SARS-CoV पर भेद्यता का स्थान -2 स्पाइक एंटीजेनिक रूप से विशिष्ट ओमीक्रॉन सबवेरिएंट के खिलाफ व्यापक रूप से सुरक्षात्मक एंटीबॉडी को प्रेरित करता है

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) ओमीक्रॉन वेरिएंट के तेजी से विकास ने भविष्य के मोनोक्लोनल थेरेपी और टीकाकरण रणनीतियों को सूचित करने के लिए व्यापक तटस्थ क्षमताओं के साथ एंटीबॉडी की पहचान करने की आवश्यकता पर जोर दिया है। इसमें, हमने एस 728-1157 की पहचान की, जो रिसेप्टर-बाइंडिंग साइट (आरबीएस) को लक्षित करने वाला एक व्यापक रूप से निष्क्रिय करने वाला एंटीबॉडी (बीएनएबी) है जो इसके प्रसार से पहले डब्ल्यूटी सार्स-सीओवी से संक्रमित एक व्यक्ति से प्राप्त हुआ था। चिंता के प्रकार (वीओसी)। S728-1157 ने D614G, बीटा, डेल्टा, कप्पा, म्यू और ओमीक्रॉन (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/) सहित सभी प्रमुख वेरिएंट के व्यापक क्रॉस-न्यूट्रलाइज़ेशन का प्रदर्शन किया। बीएल.1/एक्सबीबी)। इसके अलावा, S728-1157 ने हैम्स्टर्स को WT, डेल्टा और BA.1 वायरस के साथ विवो चुनौतियों से बचाया। संरचनात्मक विश्लेषण से पता चला कि यह एंटीबॉडी सीडीआर-एच1/ में सामान्य रूपांकनों के अलावा, अपने भारी श्रृंखला संपूरकता निर्धारण क्षेत्र 3 (सीडीआर-एच3) के साथ कई हाइड्रोफोबिक और ध्रुवीय इंटरैक्शन के माध्यम से रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन में एक वर्ग 1/आरबीएस-ए एपिटोप को लक्षित करता है। कक्षा 1/आरबीएस-ए एंटीबॉडी का सीडीआर-एच2। महत्वपूर्ण बात यह है कि डिप्रोलाइन (2पी) निर्माणों की तुलना में यह एपिटोप खुले और प्रीफ्यूजन राज्य में, या हेक्साप्रोलाइन (6पी)-स्थिर स्पाइक निर्माणों में अधिक आसानी से पहुंच योग्य था। कुल मिलाकर, S728-1157 व्यापक चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शित करता है और भविष्य के SARS-CoV -2 वेरिएंट के खिलाफ लक्ष्य-संचालित वैक्सीन डिज़ाइन की जानकारी दे सकता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

परिचय

दिसंबर 2019 में महामारी की शुरुआत के बाद से, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) वायरस के कारण कोरोनोवायरस रोग 2019 (कोविड-19) के 660 मिलियन से अधिक और 6.5 से अधिक मामले सामने आए हैं। वैश्विक स्तर पर लाखों मौतें। यद्यपि टीकों और उपचारों के तेजी से विकास और वितरण ने काफी हद तक सीओवीआईडी ​​​​के प्रभाव को कम कर दिया है, चिंता के परिसंचारी वेरिएंट (वीओसी) का उद्भव आगे प्रतिरक्षा चोरी की संभावना के कारण एक बड़ा खतरा बना हुआ है। और बढ़ी हुई रोगजन्यता। D614G वैरिएंट उभरने वाला सबसे पहला वैरिएंट था और उसके बाद सार्वभौमिक रूप से प्रचलित हो गया। डब्ल्यूटी की तुलना में, डी614जी वैरिएंट ने बढ़ी हुई रोगजनकता के बजाय बढ़ी हुई संप्रेषणीयता प्रदर्शित की और इसलिए नैदानिक ​​​​परीक्षणों में टीकों की प्रभावकारिता को कम करने की संभावना नहीं थी (1)। D614G के उद्भव से अक्टूबर 2021 के बीच, दुनिया भर में 4 अतिरिक्त महत्वपूर्ण VOC विकसित हुए, जिनमें अल्फा, बीटा, गामा और डेल्टा शामिल हैं। इन वेरिएंट्स में, डेल्टा अपनी संक्रामकता, बढ़ी हुई बीमारी की गंभीरता और आंशिक प्रतिरक्षा चोरी के कारण एक गंभीर वैश्विक खतरा बन गया है, जैसा कि इस स्ट्रेन को बेअसर करने के लिए पॉलीक्लोनल सीरम और एमएबीएस की कम क्षमता से पता चलता है (2-6)। कुछ ही समय बाद, नवंबर 2021 में, ओमिक्रॉन संस्करण की पहचान की गई और उसे एक नए वीओसी के रूप में घोषित किया गया। इस वैरिएंट में अब तक की सबसे बड़ी संख्या में उत्परिवर्तन हुए हैं और यह पिछले उपभेदों (7, 8) की तुलना में अधिक तेज़ी से फैलता हुआ प्रतीत होता है। वर्तमान में, ओमिक्रॉन सबलाइनेज की एक विस्तृत श्रृंखला है जो नए सीओवीआईडी ​​​​{21}} मामलों को जन्म दे रही है, जिसमें बीक्यू.1, बीक्यू.1.1 और एक्सबीबी.1.5 बीए.5 पर हावी हो रहे हैं और उस समय दुनिया भर में अधिकांश नए मामलों के लिए जिम्मेदार हैं। लिखने का. ओमिक्रॉन वेरिएंट अलग-अलग हद तक वैक्सीन-संबंधी प्रतिरक्षा द्वारा मान्यता से बच सकते हैं, जिससे स्वस्थ हो चुके, पूरी तरह से एमआरएनए-टीकाकृत व्यक्तियों और नए डब्ल्यूटी/बीए.5 द्विसंयोजक के साथ बढ़े हुए व्यक्तियों से सीरम एंटीबॉडी की निष्क्रिय क्षमता में काफी कमी आ सकती है। एमआरएनए वैक्सीन (9, 10)। इसी तरह, ओमिक्रॉन वेरिएंट कई आपातकालीन उपयोग-प्राधिकरण (ईयूए) चिकित्सीय एमएबीएस के बंधन से बचने में सक्षम थे, भले ही इन्हें पहले वीओसी (10-12) के खिलाफ प्रभावी दिखाया गया था। ओमिक्रॉन के खिलाफ कम तटस्थता और भविष्य के वीओसी के निरंतर खतरे के कारण, व्यापक और शक्तिशाली तटस्थ एंटीबॉडी की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता है जो विविध, विकसित SARS-CoV -2 वंशावली से रक्षा कर सकते हैं। इस अध्ययन में, हमने SARS-CoV के परिधीय रक्त से एक शक्तिशाली रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन-रिएक्टिव (आरबीडी-रिएक्टिव) mAb की पहचान की - स्वस्थ व्यक्ति जिसने अल्फा, बीटा, कप्पा, डेल्टा, म्यू, को प्रभावी ढंग से बेअसर कर दिया। और ओमिक्रॉन वेरिएंट (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 और XBB)। इस mAb, S728-1157 ने हैम्स्टर्स में विवो चुनौती के बाद फेफड़ों और नाक के म्यूकोसा में BA.1 ओमीक्रॉन, डेल्टा और WT वायरल लोड को काफी कम कर दिया। एस728-1157 रिसेप्टर बाइंडिंग साइट (आरबीएस) को बांधता है जो कि स्पाइक पर आरबीडी के ऊपर की संरचना में होने पर पूरी तरह से उजागर हो जाता है। एमएबी सीडीआर-एच1 और सीडीआर-एच2 में पाए जाने वाले रूपांकनों का उपयोग करता है जो आईजीएचवी3-53/3-66 वर्ग 1/आरबीएस-ए एंटीबॉडी (13, 14) के लिए सामान्य हैं, लेकिन सीडीआर के साथ व्यापक अद्वितीय संपर्कों के माध्यम से भी -H3 VOCs स्पाइक्स में उत्परिवर्तन को रोकने के लिए। इससे पता चलता है कि ओमिक्रॉन वेरिएंट को कवर करने वाले भविष्य के वैक्सीन बूस्ट के तर्कसंगत डिजाइन को संशोधित किया जाना चाहिए ताकि क्लास 1/आरबीएस-ए एमएबीएस को बेहतर ढंग से प्रेरित करने के लिए अधिकतर कॉन्फ़िगरेशन में एक स्थिर स्पाइक पेश किया जा सके जिसमें समान सीडीआर-एच 3 विशेषताएं हों।

सिस्तांचे के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत बनाना

परिणाम

आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबीएस का अलगाव जो तटस्थता और क्षमता के विविध पैटर्न प्रदर्शित करता है। ओमिक्रॉन वंशावली के प्रसार से पहले, हमने पहले एन-टर्मिनल डोमेन (एनटीडी), आरबीडी, और सबयूनिट 2 (एस2) सहित स्पाइक प्रोटीन पर अलग-अलग एपिटोप को लक्षित करने वाले 43 एमएबी की विशेषता बताई थी। इनमें से कोई भी एंटीबॉडी उस समय प्रसारित SARS-CoV-2 वेरिएंट को बेअसर करने में सक्षम नहीं था (15)। इस अध्ययन में, आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबीएस का एक अतिरिक्त पैनल 3 उच्च-उत्तरदाता व्यक्तियों से व्यक्त किया गया था, जिन्होंने मजबूत एंटी-स्पाइक आईजीजी प्रतिक्रियाओं को माउंट किया था, जैसा कि पहले परिभाषित किया गया था (16) (पूरक तालिका 1 और 3; पूरक सामग्री इस लेख के साथ ऑनलाइन उपलब्ध है; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1)। यद्यपि स्पाइक आरबीडी-बाइंडिंग बी कोशिकाओं का अनुपात मध्य और निम्न-उत्तरदाताओं (चित्र 1, ए-सी) की तुलना में उच्च-उत्तरदाताओं में समान था, उच्च-उत्तरदाता समूह (चित्र 1) में भारी श्रृंखला दैहिक हाइपरम्यूटेशन दरें काफी अधिक थीं। , डी, और ई), यह सुझाव देते हुए कि इन व्यक्तियों में शक्तिशाली क्रॉस-रिएक्टिव एमएबी (16) उत्पन्न करने की उच्चतम क्षमता हो सकती है। इन एंटीबॉडीज की आरबीडी म्यूटेंट के खिलाफ उनके एपिटोप वर्गीकरण (17) की पहचान करने के लिए आगे जांच की गई। 14 आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबी में से, हमने 4 वर्ग 2 एमएबी, 2 वर्ग 3 एमएबी और 8 अवर्गीकृत एमएबी की पहचान की, जिन्होंने परीक्षण किए गए किसी भी प्रमुख आरबीडी म्यूटेंट के खिलाफ बंधन में बहुत कम या कोई कमी नहीं दिखाई (चित्रा 1एफ)। ध्यान देने योग्य बात यह है कि कक्षा 2, कक्षा 3 और कक्षा 4 एंटीबॉडी लगभग पिछले अध्ययनों (13, 18) में परिभाषित आरबीएस बीडी, एस309 और सीआर3022 एपिटोप्स के अनुरूप हैं। क्लास 2 और 3 RBD mAbs ने K417N/E484K/L452R/ N501Y प्रतिस्थापन वाले मल्टीवेरिएंट RBD म्यूटेंट को नहीं पहचाना, वायरस से बचने के लिए प्रमुख म्यूटेशन (17, 18) को शामिल करने के लिए एक कृत्रिम रूप से डिज़ाइन किया गया RBD, और न ही उन्होंने कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी प्रदर्शित की। SARS-CoV का RBD-1 और मध्य पूर्वी श्वसन सिंड्रोम (MERS)-CoV (चित्र 1F)। कार्यात्मक रूप से, कक्षा 2 और 3 आरबीडी एमएबीएस ने संभावित रूप से डी614जी और डेल्टा वेरिएंट को बेअसर कर दिया, लेकिन बीटा, कप्पा और म्यू (चित्रा 1जी) के खिलाफ निष्क्रिय गतिविधि अधिक सीमित थी। वर्ग 2 या 3 एंटीबॉडी में से किसी ने भी परीक्षण किए गए किसी भी ओमिक्रॉन संस्करण को बेअसर नहीं किया।

इसके विपरीत, अधिकांश अवर्गीकृत mAbs RBD मल्टीवेरिएंट से बंधे हैं और SARS-CoV-1 RBD (चित्र 1F) पर क्रॉस-रिएक्ट करते हैं। इनमें से, हमने 3 एमएबीएस, एस 451-1140, एस 626-161, और एस 728-1157 की पहचान की, जिसने डी 614 जी के खिलाफ उच्च न्यूट्रलाइजेशन क्षमता दिखाई और बीटा, डेल्टा, कप्पा, म्यू और क्रॉस-न्यूट्रलाइज्ड किया। 20-2,500 एनजी/एमएल (चित्रा 1जी) की सीमा में 99% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी99) के साथ ओमिक्रॉन बीए.1। इन 3 mAbs की व्यापक न्यूट्रलाइज़ेशन क्षमता को देखते हुए, प्लाक परख प्लेटफ़ॉर्म के अलावा, हमने प्रामाणिक BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, के विरुद्ध न्यूट्रलाइज़ेशन गतिविधि भी की। BA.5, और XBB वायरस फ़ोकस रिडक्शन न्यूट्रलाइज़ेशन टेस्ट (FRNT) का उपयोग कर रहे हैं (चित्र 1G)। इनमें से, S728-1157 ने BA.1, BA.2, BA.4, और BA.5 सहित ओमीक्रॉन वेरिएंट के पैनल के खिलाफ उच्च न्यूट्रलाइजिंग गतिविधियां प्रदर्शित कीं, जिसमें 100 एनजी/एमएल तक IC99 मापा गया था। पट्टिका परख. एफआरएनटी का उपयोग करते हुए एक समान परिदृश्य देखा गया, जहां एस 728-1157 ने 8-300 एनजी की सीमा में आईसी50 के साथ बीए.2.75, बीएल.1, बीए.4, बीए.5 और एक्सबीबी के खिलाफ अपनी उच्च तटस्थता गतिविधि बनाए रखी। /एमएल (चित्र 1जी)। S451-1140 ने BA.1, BA.2, BA.2.75, और BL.1 को संभावित रूप से बेअसर कर दिया, लेकिन BA.4 और BA.5 को नहीं, जैसा कि दोनों न्यूट्रलाइजेशन परख प्लेटफार्मों में देखा गया। दूसरी ओर, S626-161 ने BA.1 वैरिएंट (चित्र 1G) से परे ओमिक्रॉन वेरिएंट के खिलाफ तटस्थ गतिविधि प्रदर्शित नहीं की। हालाँकि S626-161 में अन्य 2 एंटीबॉडी की तुलना में परीक्षण किए गए VOCs के खिलाफ कम तटस्थता क्षमता थी, यह एकमात्र mAb था जिसने न केवल SARS CoV -1 RBD के प्रति क्रॉस-रिएक्टिविटी दिखाई, बल्कि बल्ले को बेअसर करने में भी सक्षम था। कोरोना वायरस WIV-1 और RsSHC014 (चित्र 1, F और G)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि S626-161 एक संरक्षित एपिटोप को पहचानता है जो इन अर्बोवायरस वंशावली के बीच साझा किया जाता है लेकिन BA.2 और बाद के उपभेदों में अनुपस्थित है। इसके अतिरिक्त, एस {{64 }} और एस {{65 }} की तुलना में, एस {{66 }} में एक लंबा सीडीआर-एच 3 है जो आर्बोवायरस में साझा किए गए अवशेषों के अत्यधिक संरक्षित पैच को पहचानने की एक उन्नत क्षमता प्रदान कर सकता है, जैसा कि वर्णित है पिछले अध्ययन में (19) (पूरक चित्र 1)। इन 3 mAbs के इम्युनोग्लोबुलिन हेवी (IGHV) और लाइट चेन (IGLV या IGKV) वैरिएबल जीन की तुलना उपलब्ध SARS-CoV-2 न्यूट्रलाइज़िंग mAbs डेटाबेस (13, 15, 20–27) से करने पर, हमने पाया कि हेवी चेन S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23), और S626-161 (IGHV4-39) द्वारा उपयोग किए जाने वाले परिवर्तनीय जीन हैं पहले बताया गया था कि आरबीडी (21, 22, 28, 29) को लक्षित करने वाले कई संभावित रूप से निष्क्रिय करने वाले SARS-CoV -2 एंटीबॉडी को एन्कोड किया गया है। हालाँकि, केवल S728-1157 में अद्वितीय भारी और हल्की श्रृंखला परिवर्तनीय जीन युग्म थे जिन्हें डेटाबेस (पूरक तालिका 3) में रिपोर्ट नहीं किया गया है, यह दर्शाता है कि यह एक सार्वजनिक क्लोनोटाइप नहीं है।

चित्र 1. कोविड से पृथक आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबीएस का लक्षण वर्णन- स्वस्थ्य व्यक्तियों

इन 3 mAbs (S451-1140, S626-161, और S{3}}) को SARSCoV-2 VOCs (चित्रा 2, ए और बी) के खिलाफ उनकी बाध्यकारी चौड़ाई निर्धारित करने के लिए आगे की विशेषता दी गई थी। . S2 सबयूनिट (2P; डिप्रोलाइन) में 2-प्रोलाइन प्रतिस्थापन युक्त प्रीफ़्यूज़न-स्थिर स्पाइक को WT स्पाइक की तुलना में एक बेहतर इम्युनोजेन दिखाया गया है और यह कई मौजूदा SARS-CoV-2 का आधार है। टीके, जिनमें एमआरएनए-आधारित टीके (30, 31) शामिल हैं। अभी हाल ही में, 6 प्रोलाइन (6पी; हेक्साप्रोलाइन) के साथ स्थिर किए गए स्पाइक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने और मूल डिप्रोलाइन निर्माण की तुलना में और भी अधिक स्थिर होने की सूचना मिली थी; परिणामस्वरूप, इसे अगली पीढ़ी के कोविड टीकों (32, 33) में उपयोग के लिए प्रस्तावित किया गया है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या डिप्रोलाइन और हेक्साप्रोलाइन स्पाइक संरचनाओं के बीच एंटीजेनेसिटी अंतर हैं, दोनों इम्युनोजेन को हमारे परीक्षण पैनल में शामिल किया गया था। जैसा कि एलिसा द्वारा मापा गया, हमने पाया कि 3 mAbs 6P-WT स्पाइक एंटीजन को WT{23}}P स्पाइक (चित्र 2, A और B) की तुलना में अधिक हद तक बांधता है। सभी 3 mAbs ने WT-2P (चित्र 2, A और B) के सापेक्ष अल्फा, बीटा, गामा और डेल्टा वायरस के स्पाइक्स के साथ तुलनीय बंधन दिखाया। हालाँकि, इन 3 mAbs की बाइंडिंग प्रतिक्रियाएँ ओमिक्रॉन-फ़ैमिली एंटीजन (चित्रा 2, बी और सी) के एक पैनल के खिलाफ काफी कम हो गई थीं। S451-1140 बाइंडिंग BA.1 और BA.2 में पाए गए उत्परिवर्तन के प्रति संवेदनशील थी, जिसके परिणामस्वरूप बाइंडिंग में बड़ी कमी आई और WT की तुलना में इन वेरिएंट के खिलाफ न्यूट्रलाइजेशन में 31- गुना कमी आई। क्रमशः पी एंटीजन और डी614जी वायरस (चित्र 2बी)। सरबेकोवायरस-क्रॉस न्यूट्रलाइज़िंग mAb, S626-161 ने भी 1.2- से 3.5- गुना कम बाइंडिंग को स्पाइक BA.1 एंटीजन के लिए दिखाया, जो कि {{45} के लिए जिम्मेदार हो सकता है }बीए.1 के मुकाबले न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि में कई गुना कमी (चित्र 1जी और चित्र 2, बी और सी)। सबसे शक्तिशाली व्यापक रूप से निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी (बीएनएबी), एस 728-1157 के लिए, ओमिक्रॉन एंटीजन के साथ बंधन को कुछ हद तक कम कर दिया गया था (1.1- से लेकर 4.{53}} गुना तक) की तुलना में डब्ल्यूटी-2पी स्पाइक और तटस्थ गतिविधि में अप्रभावित था (चित्र 1जी और चित्र 2, बी और सी)। BA.1 स्पाइक के लिए ओमिक्रॉन-न्यूट्रलाइज़िंग mAb बाइंडिंग में पर्याप्त कमी इसकी गतिशीलता में परिवर्तन के कारण हो सकती है और ओमिक्रॉन 3-आरबीडी-डाउन संरचनाओं की तंग पैकिंग और 1- के लिए प्राथमिकता से संबंधित हो सकती है। अप आरबीडी जो एंटीबॉडी से बचने में सहायता करता है, जैसा कि पिछले अध्ययन (34) में बताया गया है। 2P और 6P स्थिरीकरण उत्परिवर्तन का ओमीक्रॉन वेरिएंट में भी अलग-अलग प्रभाव होता है, जहां सभी 3 mAbs 2 से अधिक दिखाई देते हैं। BA की तुलना में स्पाइक BA के लिए बाइंडिंग में 3 गुना वृद्धि हुई है। 68P P। संस्करण, लेकिन उनके 2P संस्करणों की तुलना में स्पाइक BA.2 और BA.4/5 6P संस्करणों के लिए बाइंडिंग में केवल मामूली वृद्धि हुई है, जो 1.2 × से 1.4 × तक है, जो हेक्सापोल संस्करणों के लिए ओमीक्रॉन-न्यूट्रलाइज़िंग mAbs की थोड़ी बेहतर पहुंच का सुझाव देता है, विशेष रूप से स्पाइक BA.1 निर्माण के लिए। एलिसा के अलावा, बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई) का उपयोग स्पाइक एंटीजन (पूरक चित्र 2) के एक पैनल में इन 3 एमएबी की बाइंडिंग दर और संतुलन स्थिरांक (कोन, कॉफ और केडी) को मापने के लिए किया गया था। डिप्रोलाइन स्पाइक्स (पूरक चित्र 2, बी और सी) की तुलना में हेक्साप्रोलाइन स्पाइक्स के लिए टुकड़े एंटीजन बाइंडिंग (फैब) की पहचान कोन दर 1.5- से 3.{85}} गुना तेज थी, जो दर्शाती है कि 6P से बंधी एंटीबॉडीज़ 2P निर्माण की तुलना में अधिक तेज़ी से निर्मित होती हैं। इसकी उम्मीद की जा सकती थी यदि हेक्साप्रोलाइन स्पाइक पर खुले राज्य में आरबीडी पर एपिटोप्स अधिक सुलभ थे। एस626- 161 को छोड़कर, फैब्स डिप्रोलाइन स्पाइक की तुलना में हेक्साप्रोलाइन स्पाइक से अधिक धीरे-धीरे अलग हो गए (कम कोफ था), जैसे कि समग्र केडी ने दिखाया कि एस728-1157 और एस451-1140 बाध्य हैं अधिक आत्मीयता के साथ हेक्साप्रोलाइन स्पाइक (पूरक चित्र 2, बी और सी)। हेक्साप्रोलाइन स्पाइक के बंधन में वृद्धि 1:2 इंटरेक्शन मॉडल द्वारा अक्षुण्ण आईजीजी के लिए और भी अधिक उल्लेखनीय थी, जैसा कि एस {{95 }} और एस {{96 }} एमएबीएस द्वारा दिखाया गया है, जो 6पी स्थिरीकरण की अनुमति के साथ कई एपिटोप्स के संपर्क के अनुरूप है। बेहतर अम्लता (पूरक चित्र 2, ए और सी)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि जब आरबीडी खुली अवस्था में होता है तो लक्षित एपिटोप्स 6पी-स्थिर स्पाइक पर तुलनात्मक रूप से अधिक पहुंच योग्य हो सकते हैं। इस अनुमान को सत्यापित करने के लिए अगला संरचनात्मक विश्लेषण किया गया।

चित्र 2. ओमीक्रॉन-निष्प्रभावी एमएबीएस की बाइंडिंग चौड़ाई

मोटे तौर पर एमएबी को निष्क्रिय करने का संरचनात्मक विश्लेषण। एपिटोप्स बाउंड के पहले अनुमान के रूप में, एक एलिसा प्रतियोगिता परख का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या इन 3 व्यापक रूप से निष्क्रिय एमएबीएस ने एमएबीएस के हमारे वर्तमान पैनल के साथ कोई ओवरलैप साझा किया है, पिछले अध्ययनों से ज्ञात एपिटोप विशिष्टताओं के साथ एमएबीएस का एक संग्रह (15, 25, 35) , और 2 अन्य mAbs वर्तमान में नैदानिक ​​उपयोग में हैं, LY-CoV555 (एली लिली) (36) और REGN10933 (Regeneron) (37)। S451-1140 और S728-1157 की बाइंडिंग साइटें आंशिक रूप से CC12.3 (23, 25), एक क्लास 1 न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी और अधिकांश क्लास 2 एंटीबॉडीज़, जिनमें LY-CoV555 और REGN10933 शामिल हैं, के साथ ओवरलैप होती हैं, लेकिन नहीं कक्षा 3 और कक्षा 4 एंटीबॉडी के साथ (चित्र 3ए)। एस 626-161 ने कक्षा 1 सीसी12.3, सीआर3022 सहित कई वर्ग 4 एंटीबॉडी और अन्य अवर्गीकृत एंटीबॉडी के साथ बाइंडिंग क्षेत्र में एक उल्लेखनीय ओवरलैप साझा किया, जबकि कई वर्ग 2 और एकल वर्ग 3 एंटीबॉडी के साथ कुछ आंशिक ओवरलैप हुआ (चित्रा) 3ए). अनुरूप रूप से, एक प्रतियोगिता बीएलआई परख से पता चला कि एस 451-1140 और एस 728-1157 ने स्पाइक डब्ल्यूटी -6 पी से जुड़ने के लिए एक दूसरे के साथ दृढ़ता से प्रतिस्पर्धा की, जबकि एस 626-161 ने ऐसा नहीं किया (पूरक चित्र) 3). कुल मिलाकर, ये डेटा सुझाव देते हैं कि S451-1140 और S728-1157 समान एपिटोप्स को पहचानते हैं जो S626-161 से भिन्न हैं।

चित्र 3. S के व्यापक निराकरण का तंत्र728-1157

एंटीबॉडी एस 728-1157 को आईजीएचवी 3-66 द्वारा एन्कोड किया गया था और इसमें एक संक्षिप्त पूरकता निर्धारण क्षेत्र 3 (सीडीआर-एच 3) था। विशेष रूप से, mAbs जो RBS को बाइंडिंग मोड 1 (यानी RBS-A या क्लास 1 साइट) में बांधते हैं, CC12.1, CC12.3, B38 और C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39) द्वारा टाइप किए गए हैं। IGHV3-53 या 3-66 का उपयोग करते हैं और VOC उत्परिवर्तन (40) के प्रति संवेदनशील होते हैं। हालाँकि, S728-1157 का CDR-H3 क्षेत्र इस वर्ग के अन्य एंटीबॉडी से अत्यधिक भिन्न है, जो संभावित रूप से इसकी व्यापक गतिविधि के लिए जिम्मेदार है। इस एपिटोप में एस 728-1157 द्वारा व्यापक न्यूट्रलाइजेशन के संरचनात्मक आधार को समझने के लिए, हमने स्पाइक डब्ल्यूटी के साथ कॉम्प्लेक्स में आईजीजी एस 728-1157 की क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) संरचना (चित्रा 3बी) का समाधान किया। {31}P-Mut7, स्पाइक WT का एक संस्करण -6P, जिसमें लगभग 3.3 Å वैश्विक रिज़ॉल्यूशन पर C705 और C883 पर एक इंटरप्रोटोमर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड होता है (पूरक चित्र 4E)। समरूपता विस्तार, केंद्रित वर्गीकरण और शोधन विधियों का उपयोग करके, हमने आरबीडी-एफवी इंटरफ़ेस पर लगभग 4 Å (पूरक चित्र 4ई और पूरक तालिका 8) तक स्थानीय रिज़ॉल्यूशन हासिल किया। S728-1157 फैब की एक क्रिस्टल संरचना 3.1 Å रिज़ॉल्यूशन पर निर्धारित की गई थी और इसका उपयोग RBD-Fv इंटरफ़ेस पर परमाणु मॉडल बनाने के लिए किया गया था। हमारी संरचनाएं पुष्टि करती हैं कि S728-1157 ने RBS-A (या वर्ग 1) एपिटोप को RBD-अप संरचना (चित्र 3B और पूरक चित्र 4E) में बांधा है, अन्य IGHV3-53/{{55} के समान } एंटीबॉडीज (चित्रा 3सी)। S728-1157 द्वारा एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (ACE2) बाइंडिंग साइट की स्टेरिक रुकावट SARS-CoV-2 के खिलाफ इसकी उच्च तटस्थता क्षमता को बताती है। S728-1157 CDR-H1 और -H2 में 32NY33 मोटिफ और 53SGGS56 मोटिफ (23) RBD के साथ लगभग CC12.3 (पूरक चित्र 4, B और C) की तरह ही इंटरैक्ट करते हैं। हालाँकि, CC12.3 में VH 98DF99 की तुलना में, S में VH 98DY99 (82%) CDR-H3 RBD के साथ हाइड्रोफोबिक और ध्रुवीय इंटरैक्शन सहित अधिक व्यापक इंटरैक्शन बनाता है, जो VOCs के खिलाफ व्यापक न्यूट्रलाइजेशन के लिए जिम्मेदार हो सकता है (चित्र) 3डी और पूरक तालिकाएँ 6 और 7)। S728- 1157 CDR-H3 में डाइग्लिसिन VH 100GG101 CC12.3 में VH Y100 की तुलना में अधिक व्यापक बाइंडिंग की सुविधा भी दे सकता है, संभवतः ग्लाइसिन अवशेषों में लचीलेपन के कारण जो CDR की नोक की एक अलग संरचना का कारण बनता है। -H3 लूप और 98DY99 पर अवशेषों का सापेक्ष बदलाव।

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यद्यपि ओमिक्रॉन वीओसी में आरबीडी में व्यापक उत्परिवर्तन हैं, इनमें से अधिकांश अवशेष एस 728-1157 के साथ बातचीत नहीं करते हैं, क्योंकि बंधन अभी भी देखा जाता है (पूरक चित्र 4 ए)। हमारे स्पाइक WT-6P-Mut7 + फैब S728-1157 मॉडल से, Y505 से VL Q31, और E484 से VH Y99 तक हाइड्रोजन बॉन्ड बनाने की भविष्यवाणी की गई है (पूरक चित्र 4D और पूरक तालिका 6) ), जिसमें ओमिक्रॉन म्यूटेशन Y505H और E484A द्वारा बाधित होने की क्षमता है। हालाँकि, Y505H उत्परिवर्तन अभी भी VL Q31 के साथ हाइड्रोजन बंधन की अनुमति देगा, और E484A उत्परिवर्तन हाइड्रोफोबिक अवशेषों VL Y99, F456 और Y489 के पास एक और हाइड्रोफोबिक साइड चेन जोड़ देगा। ये संपर्क, आंशिक रूप से, उस तंत्र की व्याख्या कर सकते हैं जो स्पाइक बीए.1 एंटीजन (चित्रा 1जी और चित्रा 2बी) के खिलाफ, कम होने के बावजूद, तटस्थ गतिविधि को बनाए रखने के लिए एस 728-1157 को सक्षम बनाता है। बदले में, BA.1 एंटीजन संभवतः ओमिक्रॉन उत्परिवर्तन से संबंधित है जो स्पाइक प्रोटीन (34) के गठनात्मक परिदृश्य को बदल देता है। हालाँकि, कई दैहिक रूप से उत्परिवर्तित अवशेष, यानी, VH L27, L28, R31, F58, और VL V28 और Q31, S728-1157 में SARS-CoV-2 RBD (पूरक चित्र 1 और पूरक तालिका 7), जो CC12.3 की तुलना में इसकी व्यापक प्रतिक्रियाशीलता में भी योगदान दे सकती है। कुल मिलाकर, हमारे संरचनात्मक अध्ययनों ने S728-1157 के व्यापक निष्प्रभावीकरण के आधार का खुलासा किया जो SARS-CoV-2 VOCs में अधिकांश उत्परिवर्तन को समायोजित कर सकता है।

चित्र 4. हैम्स्टर में SARS-CoV-2 संक्रमण के विरुद्ध bnAbs की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता।

S728-1157 सीरियाई हैम्स्टर्स में SARS-CoV-2 BA.1 ओमीक्रॉन, डेल्टा और WT SARS-CoV-2 की प्रतिकृति को कम कर देता है। हमारे व्यापक रूप से निष्क्रिय करने वाले mAbs की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक गोल्डन सीरियाई हैम्स्टर संक्रमण मॉडल का उपयोग किया जिसका व्यापक रूप से SARS-CoV के लिए उपयोग किया गया है। हैम्स्टर्स को SARS CoV वायरस से संक्रमण के 1 दिन बाद इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से एक अप्रासंगिक एंटीजन (इबोलावायरस ग्लाइकोप्रोटीन) को लक्षित करने वाले हमारे परीक्षण mAbs या एक आइसोटाइप नियंत्रण के 5 मिलीग्राम/किग्रा प्राप्त हुए। संक्रमण के 4 दिन बाद फेफड़े और नाक के ऊतकों को एकत्र किया गया (चित्र 4ए)। S728-1157 के चिकित्सीय प्रशासन के परिणामस्वरूप संक्रमित हैम्स्टर्स के नाक के टर्बाइनेट्स और फेफड़ों दोनों में WT, BA.1 ओमीक्रॉन और डेल्टा वेरिएंट के अनुमापांक कम हो गए (चित्र 4, B-D)। दिलचस्प बात यह है कि फेफड़ों में S728-1157 का प्रभाव नाटकीय था, जिससे WT और BA.1 ओमिक्रॉन वायरल लोड लगभग 104PFU तक कम हो गया, BA.1 ओमिक्रॉन वैरिएंट के वायरल टाइटर्स पूरी तरह से समाप्त हो गए (चित्र 4C)। इन विट्रो न्यूट्रलाइजेशन (चित्रा 1जी) के विपरीत, एस 451-1140 ने फेफड़ों और नाक टर्बाइनेट्स में बीए.1 ओमिक्रॉन वायरल प्रतिकृति को कम नहीं किया, जो इस क्लोन के लिए इन विट्रो न्यूट्रलाइजेशन और विवो सुरक्षा के बीच एक डिस्कनेक्ट का संकेत देता है (चित्र 4ई) . इसकी तुलना में, डब्ल्यूटी और बीए.1 चुनौती (चित्रा 4, एफ और जी) के बाद एस 626-161 प्रशासन के परिणामस्वरूप फेफड़े के वायरल टाइटर्स में मामूली महत्वपूर्ण कमी आई। ये डेटा रेखांकित करते हैं कि, मोटे तौर पर सुरक्षात्मक एमएबी को सटीक रूप से परिभाषित करने के लिए, तटस्थता गतिविधि के समानांतर सुरक्षा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना आवश्यक है। आगे बढ़ते हुए, यह जांचना दिलचस्प होगा कि S728-1157 की सुरक्षात्मक क्षमता किस हद तक Fc पर निर्भर है। कुल मिलाकर, S728-1157 SARS CoV वेरिएंट के खिलाफ व्यापक न्यूट्रलाइजेशन प्रभावकारिता के साथ एक आशाजनक mAb का प्रतिनिधित्व करता है जो कि विवो में WT, डेल्टा और BA.1 प्रतिकृति को नाटकीय रूप से कम करने में सक्षम है।

SARS-CoV-2 संक्रमण शायद ही कभी शक्तिशाली S728-1157-जैसे क्रॉस-न्यूट्रलाइज़िंग mAbs उत्पन्न करता है। S728-1157 की क्रॉस-न्यूट्रलाइज़ेशन और रोगनिरोधी क्षमता को देखते हुए, हमने यह मूल्यांकन करने की कोशिश की कि क्या S728–1157-जैसे एंटीबॉडी आमतौर पर SARS-CoV -2 रोगियों में पॉलीक्लोनल प्रतिक्रियाओं के बीच प्रेरित होते हैं। इसका आकलन करने के लिए, हमने एंटी-आरबीडी एंटीबॉडी टाइटर्स का पता लगाने के लिए कॉन्वलेसेंट सीरम का उपयोग करके प्रतिस्पर्धा एलिसा का प्रदर्शन किया जो एस 728-1157 (चित्रा 5 ए) के साथ बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकता है। विषयों को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की भयावहता के आधार पर 3 समूहों में विभाजित किया गया था, जैसा कि पहले परिभाषित किया गया था (15, 16)। यद्यपि उच्च और मध्यम उत्तरदाताओं में एस 728-1157 के उच्च अनुमापांक थे - निम्न उत्तरदाताओं (चित्र 5बी) की तुलना में प्रतिस्पर्धी सीरम एंटीबॉडी, सभी समूहों में अनुमापांक काफी कम थे, जिससे पता चलता है कि एस के उच्च स्तर प्राप्त करना असामान्य है। 18}}-WT SARS-CoV -2 संक्रमण के बाद पॉलीक्लोनल सीरम में एंटीबॉडी की तरह। S728-1157 के अलावा, हमने S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022, और CC12.3 सहित अन्य mAbs के साथ कॉन्वलसेंट सीरम की प्रतिस्पर्धा का परीक्षण किया। S728-1157 के समान, हमने अधिकांश स्वस्थ्य व्यक्तियों के पॉलीक्लोनल सीरम में S451-1140, S{32}}, LY-CoV555, REGN10933, और CC12.3 के साथ प्रतिस्पर्धा करने वाले एंटीबॉडी के अपेक्षाकृत कम अनुमापांक देखे। व्यक्ति (चित्रा 5, सी-एफ और एच)। फिर भी, उच्च उत्तरदाताओं के पास कम उत्तरदाताओं की तुलना में उन निष्क्रिय एमएबी के मुकाबले काफी अधिक अनुमापांक होते हैं (चित्रा 5, बी-एफ और एच)। इसके विपरीत, सीआर3022 एपिटोप साइट को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी स्वस्थ व्यक्तियों में अधिक स्पष्ट थे, जो पॉलीक्लोनल सीरम (चित्रा 5जी) में कक्षा 4 आरबीडी एंटीबॉडी के संवर्धन का सुझाव देते हैं। उल्लेखनीय रूप से, 3 प्रत्युत्तर समूहों में CR3022 के टाइटर्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जिससे पता चलता है कि अधिकांश व्यक्तियों में WT SARS-CoV -2 संक्रमण के दौरान CR 3022- साइट एंटीबॉडी लगातार प्रेरित हुए थे। दिलचस्प बात यह है कि, CC12.3 की तुलना में, उच्च उत्तरदाताओं के सीरम में S728-1157 गुना निचले स्तर पर पाया गया। इस प्रकार, कक्षा 1 के एंटीबॉडी अक्सर प्राकृतिक संक्रमण और टीकाकरण (14, 20, 28, 29, 41-43) से प्रेरित होने के बावजूद, हमारा डेटा बताता है कि एस728-1157-जैसे एंटीबॉडी जो इस वर्ग के एक उपसमूह का प्रतिनिधित्व करते हैं, तुलनात्मक रूप से दुर्लभ हैं।

इसके अतिरिक्त, हमने हमारे कॉन्वलेसेंट कोहोर्ट सीरा (चित्र 5, I-K) में 2P बनाम 6P-स्थिर स्पाइक की प्रतिक्रियाशीलता में अंतर की जांच की। हमने पाया कि सभी 3 प्रत्युत्तर समूहों ने 6पी-स्थिर स्पाइक डब्ल्यूटी के खिलाफ 2पी-स्थिर स्पाइक डब्ल्यूटी की तुलना में 6-से-11-गुना (चित्रा 5जे) के कारक से अधिक हद तक एंटी-स्पाइक प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी स्थापित की, जो दर्शाता है कि प्रमुख एंटीजेनिक एपिटोप्स को 6पी-स्थिर एंटीजन पर बेहतर ढंग से प्रदर्शित या स्थिर किया गया। समान नमूनों का उपयोग करते हुए, उच्च और मध्यम उत्तरदाताओं में बीए के खिलाफ एंटी-स्पाइक एंटीबॉडी के अनुमापांक भी कम थे। {{17}P, BA की तुलना में। {{18}P, 4-से-5-गुना (चित्र 5K)। ध्यान देने वाली बात यह है कि कम उत्तरदाताओं में स्पाइक BA.1 ओमीक्रॉन {{23} P और 6P (2- गुना कमी) के विरुद्ध बाइंडिंग प्रतिक्रियाशीलता में WT {{26} P और 6P स्पाइक ({) की तुलना में कम गुना परिवर्तन हुआ था। {28}}गुना कमी) (चित्रा 5, जे और के), सुझाव देता है कि बीए.1 ओमिक्रॉन-प्रतिक्रियाशील एपिटोप्स के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी कम प्रतिक्रिया वाले विषयों में अधिक सीमित हो सकता है। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि डब्ल्यूटी और ओमिक्रॉन वायरस दोनों के लिए 6पी-स्थिर स्पाइक में प्राकृतिक संक्रमण से प्रेरित पॉलीक्लोनल बाइंडिंग में सुधार हुआ है।

S728-1157-जैसे एंटीबॉडी हाइब्रिड प्रतिरक्षा के संदर्भ में इष्टतम रूप से प्रेरित होते हैं। वर्तमान वैश्विक परिदृश्य में टीकाकरण के बिना प्राथमिक SARS-CoV -2 संक्रमण दुर्लभ हो गया है, और कई अध्ययनों से पता चला है कि SARS-CoV -2 प्रतिरक्षा विशिष्ट टीकाकरण/संक्रमण इतिहास वाले व्यक्तियों के बीच भिन्न होती है। परिणामस्वरूप, हमने अगली बार यह जांच करने की कोशिश की कि अकेले पैतृक SARS-CoV के साथ WT संक्रमण के अलावा कौन से सामान्य एक्सपोज़र, मोनोवैलेंट mRNA-आधारित टीकों से प्लाज्मा में S728-1157 जैसे एंटीबॉडी को प्रभावी ढंग से प्रेरित करेंगे, बिना किसी पूर्व-परीक्षण के संक्रमण। हमने SARS-CoV के लिए रैपिड इम्युनिटी से जुड़े प्रोटेक्शन एसोसिएटेड (PARIS) अध्ययन दल से आवश्यक जैव नमूना प्राप्त किया, जिसने महामारी (44) की शुरुआत के बाद से लंबे समय तक स्वास्थ्य कर्मियों का अनुसरण किया है। हमने पूरी तरह से प्रतिरक्षित (2 × टीका लगाए गए) अध्ययन प्रतिभागियों से संक्रमण के साथ और बिना संक्रमण के साथ-साथ बढ़े हुए प्रतिभागियों (3 × टीकाकरण) से संक्रमण के साथ और बिना प्लाज्मा के नमूने चुने। इसके अलावा, हमने उन अध्ययन प्रतिभागियों के नमूने भी शामिल किए जिन्हें बाइवेलेंट एमआरएनए वैक्सीन (पैतृक WA1/2020 प्लस ओमिक्रॉन BA.5) प्राप्त हुआ था (चित्र 6A और पूरक तालिका 2)। बूस्टर टीकाकरण प्राप्त करने वाले प्रतिभागियों में तीव्र संक्रमण ऐसे समय में हुआ जब ओमीक्रॉन वंशावली ने न्यूयॉर्क महानगरीय क्षेत्र में अन्य सभी SARS-CoV-2 वंशावली को विस्थापित कर दिया था। हमने पाया कि परीक्षण किए गए नमूनों के 5 समूहों में डबल-टीकाकरण वाले व्यक्तियों में प्रतिस्पर्धी सीरम एंटीबॉडी के एस 728-1157 सबसे कम अनुमापांक थे (चित्र 6बी)। उल्लेखनीय रूप से, ये स्तर हमारे स्वास्थ्य-संक्रमण-रहित समूह (सभी उत्तरदाताओं; चित्र 5बी) के लिए देखे गए समान थे। इसकी तुलना में, प्राकृतिक संक्रमण के इतिहास वाले व्यक्तियों, जिनमें 3 में से 2 टीके की खुराक वाले स्वस्थ व्यक्ति शामिल हैं, और जिन व्यक्तियों ने एक सफल संक्रमण का अनुभव किया था और एक द्विसंयोजक बूस्टर प्राप्त किया था, उनमें असंक्रमित की तुलना में एस 728-1157 उत्सर्जन का स्तर काफी अधिक था। लेकिन टीका लगाए गए व्यक्ति (चित्र 6बी)। यद्यपि असंक्रमित 3- खुराक समूह ने 2- खुराक समूह की तुलना में केवल एक गैर-महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित की, टीके के प्रकार के आधार पर युग्मित टूटने से संकेत मिलता है कि बीएनटी162बी2 और एमआरएनए की समजात तीसरी खुराक -1273 ने एस {{37%) में उल्लेखनीय वृद्धि की 38}}जैसे एंटीबॉडी टाइटर्स को क्रमशः 2.72 × और 2.85 × द्वारा निष्क्रिय करना (चित्रा 6, सी और डी)। ध्यान देने के लिए, किसी भी तरह से स्पाइक के साथ कुल 3 संपर्क वाले प्रतिभागियों में, संक्रमण-अनुभवहीन ट्रिपल-वैक्सीन की तुलना में स्वस्थ डबल-वैक्सीन वाले एस {{45} जैसे एंटीबॉडी टाइटर्स 3 × अधिक थे, जो सुझाव देते हैं कि SARS-CoV {{ 51}} संक्रमण इस क्लोनोटाइप को अधिक बेहतर ढंग से प्रेरित करता है। हाइब्रिड इम्युनिटी समूहों के बीच, हमने देखा कि बाइवैलेंट बूस्टर वैक्सीन की खुराक प्राप्त करने वाले अधिकांश उन्नत व्यक्तियों में प्री ओमिक्रॉन कॉन्वलसेंट टीकाकरण वाले समूहों की तुलना में केवल मामूली रूप से अधिक एस 728-1157 एंटीबॉडी टिटर था, जो सुझाव देता है कि एस {{53) }} टिटर 3 एक्सपोज़र के बाद संभवतः एक पठार के करीब पहुंच रहा था। हमने पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के टाइटर्स की भी जांच की जो S728-1157 के अलावा CC12.3 और CR3022 के साथ प्रतिस्पर्धा करते थे। सभी व्यक्तियों ने सीसी12 के अपेक्षाकृत उच्च अनुमापांक प्रदर्शित किए। एंटीबॉडी की तरह. कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि SARS-CoV संक्रमण और mRNA टीकाकरण दोनों ही S जैसे एंटीबॉडी प्रेरण में योगदान करते हैं, टीकाकरण वाले व्यक्तियों में संक्रमण अधिक प्रमुख भूमिका निभाता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

अंत में, एमआरएनए-टीकाकरण समूह में 2पी- बनाम 6पी-स्थिर स्पाइक के खिलाफ प्रतिक्रियाओं की तुलना करने पर, हमने पाया कि अधिकांश समूहों ने दोनों संरचनाओं के खिलाफ एंटीबॉडी के समान स्तर प्राप्त किए। इसका अपवाद असंक्रमित ट्रिपल-टीकाकृत समूह था, जिसने 6पी-स्थिर स्पाइक (चित्रा 6ई) की तुलना में 2पी के प्रति प्रतिक्रियाशीलता को सांख्यिकीय रूप से उच्चतर, हालांकि केवल थोड़ा बढ़ा हुआ प्रदर्शित किया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि प्राकृतिक संक्रमण (चित्रा 5, जे, और के) के विपरीत, टीकाकरण अकेले एक पॉलीक्लोनल प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है जो स्पाइक के अनुरूप, स्पाइक -2 पी निर्माण में एपिटोप्स तक ही सीमित है। }}वर्तमान टीकों का पी फॉर्मूलेशन। अंततः, ये निष्कर्ष इस विचार का समर्थन करते हैं कि भविष्य के SARS-CoV -2 टीकों का 6P-स्थिरीकरण S728-1157 जैसे व्यापक रूप से सुरक्षात्मक एंटीबॉडी क्लोनोटाइप को प्रेरित करने में बड़ा लाभ हो सकता है।

चित्र 5. मोटे तौर पर आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबी को निष्क्रिय करने के साथ स्वास्थ्यवर्धक सीरम एंटीबॉडी प्रतिस्पर्धा और 6पी- बनाम 2पी-स्थिर स्पाइक्स के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की तुलना

चित्र 6. आरबीडी-प्रतिक्रियाशील एमएबी को निष्क्रिय करने वाले एस728-1157 के साथ एमआरएनए-टीकाकृत सीरम एंटीबॉडी प्रतिस्पर्धा और 6पी- बनाम 2पी-स्थिर स्पाइक्स के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की तुलना।

बहस

इस अध्ययन में, हम एक ऐसे व्यक्ति की मेमोरी बी सेल से अलग किए गए एक शक्तिशाली bnAb की पहचान करते हैं जो COVID-19 महामारी की प्रारंभिक लहर के दौरान SARS-CoV-2 संक्रमण से उबर गया था। इस bnAb, S728- 1157 ने पर्याप्त बाइंडिंग प्रतिक्रियाशीलता बनाए रखी और इसमें ओमीक्रॉन BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5, और XBB, और हैम्स्टर में डेल्टा और BA.1 संक्रमण के बाद संक्रामक वायरल टाइटर्स को काफी हद तक कम करने में सक्षम था।

हमने पाया कि हमारे समूह के कॉन्वलेसेंट सीरम में एंटीबॉडी की कम सांद्रता थी जो एस 728-1157 (एक वर्ग 1/ आरबीएस-ए एंटीबॉडी) और वर्ग 2 एपिटोप एमएबीएस के साथ प्रतिस्पर्धा करती है। इससे पता चलता है कि एस 728-1157 अन्य एंटीबॉडी से कुछ हद तक अद्वितीय है जो कक्षा 1 के एपिटोप्स को लक्षित करता है और आरबीडी-विशिष्ट मेमोरी बी सेल पूल में शायद ही कभी प्रेरित होता है। इसके बजाय, हमारा प्राकृतिक संक्रमण समूह सीआर3022 (वर्ग 4) एपिटोप को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी को प्रेरित करता हुआ दिखाई दिया; इस विशिष्टता के एंटीबॉडी अक्सर क्रॉस-रिएक्टिव होते हैं लेकिन आरबीएस-लक्षित एंटीबॉडी (14, 17) की तुलना में कम प्रभावी रूप से निष्क्रिय होते हैं। ये डेटा हमारे पिछले निष्कर्षों के पूरक हैं जो दर्शाते हैं कि दीक्षांत सीरा में कक्षा 3/एस309 एंटीबॉडी की प्रचुरता अल्फा और गामा वेरिएंट के खिलाफ गतिविधि को बेअसर करने में योगदान दे सकती है, जबकि कक्षा 2 एंटीबॉडी की कमी डेल्टा (15) के खिलाफ तटस्थीकरण क्षमता को कम कर सकती है। . इसके बावजूद, ओमीक्रॉन वेरिएंट के खिलाफ इनमें से अधिकांश आरबीएस-लक्षित एंटीबॉडी (आरबीएस-ए/क्लास 1, आरबीएस-बी, सी/क्लास 2, और आरबीएस-डी, एस309/क्लास 3) की गतिविधि की चौड़ाई अत्यधिक सीमित बताई गई है। (11, 40, 45).

आगे बढ़ने में मुख्य चुनौती यह निर्धारित करना होगा कि संरक्षित आरबीएस एपिटोप्स के लिए व्यापक रूप से क्रॉस-रिएक्टिव एंटीबॉडी के उत्सर्जन में सुधार कैसे किया जाए। इस संबंध में, हमने यहां देखा कि हाइब्रिड प्रतिरक्षा वाले व्यक्तियों में पूर्व संक्रमण के बिना टीका लगाए गए व्यक्तियों की तुलना में एस 728-1157- जैसे एंटीबॉडी के काफी अधिक अनुमापांक होते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस घटना को तब भी नोट किया गया था जब एक्सपोज़र की संख्या को नियंत्रित किया गया था (यानी, डबल वैक्सीन बनाम असंक्रमित ट्रिपल वैक्सीन में), यह सुझाव देते हुए कि संक्रमण से जुड़ी प्रतिरक्षा के कुछ तत्व (या एक वैक्सीन फॉर्मूलेशन जो इस प्रकार की प्रतिरक्षा की नकल कर सकता है) इस क्लोनोटाइप के उद्बोधन के लिए महत्वपूर्ण है। यह उन प्रयोगात्मक सबूतों के अनुरूप है जो बताते हैं कि हाइब्रिड प्रतिरक्षा वाले व्यक्तियों में उन लोगों की तुलना में व्यापक एंटीबॉडी-प्रतिक्रिया प्रोफ़ाइल होती है जिनमें केवल टीकाकरण-प्रेरित या प्राथमिक संक्रमण-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं होती हैं (9)।

यहां दी गई संरचनाओं से पता चलता है कि S728-1157 ने RBS-A/क्लास 1 एपिटोप को अप-कन्फर्मेशन RBD में बांध दिया है। यह एपिटोप 6पी-स्थिर स्पाइक्स पर अधिक आसानी से पहुंच योग्य प्रतीत होता है, जिसमें 2पी स्पाइक्स की तुलना में अपस्टेट में 2 आरबीडी पेश करने की सूचना दी गई है, जो केवल 1 (30, 33, 46, 47) पेश करते हैं, और जिनके लिए हमारे एंटीबॉडी हैं अप-कन्फर्मेशन स्पाइक के लिए विशिष्ट, बेहतर बाइंडिंग दिखाता है। एस728-1157 को प्राकृतिक संक्रमण के बाद अलग कर दिया गया था; ऐसे संदर्भों में, एस {{15 }}-जैसे क्लोनों को प्रेरित करने की संभावना अधिक होती है, क्योंकि आरबीडी को एसीई2 से जुड़ने के लिए क्षणिक रूप से भी ऊपर की संरचना को अपनाने में सक्षम होना चाहिए, जिससे इस एपिटोप को उजागर किया जा सके। IGHV3-53/3-66 RBS-A/क्लास 1 एंटीबॉडी के बहुमत के विपरीत, S728-1157 CDR-H3 और RBD (29) के बीच व्यापक इंटरैक्शन का उपयोग करके VOC स्पाइक्स में प्रमुख उत्परिवर्तन को समायोजित कर सकता है। 48-50). S728-1157 अन्य कम व्यापक एंटीबॉडी जैसे CC12.3 (IGKV3-20) की तुलना में एक अलग प्रकाश श्रृंखला (IGLV3-9) का भी उपयोग करता है, जो समग्र बाइंडिंग इंटरैक्शन को प्रभावित कर सकता है; हालाँकि, हमारा विश्लेषण बताता है कि CC12.3 (पूरक तालिका 7) की तुलना में S728-1157 प्रकाश श्रृंखला और RBD के बीच कम हाइड्रोजन बंधन है। यद्यपि इस इंटरैक्शन में वीओसी क्रॉस-रिएक्टिविटी के लिए महत्वपूर्ण सीडीआर-एच 3 संपर्क अवशेषों में से अधिकांश जर्मलाइन-एनकोडेड हैं और दैहिक उत्परिवर्तन द्वारा पेश नहीं किए गए हैं, फ्रेमवर्क क्षेत्रों या सीडीआर-एच 1, सीडीआर-एच 2 और सीडीआर-एल 1 में कई दैहिक रूप से उत्परिवर्तित अवशेष हैं। SARS-CoV-2 RBD के साथ अंतःक्रिया में शामिल। एक ओर, इससे पता चलता है कि मेमोरी बी कोशिकाएं IGHV3-53/66 श्रेणी के एंटीबॉडी को एन्कोडिंग करती हैं, जो आगे की आत्मीयता परिपक्वता द्वारा क्रॉस-रिएक्टिविटी की समान डिग्री प्राप्त कर सकती हैं। दूसरी ओर, यह जर्मलाइन-लक्षित इम्युनोजेन को डिजाइन करने की संभावना को भी इंगित करता है जो भोली बी कोशिकाओं की तरह एस 728-1157- को लक्षित करते हैं। हालांकि ऐसे टीके डिज़ाइन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जो विशेष रूप से VOC उत्परिवर्तन पर काबू पाने में सक्षम चुनिंदा CDR-H3s के साथ S{53}}-जैसे एंटीबॉडी उत्पन्न कर सकते हैं, यह उत्साहजनक है कि IGHV-जीन प्रतिबंध अन्य शक्तिशाली SARS-CoV में देखा गया है। {58}} mAbs अध्ययनों को निष्प्रभावी करना (13, 15, 20-27)। वैकल्पिक रूप से, यह अनुकूलित आरबीडी इम्युनोजेन के साथ पुनरावृत्त टीकाकरण के माध्यम से भी संभव हो सकता है, जैसा कि पहले अन्य रोगजनकों (51-55) के लिए बताया गया है।

हालाँकि, आरबीएस-ए/वर्ग 1 एंटीजेनिक साइट (18) में एस728-1157 एपिटोप के संबंध में कई उत्परिवर्तन देखे गए हैं, कुल 15 में से 13 आरबीडी संपर्क अवशेष और 3 में से 2 सीडीआर-एच{{9} }बाउंड आरबीडी संपर्क अवशेष ओमिक्रॉन और अन्य सभी वीओसी के भीतर संरक्षित हैं। इससे पता चलता है कि आरबीडी क्षेत्र जहां एस 728-1157 एपिटोप पाया जाता है, उसमें इसके गतिशील कार्य और वायरल फिटनेस के लिए महत्वपूर्ण अवशेष शामिल हो सकते हैं और इसलिए आसपास के आरबीएस-ए/क्लास 1 साइट अवशेषों की तुलना में उत्परिवर्तन और एंटीजेनिक बहाव के प्रति कम सहनशील होगा। यदि यह मामला है, तो वायरल वेरिएंट के विकसित होने पर इस विशेष एपिटोप के खो जाने की प्रवृत्ति को कम किया जाना चाहिए, जिससे एस 728-1157 और इसी तरह के एंटीबॉडी और एपिटोप का लक्षण वर्णन वेरिएंट-प्रतिरोधी टीके या एमएबी चिकित्सीय विकास के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा। संक्षेप में, हमारा अध्ययन ऐसे bnAbs की पहचान करता है जो अगली पीढ़ी के वैरिएंट-प्रूफ़ कोरोना वायरस टीकों के लिए इम्यूनोजेन डिज़ाइन को सूचित कर सकते हैं या mAb चिकित्सीय के रूप में काम कर सकते हैं जो SARS CoV-2 विकास के प्रति प्रतिरोधी हैं। विशेष रूप से, संयुक्त क्षमता और चौड़ाई के संदर्भ में, S728-1157 अब तक पृथक श्रेणी में सबसे अच्छा एंटीबॉडी प्रतीत होता है। यह देखते हुए कि यह एंटीबॉडी 6P-स्थिरीकरण के साथ अधिक आसानी से जुड़ता है, यह अधिमानतः 6P-स्थिर पुनः संयोजक स्पाइक प्रोटीन या पूरे वायरस से प्रेरित होने का अनुमान है, जो बताता है कि हेक्साप्रोलाइन संशोधन भविष्य के SARS-CoV से बेहतर सुरक्षा के लिए भविष्य के वैक्सीन निर्माणों को लाभ पहुंचा सकता है। -2 वैरिएंट और अन्य आर्बोवायरस।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

तरीकों

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अलगाव. पीबीएमसी को ल्यूकोरेडक्शन फिल्टर से अलग किया गया और पहले बताए अनुसार जमे हुए थे (24)। बी कोशिकाओं को एफएसीएस के माध्यम से पीबीएमसी से समृद्ध किया गया था। कोशिकाओं को CD19, CD3 और ऑलिगो-फ्लोरोफोरे से संयुग्मित एंटीजन जांच से रंगा गया; रुचि की कोशिकाओं की पहचान CD3- CD{5}} एंटीजन+ के रूप में की गई। सभी mAbs ऑलिगो-टैग, एंटीजन बैट-सॉर्टेड कोशिकाओं से उत्पन्न हुए थे, जिन्हें एकल-सेल आरएनए-सेक के माध्यम से पहचाना गया था, जैसा कि पहले बताया गया है (15, 24)। इस अध्ययन में उत्पन्न एकल बी सेल डेटा को जीन एक्सप्रेशन ऑम्निबस: GSE171703 और GSM5231088-GSM5231123 में जमा किया गया है।

जेएमपी प्रो 15 द्वारा विश्लेषण किए गए एंटीजन-जांच तीव्रता के आधार पर एमएबीएस उत्पन्न करने के लिए एंटीजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं का चयन किया गया था। एंटीबॉडी भारी और हल्की श्रृंखला जीन को एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज (आईडीटी) द्वारा संश्लेषित किया गया था और मानव आईजीजी1 और मानव κ या λ प्रकाश-श्रृंखला में क्लोन किया गया था। गिब्सन असेंबली द्वारा अभिव्यक्ति वैक्टर, जैसा कि पहले वर्णित है (56)। संबंधित mAb की भारी और हल्की श्रृंखलाओं को क्षणिक रूप से HEK293T कोशिकाओं (ATCC) में परिवर्तित किया गया। 18 घंटे तक ट्रांसफ़ेक्शन के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को प्रोटीन-मुक्त हाइब्रिडोमा मीडियम सुपरनैटेंट (पीएफएचएम-II, गिब्को) के साथ पूरक किया गया। स्रावित एमएबी युक्त सतह पर तैरनेवाला को 4 दिन में काटा गया और प्रोटीन ए-एगरोज़ मोतियों (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके शुद्ध किया गया जैसा कि पहले बताया गया था (56)। अच्छी तरह से चित्रित एंटीबॉडी की भारी और हल्की श्रृंखलाओं के अनुक्रम प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी), LY-CoV555 (PDB आईडी: 7KMG), CR3 0 22 (PDB आईडी: 6W7Y), और REGN1 {{ से प्राप्त किए गए थे। 125}}933 (पीडीबी आईडी: 6एक्सडीजी) और ऊपर वर्णित अनुसार संश्लेषित किए गए थे। CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट (सैन डिएगो, कैलिफ़ोर्निया, यूएसए) में मेंग युआन द्वारा प्रदान किया गया था। पुनः संयोजक स्पाइक प्रोटीन अभिव्यक्ति। पुनः संयोजक D614G SARS-CoV-2 पूर्ण-लंबाई (FL) स्पाइक, BA.{{30}P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1। Y505A, और Y505F), संयोजन RBD उत्परिवर्ती (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD, और MERS-CoV RBD इन-हाउस उत्पन्न हुए थे। संक्षेप में, पुनः संयोजक एंटीजन को एक्सपी293एफ कोशिकाओं (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके व्यक्त किया गया था। रुचि के जीन को एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर (इन-हाउस संशोधित AbVec) में क्लोन किया गया था और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक्सपीफेक्टामाइन 293 किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के बाद चौथे दिन सतह पर तैरनेवाला काटा गया और नी-नाइट्रिलोट्राइसेटिक एसिड (नी-एनटीए) एगरोज़ (क्यूजेन) के साथ ऊष्मायन किया गया। शुद्धिकरण एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ का उपयोग करके किया गया था और पहले वर्णित (57, 58) के अनुसार इमिडाज़ोल युक्त बफर के साथ निक्षालित किया गया था। एमिकॉन सेंट्रीफ्यूगल यूनिट (मिलिपोर) का उपयोग करके एलुएट को बफर किया गया और पीबीएस के साथ एक्सचेंज किया गया। पुनः संयोजक FL स्पाइक्स को वेरिएंट B.1.1.7 अल्फा, B.1.351 बीटा, P.1 गामा, B.1.617.2 डेल्टा, BA.1, BA.2, और BA.4 ओमीक्रॉन के 2P उत्परिवर्तन द्वारा स्थिर किया गया और थे सिएटल चिल्ड्रेन्स रिसर्च इंस्टीट्यूट में सैथर प्रयोगशाला में उत्पादित। K417V, N439K, और E484K RBDs और पुनः संयोजक FL स्पाइक WT-2P और 6P का उत्पादन माउंट सिनाई के इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में क्रेमर प्रयोगशाला में किया गया था। SARS-CoV-2-6P-Mut7 और स्पाइक BA.1-6P को पिछले अध्ययन (59) में वर्णित अनुसार डिजाइन और उत्पादित किया गया था। प्रत्येक एंटीजन के लिए प्रोटीन अनुक्रम और संसाधन पूरक तालिका 4. एलिसा में सूचीबद्ध हैं। पुनः संयोजक SARS-CoV -2 स्पाइक/आरबीडी प्रोटीन को पीबीएस में 2 यूजी/एमएल पर 50 μL/वेल पर उच्च प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोटिटर प्लेट्स (कोस्टार) पर लेपित किया गया और रात भर 4 डिग्री पर रखा गया। प्लेटों को 0.05% ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) वाले पीबीएस से धोया गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए 20% एफबीएस वाले 150 μL पीबीएस से अवरुद्ध किया गया। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को पीबीएस में 10 यूजी/एमएल से शुरू करके क्रमिक रूप से {{107}गुना पतला किया गया और कुओं में 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर प्लेटों को धोया गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी (जैक्सन इम्यूनोरिसर्च; 109- 035-098), 1:1, 000) के साथ इनक्यूबेट किया गया। धोने के बाद, प्रति कुएं में 100 μL सुपर एक्वाब्लू एलिसा सब्सट्रेट (ईबायोसाइंस) मिलाया गया। माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बायो-रेड) पर अवशोषण को 405 एनएम पर मापा गया था। प्रत्येक प्लेट में ज्ञात बाइंडिंग विशेषताओं के साथ नियंत्रण एंटीबॉडी एस 144-509 (15) का उपयोग करके परख को मानकीकृत किया गया था, और प्लेटों को तब तक विकसित किया गया था जब तक कि नियंत्रण का अवशोषण 3.0 के ओडी तक नहीं पहुंच गया। सभी mAbs का दो प्रतियों में परीक्षण किया गया, और प्रत्येक प्रयोग दो बार किया गया।

सीरम एलिसा. उच्च प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेटों को पीबीएस में रात भर 4 डिग्री पर 2 यूजी/एमएल पर पुनः संयोजक SARS-CoV -2 स्पाइक एंटीजन के साथ लेपित किया गया था। प्लेटों को पीबीएस 0 से धोया गया। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए स्किम मिल्क पाउडर। सीरोलॉजी प्रयोग करने से पहले प्लाज्मा नमूनों को 56 डिग्री पर 1 घंटे के लिए गर्म किया गया। प्लाज़्मा को पीबीएस 0.1% ट्वीन + 1% स्किम मिल्क पाउडर में क्रमिक रूप से 2- गुना पतला किया गया था। आरटी पर 2 घंटे के लिए प्लेटों को सीरम तनुकरण के साथ ऊष्मायन किया गया था। एंटीबॉडी के बंधन का पता लगाने के लिए एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी मानव आईजी माध्यमिक एंटीबॉडी को पीबीएस 0.1% ट्वीन + 1% स्किम मिल्क पाउडर के साथ 1:3, 000 पर पतला किया गया था। 1 घंटे के ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए 100 μL सिग्माफास्ट ओपीडी समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ प्लेटें विकसित की गईं। फिर, विकास प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 50 μL 3M HCl का उपयोग किया गया। माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बायो-रेड) पर अवशोषण को 490 एनएम पर मापा गया था। प्रत्येक नमूने के लिए समापन बिंदु अनुमापांक को सिग्मॉइडल 4PL (जहां x लॉग एकाग्रता है) मानक वक्र से निकाला गया था। पता लगाने की सीमा (एलओडी) को पूर्व-SARS-CoV व्यक्तियों के प्लाज्मा का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए OD सिग्नल के माध्य + 3 SD के रूप में परिभाषित किया गया है। सभी गणनाएँ ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर (संस्करण 9.0) में की गईं।

प्रतियोगिता एलिसा. आरबीडी-रिएक्टिव एमएबीएस के लक्ष्य एपिटोप वर्गीकरण को निर्धारित करने के लिए, प्रतिस्पर्धी एमएबीएस के रूप में ज्ञात एपिटोप बाइंडिंग विशेषताओं के साथ अन्य एमएबी का उपयोग करके प्रतिस्पर्धा एलिसा का प्रदर्शन किया गया था। प्रतिस्पर्धी एमएबी को आरटी पर 2 घंटे के लिए ईज़ी-लिंक सल्फो-एनएचएस-बायोटिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके बायोटिनाइलेट किया गया था। बायोटिनाइलेटेड mAbs के अतिरिक्त बायोटिन को 7k आणविक भार-कटऑफ (MWCO) ज़ेबा स्पिन डीसाल्टिंग कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ हटा दिया गया था। प्लेटों को रात भर 4 डिग्री पर 2 यूजी/एमएल आरबीडी एंटीजन से लेपित किया गया। प्लेटों को आरटी पर 2 घंटे के लिए पीबीएस -2 {{25 }}% एफबीएस के साथ अवरुद्ध किया गया था, और एक अनिर्धारित वर्ग या सीरम के एमएबी के {{11 }} गुना कमजोर पड़ने को जोड़ा गया था, जो 2 {{34 }} से शुरू हुआ था। mAbs का ug/mL और सीरम का 1:10 तनुकरण। आरटी पर 2 घंटे तक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, बायोटिनाइलेटेड प्रतिस्पर्धी एमएबी को उसके पृथक्करण स्थिरांक (केडी) की दोगुनी सांद्रता में जोड़ा गया था और पहले जोड़े गए एमएबी या सीरम के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। प्लेटों को धोया गया और 100 μL एचआरपी-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (दक्षिणी बायोटेक) के साथ 1:1, 000 के तनुकरण पर 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्लेटों को सुपर एक्वाब्लू एलिसा सब्सट्रेट (ईबायोसाइंस) के साथ विकसित किया गया था। परख को सामान्य करने के लिए, प्रतिस्पर्धी बायोटिनाइलेटेड एमएबी को नियंत्रण के रूप में किसी भी प्रतिस्पर्धी एमएबी या सीरम के बिना एक कुएं में जोड़ा गया था। डेटा तब रिकॉर्ड किया गया जब नियंत्रण कुएं का अवशोषण 1.0-1.5 के ओडी तक पहुंच गया। mAbs के बीच प्रतिशत प्रतिस्पर्धा की गणना एक नमूने के देखे गए OD को सकारात्मक नियंत्रण द्वारा प्राप्त OD द्वारा विभाजित करके, इस मान को 1 से घटाकर, और 100 से गुणा करके की गई थी। सीरम के लिए, 50 निर्धारित करने के लिए OD को लॉग 10 में रूपांतरित किया गया और गैर-रेखीय प्रतिगमन द्वारा विश्लेषण किया गया। ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर (संस्करण 9.0) का उपयोग करके % निषेध एकाग्रता (IC50) मान। डेटा को Log1P में बदल दिया गया और सीरम कमजोर पड़ने वाले IC50 के पारस्परिक सीरम कमजोर पड़ने के एक ग्राफ प्रतिनिधि में प्लॉट किया गया जो कि रुचि के प्रतिस्पर्धी mAb के साथ 50% प्रतिस्पर्धा प्राप्त कर सकता है। सभी mAbs का दो प्रतियों में परीक्षण किया गया, प्रत्येक प्रयोग 2 बार स्वतंत्र रूप से किया गया, और 2 स्वतंत्र प्रयोगों के मूल्यों का औसत निकाला गया।

पट्टिका परख. वेरो E6/TMPRSS2 कोशिकाओं (जापानी रिसर्च बायोरिसोर्सेज (JCRB) का संग्रह) (पूरक तालिका 5) पर SARS-CoV -2 प्रकार के वायरस के साथ प्लाक परीक्षण किया गया। कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करने से पहले 9{23}}% संगम प्राप्त करने के लिए सुसंस्कृत किया गया था और 3 × 1{53}}4 कोशिकाओं/वेल प्लेटों में 96- के घनत्व पर बीजित किया गया था। अगले दिन, SARS-CoV के 102 PFUs को 1 घंटे के लिए गुना-पतले mAbs के साथ इनक्यूबेट किया गया। एंटीबॉडी-वायरस मिश्रण को 37 डिग्री पर 3 दिनों के लिए वेरो E6/TMPRSS2 कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया था। प्लेटों को 20% मेथनॉल के साथ तय किया गया और फिर क्रिस्टल वायलेट समाधान के साथ दाग दिया गया। पूर्ण निरोधात्मक सांद्रता (IC99) की गणना ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 9.0) में किए गए लॉग (अवरोधक) बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया (परिवर्तनीय ढलान) का उपयोग करके की गई थी। सभी mAbs का दो प्रतियों में परीक्षण किया गया, और प्रत्येक प्रयोग दो बार किया गया। फोकस कमी न्यूट्रलाइजेशन परीक्षण। प्लाक परख के अलावा एक अतिरिक्त मंच के रूप में न्यूट्रलाइजेशन गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए फोकस रिडक्शन न्यूट्रलाइजेशन टेस्ट (एफआरएनटी) का उपयोग किया गया था। 1:20 की अंतिम सांद्रता से शुरू होने वाले सीरम के क्रमिक तनुकरण को प्रति कुएं में वायरस की 103 फोकस बनाने वाली इकाइयों के साथ मिलाया गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। एक एकत्रित प्रीपेन्डेमिक सीरम सैंपल को नियंत्रण के रूप में कार्य किया गया। एंटीबॉडी-वायरस मिश्रण को वेरो E6/TMPRSS2 कोशिकाओं (JCRB) पर {{33}वेल प्लेटों में टीका लगाया गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्रत्येक कुएं में समान मात्रा में मिथाइलसेलुलोज घोल मिलाया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 16 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया और फिर फॉर्मेलिन से ठीक किया गया। फॉर्मेलिन को हटा दिए जाने के बाद, कोशिकाओं को SARS-CoV -1/2 न्यूक्लियोप्रोटीन [क्लोन 1C7C7 (सिग्मा-एल्ड्रिच)] के खिलाफ माउस mAb से प्रतिरक्षित किया गया, इसके बाद HRP-लेबल बकरी विरोधी माउस इम्युनोग्लोबुलिन (सिग्मा-) लगाया गया। एल्ड्रिच; ए8924)। संक्रमित कोशिकाओं को ट्रूब्लू सब्सट्रेट (सेराकेयर लाइफ साइंसेज) से रंगा गया और फिर आसुत जल से धोया गया। सूखने के बाद, इम्यूनोस्पॉट एस6 एनालाइजर, इम्यूनोकैप्चर सॉफ्टवेयर और बायोस्पॉट सॉफ्टवेयर (सेलुलर टेक्नोलॉजी) का उपयोग करके फोकस संख्या निर्धारित की गई। IC50 की गणना ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 9.0) में किए गए वैरिएबल ढलान (4 पैरामीटर) नॉनलाइनर रिग्रेशन का उपयोग करके लॉग (अवरोधक) बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया से इंटरपोलेटेड मान से की गई थी।

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