिए, पोडोसाइट आकृति विज्ञान के परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए नए उपकरण विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जीवित नमूनों में। स्कैनिंग आयन चालकता की होपिंग जांच मोड माइक्रोस्कोपी (SICM) एक ऐसी तकनीक है जो जटिल आकृति विज्ञान के साथ जीवित सेल सतहों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, नॉनऑप्टिकल इमेजिंग को सक्षम बनाती है। इस विधि का प्रमुख लाभ कई नैनोमीटर के करीब है स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और एक लंबी जेड (ऊर्ध्वाधर) सीमा, जिसे लागू किया जा सकता है शारीरिक रूप से के तहत जटिल आकृति विज्ञान के साथ जीवित नमूने के लिए प्रासंगिक शर्तें। SICM एक multimodal imaging technique है जो अन्य स्थापित तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, समवर्ती और झिल्ली आकृति विज्ञान का गतिशील विश्लेषण, और विभिन्न कार्यात्मक पैरामीटर, जैसे कि सेल की मात्रा, झिल्ली क्षमता, एकल आयन-चैनल धाराओं, और यहां तक कि झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में परिसर.9-11 यहां, हम जीवित मानव की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एसआईसीएम के आवेदन का एक उदाहरण प्रदान करते हैंग्लोमेरुलसनिर्माण।

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2. सामग्री और तरीके

प्रयोग के लिए, हमने छोड़े गए प्रत्यारोपण मानव से कॉर्टिकल क्षेत्र के एक हिस्से का उपयोग कियागुर्दाविच्छेदित और विस्कॉन्सिन में संग्रहीत परिरक्षण समाधान एक ऑक्सीजन युक्त में इनक्यूबेशन के बाद शारीरिक लवणीय समाधान (पीएसएस).12 वृक्क ग्लोमेरुली को अलग किया गया था एक vibrodissociation तकनीक का उपयोग करना जैसा कि पहले वर्णित है.13 यह दृष्टिकोण मानव से अच्छी तरह से संरक्षित गुर्दे ग्लोमेरुली के तेजी से अलगाव की अनुमति देता हैगुर्दे. SICM इमेजिंग करने के लिए, ताजा अलग मानवग्लोमेरुलसपॉली-एल-लाइसिन ग्लास सतह से जुड़े थे पीएसएस समाधान से भरे सेल कक्ष में रखा गया। नमूने थे मैन्युअल रूप से एक उल्टे ऑप्टिकल के तहत x-y दिशाओं में स्थित माइक्रोस्कोप Nikon TE2000-U (Nikon इंस्ट्रूमेंट्स). hopping के लिए जांच, SICM इमेजिंग बोरोसिलिकेट ग्लास नैनोपिपेट्स एक प्रतिरोध के साथ लगभग 100 MΩ का, जो 120 एनएम के आसपास अनुमानित टिप व्यास से मेल खाता है, का उपयोग किया गया था। नैनोपिपेट्स के साथ खींचे गए थे क्षैतिज ज्वलंत / भूरे रंग के प्रकार खींचने पी -97 (सटर इंस्ट्रूमेंट्स, नोवाटो, सीए)। नैनोपिपेट्स को स्नान के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही पीएसएस समाधान से भरा गया था और एक के साथ जेड-दिशा में तैनात किया गया था पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर। नैनोपिपेट्स के माध्यम से बहने वाली आयन धारा को एक एक्सोपैच 700 बी पैच-क्लैंप एम्पलीफायर के साथ मापा गया था (अक्षतंतु उपकरण) वोल्टेज-क्लैंप मोड में और द्वारा निगरानी की जाती है कस्टम-संशोधित सार्वभौमिक नियंत्रक (ICAPPIC लिमिटेड, ब्रिटेन), जो एक साथ नियंत्रित नमूना और पिपेट positioning.6 सभी प्रयोग कमरे के तापमान (20-22 डिग्री सेल्सियस) पर आयोजित किए गए थे। इमेजिंग के लिए जटिल जटिल जटिल संरचनाएं जैसे कि पोडोसाइट्स पैर की प्रक्रियाओं में वहीग्लोमेरुलस, हम backstep / hopping मोड SICM जो सबसे अधिक है इस्तेमाल किया उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ जीवित कोशिकाओं की स्थलाकृति इमेजिंग के लिए लागू.6,14 होपिंग सिद्धांत के एकल चरण में एक घटना होती है जब संदर्भ वर्तमान को नमूने के ऊपर नैनोपिपेट को अच्छी तरह से स्थित करके मापा जाता है। फिर, नैनोपिपेट दृष्टिकोण नमूना सतह के लिए z-अक्ष के साथ जब तक मापा वर्तमान स्तर पूर्व निर्धारित सेट-बिंदु के लिए ~ 1.0% -1.2% के अनुरूप बूँदें संदर्भ वर्तमान. इस पल में, दृष्टिकोण समाप्त हो जाता है, XY और Z piezo actuators के XYZ-निर्देशांक दर्ज किए जाते हैं पहले इमेजिंग बिंदु के लिए नमूना सतह समन्वय के रूप में, और पिपेट को सतह से दूर वापस ले लिया जाता है। यह प्रक्रिया तब प्रत्येक एकल इमेजिंग बिंदु पर x-y अक्ष के साथ दोहराती है पूर्व निर्धारित रिज़ॉल्यूशन और स्कैन क्षेत्र रेंज. चित्रा 1B के लिए, स्कैन रेंज और छवि संकल्प 30 μm × 30 μm और 512 px × 512 px थे, और के लिए चित्रा 1C क्रमशः 5 μm × 5 μm और 480 px × 480 px थे। कच्चा SICM स्थलाकृति डेटा और छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग किया गया था SICM ImageViewer माइक्रोस्कोपी विश्लेषण सॉफ्टवेयर (ICAPPIC) का उपयोग करना लिमिटेड, यूके)।

चित्रा 1 स्कैनिंग आयन चालकता माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के अनुप्रयोग. A, ताजा अलग-थलग मानवग्लोमेरुलसपॉली-लाइसिन कांच की सतह से जुड़ा हुआ है। बाईं ओर दिखाया गया एक माइक्रोपिपेट है जो एसआईसीएम इमेजिंग करने के लिए ग्लोमेरुलस सतह पर पहुंच रहा है। B, का एक उदाहरण ग्लोमेरुलस निस्पंदन बाधा घटक, जिसमें पोडोसाइट और पैर की प्रक्रियाएं शामिल हैं, जो एसआईसीएम द्वारा कल्पना की गई जहाजों को कवर करती हैं। कुल क्षेत्रफल के लिए 45 मिनट स्कैन (30 × 30 μm, रिज़ॉल्यूशन 512 × 512 पिक्सेल; z-अक्ष 15 μm बदलता है)। सी, मानव पोडोसाइट माध्यमिक की वास्तुकला पर विस्तारित दृश्य पैर प्रक्रियाओं उच्च संकल्प SICM द्वारा पता चला. कुल क्षेत्र स्कैन के लिए 12 मिनट (रिज़ॉल्यूशन 5 × 5 μm, रिज़ॉल्यूशन 480 × 480 पिक्सेल; z-अक्ष परिवर्तन 3 μm). स्केल पट्टियाँ दिखाई जाती हैं

3. परिणाम और चर्चा

SICM छवि गुणवत्ता SEM के लिए तुलनीय है और की सटीक परीक्षा की अनुमति देता हैग्लोमेरुलससतह संरचना, रक्त वाहिकाओं सहित और podocytes, और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं की वास्तुकला.4 में हमारे पिछले अध्ययन, हमने टाइप 2 मधुमेह में पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं में पैथोलॉजिकल संरचनात्मक परिवर्तनों का अनुमान लगाने के लिए एसआईसीएम इमेजिंग का उपयोग किया नेफ्रोपैथी (T2DN) चूहों.15 हमने किसका तुलनात्मक विश्लेषण किया? पोडोसाइट निस्पंदन बाधा की त्रि-आयामी वास्तुकला गैर मधुमेह और T2DN चूहों में. हमारे डेटा से पता चला एक महत्वपूर्ण नुकसान T2DN ग्लोमेरुली में पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं की एक सटीक प्रदान हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों के लिए मूल्यांकन जो मधुमेह नेफ्रोपैथी में हुआ था जो इन चूहों में नेफ्रिनुरिया और एल्बुमिनुरिया को रेखांकित करता है। यहां, पहली बार, हमने एक सफल दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया ताजा अलग-थलग की त्रि-आयामी सतह संरचना का आकलन करना, जीवित मानव ग्लोमेरुलस। मानव वृक्क ग्लोमेरुली गोलाकार संरचनाएं हैं जिनके व्यास लगभग 300 μm16 हैं; इस प्रकार, पिपेट की नोक ध्यान से ब्याज के क्षेत्र के शीर्ष पर दृष्टिकोण करना चाहिए. हमारे SICM सेट-अप में 25 μm z-अक्ष और 30 × 30 μm x-y-अक्ष स्कैनर रेंज है, जो हमें के बड़े हिस्से की एक उच्च संकल्प छवि प्राप्त करने की अनुमति दीग्लोमेरुलससतह। अधिग्रहण का समय दृढ़ता से इस पर निर्भर करता है स्कैन रेंज, संकल्प, और hopping इलेक्ट्रोड टिप आकार. ताजा अलग ग्लोमेरुलस जैसी जटिल संरचनाओं में लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, स्कैनिंग समय प्रति फ्रेम 10 से 50 मिनट तक भिन्न होता है (चित्रा किंवदंती देखें) अधिक जानकारी के लिए)। उच्च रिज़ॉल्यूशन का संचयी प्रभाव, बड़ा स्कैनिंग क्षेत्र, और जीवित प्रणालियों में स्टोकेस्टिक उतार-चढ़ाव के परिणामस्वरूप इमेजिंग कलाकृतियों को क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर बदलावों के रूप में दर्शाया जा सकता है पिपेट reposition चक्र की उम्मीद के बीच. ध्यान दें कि सतह के स्थानों में अचानक परिवर्तन के साथ जटिल ज्यामिति में, दोनों अधिग्रहण समय और इमेजिंग कलाकृतियों, अंधेरे या बुरे पिक्सेल की तरह, हो सकता है वृद्धि करना। SICM स्थलाकृति छवि (चित्रा 1A) स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले प्राथमिक और माध्यमिक द्वारा कवर किए गए ग्लोमेरुलर केशिकाओं को दर्शाती है पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं. SICM के साथ नमूना छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है नैनोमीटर पैमाने में विभिन्न स्कैन श्रेणियां, एक पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन स्तर रखते हुए.17 चित्रा 1B मानव पोडोसाइट माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं की वास्तुकला का प्रतिनिधित्व करता है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसआईसीएम द्वारा प्रकट होता है। इस तरह की स्थलाकृति छवियों के आगे के विश्लेषण का उपयोग अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है रोग संबंधी स्थितियों के तहत और विभिन्न दवा अनुप्रयोगों के जवाब में पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं के रूपात्मक परिवर्तन।

जांच के लिए SICM तकनीक का अनुप्रयोग नरम ऊतक के नमूनों की त्रि-आयामी सतह संरचना, जिसमें शामिल हैंग्लोमेरुलसऔर पोडोसाइट कोशिकाओं, शुरू में द्वारा पेश किया गया था Nakajima एट al4. लेखकों ने किया इस्तेमालगुर्दापारंपरिक SEM के साथ इस तकनीक की तुलना करने के लिए स्लाइस। यहां, हमने इन अध्ययनों को विस्तारित किया जीवित मानव ग्लोमेरुलस। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने महान का खुलासा किया की त्वरित और विश्वसनीय परीक्षा के लिए SICM तकनीक की क्षमताग्लोमेरुलसनिस्पंदन बाधा. महान लाभों में से एक SICM का (लाइव नमूनों के उपयोग के अलावा) यह है कि यह नहीं करता है आमतौर पर आवश्यक कई नमूना तैयारी प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है निर्जलीकरण और निर्धारण समाधान सहित ईएम माइक्रोस्कोपी इमेजिंग। इसलिए, SICM के साथ मनाया नमूनों के संकोचन से बचने की अनुमति देता है EM, जो भ्रामक वास्तविक आयामों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. महत्वपूर्ण ताजा अलग ग्लोमेरुली पर वास्तविक समय SICM भी परीक्षण की अनुमति देता है ब्याज की दवाओं के लिए तीव्र जोखिम के जवाब में पैर प्रक्रियाओं आंदोलन की गतिशील. अंत में, SICM पिपेट का उपयोग किया जा सकता है एकल चैनल धाराओं की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करने के लिए.18 इस उद्देश्य के लिए, स्थलाकृति मानचित्र के पुनर्निर्माण के बाद, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (ICAPPIC लिमिटेड, ब्रिटेन) एक नियंत्रित के लिए अनुमति दी कक्ष की सतह पर SICM ग्लास hopping जांच का ब्रेक, पैच-क्लैंप स्थितियों के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड प्रतिरोध को कम करना (7 से 12 MΩ) और इसे एक ही प्रयोग में एकल-चैनल रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त बनाना। SICM के चयन की अनुमति देता है पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोड का सेल सतह पर सटीक स्थान के आधार पर नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ एक अच्छी तरह से नियंत्रित ऊर्ध्वाधर दृष्टिकोण द्वारा स्थलाकृतिक डेटा, जिसके परिणामस्वरूप एक संपर्क गीगाज़ेअल का आसान गठन होता है सेलुलर झिल्ली स्मार्ट Patch.19 कहा जाता के साथ

संक्षेप में, यहां वर्णित विधि में उत्कृष्ट क्षमता है ग्लोमेरुली और अन्य ताजा अलग-थलग नेफ्रॉन खंडों के अध्ययन के लिए। इसके अलावा, यह दिखाता है कि मानव का उपयोग करना संभव हैगुर्दारूपात्मक मूल्यांकन करने के लिए विस्तृत तैयारी के बिना नमूने विकृति विज्ञान के अध्ययन में परिवर्तन।

गुर्दे की बीमारी के लिए Cistanche

पावती

लेखकों की प्रयोगशाला में अनुसंधान के विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था अनुभवी मामलों I01 BX004024, राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान R35 HL135749 और P01 HL116264, राष्ट्रीय संस्थान Diabetes and Digestive औरगुर्दारोग R01 DK126720, और अमेरिकन फिजियोलॉजिकल सोसाइटी रिसर्च कैरियर एन्हांसमेंट पुरस्कार।

हितों का टकराव

एंड्रयू शेवचुक एक शेयरधारक है और परामर्श प्राप्त करता है ICAPPIC Ltd से शुल्क अन्य सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धा नहीं करने की घोषणा की हितों

लेखक योगदान

Ruslan Bohovyk: अवधारणा (बराबर); डेटा क्यूरेशन (लीड); औपचारिक विश्लेषण (लीड); लेखन-मूल मसौदा (बराबर); लेखन-समीक्षा संपादन (समान) ( समान ) । Mykhailo Fedoriuk: डेटा क्यूरेशन (समर्थन); औपचारिक विश्लेषण (समर्थन); लेखन-समीक्षा और संपादन (बराबर)। ऐलेना इसेवा: अवधारणा (समर्थन); डेटा क्यूरेशन (समर्थन); औपचारिक विश्लेषण (समर्थन); लेखन-मूल मसौदा (समर्थन); लेखन-समीक्षा और संपादन (बराबर)। एंड्रयू शेवचुक: अवधारणा (समर्थन); सॉफ्टवेयर (समर्थन); लेखन मूल मसौदा (समर्थन); लेखन-समीक्षा और संपादन (बराबर)। ओलेग Palygin: अवधारणा (बराबर); औपचारिक विश्लेषण (समर्थन); कार्यप्रणाली (समर्थन); परियोजना प्रशासन (समर्थन); लेखन-मूल मसौदा (समर्थन); लेखन-समीक्षा और संपादन (बराबर)। अलेक्जेंडर Staruschenko: अवधारणा (नेतृत्व); परियोजना प्रशासन (लीड); संसाधन (लीड); पर्यवेक्षण (लीड); लेखन-मूल मसौदा (बराबर); लेखन-समीक्षा और संपादन (बराबर)।

डेटा उपलब्धता विवरण

इस अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन करने वाले डेटा से उपलब्ध हैं उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक।